CN115629139B - 一种利用hplc测定丙硫异烟胺中杂质含量的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种利用HPLC测定丙硫异烟胺中杂质含量的方法，属于药物分析技术领域。丙硫异烟胺中杂质包括4‑氰基吡啶、2‑丙基‑4‑氰基吡啶、异硫酰胺、2‑丙基异烟酰胺和乙硫异烟胺；包括以下步骤：1)配置供试品溶液和对照溶液；2)设置高效液相检测条件：色谱柱以十八烷基键合硅胶为填充剂，规格为250mm×4.6mm，填料粒径为5μm，柱温为35℃，以缓冲盐为流动相A，以乙腈为流动相B；流速为1.0mL/min进行梯度洗脱；3)分别精密吸取供试品溶液和对照溶液，注入液相色谱仪，记录色谱图。本发明能够快速、有效、准确和可靠的分离检测出丙硫异烟胺中有关物质，有利于提高丙硫异烟胺的产品质量。
Description
技术领域
本发明属于药物分析技术领域，具体涉及一种利用HPLC测定丙硫异烟胺中杂质含量的方法。
背景技术
丙硫异烟胺为抗结核病药，仅对分枝杆菌有效，与其他抗结核药联合用于结核病一线药物治疗无效者。
丙硫异烟胺为异烟酸的衍生物，可能对肽类合成具有抑制作用。本品对结核分枝杆菌的作用取决于感染部位的药物浓度，低浓度时仅具有抑菌作用，高浓度具有杀菌作用。抑制结核杆菌分枝菌酸的合成。本品与乙硫异烟胺有部分交叉耐药现象。
根据丙硫异烟胺工艺路线，丙硫异烟胺在生产生产过程中会产生杂质A(4-氰基吡啶)、B(2-丙基-4-氰基吡啶)、C(异硫酰胺)、D(2-丙基异烟酰胺)、E(乙硫异烟胺)，针对杂质A、B、C、D、E分离测定的相关文献报道极少，因此，提供一种测定丙硫异烟胺中杂质含量的方法对于原料制剂的生成和贮存具有重要意义。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明所要解决的技术问题是提供一种利用HPLC测定丙硫异烟胺中杂质含量的方法。
为了解决上述问题，本发明采用的技术方案为：
一种利用HPLC测定丙硫异烟胺中杂质含量的方法，包括以下步骤：
1)配置供试品溶液和对照溶液；供试品溶液的制备是方法为：取丙硫异烟胺，用乙腈溶解稀释成每1mL中含丙硫异烟胺1mg的溶液作为供试品溶液；对照溶液的制备方法为：取丙硫异烟胺对照品10mg、杂质A对照品、杂质B对照品、杂质C对照品和杂质D对照品各15mg、杂质E对照品25mg，置不同10mL量瓶中用乙腈超声溶解并稀释至刻度，作为各化合物对照品储备液I；精密量取丙硫异烟胺对照品、杂质A对照品、杂质B对照品、杂质C对照品和杂质D对照品储备液I各2.5mL，杂质E对照品储备液I5mL置同一50mL量瓶，加稀释剂稀释至刻度，作为对照品储备液II；精密量取对照品储备液II 1mL置50mL量瓶中，加稀释剂稀释至刻度，作为对照品溶液；
2)设置高效液相检测条件：色谱柱以十八烷基键合硅胶为填充剂，规格为250mm×4.6mm，填料粒径为5μm，柱温为35℃，以缓冲盐为流动相A，以乙腈为流动相B；流速为1.0mL/min进行梯度洗脱；
3)分别精密吸取供试品溶液和对照溶液，注入液相色谱仪，记录色谱图；
丙硫异烟胺中杂质包括杂质A、杂质B、杂质C、杂质D和杂质E；杂质A为4-氰基吡啶、杂质B为2-丙基-4-氰基吡啶、杂质C为异硫酰胺、杂质D为2-丙基异烟酰胺，杂质E为乙硫异烟胺。
进一步的，步骤2)中，缓冲盐为2g/l磷酸二氢钠，用磷酸调节PH至3.0。
进一步的，步骤2)中，梯度洗脱的条件为：0-8min，流动相A的体积百分比为95％，流动相B的体积百分比为5％；8-40min，流动相A的体积百分比从95％过渡到60％，流动相B的体积百分比从5％过渡40％；40-50min，流动相A的体积百分比为60％，流动相B的体积百分比为40％；50-50.1min，流动相A的体积百分比从60％过渡到95％，流动相B的体积百分比从40％过渡到5％；50.1-55min，流动相A的体积百分比为95％，流动相B的体积百分比为5％。
进一步的，步骤3)中，供试品溶液与对照溶液的进样量分别为10μL。
进一步的，步骤3)中，液相色谱仪的紫外检测器的的检测波长为282nm。
进一步的，供试品溶液色谱图中如有与对照品溶液色谱图中保留时间一致的杂质，按外标法以峰面积计算，4-氰基吡啶、2-丙基-4-氰基吡啶、异硫酰胺和2-丙基异烟酰胺均不得过0.15％，乙硫异烟胺不得过0.5％，供试品溶液色谱图扣除空白溶剂峰，如有其它未知杂质，按主成分外标法以峰面积计算，不得过0.10％，0.03％以下杂质不计入。
有益效果：与中国药典方法相比，采用本申请方法，在282nm检测波长下，丙硫异烟胺与各杂质之间能很好分离；辅料峰及溶剂峰不干扰主成分及杂质的检测；各条件下破坏产生的杂质均能与主峰很好地分离，有关物质检测专属性良好；同时对色谱条件参数发生微小变化时对丙硫异烟胺有关物质杂质分离与检查结果没有影响，耐用性良好；使用该高效液相色谱法能够快速、有效、准确和可靠的分离检测出丙硫异烟胺中有关物质，有利于提高丙硫异烟胺的产品质量。
附图说明
图1是本发明利用HPLC测定丙硫异烟胺中杂质含量的系统适用性试验4-氰基吡啶定位谱图；
图2为本发明利用HPLC测定丙硫异烟胺中杂质含量的系统适用性试验2-丙基-4-氰基吡啶定位谱图；
图3为本发明利用HPLC测定丙硫异烟胺中杂质含量的系统适用性试验异硫烟胺定位谱图；
图4为本发明利用HPLC测定丙硫异烟胺中杂质含量的系统适用性试验2-丙基异烟酰胺定位谱图；
图5为本发明利用HPLC测定丙硫异烟胺中杂质含量的系统适用性试验乙硫异烟胺定位谱图；
图6为本发明利用HPLC测定丙硫异烟胺中杂质含量的系统适用性试验丙硫异烟胺定位谱图；
图7为本发明利用HPLC测定丙硫异烟胺中杂质含量的系统适用性试验图谱图；
图8为本发明利用HPLC测定丙硫异烟胺中杂质含量的系统适用性试验供试品溶液谱图；
图9为本发明利用HPLC测定丙硫异烟胺中杂质含量的强制降解试验未破坏样品溶液谱图；
图10为本发明利用HPLC测定丙硫异烟胺中杂质含量的强制降解试验氧化破坏样品溶液谱图；
图11为本发明利用HPLC测定丙硫异烟胺中杂质含量的强制降解试验碱破坏样品溶液谱图；
图12为本发明利用HPLC测定丙硫异烟胺中杂质含量的强制降解试验酸破坏样品溶液谱图；
图13为本发明利用HPLC测定丙硫异烟胺中杂质含量的强制降解试验光照破坏样品溶液谱图；
图14为本发明利用HPLC测定丙硫异烟胺中杂质含量的强制降解试验高温破坏样品谱图；
图15为本发明利用HPLC测定丙硫异烟胺中杂质含量的线性和范围试验线性溶液1谱图；
图16为本发明利用HPLC测定丙硫异烟胺中杂质含量的线性和范围试验线性溶液2谱图；
图17为本发明利用HPLC测定丙硫异烟胺中杂质含量的线性和范围试验线性溶液3谱图；
图18为本发明利用HPLC测定丙硫异烟胺中杂质含量的线性和范围试验线性溶液4谱图；
图19为本发明利用HPLC测定丙硫异烟胺中杂质含量的线性和范围试验线性溶液5谱图；
图20为本发明利用HPLC测定丙硫异烟胺中杂质含量的线性和范围试验线性溶液6谱图；
图21为本发明利用HPLC测定丙硫异烟胺中杂质含量的线性和范围试验线性溶液7谱图；
图22为本发明利用HPLC测定丙硫异烟胺中杂质含量的准确度试验对照品溶液1谱图；
图23为本发明利用HPLC测定丙硫异烟胺中杂质含量的准确度试验对照品溶液2谱图；
图24为本发明利用HPLC测定丙硫异烟胺中杂质含量的准确度试验供试品溶液1谱图；
图25为本发明利用HPLC测定丙硫异烟胺中杂质含量的准确度试验供试品溶液2谱图；
图26为本发明利用HPLC测定丙硫异烟胺中杂质含量的准确度试验回收率溶液80％谱图；
图27为本发明利用HPLC测定丙硫异烟胺中杂质含量的准确度试验回收率溶液100％谱图；
图28为本发明利用HPLC测定丙硫异烟胺中杂质含量的准确度试验回收率溶液120％谱图。
具体实施方式
下面结合具体实施例进一步说明本发明，但这些实施例并不用来限制本发明。
丙硫异烟胺在生产生产过程中会产生杂质A(4-氰基吡啶)、B(2-丙基-4-氰基吡啶)、C(异硫酰胺)、D(2-丙基异烟酰胺)、E(乙硫异烟胺)，通过HPLC法同时检测丙硫异烟胺及其杂质A、B、C、D、E的含量。
杂质的限度制定：丙硫异烟胺每日最大使用剂量为750mg，根据ICH Q3D及《化学药物杂质研究的指导原则》将杂质A、杂质B、杂质C、杂质D限度定为质量分数0.15％，杂质E限度定为质量分数0.5％，其他杂质限度定为质量分数0.1％。
实施例1
1、系统适用性
取杂质A、杂质B、杂质C、杂质D对照品各约15mg、丙硫异烟胺对照品约10mg、杂质E约25mg，精密称定，各对照品分别置不同10mL量瓶中加乙腈超声溶解，并稀释至刻度，作为各对照品贮备液I，分别精密量取各对照品贮备液I 1mL，至不同50mL量瓶，加稀释剂(乙腈-水(20：80))稀释至刻度，作为定位溶液；分别精密量取2.5mL丙硫异烟胺、杂质A、杂质B、杂质C、杂质D对照品贮备液I、5mL杂质E各对照品贮备液I置同一50mL量瓶，加稀释剂稀释至刻度，作为对照品贮备液II；取本品约50mg，精密称定，置50mL量瓶中，用10mL乙腈超声溶解，精密加入对照品贮备液II 1mL，加水稀释至刻度，制成每1mL含丙硫异烟胺1mg、杂质A 1.5μg、杂质B 1.5μg、杂质C 1.5μg、杂质D 1.5μg和杂质E 5μg的溶液，作为系统适用性溶液；取本品约50mg，精密称定，置50mL量瓶中，用10mL乙腈超声溶解，加水稀释至刻度，制成每1mL含丙硫异烟胺1mg的溶液，作为供试品溶液。
按照有关物质色条件，精密量取稀释剂、各杂质定位溶液、供试品溶液及系统适用性溶液各10μL，注入色谱仪，记录色谱图，各峰的分离度较好，结果汇总详见表1，色谱图详见附图1-8。
表1 系统适用性
结果表明：空白溶剂不干扰杂质测定，供试品溶液和系统适用性溶液色谱图中，主峰与相邻杂质，及杂质间的分离度均符合要求，上述各已知杂质及丙硫异烟胺出峰顺序如下：杂质C、杂质D、杂质E、杂质A、丙硫异烟胺、杂质B。
2、强制降解试验
取丙硫异烟胺约25mg，精密称定，置25mL量瓶中，进行酸、碱、氧化、高温、光照破坏试验，冷却至室温，按未破坏样品溶液方法制成不同降解条件下的供试品溶液，考察主成分的降解及杂质的产生情况，并进行主峰峰纯度检查和计算物料平衡，结果见表2、表3，图谱见附图9-14。
表2 强制降解试验表
表3 强制降解试验峰纯度及物料平衡结果
| 样品 | 称样量 | 总峰面积/浓度 | 峰纯度因子 | 物料平衡 |
| 未破坏 | 25.04 | 619.33 | 999.6 | 100.00％ |
| 酸破坏 | 25.29 | 621.77 | 999.7 | 100.39％ |
| 碱破坏 | 25.71 | 586.38 | 999.5 | 94.68％ |
| 氧化破坏 | 24.97 | 514.06 | 999.9 | 83.00％ |
| 光照破坏 | 25.54 | 615.84 | 999.4 | 99.44％ |
| 高温破坏 | 25.11 | 618.10 | 999.5 | 99.80％ |
结果表明：丙硫异烟胺在双氧水条件下破坏产生特殊臭味的气体，根据反应原理知该气体为硫化氢，在紫外上无吸收，导致物料不守恒，其它降解条件物料基本守恒，在90％-110％内，降解产物与主峰分离度良好，分离度均大于1.5，主成分纯度因子均大于999.0，表明该色谱条件适合用来进行有关物质测定。
实施例2
1、定量限和检测限
取线性溶液中最低点的对照品混合溶液，照本发明方法色谱条件连续进6针，峰面积相对标准偏差RSD不得过10.0％，各化合物的信噪比不得低于10；在定量限基础上稀释3倍的溶液，作为检测限溶液，照本发明方法色谱条件连续进样3针，各化合物的信噪比不得低于3，各化合物浓度及信噪比结果见表4、表5。
表4 定量限检测限结果
表5 各化合物的检测限试验结果
结果表明：在相当于供试品溶液0.008％以上浓度的各已知杂质和主成分的信噪比均大于3，浓度小于设定的忽略限度(0.03％)，能满足检测要求。
2、线性和范围
取已知杂质和丙硫异烟胺对照品各约10mg，置同一25mL量瓶中，加10mL乙腈超声稀释并稀释至刻度，精密量取5mL，置50mL量瓶中，加稀释剂稀释至刻度，作为线性储备液；精密量取线性储备液适量，加稀释剂稀释制成一系列线性溶液(从相当于供试品溶液浓度0.03％至0.8％范围内取7个浓度点)；照本发明方法色谱条件依次进样，以各峰面积A为纵坐标，对应浓度C为横坐标，绘制杂质及主成分标准曲线，以最小二乘法进行线性回归，计算各化合物的线性回归方程和相关系数。结果见表6，图谱见附图15-21。
表6 线性及范围试验结果
结果表明：丙硫异烟胺及已知杂质在相当于供试品浓度0.024％(忽略限浓度为0.03％)至1.2％的范围内，浓度与峰面积具有良好的线性，相关系数r均大于0.99，Y轴截距在100％响应值均不大于10％。
3、准确度
取各已知杂质对照品适量，按各杂质限度的80％～120％比例，加入丙硫异烟胺原料中，配制过程如下：
取杂质A、杂质B、杂质C、杂质D对照品各约15mg、丙硫异烟胺对照品约10mg、杂质E约25mg，精密称定，置不同10mL量瓶中加乙腈超声溶解，并稀释至刻度，作为对照品储备液I(平行配制两份)；分别精密量取2.5mL丙硫异烟胺、杂质A、杂质B、杂质C、杂质D对照品贮备液I、5mL杂质E对照品贮备液I置同一50mL量瓶，加稀释剂(乙腈-水(20：80))稀释至刻度，作为对照品贮备液II；精密量取1mL对照品贮备液II，置50mL量瓶，加稀释剂稀释至刻度，摇匀制成每1mL含杂质A 1.5μg、杂质B 1.5μg、杂质C 1.5μg、杂质D 1.5μg、杂质E 2.5μg、丙硫异烟胺对照品1μg的溶液，作为对照品溶液。
取丙硫异烟胺约50mg，精密称定，置50mL量瓶中，用10mL乙腈超声溶解，加水稀释至刻度，作为未加标供试品溶液，平行配制2份。
取丙硫异烟胺约50mg，精密称定，置50mL量瓶中，用10mL乙腈超声溶解，精密加入杂质对照品贮备液II 0.8mL，用水稀释至刻度，作为80％水平回收率溶液，平行配制3份。
取丙硫异烟胺约50mg，精密称定，置50mL量瓶中，用10mL乙腈超声溶解，精密加入杂质对照品贮备液II 1mL，用水稀释至刻度，作为100％水平回收率溶液，平行配制3份。
取丙硫异烟胺约50mg，精密称定，置50mL量瓶中，用10mL乙腈超声溶解，精密加入杂质对照品贮备液II 1.2mL，用水稀释至刻度，作为120％水平回收率溶液，平行配制3份。
照本发明方法色谱条件，对照品溶液1进5针，对照品溶液2进2针，其余溶液进1针，记录色谱图，按外标法以峰面积计算，扣除本底，将外标法的实测值与理论值比较，计算回收率，并计算回收率的相对标准偏差以考察方法的准确度。结果见表7-10，色谱图见附图22-28。
表7 杂质A准确度试验结果
表8 杂质B准确度试验结果
表9 杂质C准确度试验结果
表10 杂质D准确度试验结果
表11 杂质E准确度试验结果
结果表明：各杂质在高(限度的120％)、中(限度的100％)、低(限度的80％)三个浓度水平下的回收率均在90.0％～110.0％范围内，回收率的相对标准偏差RSD(n＝9)均不大5％，方法的准确度良好。
4、重复性
取准确度项下的对照品溶液，供试品溶液按照杂质限度的100％比例，加入丙硫异烟胺原料药中，平行配制6份(同准确度项下100％回收率水平溶液配制方法)，照本发明方法色谱条件，取对照品溶液和供试品溶液进样检测，按外标法以峰面积计算供试品溶液中各杂质含量，并计算各杂质含量变化(以相对标准偏差计)，方法的重复性结果见表12。
表12 杂质重复性试验各杂质含量结果
结果表明：按杂质限度的100％比例加入同一批丙硫异烟胺原料药中，重复测定6次，各单个杂质及总杂质含量RSD(n＝6)均小于10.0％，杂质检出个数相同，方法的重复性好。
5、中间精密度
于不同日期，不同操作员，按“重复性”项下，同法配制2份对照品溶液及6份供试品溶液(按照杂质限度的100％比例)，照有关物质测定方法进样检测，按外标法以峰面积分别计算各杂质含量，考察杂质含量的变化情况，并统计两个操作员测定结果的差异，考察方法的精密度，结果见表13、表14。
表13 中间精密度各杂质含量结果
表14 精密度各杂质含量统计结果
| 杂质 | 重复性平均值含量 | 中间精密度平均值含量 | 绝对差值 |
| 杂质A | 0.15％ | 0.15％ | 0.00％ |
| 杂质B | 0.16％ | 0.17％ | 0.01％ |
| 杂质C | 0.16％ | 0.16％ | 0.00％ |
| 杂质D | 0.15％ | 0.18％ | 0.03％ |
| 杂质E | 0.76％ | 0.77％ | 0.01％ |
| 未知杂质(RRT＝1.4) | 0.08％ | 0.08％ | 0.00％ |
| 总杂 | 1.57％ | 1.57％ | 0.00％ |
| 杂质个数 | 8 | 7 | 1 |
结果表明：于不同时间，不同人员，同重复性方法平行配制6份供试品溶液，单个杂质及总杂含量无明显差异，RSD均不大于10.0％，杂质检出个数相同，说明方法的中间精密度良好，统计2位化验员测定单杂质和总杂含量的绝对差值均不大于0.05％，结果无明显差异，杂质检出个数不同，是由于两名人员使用的色谱柱不同(重复性试验色谱柱为YMC-PackODS-A、中间精密度试验色谱柱为Agilent Extend C18)。
6、溶液稳定性
取“准确度”项下的对照品溶液及未加标供试品溶液，精密量取10μl，于不同时间段，注入液相色谱仪，对照品溶液以峰面积的变化来考察不同时间内的溶液稳定性，供试品溶液以杂质含量的变化及杂质检出个数来考察溶液的稳定性，结果见表15、表16。
表15 对照品溶液稳定性试验峰面积结果
表16 供试品溶液稳定性试验各杂质含量结果(面积归一化法)
结果表明：对照品溶液室温放置46h，各化合物峰面积相对标准偏差RSD均不大于3.0，说明对照品溶液室温条件下放置46h是相对稳定的，供试品溶液常温下放置40小时，已知杂质、未知杂质及总杂的含量无明显变化RSD均不大于10.0％，未检出新的大于报告限度(对照品溶液丙硫异烟胺主峰面积0.3倍，面积归一化法计算约为0.03％)的杂质，说明供试品溶液室温放置40h是相对稳定的。
7、色谱系统耐用性
取已知杂质对照品、丙硫异烟胺对照品及本品，按拟定的有关物质方法配制对照品溶液、供试品溶液及系统适用性溶液，改变色谱条件的变量见表17，进样分析，考察供试品溶液中杂质含量变化，系统适用性溶液中杂质的分离度情况。结果见表17～22。
表17 色谱条件变动参数
表18 流速变化(±0.1mL/min)对色谱系统适用性影响
表19 柱温变化(±3℃)对色谱系统适用性影响
表20 pH值变化(±2.0)对色谱系统适用性影响
表21 色谱柱变化对色谱系统适用性影响
表22 色谱条件改变供试品溶液中杂质含量检测结果
结果表明：流速0.9mL/min、柱温32℃、pH2.8和pH3.2供试品溶液色谱图中检出的单个杂质及总杂含量与正常条件比无明显差异，杂质检出个数相同；但流速1.1mL/min，柱温38℃时，供试品溶液色谱图中主峰与相邻杂质未知单杂(RRT＝0.98)的分离度降低，而未被积分出，导致杂质个数与正常条件比减少；更换不同品牌色谱柱，主峰与相邻杂质的分离度也较差，导致该杂质的检出能力变差，杂质D的检测能力变大(0.03％)，但检出量远小于限度的一半，因此推荐使用YMC-Pack ODS-A色谱柱，使用的仪器必须具备柱温箱。
8、样品的液相色谱有关物质检查
照本发明方法描述的有关物质检测方法测定本品其他批次，结果见表23。
表23 丙硫异烟胺有关物质检查结果
结果表明：多批样品中的总杂质均小于1.0％，各已知杂质和未知杂质均小于0.15％。
需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
Claims (3)
1.一种利用HPLC测定丙硫异烟胺中杂质含量的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)配置供试品溶液和对照溶液；
2)设置高效液相检测条件：色谱柱以十八烷基键合硅胶为填充剂，规格为250mm×4.6mm，填料粒径为5μm，柱温为35℃，以缓冲盐为流动相A，以乙腈为流动相B；流速为1.0mL/min进行梯度洗脱；
3)分别精密吸取供试品溶液和对照溶液，注入液相色谱仪，记录色谱图；
所述供试品溶液的制备方法为：取丙硫异烟胺，用乙腈溶解稀释成每1mL中含丙硫异烟胺1mg的溶液作为供试品溶液；所述对照溶液的制备方法为：取丙硫异烟胺对照品10mg、杂质A对照品、杂质B对照品、杂质C对照品和杂质D对照品各15mg、杂质E对照品25mg，置不同10mL量瓶中用乙腈超声溶解并稀释至刻度，作为各化合物对照品储备液I；精密量取丙硫异烟胺对照品、杂质A对照品、杂质B对照品、杂质C对照品和杂质D对照品储备液I各2.5mL，杂质E对照品储备液I5mL置同一50mL量瓶，加稀释剂稀释至刻度，作为对照品储备液II；精密量取对照品储备液II1mL置50mL量瓶中，加稀释剂稀释至刻度，作为对照品溶液；所述丙硫异烟胺中杂质包括杂质A、杂质B、杂质C、杂质D和杂质E；所述杂质A为4-氰基吡啶、杂质B为2-丙基-4-氰基吡啶、杂质C为异硫酰胺、杂质D为2-丙基异烟酰胺，杂质E为乙硫异烟胺；
所述缓冲盐为2g/l磷酸二氢钠，用磷酸调节PH至3.0；
所述梯度洗脱的条件为：0-8min，流动相A的体积百分比为95％，流动相B的体积百分比为5％；8-40min，流动相A的体积百分比从95％过渡到60％，流动相B的体积百分比从5％过渡40％；40-50min，流动相A的体积百分比为60％，流动相B的体积百分比为40％；50-50.1min，流动相A的体积百分比从60％过渡到95％，流动相B的体积百分比从40％过渡到5％；50.1-55min，流动相A的体积百分比为95％，流动相B的体积百分比为5％；
供试品溶液色谱图中如有与对照品溶液色谱图中保留时间一致的杂质，按外标法以峰面积计算，4-氰基吡啶、2-丙基-4-氰基吡啶、异硫酰胺和2-丙基异烟酰胺均不得过0.15％，乙硫异烟胺不得过0.5％，供试品溶液色谱图扣除空白溶剂峰，如有其它未知杂质，按主成分外标法以峰面积计算，不得过0.10％。
2.根据权利要求1所述的利用HPLC测定丙硫异烟胺中杂质含量的方法，其特征在于，步骤3)中，所述供试品溶液与对照溶液的进样量分别为10μL。
3.根据权利要求1所述的利用HPLC测定丙硫异烟胺中杂质含量的方法，其特征在于，步骤3)中，所述液相色谱仪的紫外检测器的检测波长为282nm。
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