CN112557569B - 一种利多卡因中有关物质的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种利多卡因中有关物质的检测方法，针对杂质B在高比例的有机相中会产生溶剂效应，而利多卡因在低比例的有机相中溶解困难的问题，通过对溶剂中有机相的调整和优化，确定以体积比为70:30的磷酸氢二钠溶液(用磷酸调节其pH值至8.0)和乙腈混合后得到的混合溶液作为溶剂，提高了待测样品的稳定性和排除溶剂效应带来的干扰；在确保利多卡因及12种有关物质完全溶解的情况下，保证灵敏度高、特异性强、重现性好，对杂质分离效果好，检测能力高，能够准确的分离已知及相关未知杂质，满足利多卡因及12种有关物质的检测要求，可用于利多卡因的质量控制。
Description
技术领域
本发明属于药物分析方法技术领域，具体涉及一种利多卡因中有关物质的检测方法。
背景技术
利多卡因是医用临床常用的局部麻药，1963年用于治疗心率失常，是目前防治急性心肌梗死及各种心脏病并发快速室性心律失常药物，是急性心肌梗死的室性早搏，室性心动过速及室性震颤的首选药。
为了保证药物的安全有效，需要对药物中的有关物质进行研究、检测和监控。有关物质主要为工艺副产物及降解产物，药品在放置过程中，杂质在发生变化，因此，需要根据不同的合成路线和生产工艺、贮藏条件建立合适的分析方法，达到对利多卡因有关物质准确、有效的检测和监控。
发明内容
本发明的目的是在现有技术的基础上，提供一种利多卡因中有关物质的检测方法。
本发明的技术方案如下：
一种利多卡因有关物质的检测方法，该检测方法采用高效液相色谱对利多卡因及有关物质进行定量检测，其高效液相色谱条件包括：采用流动相A和流动相B为混合流动相进行梯度洗脱，其中，流动相A由体积比为80～90:20～10的磷酸氢二钠溶液和乙腈组成，流动相B由体积比为25～35:65～75的磷酸氢二钠溶液和乙腈组成；所述梯度洗脱过程中流动相A和流动相B的初始比例为95:5；(1)在0-10分钟内，流动相A和流动相B的体积比保持95:5不变；(2)在10-40分钟内，流动相A和流动相B的体积比由初始比例匀速渐变至40:60；(3)在40-55分钟内，流动相A和流动相B的体积比保持40:60不变；(4)在55-56分钟内，流动相A和流动相B的体积比由40:60匀速渐变至95:5；(5)在56-60分钟内，流动相A和流动相B的体积比保持95:5不变。具体的梯度洗脱过程如下所示：
本发明的检测方法可用于检测利多卡因原料药、利多卡因凝胶贴膏中的利多卡因及有关物质。
本发明采用高效液相色谱法检测时，采用流动相A(由磷酸氢二钠溶液和乙腈组成，其体积比为80～90:20～10)与流动相B(由磷酸氢二钠溶液和乙腈组成，其体积比为25～35:65～75)作为混合流动相进行梯度洗脱。
在一种优选方案中，流动相A中磷酸氢二钠溶液与乙腈的体积比为85:15；流动相B中磷酸氢二钠溶液与乙腈的体积比为30:70。
在不影响本发明效果的情况下，流动相A和流动相B中，磷酸氢二钠溶液中磷酸氢二钠的浓度为0.005mol/L～0.015mol/L，用磷酸调节其pH值至8.0；优选地，磷酸氢二钠溶液中磷酸氢二钠的浓度为0.01mol/L，用磷酸调节其pH值至8.0。
在一种优选方案中，本发明中提到的流动相A的制备可包括以下步骤：将磷酸二氢钠以水溶解并稀释成浓度为0.01mol/L的缓冲液(用磷酸调节其pH值至8.0)850ml与乙腈150ml混匀，即可。
在一种优选方案中，本发明中提到的流动相B的制备可包括以下步骤：将磷酸二氢钠以水溶解并稀释成浓度为0.01mol/L的缓冲液(用磷酸调节其pH值至8.0)300ml与乙腈700ml混匀，即可。
本发明溶解待测样品(利多卡因及有关物质)采用的溶剂为由体积比为70:30的磷酸氢二钠溶液和乙腈混合而成，所述磷酸氢二钠溶液中磷酸氢二钠的浓度为0.01mmol//L，用磷酸调节其pH值至8.0。例如，溶剂为0.01mmol//L磷酸氢二钠溶液(用磷酸调节其pH值至8.0)700ml与乙腈300ml混匀，即可。
本发明采用高效液相色谱法检测时，色谱柱采用Xtimate C18，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂。在不影响检测效果的情况下，优选色谱柱的长度为150mm，直径为3.9mm，填料粒径为5μm。例如：Xtimate C18(3.9×150mm 5μm)。
进一步的，高效液相色谱条件包括：检测波长为228nm～232nm，优选230nm。
进一步的，柱温为25℃～35℃，优选为30℃。
进一步的，流速为0.8～1.5ml/min，优选为1.0ml/min。
本发明可以根据需要，选择合适的进样量进样，进样量为10～50μl；优选20μl。例如：进样量为10μl、20μl或50μl。
本发明提及的利多卡因有关物质，包括以下物质：杂质A：2,6-二甲基苯胺；杂质B：2-二乙基叠氮酰基-N-(2,6-二甲基苯基)乙酰胺；杂质C：N-(2,6-二甲基苯基)乙酰胺；杂质D：N-(2,5-二甲基苯基)-2-乙氨基乙酰胺；杂质E：2,2'-亚氨基双(N-(2,6-二甲苯基)乙酰胺；杂质F：2-(二乙氨基)-N-(2,3-二甲基苯基)乙酰胺；杂质G：N-(2,6-二甲基苯基)-2-[(1-甲基乙基)氨基]乙酰胺；杂质H：2-氯-N-(2,6-二甲基苯基)乙酰胺；杂质I：2-(二乙氨基)-N-(2,4-二甲基苯基)乙酰胺；杂质J：2-(二乙氨基)-N-(2,5-二甲基苯基)乙酰胺；杂质K：N-(2,6-二甲基苯基)-2-(乙基甲基氨基)乙酰胺；杂质L：2-氯-N-(2,4-二甲基苯基)乙酰胺。具体如下所示：
本发明采用高效液相色谱法，分别从色谱条件等方面进行筛选、优化，拟定有关物质的检测方法，进行方法学验证，对杂质A、杂质B、杂质C、杂质D、杂质E、杂质F、杂质G、杂质H、杂质I、杂质J、杂质K、杂质L进行了定量研究，并提供完整的验证方案，操作简单，稳定性和重现性良好。其中，杂质的校正因子为：杂质A为0.4、杂质B为1.2、杂质C为1.2、杂质D为1.2、杂质E为1.0、杂质F为0.7、杂质G为1.5、杂质H为1.1、杂质I为0.6、杂质J为0.7、杂质K为1.3、杂质L为0.6。
本发明提供的检测方法可以包括以下步骤：分别配制混合杂质定位溶液、供试品溶液、对照溶液并进样，通过加校正因子的主成分自身对照法进行杂质含量检测。
本发明采用高效液相色谱法，可以配制如下样品溶液：
供试品溶液：取本品利多卡因适量，精密称定，加溶剂溶解并定量稀释制成每1ml中约含5mg利多卡因的溶液。
对照品溶液：0.1％供试品溶液。
混合杂质定位溶液：精密称取杂质A约5ml置50ml量瓶中，加溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀，备用。精密称取杂质B、杂质C、杂质D、杂质E、杂质F、杂质G、杂质H、杂质I、杂质J、杂质K、杂质L各约1mg，分别置10ml量瓶中，加溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀，作为各杂质储备液。精密量取杂质A储备液0.25ml、杂质B～杂质L储备液2.5ml、供试品溶液50μl置同一50ml量瓶中，用溶剂稀释至刻度，摇匀，备用。
其中，溶剂由0.01mmol//L磷酸氢二钠溶液(用磷酸调节其pH值至8.0)700ml与乙腈300ml混匀，即可。
本发明通过筛选合适的流动相并优化流动相中各组分比例，选择合适的供试品溶剂、杂质定位用溶剂，筛选合适的其他色谱条件，对利多卡因及有关杂质进行色谱分析，确定了本发明的分析方法，进行了专属性(杂质与主成分分离度实验、强制降解实验)、重复性、精密度、准确的、线性范围、校正因子、耐用性验证，确证方法的可行性。
采用本发明的技术方案，优势如下:
本发明提供的利多卡因中有关物质的检测方法，针对杂质B在高比例的有机相中会产生溶剂效应，而利多卡因在低比例的有机相中溶解困难的问题，通过对溶剂中有机相的调整和优化，确定以体积比为70:30的磷酸氢二钠溶液(用磷酸调节其pH值至8.0)和乙腈混合后得到的混合溶液作为溶剂，提高了待测样品的稳定性和排除溶剂效应带来的干扰；在确保利多卡因及12种有关物质完全溶解的情况下，保证灵敏度高、特异性强、重现性好，对杂质分离效果好，检测能力高，能够准确的分离已知及相关未知杂质，满足利多卡因及12种有关物质的检测要求，可用于利多卡因的质量控制。
附图说明
图1是实施例1中混合杂质定位溶液色谱图；
图2是实施例1中供试品溶液色谱图；
图3是对比例1中混合杂质定位溶液色谱图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
色谱条件建立
1色谱条件筛选
基于上述原因，对有关物质的检测方法进行了优化，包括方法的梯度洗脱程序、溶剂、波长、进样量等的筛选考察，具体内容如下：
1.1流动相与梯度的选择
供试品溶液：取本品利多卡因适量，精密称定，加溶剂[0.01mmol/L磷酸氢二钠溶液(用磷酸调节其pH值至8.0)-乙腈(体积比为70:30)下同]溶解并定量稀释制成每1ml中约含5mg利多卡因的溶液。
杂质储备液：精密称取杂质A约5ml置50ml量瓶中，加溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀，备用。精密称取杂质B、杂质C、杂质D、杂质E、杂质F、杂质G、杂质H、杂质I、杂质J、杂质K、杂质L各约1mg，分别置5ml量瓶中，加溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀，作为各杂质储备液。
混合杂质溶液：精密量取杂质A储备液0.25ml、供试品溶液50μl、杂质B～杂质L储备液各2.5ml置同一50ml量瓶中，用溶剂稀释至刻度，摇匀备用。
色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相，检测波长为230nm，柱温30℃，进样量为20μl，由等度改为梯度，调整杂质出峰时间，取混合杂质溶液按表1进行条件筛选。
表1 流动相体系与梯度的选择
结论：由上述实验结果可见，序号6的流动相体系与梯度分离情况及梯度干扰情况较好，故拟定流动相体系流动相A：0.01mol/L磷酸氢二钠溶液(用磷酸调节其pH值至8.0)-乙腈(体积比为85:15)；流动相B：0.01mol/L磷酸氢二钠溶液(用磷酸调节其pH值至8.0)-乙腈(体积比为30:70)。按下表进行梯度洗脱：
1.2柱温的选择
考察柱温对整个检测方法的影响，照上述序号6中拟定的流动相体系与梯度，检测波长为230nm，柱温为35℃。取混合杂质溶液20μl注入液相色谱仪。
表2 柱温的选择
结论：由上述实验结果可见，随着柱温升高，最小分离度由2.70变为1.77，柱温升高影响杂质分离，色谱条件中柱温为30℃时各杂质分离更好，拟定柱温为30℃。
1.3溶剂的选择
照上述拟定的有关物质的检测方法，对样品及杂质对照品中采用的溶剂进行考察。
色谱条件：色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(Xtimate C18，3.9×150mm，5μm)；
流动相A：0.01mol/L磷酸氢二钠溶液(用磷酸调节其pH值至8.0)-乙腈(体积比为85:15)；
流动相B：0.01mol/L磷酸氢二钠溶液(用磷酸调节其pH值至8.0)-乙腈(体积比为30:70)；
具体梯度过程如下：
检测波长：230nm；流速：1.0ml/min；进样量：20μl；柱温：30℃；
杂质B溶液1：取上述“1.1”中杂质B储备液0.5ml置10ml量瓶中，加溶剂1(0.01mol/L磷酸氢二钠溶液(磷酸调节pH值至8.0)-乙腈(体积比为85:15))稀释置刻度，备用。
杂质B溶液2：取上述“1.1”中杂质B储备液0.5ml置10ml量瓶中，加溶剂2(0.01mol/L磷酸氢二钠溶液(磷酸调节pH值至8.0)-乙腈(体积比为30:70))稀释置刻度，备用。
杂质B溶液3：取上述“1.1”中杂质B储备液0.5ml置10ml量瓶中，加溶剂3(0.01mol/L磷酸氢二钠溶液(磷酸调节pH值至8.0)-乙腈(体积比为70:30))稀释置刻度，备用。
取上述各杂质B溶液20μl注入液相色谱仪，考察溶剂对杂质峰形的影响，见表3。
表3 溶剂的选择
结论：由上述实验结果可见，当溶剂中有机相比例超过30％时，杂质B出现溶剂效应，由于利多卡因易溶于有机溶剂，当有机溶剂比例为15％时，供试品溶解困难，故选择溶剂为0.01mol/L磷酸氢二钠溶液(用磷酸调节其pH值至8.0)-乙腈(体积比为70:30)的混合溶剂。
1.4波长的选择
供试品溶液：取本品利多卡因适量，精密称定，加溶剂[0.01mmol/L磷酸氢二钠溶液(用磷酸调节其pH值至8.0)-乙腈(体积比为70:30)下同]溶解并定量稀释制成每1ml中约含5mg利多卡因的溶液。
杂质储备液：精密称取杂质A约5ml置50ml量瓶中，加溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀，备用。精密称取杂质B、杂质C、杂质D、杂质E、杂质F、杂质G、杂质H、杂质I、杂质J、杂质K、杂质L各约1mg，分别置5ml量瓶中，加溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀，作为各杂质储备液。
混合杂质溶液：精密量取杂质A储备液0.25ml、供试品溶液50μl、杂质B～杂质L储备液各2.5ml置同一50ml量瓶中，用溶剂稀释至刻度，摇匀备用。
使用二极管阵列检测器进行各杂质全波长扫描，波长统计见表4。
表4 已知杂质最大吸收波长统计
结论：由上述实验结果可见，杂质A在230nm处有最大吸收，利多卡因及其他杂质均在210nm处存在最大吸收，由于杂质A限度最低为0.01％，为了使得上述杂质在一个有关物质体系中检测，考虑使用杂质A最大吸收作为检测波长，提高杂质A检测灵敏度，并结合EP9.0记载的利多卡因与中国药典2015年版记载的盐酸利多卡因有关物质检测波长均为230nm，将检测波长拟定为230nm。
实施例：一种利多卡因片有关物质的HPLC检测方法
一、实验材料与仪器
1.药品及试剂：如表5所示。
表5 药品及试剂
2.仪器：具体仪器的名称和规格，如表6所示。
表6 仪器的名称及规格
| 名称 | 厂家 |
| Agilent高效液相色谱仪 | 安捷伦科技有限公司 |
| AUW120D分析天平(十万分之一) | 日本岛津公司 |
| XPE204分析天平(万分之一) | 梅特勒-托利多仪器有限公司 |
| XP6分析天平(百万分之一) | 梅特勒-托利多仪器有限公司 |
| PHS-3C酸度计 | 上海雷磁仪器厂 |
| 电热鼓风干燥箱 | 上海博讯实业 |
| 药品强光照射试验箱 | 永生仪器 |
二、液相色谱条件
色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶柱，型号为：Xtimate C18(3.9×150mm 5μm)，流动相A：0.01mol/L磷酸氢二钠溶液(用磷酸调节其pH值至8.0)-乙腈(体积比为85:15)；流动相B：0.01mol/L磷酸氢二钠溶液(用磷酸调节其pH值至8.0)-乙腈(体积比为30:70)；梯度洗脱，流速为1.0ml/min，检测波长为230nm，柱温30℃，进样量20μl。
流动相A和流动相B的初始比例为95:5；(1)在0-10分钟内，流动相A和流动相B的体积比保持95:5不变；(2)在10-40分钟内，流动相A和流动相B的体积比由初始比例匀速渐变至40:60；(3)在40-55分钟内，流动相A和流动相B的体积比保持40:60不变；(4)在55-56分钟内，流动相A和流动相B的体积比由40:60匀速渐变至95:5；(5)在56-60分钟内，流动相A和流动相B的体积比保持95:5不变
样品溶液的配制：
取本品利多卡因适量，精密称定，加溶剂[0.01mmol/L磷酸氢二钠溶液(用磷酸调节其pH值至8.0)-乙腈(体积比为70:30)]溶解并定量稀释制成每1ml中约含5mg利多卡因的溶液。
对照品溶液：0.1％供试品溶液。
三、实验过程
1.方法学验证
1.1系统适用性、专属性试验
1.1.1空白干扰及分离试验
精密量取上述“波长选择”项下混合杂质溶液、供试品溶液和空白溶剂各20μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，考察出峰情况，结果见表7、图1和图2。
表7 利多卡因有关物质测定系统适用性试验结果
注：“/”表示无数据。
结论：由上表可见，空白溶剂不干扰样品及杂质出峰，各杂质与主成分、杂质与杂质之间分离情况良好，分离度均大于1.5，各峰理论板数均大于2000。
本发明由图1可见，较对比例1中图3的等度洗脱的得到的色谱图，各杂质分离情况良好，能够准确检测各已知杂质，且出峰均处在基线平稳处，检测灵敏度高。
1.1.2强制降解试验
取本品(批号：Z202001001)适量，分别进行酸、碱、氧化、高温、光照破坏，用上述拟定色谱条件及二极管阵列检测器(DAD)检查降解产物，并测试主峰和已知杂质的峰纯度，结果见表8～表10。
表8 强制降解破坏方法
注：上述破坏溶液均为高浓度样品溶液，各条件下取0.6ml置10ml量瓶，加溶剂稀释至刻度，摇匀，作为各条件下的稀释溶剂，作为考察主成分纯度的样品溶液。
表9 各破坏试验下供试品溶液中杂质情况
表10 各破坏试验物料平衡情况
结论：由上述试验结果可看出：本品在光照、酸、碱、高温条件下比较稳定，在氧化条件下不稳定，其降解产物均可被检出；各破坏条件下主峰与杂质分离情况良好，分离度均大于1.5，主峰纯度均大于980；主成分理论板数均大于2000；物料平衡在0.9～1.1范围内。
1.2线性与范围试验
上述“波长选择”项下混合杂质溶液、供试品溶液。
线性溶液：精密量取混合杂质储备液2.5ml、4ml、5ml、6ml、7.5ml分别置10ml、10ml、10ml、10ml、10ml，作为杂质线性50％、80％、100％、120％、150％的溶液。
设进样浓度(μg/ml)为横坐标(X轴)，峰面积为纵坐标(Y轴)，利多卡因及杂质的线性范围及线性方程见表11。
表11 利多卡因及各杂质的线性范围及线性方程
结论：由上述试验结果可看出：利多卡因及各个杂质在一定范围内均呈良好的线性，各线性回归系数均大于0.999，Y轴截距偏差均在25％以内。
1.3校正因子试验
取杂质(杂质A、B、C、D、E、F、G、H、I、J、K、L)对照品及利多卡因对照品，同线性项下的配制方法，在限度浓度的50％～200％内共制备5份样品，以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，进行线性回归并求出各杂质的标准曲线和利多卡因的标准曲线；
采用利多卡因的标准曲线斜率与杂质的标准曲线斜率之比，即为校正因子。采用不同时间、和不同仪器进行测定。测定结果见表12。
表12 杂质校正因子的测定
小结：由表可见杂质E与杂质H校正因子在0.9-1.1之间，均以1计，杂质A、杂质B、杂质C、杂质D、杂质F、杂质G、杂质I、杂质J、杂质K、杂质L的校正因子分别为0.4、1.2、1.2、1.2、0.7、1.5、0.6、0.7、1.3、0.6。
1.4检测限与定量限试验
取线性与范围试验项下混合杂质溶液逐步稀释后进样20μl，以信噪比S/N＝3、S/N＝10分别作为检测限和定量限，结果见表13～14。
表13 检测限、定量限数据总结
表14 定量限进样精密度数据总结
结论：从上述实验结果可以看出，在本品有关物质浓度及色谱条件下，主成分及各已知杂质的定量限均在检测浓度的0.05％(0.5μg/ml)以下，检测限均在检测浓度的0.015％以下，方法的灵敏度良好，供试品溶液浓度选择合理，采用上述色谱条件可有效地检出上述各杂质。定量限6次进样峰面积RSD＜25.0％，精密度良好。
1.5精密度试验
1.5.1重复性试验
取利多卡因(批号：Z202001001)约10mg，置20ml量瓶中，加溶剂[0.01mmol/L磷酸氢二钠溶液(用磷酸调节其pH值至8.0)-乙腈(体积比为70:30)下同]溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液；精密量取1ml供试品溶液置100ml量瓶加水稀释至刻度，摇匀，量取1ml置10ml量瓶，加水稀释至刻度，摇匀，作为自身对照溶液。
上述“波长选择”项下混合杂质溶液。
平行配制六份供试品溶液及自身对照溶液；精密量取上述供试品溶液与自身对照溶液以及杂质对照品溶液20μl分别注入液相色谱仪，分别按加校正因子的自身对照法、外标法以峰面积计算本品有关物质含量，对比计算方式对结果的影响，已知杂质对比测定结果，加校正因子自身对照计算本品的重复性结果见表15～16。
表15 重复性计算方式结果对比(加校正因子的自身对照法、外标法)
表16 重复性检测结果(加校正因子的自身对照法)
注：“/”表示无数据；
结论：从上述实验结果可以看出，①6份供试品溶液通过杂质外标与加校正因子的自身对照法计算的结果基本一致，杂质B检出量均为0.001％；杂质D检出量均为0.002％；杂质H检出量为0.001％～0.002％范围内，RSD为33.37％＜40％；杂质I检出量为0.008％～0.009％范围内，RSD为6.15％＜40％；②通过加校正因子的自身对照法测得的6份供试品溶液结果基本一致，杂质B检出量均为0.001％；杂质D检出量均为0.002％；杂质H检出量均为0.001％；杂质I检出量均为0.008％；最大单杂检出量均为0.005％～0.006％范围内，RSD为9.96％＜40％；总杂检出量在0.028％～0.030％范围内，RSD为2.85％＜40％；表明本品有关物质检测方法重复性良好。
1.5.2中间精密度试验
取本品(批号：Z202001001)，照重复性试验项下方法，由不同分析人员使用不同的仪器在不同时间进行检测，结果见表17。
表17 利多卡因有关物质中间精密度试验结果
注：仪器A编号为100146A；仪器B编号为100156A；日期1为2020.07.03；日期2为2020.07.09；
结论：以上结果表明，由不同分析人员使用不同的仪器在不同时间进行检测，杂质B检出量均为0.001％，杂质D检出量均为0.002％，杂质H检出量均为0.001％，杂质I检出量在0.007％～0.008％范围内波动，RSD为9.50％＜40％；最大单杂检出量在0.005％～0.006％范围内波动，RSD为9.90％＜40％。本方法重复性、中间精密度均良好。
1.5.3进样精密度试验
取重复性项下的对照品溶液20μl进样6次，考察进样精密度，结果见表18。
表18 利多卡因及各杂质对照品进样精密度考察结果(以峰面积计)
结论：从上述实验结果可以看出，各杂质对照品溶液的进样精密度RSD均小于2.0％，进样精密度良好。
1.6准确度试验
杂质A储备液：取杂质A约5ml，精密称定，置于一50ml量瓶中，加溶剂[0.01mmol/L磷酸氢二钠溶液(用磷酸调节其pH值至8.0)-乙腈(体积比为70:30)下同]溶解并稀释至刻度，摇匀，备用。
(平行两份)
杂质B～杂质L储备液：分别取杂质B、杂质C、杂质D、杂质E、杂质F、杂质G、杂质H、杂质I、杂质J、杂质K、杂质L各约1mg，分别置5ml量瓶中，加溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀，备用。
(每个杂质平行两份)
利多卡因对照品储备液：取利多卡因对照品约1mg，精密称定，置于一5ml量瓶中，加溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀，备用。(平行两份：利多卡因1、利多卡因2)
混合储备液(限度200％)：取杂质A储备液1ml、杂质B至杂质L与利多卡因对照品储备液各2.5ml，置同一50ml量瓶中，加溶剂稀释至刻度，摇匀。
杂质对照品溶液的配制：精密量取5ml混合储备液置10ml量瓶中，加溶剂稀释至刻度，摇匀作为杂质对照品溶液；
本底溶液配制：精密称取利多卡因原料约50mg至10ml量瓶中，加溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀。
回收率溶液(80％)配制：精密称取利多卡因原料50mg置10ml量瓶中，精密加入4ml混合储备液，再加入溶剂溶解稀释至刻度，摇匀，即得。(平行3份)
回收率溶液(100％)配制：精密称取利多卡因原料50mg置10ml量瓶中，精密加入5ml混合储备液，再加入溶剂溶解稀释至刻度，摇匀，即得。(平行3份)
回收率溶液(120％)配制：精密称取利多卡因原料50mg置10ml量瓶中，精密加入6ml混合储备液，再加入溶剂溶解稀释至刻度，摇匀，即得。(平行3份)
取上述对照品溶液、本底溶液、回收率样品溶液各20μl注入液相色谱仪，进行回收率测定，结果统计见表19～30。
表19 利多卡因杂质A片有关物质准确度试验结果
表20 利多卡因杂质B片有关物质准确度试验结果
表21 利多卡因杂质C片有关物质准确度试验结果
表22 利多卡因杂质D片有关物质准确度试验结果
表23 利多卡因杂质E片有关物质准确度试验结果
表24 利多卡因杂质F片有关物质准确度试验结果
表25 利多卡因杂质G片有关物质准确度试验结果
表26 利多卡因杂质H片有关物质准确度试验结果
表27 利多卡因杂质I片有关物质准确度试验结果
表28 利多卡因杂质J片有关物质准确度试验结果
表29 利多卡因杂质K片有关物质准确度试验结果
表30 利多卡因杂质L片有关物质准确度试验结果
结论：从上述实验结果可以看出，杂质A回收在100.5％～101.4％范围内，平均回收率为101.0％，9个回收率数据RSD为0.48％＜2.0％；杂质B回收在102.3％～103.8％范围内，平均回收率为103.0％，9个回收率数据RSD为0.73％＜2.0％；杂质C回收在100.6％～101.3％范围内，平均回收率为101.0％，9个回收率数据RSD为0.32％＜2.0％；杂质D回收在99.3％～100.1％范围内，平均回收率为99.7％，9个回收率数据RSD为0.40％＜2.0％；杂质E回收在99.9％～100.4％范围内，平均回收率为100.2％，9个回收率数据RSD为0.29％＜2.0％；杂质F回收在101.8％～102.9％范围内，平均回收率为102.2％，9个回收率数据RSD为0.61％＜2.0％；杂质G回收在101.2％～101.8％范围内，平均回收率为101.5％，9个回收率数据RSD为0.32％＜2.0％；杂质H回收在100.7％～101.2％范围内，平均回收率为101.0％，9个回收率数据RSD为0.29％＜2.0％；杂质I回收在97.6％～98.7％范围内，平均回收率为98.1％，9个回收率数据RSD为0.37％＜2.0％；杂质J回收在98.2％～98.7％范围内，平均回收率为98.4％，9个回收率数据RSD为0.31％＜2.0％；杂质K回收在101.1％～101.7％范围内，平均回收率为101.4％，9个回收率数据RSD为0.27％＜2.0％；杂质L回收在100.9％～101.3％范围内，平均回收率为101.1％，9个回收率数据RSD为0.21％＜2.0％；限度为0.01％的回收率在85％～110％范围内，限度为0.1％的回收率在90％～108％范围内，符合验证要求。
1.7耐用性试验
为考察本发明的检测方法对条件发生微小变化的耐受程度，取杂质定位溶液和利多卡因供试品溶液及其自身对照溶液，进行了耐用性试验，考察因素包括流动相不同比例(流动相B为3％～5％)、色谱柱柱温(30±5℃)、流动相pH值(7.8～8.2)、检测波长(228nm～232nm)、流速(0.9～1.1ml/min)、不同色谱柱。考察各杂质量检出情况。
杂质定位溶液：取准确度项下的杂质对照品溶液。
供试品及对照溶液：精密称取利多卡因原料约50mg至10ml量瓶中，加溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液；精密量取上述供试品溶液适量，加溶剂稀释制成每1ml含有利多卡因约为0.5μg的溶液，作为对照溶液。
1.7.1混合流动相中流动相B初始有机相比例的变化
分别考察了混合流动相中流动相B初始比例为3％、5％、7％的条件下的耐用性，测定结果见表31。
表31 耐用性考察(流动相初始有机相比例)
注：拟定条件采用重复性1的数据(下同)。
结论：从上述实验结果可以看出，混合流动相中流动相B的比例在3％～7％范围内变化时，杂质检出情况基本一致，说明流动相初始比例对检测无明显影响。
1.7.2柱温的变化
分别考察柱温为25℃、30℃、35℃的变化，测定结果见表32。
表32 耐用性考察(柱温)
结论：从上述实验结果可以看出，柱温在25℃～35℃范围内变化时，杂质检出情况基本一致，说明柱温对检测无明显影响。
1.7.3流动相pH的变化
分别考察流动相pH值为7.8、8.0、8.2的变化，测定结果见表33。
表33 耐用性考察(流动相pH)
结论：从上述实验结果可以看出，流动相pH值在7.8～8.2范围内变化时，杂质检出情况基本一致，说明柱温对检测无明显影响。
1.7.4检测波长的变化
分别考察检测波长在228nm、230nm、232nm的变化，测定结果见表34。
表34 耐用性考察(检测波长)
结论：从上述实验结果可以看出，检测波长在228nm～232nm范围内变化时，杂质检出情况基本一致，说明柱温对检测无明显影响。
1.7.5流速的变化
分别考察流速在0.9ml/min、1ml/min、1.1ml/min的变化，测定结果见表35。
表35 耐用性考察(流速)
结论：从上述实验结果可以看出，流速在0.9ml/min～1.1ml/min范围内变化时，杂质检出情况基本一致，说明柱温对检测无明显影响。
1.7.6更换不同序列号的色谱柱
分别考察了同一色谱柱，不同序列号对本品的检测情况，检测结果见表36。
表36 耐用性考察(色谱柱)
注：柱1为Xtimate C18(3.9×150mm，5μm)，S/N：6020901302；柱2为Xtimate C18(3.9×150mm，5μm)；S/N：60209900519
结论：从上述实验结果可以看出，杂质检出情况基本一致，说明同一色谱柱，不同序列号对检测无明显影响。
对比例1
EP9.0记载的有关物质方法，色谱条件如下：
色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶为固定相。(UItimate XB-C18 3.9×150mm，5μm)
流动相：流动相A为：4.85g/l磷酸二氢钾溶液(氢氧化钠溶液调节其pH值至8.0)；流动相B为乙腈；以流动相A和流动相B的体积比为70:30作为混合流动相进行等度洗脱。
检测波长：230nm。柱温：30℃。进样量：20μl。
杂质储备液：精密称取杂质A约5ml置50ml量瓶中，加混合流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，备用。精密称取杂质B、杂质C、杂质E、杂质F、杂质G、杂质H、杂质K、杂质L各约1mg，分别置10ml量瓶中，加混合流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，作为各杂质储备液。
供试品溶液：精密称取利多卡因(批号：Z202001001)约250mg置50ml量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，备用。
混合杂质溶液：精密量取杂质A储备液0.25ml、利多卡因供试品溶液50μl、杂质B～杂质L储备液各2.5ml置同一50ml量瓶中，用溶剂稀释至刻度，摇匀备用。
采用本对比例的检测方法测定混合杂质定位溶液，色谱图如图3所示，等度情况下检测的杂质个数为10个，有2个杂质未峰出，并且杂质出峰时间过早，存在溶剂效应或死体积干扰，对杂质分离效果差，检测时间过长。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明保护范围之内。
Claims (5)
1.一种利多卡因中有关物质的检测方法，其特征在于，所述检测方法采用高效液相色谱对利多卡因及有关物质进行定量检测，其高效液相色谱条件包括：色谱柱为XtimateC18，色谱柱的长度为150mm，直径为3.9mm，填料粒径为5μm；检测器的检测波长为228nm~232nm；柱温为25~35℃；进样量为10~50μl；流速为0.8~1.5ml/min；采用流动相A和流动相B为混合流动相进行梯度洗脱，所述流动相A由体积比为85:15的磷酸氢二钠溶液和乙腈组成，所述流动相B由体积比为30:70的磷酸氢二钠溶液和乙腈组成，所述磷酸氢二钠溶液中磷酸氢二钠的浓度为0.01mol/L，用磷酸调节其pH值至8.0；所述梯度洗脱过程中流动相A和流动相B的初始比例为95:5；所述梯度洗脱包括以下步骤：（1）在0-10分钟内，流动相A和流动相B的体积比保持初始比例不变；（2）在10-40分钟内，流动相A和流动相B的体积比由初始比例匀速渐变至40:60；（3）在40-55分钟内，流动相A和流动相B的体积比保持40:60不变；（4）在55-56分钟内，流动相A和流动相B的体积比由40:60匀速渐变至95:5；（5）在56-60分钟内，流动相A和流动相B的体积比保持初始比例不变；
其中，
所述有关物质包括以下物质：杂质A：2,6-二甲基苯胺；杂质B：2-二乙基叠氮酰基-N-(2,6-二甲基苯基)乙酰胺；杂质C：N-(2,6-二甲基苯基)乙酰胺；杂质D：N-(2,5-二甲基苯基)-2-乙氨基乙酰胺；杂质E：2,2'-亚氨基双(N-(2,6-二甲苯基)乙酰胺；杂质F：2-(二乙氨基)-N-(2,3-二甲基苯基)乙酰胺；杂质G：N-(2,6-二甲基苯基)-2-[(1-甲基乙基)氨基]乙酰胺；杂质H：2-氯-N-(2,6-二甲基苯基)乙酰胺；杂质I：2-(二乙氨基)-N-(2,4-二甲基苯基)乙酰胺；杂质J：2-(二乙氨基)-N-(2,5-二甲基苯基)乙酰胺；杂质K：N-(2,6-二甲基苯基)-2-(乙基甲基氨基)乙酰胺；杂质L：2-氯-N-(2,4-二甲基苯基)乙酰胺；
溶解利多卡因及有关物质的溶剂由体积比为70:30的磷酸氢二钠溶液和乙腈混合而成，所述磷酸氢二钠溶液中磷酸氢二钠的浓度为0.01mmol//L，用磷酸调节其pH值至8.0。
2.根据权利要求1所述的利多卡因中有关物质的检测方法，其特征在于，所述高效液相色谱条件包括：检测器的检测波长为230nm。
3.根据权利要求1所述的利多卡因中有关物质的检测方法，其特征在于，所述高效液相色谱条件包括：柱温为30℃。
4.根据权利要求1所述的利多卡因中有关物质的检测方法，其特征在于，所述高效液相色谱条件包括：进样量为20μl；流速为1.0ml/min。
5.根据权利要求1所述的利多卡因中有关物质的检测方法，其特征在于，杂质A的校正因子为0.4；杂质B的校正因子为1.2；杂质C的校正因子为1.2；杂质D的校正因子为1.2；杂质E的校正因子为1.0；杂质F的校正因子为0.7；杂质G的校正因子为1.5；杂质H的校正因子为1.1；杂质I的校正因子为0.6；杂质J的校正因子为0.7；杂质K的校正因子为1.3；杂质L的校正因子为0.6。
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