CN115144500B - 一种异环磷酰胺原料药中异环磷酰胺、杂质e、杂质g的检测方法 - Google Patents

一种异环磷酰胺原料药中异环磷酰胺、杂质e、杂质g的检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种异环磷酰胺原料药中异环磷酰胺、杂质E、杂质G的检测方法，所述检测方法是采用液相色谱‑质谱联用法进行检测，所述异环磷酰胺的检测限为0.005μg/mL，杂质E的检测限为0.125μg/mL，杂质G的检测限为0.002μg/mL，本发明采用的液相色谱‑质谱联用法对异环磷酰胺原料药中主成分以及相关物质进行检测，为解决异环磷酰胺原料药中异环磷酰胺、杂质E、杂质G的检测问题，提供了一种高效、准确、快速的检测方法，具有方法简便、精密度高、重现好等优点，能够快速、准确地对异环磷酰胺原料药进行检测，整个操作过程可靠、可控，适用于实际应用和推广，具有广阔的应用前景。

Description

一种异环磷酰胺原料药中异环磷酰胺、杂质E、杂质G的检测 方法
技术领域
本发明涉及药物分析技术领域，尤其涉及一种异环磷酰胺原料药中异环磷酰胺、杂质E、杂质G的检测方法。
背景技术
异环磷酰胺，简称IF，是结构上与环磷酰胺相似的烷化类氧氮磷环类药物，化学名称为3-(2-氯乙基)-2-[(2-氯乙基)氨基]四氢-2H-1,3,2-噁磷-2-氧化物，是一种前体药物，在肝内经酶转化为具有细胞毒活性的代谢物，从而能与DNA链发生不可逆的交联，干扰DNA的合成。目前主要适用于软组织肿瘤、睾丸肿瘤、恶性淋巴瘤、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、子宫颈癌及儿童肿瘤。在现代异环磷酰胺生产过程中，会引入一些有关物质，这些物质会影响活性成分的纯度，难以保障用药安全。因此，迫切需要开发一种能够实现对异环磷酰胺原料药中主成分以有关物质的检测方法，对异环磷酰胺的质量控制具有重要的意义。
发明内容
本发明针对异环磷酰胺原料药中异环磷酰胺、杂质E、杂质G的检测，提出了一种具有优异的灵敏度、精密度和线性关系的检测方法，具体技术方案如下：
一种异环磷酰胺原料药中异环磷酰胺、杂质E、杂质G的检测方法，所述检测方法是采用液相色谱-质谱联用法进行检测，所述异环磷酰胺为异环磷酰胺，所述异环磷酰胺、杂质E、杂质G结构分别如式I、II、III所示：
所述异环磷酰胺的检测限为0.005μg/mL，杂质E的检测限为0.125μg/mL，杂质G的检测限为0.002μg/mL。
进一步的，所述检测步骤如下：
(1)溶液的配制：包括空白溶液、对照品储备液、对照品溶液、供试品储备液、供试品溶液，其中：
空白溶液：5％甲醇水溶液作为稀释剂；
对照品储备液：精密称定异环磷酰胺、杂质E、杂质G对照品，分别置于10mL棕色容量瓶中，用稀释剂稀释定容至刻度，摇匀制得浓度均为1.0mg/mL的异环磷酰胺、杂质E、杂质G对照品储备液；精密量取异环磷酰胺、杂质E、杂质G对照品储备液0.1mL，置于100mL棕色容量瓶中，用稀释剂稀释定容至刻度，摇匀制得异环磷酰胺、杂质E、杂质G浓度为1000ng/mL的对照品储备液二；
对照品溶液：精密量取异环磷酰胺、杂质E对照品储备液二各0.1mL、杂质G对照品储备液二0.1μL置于100mL棕色容量瓶中，用稀释剂稀释定容至刻度，摇匀制得异环磷酰胺、杂质E为1ng/mL、杂质G为0.01ng/mL的对照品溶液；
供试品储备液：取异环磷酰胺原料药，精密称定，置于10mL棕色容量瓶中，用稀释剂稀释定容至刻度，摇匀制得浓度为1.0mg/mL供试品储备液；精密量取供试品储备液0.1mL，置于100mL棕色容量瓶中，用稀释剂稀释定容至刻度，摇匀制得1000ng/mL供试品储备液二；
供试品溶液：精密量取4mL供试品储备液二置于100mL棕色容量瓶中，稀释剂稀释定容至刻度摇匀，制得异环磷酰胺约40ng/mL供试品溶液。
(2)采用液相色谱-质谱联用法对所述的空白溶液、供试品溶液、对照品溶液进行检测，所述液相色谱条件为：采用T3色谱柱，以5mM碳酸氢铵水溶液为流动相A，以甲醇为流动相B，梯度洗脱，所述的梯度洗脱的程序如下：0min→1.5min，5％流动相A，95％流动相B；1.5min→8.5min，5％流动相A→55％流动相A，95％流动相B→45％流动相B；8.5min→8.6min，55％流动相A→5％流动相A，5％流动相B→95％流动相B；8.6min→10min，55％流动相A→5％流动相A，5％流动相B→95％流动相B。
进一步的，所述的色谱柱的型号为ACQUITYHSS T3，规格为1.8μm×100mm×2.1mm，流速为0.2mL/min-0.3mL/min，柱温为30℃-40℃，进样体积为10μL。
进一步的，所述质谱采用ESI离子源，正离子模式下以多反应监测方式(MRM)进行定量分析，所述的异环磷酰胺的定量离子为：母离子为260.75m/z，子离子为91.74m/z，碰撞能为24eV；杂质E的定量离子为：母离子为155.48m/z，子离子为62.72m/z，碰撞能为16eV；杂质G的定量离子为：母离子为274.72m/z，子离子为199.82m/z，碰撞能为10eV。
进一步的，所述质谱的离子源参数为：电喷雾电压(IS)为5500V，毛细管电压为3.2kV，脱溶剂气流速为700L/h，锥孔气流速为150L/h，碰撞气为氩气，碰撞气流速为0.13mL/min，离子源温度(TEM)为150℃，脱溶剂气温度为350℃。
与现有技术相比，本发明具有的有益效果如下：
相对于现有技术，本发明提供的异环磷酰胺原料药中主成分及有关物质的检测方法，实现对异环磷酰胺原料药中异环磷酰胺、杂质E、杂质G的定量和定性分析，该方法专属性强，检测限低，异环磷酰胺异环磷酰胺的检测限为0.005μg/mL，杂质E的检测限为0.125μg/mL，杂质G的检测限为0.002μg/mL，满足异环磷酰胺原料药中异环磷酰胺、杂质E、杂质G的检测要求，而且这三个物质的线性关系良好，重复性良好、准确度高，标准曲线的线性范围内的相关系数均大于0.99，且该分析方法还具有分析速度快、需样量少等优点，能够提高样品分析效率，本发明采用的液相色谱-质谱联用法对异环磷酰胺原料药中主成分以及相关物质进行检测，具有方法简便、精密度高、重现好等优点，能够快速、准确地对异环磷酰胺原料药进行检测，整个操作过程可靠、可控，适用于实际应用和推广，具有广阔的应用前景。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例技术描述中所需要使用的附图做简单的介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。
图1为本发明实施例1空白溶液的高效液相色谱图。
图2为本发明实施例1对照品溶液的高效液相色谱图。
图3为本发明实施例1供试品溶液的高效液相色谱图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明的保护范围。
一种异环磷酰胺原料药中异环磷酰胺、杂质E、杂质G的检测方法，所述检测方法是采用液相色谱-质谱联用法进行检测，所述异环磷酰胺简称为IF，所述异环磷酰胺、杂质E、杂质G结构分别如式I、II、III所示：
作为优选方案，一种异环磷酰胺原料药中异环磷酰胺、杂质E、杂质G的检测方法包括以下步骤：
(1)溶液的配制：
空白溶液的配制：5％甲醇水溶液，作为稀释剂；
对照品储备液：精密称定异环磷酰胺、杂质E、杂质G对照品，分别置于10mL棕色容量瓶中，用稀释剂稀释定容至刻度，摇匀制得浓度均为1.0mg/mL的异环磷酰胺、杂质E、杂质G对照品储备液；精密量取异环磷酰胺异环磷酰胺、杂质E、杂质G对照品储备液0.1mL，置于100mL棕色容量瓶中，用稀释剂稀释定容至刻度，摇匀制得浓度均为1000ng/mL的异环磷酰胺、杂质E、杂质G对照品储备液二；
对照品溶液：精密量取异环磷酰胺、杂质E对照品储备液二各0.1mL、杂质G对照品储备液二0.1μL置于100mL棕色容量瓶中，用稀释剂稀释定容至刻度，摇匀制得浓度为1ng/mL的异环磷酰胺、杂质E的对照品溶液，浓度为0.01ng/mL的杂质G对照品溶液；
供试品储备液：取异环磷酰胺原料药，精密称定，置于10mL棕色容量瓶中，用稀释剂稀释定容至刻度，摇匀制得浓度为1.0mg/mL供试品储备液；精密量取供试品储备液0.1mL，置于100mL棕色容量瓶中，用稀释剂稀释定容至刻度，摇匀制得1000ng/mL供试品储备液二；
供试品溶液：精密量取4mL供试品储备液二置于100mL棕色容量瓶中，稀释剂稀释定容至刻度摇匀，制得异环磷酰胺40ng/mL供试品溶液。
(2)采用液相色谱-质谱联用法对所述的空白溶液、供试品溶液、对照品溶液进行检测，所述的液相色谱条件为：
采用T3色谱柱，以5mM碳酸氢铵水溶液为流动相A，以甲醇为流动相B，梯度洗脱；
所述质谱采用ESI离子源，正离子模式下以多反应监测方式(MRM)进行定量分析，所述的异环磷酰胺的定量离子为：母离子为260.75m/z，子离子为91.74m/z，碰撞能为24eV；杂质E的定量离子为：母离子为155.48m/z，子离子为62.72m/z，碰撞能为16eV；杂质G的定量离子为：母离子为274.72m/z，子离子为199.82m/z，碰撞能为10eV。
相对于现有技术，本发明提供的异环磷酰胺原料药中主成分及有关物质的检测方法，实现对异环磷酰胺原料药中异环磷酰胺IF、杂质E、杂质G的定量和定性分析，该方法专属性强，检测限低，异环磷酰胺的检测限为0.005μg/mL，杂质E的检测限为0.125μg/mL，杂质G的检测限为0.002μg/mL，满足异环磷酰胺原料药中异环磷酰胺异环磷酰胺、杂质E、杂质G的检测要求，而且这三个物质的线性关系良好，重复性良好、准确度高，标准曲线的线性范围内的相关系数均大于0.99，且该分析方法还具有分析速度快、需样量少等优点，能够提高样品分析效率。
作为优选方案，所述的液相色谱-质谱联用法中的梯度洗脱程序如下：
0min→1.5min，5％流动相A，95％流动相B；
1.5min→8.5min，5％流动相A→55％流动相A，95％流动相B→45％流动相B；
8.5min→8.6min，55％流动相A→5％流动相A，5％流动相B→95％流动相B；
8.6min→10min，55％流动相A→5％流动相A，5％流动相B→95％流动相B。
梯度洗脱对检测目标物的分离效果和峰形有显著影响，能够将异环磷酰胺、杂质E、杂质G进行分离，分离效果优异，同时能够缩短分析时间，在8.40min出现杂质E色谱峰，8.56min出现异环磷酰胺色谱峰，6.47min出现杂质G色谱峰。
作为优选方案，所述质谱的离子源参数为：喷雾电压(IS)为5500V，毛细管电压为3.2kV，脱溶剂气流速为700L/h，锥孔气流速为150L/h，碰撞气为氩气，碰撞气流速为0.13mL/min，离子源温度(TEM)为150℃，脱溶剂气温度为350℃。
作为优选方案，流速为0.3mL/min，柱温为30℃，能够使得三个物质在较短的时间内出峰，减少分析时间，并且还具有良好的分离效果。
作为优选方案，所述的色谱柱的型号为ACQUITYHSS T3，规格为1.8μm×100mm×2.1mm，进样体积为10μL。
不同色谱柱对三个物质的保留能力不同，因此本申请采用的是ACQUITYHSS T3色谱柱，规格为1.8μm×100mm×2.1mm，能够实现三个物质的快速、有效分离，且峰形较好。
作为优选方案，所述异环磷酰胺对照品溶液的浓度为1ng/mL，杂质E对照品溶液的浓度为1ng/mL，杂质G对照品溶液的浓度为0.1ng/mL，供试品溶液的浓度为4ng/mL。
作为优选方案，所述质谱采用ESI离子源，正离子模式下以多反应监测方式(MRM)进行定量分析，所述的异环磷酰胺的定量离子为：母离子为260.75m/z，子离子为91.74m/z，碰撞能为24eV；杂质E的定量离子为：母离子为155.48m/z，子离子为62.72m/z，碰撞能为16eV；杂质G的定量离子为：母离子为274.72m/z，子离子为199.82m/z，碰撞能为10eV。
作为优选方案，所述质谱的离子源参数为：电喷雾电压(IS)为5500V，毛细管电压为3.2kV，脱溶剂气流速为700L/h，锥孔气流速为150L/h，碰撞气为氩气，碰撞气流速为0.13mL/min，离子源温度(TEM)为150℃，脱溶剂气温度为350℃
实施例1：溶液的配制及检测
(1)配制空白溶液：5％甲醇水溶液，同时作为稀释剂；
(2)对照品储备液：取异环磷酰胺IF、杂质E、杂质G对照品各10mg，精密称定，所述异环磷酰胺简称为IF，分别置于10mL棕色容量瓶中，用稀释剂稀释定容至刻度，摇匀制得浓度为1.0mg/mL异环磷酰胺对照品储备液，1.0mg/mL的杂质E对照品储备液，1.0mg/mL杂质G对照品储备液；精密量取异环磷酰胺、杂质E、杂质G对照品储备液0.1mL，置于100mL棕色容量瓶中，用稀释剂稀释定容至刻度，摇匀制得异环磷酰胺、杂质E、杂质G1000ng/mL的对照品储备液二；
(3)对照品溶液：精密量取异环磷酰胺、杂质E对照品储备液二各0.1mL、杂质G对照品储备液二0.1μL置于100mL棕色容量瓶中，用稀释剂稀释定容至刻度，摇匀制得浓度为1ng/mL的异环磷酰胺、杂质E的对照品溶液、浓度为0.01ng/mL杂质G的对照品溶液；
(4)供试品储备液：取异环磷酰胺原料药10mg，精密称定，置于10mL棕色容量瓶中，用稀释剂稀释定容至刻度，摇匀制得浓度为1.0mg/mL的供试品储备液；精密量取供试品储备液0.1mL，置于100mL棕色容量瓶中，用稀释剂稀释定容至刻度，摇匀制得1000ng/mL供试品储备液二；
(5)供试品溶液：精密量取4mL供试品储备液二置于100mL棕色容量瓶中，稀释剂稀释定容至刻度摇匀，制得异环磷酰胺40ng/mL供试品溶液。
采用液相色谱-质谱联用法对所述的空白溶液、供试品溶液、对照品溶液进行检测，记录色谱图，其色谱图分别如图1-3所示：液相色谱的色谱条件为：采用ACQUITYHSS T3(1.8μm×100mm×2.1mm)色谱柱，以5mM碳酸氢铵水溶液为流动相A，以甲醇为流动相B，梯度洗脱，流速为0.3mL/min，柱温为30℃，进样体积为10μL，其中梯度洗脱的程序如下：
0min→1.5min，5％流动相A，95％流动相B；
1.5min→8.5min，5％流动相A→55％流动相A，95％流动相B→45％流动相B；
8.5min→8.6min，55％流动相A→5％流动相A，5％流动相B→95％流动相B；
8.6min→10min，55％流动相A→5％流动相A，5％流动相B→95％流动相B。
上述质谱条件为：采用ESI离子源，正离子模式下以多反应监测方式(MRM)进行定量分析，所述的异环磷酰胺的定量离子为：母离子为260.75m/z，子离子为91.74m/z，碰撞能为24eV；杂质E的定量离子为：母离子为155.48m/z，子离子为62.72m/z，碰撞能为16eV；杂质G的定量离子为：母离子为274.72m/z，子离子为199.82m/z，碰撞能为10eV。
从图1-3可以看出，空白溶液对异环磷酰胺原料药中IF、杂质E、杂质G的检测无干扰，说明本发明提供的液相色谱-质谱联用法专属性良好，在保留时间8.40min出现杂质E色谱峰，8.56min出现异环磷酰胺色谱峰，6.47min出现杂质G色谱峰，且色谱峰分离度良好。
实施例2：检测限和定量限
检测限：将实施例1制备的1.0mg/mL的对照品储备液采用稀释剂逐级定量稀释，然后采用液相色谱-质谱联用法进行检测，液相色谱和质谱的具体条件如实施例1所述，记录谱图，按信噪比不低于3：1，得到检测限，结果见表1。
定量限：将实施例1制备的1.0mg/mL的对照品储备液采用稀释剂逐级定量稀释，然后采用液相色谱-质谱联用法进行检测，液相色谱和质谱的具体条件如实施例1所述，记录谱图，按信噪比不低于10：1，得到定量限，结果见表1。结果见表1。
表1
实施例3：线性关系
将实施例1制备的浓度为1.0mg/mL的对照品储备液，采用稀释剂稀释，分别得到浓度为1ng/mL-50ng/mL的异环磷酰胺线性溶液，1ng/mL-50ng/mL的杂质E线性溶液，0.01ng/mL-0.5ng/mL的杂质G线性溶液。
将上述制备的线性溶液采用液相色谱-质谱联用法进行检测，液相色谱和质谱的具体条件如实施例1所述，记录谱图。以各组分浓度为X轴，响应为Y轴绘制线性曲线，计算相关系数R，斜率和线性方程，结果见表2。
表2
从结果可以看出，异环磷酰胺在1ng/mL-50ng/mL的浓度范围内线性关系良好，杂质E在1ng/mL-50ng/mL的浓度范围内线性关系良好，杂质G在0.01ng/mL-0.5ng/mL的浓度范围内线性关系良好。
实施例4：准确度
异环磷酰胺、杂质E、杂质G的准确度试验以回收率(％)表示，分别取3个浓度水平的加标供试品溶液作为回收率测试样品。
对照品储备液的配制：取异环磷酰胺、杂质E、杂质G对照品各10mg，精密称定，置于10mL棕色容量瓶中，用稀释剂稀释定容至刻度，摇匀制得浓度为1.0mg/mL异环磷酰胺对照品储备液，1.0mg/mL的杂质E对照品储备液，1.0mg/mL杂质G对照品储备液；精密量取异环磷酰胺、杂质E、杂质G对照品储备液0.1mL，置于100mL棕色容量瓶中，用稀释剂稀释定容至刻度，摇匀制得异环磷酰胺、杂质E、杂质G1000ng/mL的对照品储备液二；
对照品溶液的配制：精密量取异环磷酰胺、杂质E对照品储备液二各0.1mL、杂质G对照品储备液二0.1μL置于100mL棕色容量瓶中，用稀释剂稀释定容至刻度，摇匀制得异环磷酰胺、杂质E为1ng/mL、杂质G为0.01ng/mL的对照品溶液；
100％异环磷酰胺、杂质G加标供试品溶液的配制：精密移取供试品储备液1mL，异环磷酰胺对照品储备液0.6mL、和杂质G对照品储备液二(1000ng/mL)10mL，置于100mL容量瓶中，以稀释剂稀释至刻度，摇匀。再次取上述混合溶液0.1mL，置于100mL容量瓶中，以稀释剂稀释至刻度。摇匀即得异环磷酰胺6ng/mL、杂质G 0.1ng/mL的加标供试品溶液。
100％杂质E加标供试品溶液的配制：精密移取供试品储备液1mL置于100mL容量瓶中，以稀释剂稀释至刻度，摇匀。再取稀释供试品0.1mL、杂质E储备液0.2mL，置于100mL容量瓶中，以稀释剂稀释至刻度。摇匀即得杂质E 2000ng/mL的加标供试品溶液。
按照上述100％加标供试品溶液配制方式配制低、中、高三种浓度水平的加标供试品溶液，采用液相色谱-质谱联用法进行检测，液相色谱和质谱具体条件如实施例1所述，记录色谱图，回收率结果见表3。
根据公式计算回收率：回收率(％)＝准确度溶液中实测量/理论加入量×100％
表3
从表3可以看出，异环磷酰胺回收率在90.09％-101.57％，RSD为3.04％；杂质E回收率在86.46％～102.93％范围内，RSD为6.1％；杂质G回收率在83.21％-116.15范围内，RSD为11.8％，均小于15％。由此说明本申请提供的异环磷酰胺有关物质的检测方法准确度良好。
实施例5：重复性
取同一批样品，参照实施例1所述的异环磷酰胺原料药中异环磷酰胺、杂质E、杂质G的检测方法中的提供的溶液制备方法制备6份杂质E加标供试品溶液(供试品：100ng/mL；杂质E：10ng/mL；杂质G：10ng/mL)，采用液相色谱-质谱联用法进行检测，液相色谱和质谱的具体条件如实施例1所述，结果如表4所示。
成分 RSD
异环磷酰胺 1.668
杂质E 2.05
杂质G 3.49
表4
从表4可以看出，异环磷酰胺、杂质E、杂质G重复性峰面积RSD分别为1.68％、2.05％和3.49％，均小于5.0％，结果表明本方法重复性良好。
实施例6：精密度
取实施例1所制备的对照品溶液，并采用液相色谱-质谱联用法对上述制备的对照品溶液进行检测，液相色谱和质谱的具体条件如实施例1所述，重复进样6次，每次进样10μL，检测结果见表5。
成分 RSD
异环磷酰胺 2.72
杂质E 3.4
杂质G 4.27
表5
从表5可以看出，异环磷酰胺及杂质E和杂质G的峰面积的RSD，分别为2.72％、3.4％和4.27％，结果表明仪器的精密度良好。
实施例7：稳定性
取实施例4中的杂质E加标供试品溶液，储存在2-8℃条件下，放置不同的时间后进行检测，采用液相色谱-质谱联用法对上述制备的供试品溶液和对照品溶液进行检测，液相色谱和质谱的具体条件如实施例1所述，每次进样10μL，记录谱图，考察其峰面积，计算其RSD(％)，试验结果见表6所示。
成分 RSD
异环磷酰胺 24h内RSD为8.34％
杂质E 在24h未检出，在8h内的RSD为5.93％
杂质G 在24h的RSD为28％，在8h的RSD为5.60％
表6
从表6中可以看出，杂质E加标供试品溶液在2-8℃条件下，异环磷酰胺在24h的RSD为8.34％；杂质E在24h未检出，在8h的RSD为5.93％；杂质G在24h的RSD为28％，在8h的RSD为5.60％。异环磷酰胺在24h稳定，杂质E、G在24h不稳定而在8h稳定。
实施例8：样品测定
精密称取3批次的异环磷酰胺原料药样品，按照实施例1所述的异环磷酰胺原料药中异环磷酰胺、杂质E、杂质G的检测方法中的提供的供试品制备方法制备浓度为40ng/mL的供试品溶液，每批次称2份，采用液相色谱-质谱联用法进行检测，每份样品分别进样两针，液相色谱和质谱具体条件如实施例1所述，记录色谱图，采用标准曲线法计算异环磷酰胺及杂质E和G的含量，结果如表7、表8所示。从表7、表8中可以看出，原料药中的异环磷酰胺含量为97.06～98.45％，杂质E均未检出，杂质G在其中一批次检出量为0.00925％，杂质E和G未超千分之一限度：
表7
表8
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。

Claims (5)

1.一种异环磷酰胺原料药中异环磷酰胺、杂质E、杂质G的检测方法，其特征在于：所述检测方法是采用液相色谱-质谱联用法进行检测，所述异环磷酰胺、杂质E、杂质G结构分别如式I、II、III所示：
；
所述液相色谱条件为：采用T3色谱柱，以5mM碳酸氢铵水溶液为流动相A，以甲醇为
流动相B，梯度洗脱，所述的梯度洗脱的程序如下： 0min→1.5min，5%流动相A，95%流动相B；1.5min→8.5min，5%流动相A→55%流动相A，95%流动相B→45%流动相B；8.5min→8.6min，55%流动相A→5%流动相A，5%流动相B→95%流动相B；8.6min→10min，55%流动相A→5%流动相A，5%流动相B→95%流动相B；
所述质谱采用ESI离子源，正离子模式下以多反应监测方式（MRM）进行定量分析，所
述质谱的离子源参数为：电喷雾电压（IS）为5500V，毛细管电压为3.2kV，脱溶剂气流速为700L/h，锥孔气流速为150L/h，碰撞气为氩气，碰撞气流速为0.13mL/min，离子源温度（TEM）为150℃，脱溶剂气温度为350℃；
所述异环磷酰胺的检测限为0.005μg/mL，杂质E的检测限为0.125μg/mL，杂质G的检测限为0.002μg/mL。
2.根据权利要求1所述的一种异环磷酰胺原料药中异环磷酰胺、杂质E、杂质G的检测方法，其特征在于：所述检测步骤如下：
（1）溶液的配制：包括空白溶液、对照品储备液、对照品溶液、供试品储备液、供试品溶液，其中：
空白溶液：5%甲醇水溶液，作为稀释剂；
对照品储备液：精密称定异环磷酰胺、杂质E、杂质G对照品，分别置于10mL棕色容量瓶中，用稀释剂稀释定容至刻度，摇匀制得浓度均为1.0mg/mL的异环磷酰胺、杂质E、杂质G对照品储备液；
对照品溶液：精密量取异环磷酰胺、杂质E、杂质G对照品储备液，置于100mL棕色容量瓶中，用稀释剂稀释定容至刻度，摇匀制得浓度为1ng/mL的异环磷酰胺、浓度为1ng/mL杂质E、浓度为0.01ng/mL杂质G对照品溶液；
供试品储备液：取异环磷酰胺原料药，精密称定，置于10mL棕色容量瓶中，用稀释剂稀释定容至刻度，摇匀制得浓度为1.0mg/mL供试品储备液；
供试品溶液：精密量取供试品储备液，置于100mL棕色容量瓶中，用稀释剂稀释定容至刻度，摇匀制得浓度为40ng/mL供试品溶液；
（2）采用液相色谱-质谱联用法对所述的空白溶液、供试品溶液、对照品溶液进行检测，所述液相色谱条件为：采用T3色谱柱，以5mM碳酸氢铵水溶液为流动相A，以甲醇为流动相B，梯度洗脱，所述的梯度洗脱的程序如下：0min→1.5min，5%流动相A，95%流动相B；1.5min→8.5min，5%流动相A→55%流动相A，95%流动相B→45%流动相B；8.5min→8.6min，55%流动相A→5%流动相A，5%流动相B→95%流动相B；8.6min→10min，55%流动相A→5%流动相A，5%流动相B→95%流动相B。
3. 根据权利要求2所述的一种异环磷酰胺原料药中异环磷酰胺、杂质E、杂质G的检测方法，其特征在于：所述的色谱柱的型号为ACQUITY UPLC® HSS T3，规格为1.8µm×100mm×2.1mm，流速为0.2mL/min-0.3mL/min，柱温为30℃-40℃，进样体积为10μL。
4.根据权利要求2所述的一种异环磷酰胺原料药中异环磷酰胺、杂质E、杂质G的检测方法，其特征在于：所述质谱采用ESI离子源，正离子模式下以多反应监测方式（MRM）进行定量分析，所述的异环磷酰胺的定量离子为：母离子为260.75m/z，子离子为91.74m/z，碰撞能为24eV；杂质E的定量离子为：母离子为155.48m/z，子离子为62.72m/z，碰撞能为16eV；杂质G的定量离子为：母离子为274.72m/z，子离子为199.82m/z，碰撞能为10eV。
5.根据权利要求4所述的一种异环磷酰胺原料药中异环磷酰胺、杂质E、杂质G的检测方法，其特征在于：所述质谱的离子源参数为：电喷雾电压IS为5500V，毛细管电压为3.2kV，脱溶剂气流速为700L/h，锥孔气流速为150L/h，碰撞气为氩气，碰撞气流速为0.13mL/min，离子源温度TEM为150℃，脱溶剂气温度为350℃。
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