CN112986449A - 检测硝唑尼特中2-氨基-5-硝基噻唑基因毒性杂质的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及分析检测技术领域，具体涉及一种检测硝唑尼特中2‑氨基‑5‑硝基噻唑基因毒性杂质的方法。所述的检测硝唑尼特中2‑氨基‑5‑硝基噻唑基因毒性杂质的方法，通过高效液相色谱法检测，以2‑氨基‑5‑硝基噻唑为对照品，以乙腈为稀释液，以外标法计算样品中2‑氨基‑5‑硝基噻唑含量；其中色谱柱采用十八烷基键合硅胶为填充剂，流动相采用磷酸水溶液与乙腈的混合溶液。本发明的检测硝唑尼特中2‑氨基‑5‑硝基噻唑基因毒性杂质的方法，填补了这类基因毒性杂质用高效液相色谱方法分析的空白，与传统的液质检测方法相比，此方法操作简单、方便高效，适用范围广，灵敏度更高，可达0.6ppm，保障了药品的安全性。
Description
技术领域
本发明涉及分析检测技术领域，具体涉及一种检测硝唑尼特中2-氨基-5-硝基噻唑基因毒性杂质的方法。
背景技术
基因毒性杂质是一类可与DNA反应，造成DNA损伤，在很低水平下即可诱导基因突变，并可能致癌的杂质。因其毒性较强，对用药的安全性产生了强烈的威胁，近年来各国的法规机构如ICH、FDA、EMA等都对基因毒性杂质有了更明确的要求，越来越多的药企在新药研发过程中着重关注基因毒性杂质的控制和检测。
2-氨基-5-硝基噻唑的结构式如下：
结构解析为：1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ8.80(s,2H),8.26(s,1H)；13CNMR(150MHz,DMSO-d6)δ173.87,147.86,135.70；m/z:calcd.for C3H3O2N3S,(M+H)+:145.1,Found:146.0。
2-氨基-5-硝基噻唑是染料、医药和农药中重要的合成中间体，由于它的杀菌作用，还可以用作家禽养殖的杀菌、消毒剂。2-氨基-5-硝基噻唑含有硝基这一基因毒性杂质警示结构，具有潜在的基因毒性。按照ICH相关指导原则，基因毒性杂质限度≤1.5μg/Day，该基因毒性杂质检测方法迄今没有相关报道。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种检测硝唑尼特中2-氨基-5-硝基噻唑基因毒性杂质的方法，填补了这类基因毒性杂质用高效液相色谱方法分析的空白，与传统的液质检测方法相比，此方法操作简单、方便高效，适用范围广，灵敏度更高，可达0.6ppm，保障了药品的安全性。
本发明所述的检测硝唑尼特中2-氨基-5-硝基噻唑基因毒性杂质的方法，通过高效液相色谱法检测，以2-氨基-5-硝基噻唑为对照品，以乙腈为稀释液，以外标法计算样品中2-氨基-5-硝基噻唑含量；其中色谱柱采用十八烷基键合硅胶为填充剂，流动相采用磷酸水溶液与乙腈的混合溶液。
磷酸水溶液的pH值为2.5-6.5。
在磷酸水溶液和乙腈的混合溶液中，磷酸水溶液的体积百分比为40-60％。
液相条件为：
色谱柱：尺寸4.6mm×250mm，填充剂颗粒平均粒度5μm；
柱温：30-35℃；
流速：1.0ml/min；
进样量：10-20μl：
检测波长：350-390nm。
优选地，检测波长为385nm。
优选地，流速为1.0ml/min。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明采用高效液相色谱法检测硝唑尼特中2-氨基-5-硝基噻唑基因毒性杂质，操作简单，检测速度快，分离效率高，灵敏度高，专属性强，准确度高，耐用性好，通过检测硝唑尼特中2-氨基-5-硝基噻唑基因毒性杂质，控制2-氨基-5-硝基噻唑基因毒性杂质在1.5ppm以内，以更好的控制产品的质量。
附图说明
图1是本发明实施例1的空白溶剂的HPLC图谱；
图2是本发明实施例1的对照品溶液的HPLC图谱；
图3是本发明对比例1的对照品溶液的质谱图谱；
图4是本发明实施例2的空白溶剂(KB)、对照品溶液(DZ)及供试品溶液(GSP)的HPLC图谱。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明做进一步描述。
实施例1
采用本发明的高效液相色谱法检测硝唑尼特中2-氨基-5-硝基噻唑基因毒性杂质，其中液相条件如下：
色谱柱：尺寸4.6mm×250mm，填充剂为十八烷基键合硅胶，填充剂颗粒平均粒度5μm；
柱温：35℃；
流动相：体积比为55:45的磷酸水溶液(pH值2.5)和乙腈的混合溶液；
流速：1.0ml/min；
检测波长：385nm。
检测步骤如下：
(1)以2-氨基-5-硝基噻唑为对照品，乙腈为溶剂，配制浓度为3ng/ml的2-氨基-5-硝基噻唑对照品溶液；
(2)分别取20μl空白溶剂、20μl 2-氨基-5-硝基噻唑对照品溶液经高效液相色谱法检测，记录色谱图，如图1-2所示，获得对照品溶液中2-氨基-5-硝基噻唑的出峰时间及峰面积。
从图1-2中可以看出，其定量限为0.6ppm，限度为1.5ppm，灵敏度较高，符合测定要求，即定量限≤1.5ppm。
对比例1
采用高效液相色谱-质谱法检测硝唑尼特中2-氨基-5-硝基噻唑基因毒性杂质，其中液相-质谱联用条件如下：
色谱柱：尺寸4.6mm×250mm，填充剂为十八烷基键合硅胶，填充剂颗粒平均粒度5μm；
柱温：35℃；
流动相：体积比为80:20的0.1％甲酸溶液和乙腈的混合溶液；
流速：1.0ml/min；
检测波长：385nm。
检测步骤如下：
(1)以2-氨基-5-硝基噻唑为对照品，乙腈为溶剂，配制浓度为25ng/ml的2-氨基-5-硝基噻唑对照品溶液；
(2)取10μl 2-氨基-5-硝基噻唑对照品溶液经高效液相色谱-质谱仪检测，记录谱图。如图3所示，获得对照品溶液中2-氨基-5-硝基噻唑的出峰时间及峰面积。
从图3中可以看出，其定量限为10ppm。限度为1.5ppm，灵敏度较低。
实施例2-8分别对该检测方法的专属性、定量限和检测限、线性与范围、准确度、重复性、中间精密度、耐用性进行试验，其中待测样品溶液的配制方法如下：
(1)配制空白溶剂：乙腈。
(2)配制对照品贮备液：取2-氨基-5-硝基噻唑，加乙腈配制成每1ml乙腈含30ng的2-氨基-5-硝基噻唑的溶液。
(3)配制对照品溶液：取2-氨基-5-硝基噻唑，加乙腈配制成每1ml乙腈含3ng的2-氨基-5-硝基噻唑的溶液。
(4)供配制试品溶液：取供试品，加乙腈配制成2mg/ml的溶液。
(5)配制加标供试品溶液：精密称定供试品20mg，置10ml量瓶中，精密加入对照品贮备液1ml，加入乙腈超声溶解并稀释至刻度，摇匀即得。
如无特殊记载，液相条件如下：
色谱柱：尺寸4.6mm×250mm，填充剂为十八烷基键合硅胶，填充剂颗粒平均粒度5μm；
柱温：35℃；
流动相：体积比为55:45的磷酸水溶液(pH值2.5)和乙腈的混合溶液；
流速：1.0ml/min；
检测波长：385nm。
实施例2：专属性试验
取空白溶剂、对照品溶液、供试品溶液各10μl分别注入高效液相色谱仪，记录色谱图，如图4所示，结果表明空白溶剂和供试品中的基质不干扰2-氨基-5-硝基噻唑的测定，说明本发明的检测方法专属性良好。
实施例3：定量限和检测限试验
取2-氨基-5-硝基噻唑适量，加乙腈溶解并稀释制成相应溶液。取10μl注入高效液相色谱仪。以S/N≈10时溶液的浓度作为定量限浓度，定量限溶液稀释2～3倍，以S/N≈3溶液的浓度作为检测限浓度。同时考察定量限的精密度。
结果表明，2-氨基-5-硝基噻唑的检测限浓度为0.4ng/ml，定量限浓度为1.2ng/ml。
实施例4：线性与范围试验
精密量取对照品贮备液适量，依次用乙腈稀释成浓度为1.5ng/ml、2.4ng/ml、3ng/ml、3.6ng/ml、4.5ng/ml的系列对照品溶液，取上述系列对照品溶液各10μl，分别注入高效液相色谱仪，记录色谱图，以浓度为横坐标，以2-氨基-5-硝基噻唑峰面积为纵坐标，采用最小二乘法进行线性回归。结果如表1所示。
表1：2-氨基-5-硝基噻唑线性关系试验结果
结果表明，2-氨基-5-硝基噻唑在1.5ng/ml～4.5ng/ml浓度范围内，浓度与峰面积呈良好的线性关系。
实施例5：准确度试验
回收率溶液的配制：
精密称定供试品20mg，置10ml量瓶中，按2-氨基-5-硝基噻唑限度的50％水平加入2-氨基-5-硝基噻唑对照品贮备溶液适量，加入乙腈超声溶解并稀释至刻度，摇匀，平行配制3份。
精密称定供试品20mg，置10ml量瓶中，按2-氨基-5-硝基噻唑限度的100％水平加入2-氨基-5-硝基噻唑对照品贮备溶液适量，加入乙腈超声溶解并稀释至刻度，摇匀，平行配制3份。
精密称定供试品20mg，置10ml量瓶中，按2-氨基-5-硝基噻唑限度的150％水平加入2-氨基-5-硝基噻唑对照品贮备溶液适量，加入乙腈超声溶解并稀释至刻度，摇匀，平行配制3份。
取空白溶剂、对照品溶液、供试品溶液、回收率溶液各10μl，分别注入高效液相色谱仪，记录色谱图。按外标法以峰面积计算2-氨基-5-硝基噻唑的测得总量，计算回收率，试验结果如表2所示。
表2：2-氨基-5-硝基噻唑回收率试验结果
结果表明，2-氨基-5-硝基噻唑的回收率均在80％～115％之间，其准确度符合要求。
实施例6：重复性试验
平行配制6份加标供试品溶液，取空白溶液、对照品溶液、加标供试品溶液各10μl，分别注入高效液相色谱仪，记录色谱图。按外标法以峰面积计算2-氨基-5-硝基噻唑的含量，计算RSD。试验结果如表3所示。
表3：2-氨基-5-硝基噻唑重复性试验结果
结果表明，本发明的检测方法重复性良好。
实施例7：中间精密度试验
变换不同时间，不同仪器，不同人员，平行配制6份加标供试品溶液。
取空白溶液、对照品溶液、加标供试品溶液各10μl，分别注入高效液相色谱仪，记录色谱图。按外标法以峰面积计算2-氨基-5-硝基噻唑的含量，计算RSD(n＝12)，考察方法的中间精密度。试验结果如表4所示。
表4：2-氨基-5-硝基噻唑中间精密度试验结果
结果表明，本发明的检测方法中间精密度良好。
实施例8：耐用性试验
为了考察色谱条件发生微小变化时，本发明方法对本品检测的耐受程度，对其进行色谱条件耐用性考察，具体参数变化如表5所示。
表5：色谱条件变动参数
| 色谱参数 | 标准条件 | 拟验证范围 |
| 流速 | 1.0ml/min | 0.8ml/min～1.2ml/min |
| 流动相pH | 2.5 | 2.3～2.7 |
| 色谱柱品牌 | C18 | 不同品牌色谱柱 |
取空白溶液、对照品溶液、加标供试品溶液各10μl，分别注入高效液相色谱仪，记录色谱图。按外标法以峰面积计算2-氨基-5-硝基噻唑的含量。试验结果如表6所示。
表6：2-氨基-5-硝基噻唑耐用性试验结果
由上述结果可知，对色谱条件进行微调，对2-氨基-5-硝基噻唑基因毒性杂质测定无影响，说明本发明检测方法色谱条件耐用性好。
Claims (6)
1.一种检测硝唑尼特中2-氨基-5-硝基噻唑基因毒性杂质的方法，其特征在于：通过高效液相色谱法检测，以2-氨基-5-硝基噻唑为对照品，以乙腈为稀释液，以外标法计算样品中2-氨基-5-硝基噻唑含量；其中色谱柱采用十八烷基键合硅胶为填充剂，流动相采用磷酸水溶液与乙腈的混合溶液。
2.根据权利要求1所述的检测硝唑尼特中2-氨基-5-硝基噻唑基因毒性杂质的方法，其特征在于：磷酸水溶液的pH值为2.5-6.5。
3.根据权利要求1所述的检测硝唑尼特中2-氨基-5-硝基噻唑基因毒性杂质的方法，其特征在于：在磷酸水溶液和乙腈的混合溶液中，磷酸水溶液的体积百分比为40-60％。
4.根据权利要求1所述的检测硝唑尼特中2-氨基-5-硝基噻唑基因毒性杂质的方法，其特征在于：液相条件为：
色谱柱：尺寸4.6mm×250mm，填充剂颗粒平均粒度5μm；
柱温：30-35℃；
流速：1.0ml/min；
进样量：10-20μl：
检测波长：350-390nm。
5.根据权利要求4所述的检测硝唑尼特中2-氨基-5-硝基噻唑基因毒性杂质的方法，其特征在于：检测波长为385nm。
6.根据权利要求4所述的检测硝唑尼特中2-氨基-5-硝基噻唑基因毒性杂质的方法，其特征在于：流速为1.0ml/min。
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