CN116338066A - 一种氨甲环酸注射液有关物质的hplc测试方法及其应用 - Google Patents

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CN116338066A CN202310229908.9A CN202310229908A CN116338066A CN 116338066 A CN116338066 A CN 116338066A CN 202310229908 A CN202310229908 A CN 202310229908A CN 116338066 A CN116338066 A CN 116338066A
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刘峰
郭志渊
周锐
陈诚
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Abstract

本发明公开了一种氨甲环酸注射液有关物质的HPLC测试方法及其应用，该测试方法色谱条件包括：色谱柱，色谱柱为反相/阳离子混合模式色谱柱；流速：0.5‑1.5ml/min；检测波长：208‑226nm；柱温：20‑35℃；进样量：5‑20μl；流动相：磷酸二氢钠溶液、水和乙腈，其中，磷酸二氢钠溶液：水：乙腈体积比为45:5:50～55:5:40。本发明可实现氨甲环酸与四个已知杂质的良好分离，并能同时检测其他未知杂质。

Description

一种氨甲环酸注射液有关物质的HPLC测试方法及其应用
技术领域
本发明属于柱色谱法测试技术领域，具体涉及一种氨甲环酸注射液有关物质的HPLC测试方法及其应用以及专用于氨甲环酸注射液有关物质的HPLC测试方法的流动相。
背景技术
氨甲环酸(Tranexamic Acid)是一种人工合成的赖氨酸类似物，与纤溶酶原或纤溶酶的赖氨酸结合区有高度亲和力，故能竞争性抑制纤维蛋白的赖氨酸与纤溶酶结合，从而抑制纤维蛋白凝块的裂解，产生止血作用。
目前氨甲环酸国内销售剂型有注射剂、片剂、胶囊剂，其中注射剂为常用剂型，且为国家基本药物目录品种。
氨甲环酸为氨基酸类似物，结构较简单，具有一个羧基和一个氨基，极性较强，紫外吸收弱，氨甲环酸主流合成方法为以对甲氨基苯甲酸为原料，在催化剂的作用下通过一步催化加氢得到4-氨甲基环己基-1-甲酸，再通过立体转型即得到目标产物氨甲环酸，其主要已知杂质包括氨甲苯酸，Z-异构体，环烯烃，酰胺聚合物，均为小分子两性极性物质。目前《中国药典》2020年版，USP2022，EP10.0及JP18中均采用十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱对氨甲环酸注射液的有关物质进行检测，以0.23％十二烷基硫酸钠溶液(含三乙胺、磷酸及约130mmol·L-1磷酸二氢钠)-甲醇系统为流动相进行检查，存在色谱系统平衡时间长，基线波动大，灵敏度较低，高浓度盐及离子对试剂损耗仪器及色谱柱的问题。
CN108732288A也公开了一种氨甲环酸或其有关物质含量的检测方法，该方法包含下列步骤：采用高效液相色谱联用紫外分光法分析氨甲环酸；其中，所述的高效液相色谱联用紫外分光法中的色谱柱为CR柱；流动相为磷酸、水和极性有机溶剂的混合溶液；所述的流动相中，所述的极性有机溶剂和水的体积比为20％：80％～80％：20％，该方法具有成本低，操作简便的优点，但该方法仅能分离两种已知杂质。
发明内容
基于上述问题，本发明提供一种氨甲环酸注射液中有关物质的HPLC测试方法，该方法可实现氨甲环酸与四个已知杂质的基线分离，并能同时检测其他未知杂质。
一种氨甲环酸注射液有关物质的HPLC测试方法，该测试方法色谱条件：
色谱柱，色谱柱为反相/阳离子混合模式色谱柱；
流速：0.5-1.5ml/min；
检测波长：208-226nm；
柱温：20-35℃；
进样量：5-20μl；
流动相：磷酸二氢钠溶液、水和乙腈，其中，磷酸二氢钠溶液：水：乙腈体积比为45:5:50～55:5:40；
所述氨甲环酸注射液中有关物质是指在氨甲环酸原料合成工艺及氨甲环酸注射液制剂工艺中引入或降解产生的杂质。
本发明采用高效液相色谱法，利用反相/阳离子混合模式色谱柱实施分离，利用紫外检测器进行定量分析，水为溶剂进行等度洗脱。反相/阳离子混合模式色谱柱上同时键合有疏水烷基链及端机羧基，具有弱的离子交换作用及反相双重分离机制，常用乙酸铵-乙腈体系或磷酸盐-乙腈体系，由于氨甲环酸及其杂质均为末端吸收，乙酸铵在低波段也有吸收，会产生干扰，故选择磷酸盐-乙腈体系进行试验。
以一定比例的磷酸二氢钠缓冲液、水和乙腈混合溶液作为流动相进行等度洗脱，定量检测氨甲苯酸，Z-异构体，环烯烃，酰胺聚合物四个已知杂质及其他未知杂质的含量，从而有效控制氨甲环酸注射液的质量，具有简单、灵敏、稳定、不损害仪器及色谱柱等优点。
本发明方法检测杂质包括氨甲苯酸，Z-异构体，环烯烃，酰胺聚合物四种已知杂质及其他未知杂质，实现高灵敏度的检测。
在本申请的一个或多个具体的实施方式中，氨甲环酸在0.6768～54.1424μg/ml范围内，标准曲线方程为Y＝0.0148x+0.0082，r＝0.9997；氨甲苯酸在0.007042～11.2666μg/ml范围内，标准曲线方程为Y＝0.9425x+0.0076，r＝1.0000；环烯烃在0.02238～8.9526μg/ml范围内，标准曲线方程为Y＝0.9559x-0.0018，r＝1.0000；Z-异构体在1.0007～20.0131μg/ml范围内，标准曲线方程为Y＝0.0120x+0.0083，r＝0.9990；酰胺聚合物在0.2412～9.6480μg/ml范围内，标准曲线方程为Y＝0.1063x+0.0028，r＝0.9999。
在本申请的一个或多个具体的实施方式中，所述氨甲环酸注射液有关物质的HPLC测试方法还包括供试品溶液的溶剂为水。
在本申请的一个或多个具体的实施方式中，所述磷酸二氢钠溶液的制取包括以下步骤：
取10mmol/L磷酸二氢钠溶液；
用0.1mol/L氢氧化钠溶液调pH值至5.2±0.05。
在本申请的一个或多个具体的实施方式中，所述氨甲环酸注射液有关物质的HPLC测试方法还包括计算方法：供试品溶液中各已知杂质按外标法计算含量，其他单个杂质按主成分外标法计算含量。
在本申请的一个或多个具体的实施方式中，所述色谱柱为Thermo Mixed-modeWCX，150mm×4.6mm，5μm。
在本申请的一个或多个具体的实施方式中，所述柱温为25℃或30℃。
在本申请的一个或多个具体的实施方式中，所述流速为0.9ml/min、1ml/min、1.1ml/min中的一种。
在本申请的一个或多个具体的实施方式中，所述检测波长为210nm。
本发明在柱温为25℃、流速1ml/min、检测波长210nm下，所有已知杂质及氨甲环酸间均能完全分离，氨甲环酸与相邻环烯烃的分离度大于2.0，回收率均在95％～105％之间，回收率的RSD值均小于5％，方法分离度好、准确度高。
本发明还提供一种测试方法的应用。
一种测试方法的应用，该应用将上述的氨甲环酸注射液有关物质的HPLC测试方法应用于检测中。
在本申请的一个或多个具体的实施方式中，所述检测为氨甲环酸原料、氨甲环酸注射液、注射用氨甲环酸的有关物质测定。
本发明还提供一种专用于氨甲环酸注射液有关物质的HPLC测试方法的流动相。
一种专用于氨甲环酸注射液有关物质的HPLC测试方法的流动相，所述流动相由磷酸二氢钠溶液、水和乙腈组成，其中，磷酸二氢钠溶液：水：乙腈体积比为45:5:50～55:5:40。
在本申请的一个或多个具体的实施方式中，所述磷酸二氢钠溶液：水：乙腈体积比为50：5：45。
在本申请的一个或多个具体的实施方式中，所述磷酸二氢钠溶液的制取包括以下步骤：
取10mmol/L磷酸二氢钠溶液；
用0.1mol/L氢氧化钠溶液调pH值至5.2±0.05。
本发明采用高效液相色谱法对有关物质进行测定，以反相/阳离子交换混合模式色谱柱进行分离，流动相是由磷酸二氢钠(以氢氧化钠溶液调pH值)、水和乙腈混匀得到的溶液，以水作为溶剂，对杂质进行等度洗脱。
将本发明方法应用于氨甲环酸注射液有关物质测定，可实现氨甲环酸与四个已知杂质的良好分离，并能同时检测其他未知杂质，可避免离子对试剂及高浓度盐的使用，同时具有色谱系统稳定，灵敏度高，专属性强等优点。
本发明方法色谱系统稳定，专属性好，灵敏度高，线性好，精密度高，准确度好，耐用性试验结果表明柱温、流速的微小变化不影响杂质检测。
名词术语解释
氨甲环酸注射液中有关物质：氨甲环酸注射液中有关物质是指在氨甲环酸原料合成工艺及氨甲环酸注射液制剂工艺中引入或降解产生的杂质。
附图说明
图1为本申请实例1中氨甲苯酸二极管阵列检测器扫描图谱；
图2为本申请实例1中氨甲环酸二极管阵列检测器扫描图谱；
图3为本申请实例1中环烯烃二极管阵列检测器扫描图谱；
图4为本申请实例1中Z-异构体二极管阵列检测器扫描图谱；
图5为本申请实例1中酰胺聚合物二极管阵列检测器扫描图谱；
图6为实施例3系统适用性溶液的HPLC检测图谱；
图7为实施例4供试品溶液HPLC检测图谱；
图8为实施例5系统适用性溶液的HPLC检测图谱；
图9为实施例6系统适用性溶液的HPLC检测图谱；
图10为实施例7系统适用性溶液的HPLC检测图谱。
具体实施方式
下面将对本发明作进一步说明。
本发明提供的实施例仅为进一步解释本发明，不应解释为对本发明的任何限制。
本领域技术人员应当清楚，在下文中，如果未特别说明，本发明所用材料和操作方法是本领域公知的。
本具体实施方式中仪器：
Thermo Vanquish core高效液相色谱仪，梅特勒-托利多XA205DU十万分之一电子天平，优普超纯水仪。
本具体实施方式中试剂：磷酸二氢钠(分析纯)；氢氧化钠(分析纯)；水(超纯水)；乙腈(色谱纯)。
本具体实施方式中：本品是指氨甲环酸注射液。
下述实施例中，各溶液的配制如下：
①氨甲环酸对照品储备液：精密称取氨甲环酸对照品约10mg，置10mL量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。
②Z-异构体对照品储备液：精密称取Z-异构体对照品约10mg，置10mL量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。
③环烯烃对照品储备液：精密称取Z-异构体对照品约10mg，置10mL量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。
④氨甲苯酸对照品储备液：精密称取氨甲苯酸对照品约10mg，置10mL量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。
⑤酰胺聚合物对照品储备液：精密称取酰胺聚合物对照品约10mg，置10mL量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。
⑥对照品溶液：精密量取各储备液适量，定量稀释制成含氨甲环酸25μg，环烯烃和氨甲苯酸5μg，Z-异构体10μg，酰胺聚合物5μg的混合溶液。
⑦系统适用性溶液：精密量取各储备液适量，定量稀释制成含氨甲环酸0.5mg，环烯烃和氨甲苯酸2μg，Z-异构体20μg，酰胺聚合物10μg的混合溶液。
⑧供试品溶液：精密量取本品适量，用水定量稀释制成浓度约为5mg/ml的供试品溶液。
实施例1氨甲环酸注射液有关物质的HPLC测试方法的建立
一种氨甲环酸注射液有关物质的HPLC测试方法的建立方法，包括以下步骤：
(1)选择确定检测波长
精密量取氨甲环酸以及各杂质对照品溶液注入液相色谱仪，在190～400nm波长扫描，以确定各杂质最大吸收波长，结果见图1、图2、图3、图4、图5。
氨甲环酸最大吸收波长为208nm、Z-异构体和酰胺聚合物为末端吸收、环烯烃最大吸收波长为204nm、氨甲苯酸最大吸收波长为191nm和226nm，大多数杂质为末端吸收，综合考虑基线的稳定性、检测灵敏度以及杂质计算的合理性，选择210nm作为检测波长。
(2)确定：色谱柱Thermo Mixed-mode WCX(150mm×4.6mm，5μm)；流速：1ml/min；检测波长：210nm[为(1)综合选择的检测波长]；柱温：25℃；进样量：20μl，记录至主峰保留时间的3倍。
(3)确定流动相：10mmol/L磷酸二氢钠溶液(用0.1mol/L氢氧化钠溶液调pH值至5.2±0.05)：水：乙腈(50：5：45，为体积比)。
(4)确定供试品溶液的溶剂：水。
(5)确定计算方法：供试品溶液中各已知杂质按外标法计算含量，其他单个杂质按主成分外标法计算含量。
实施例2
一种氨甲环酸注射液有关物质的HPLC测试方法，该测试方法包括：
色谱柱Thermo Mixed-mode WCX(150mm×4.6mm，5μm)；
色谱条件：流速：1ml/min；检测波长：210nm[为(1)综合选择的检测波长]；柱温：25℃；进样量：20μl，记录至主峰保留时间的3倍。流动相：10mmol/L磷酸二氢钠溶液(用0.1mol/L氢氧化钠溶液调pH值至5.2±0.05)：水：乙腈(50：5：45)。
供试品溶液的溶剂：水。
计算方法：供试品溶液中各已知杂质按外标法计算含量，其他单个杂质按主成分外标法计算含量。
实施例3
本实施例为实施例2的测试方法的方法学验证内容
(1)配制系统适用性溶液：精密量取各储备液适量，定量稀释制成含氨甲环酸0.5mg，环烯烃和氨甲苯酸2μg，Z-异构体20μg，酰胺聚合物10μg的混合溶液。
(2)系统适用性试验
取系统适用性溶液注入液相色谱仪，记录色谱图，系统适用性溶液色谱图中，出峰顺序依次为氨甲苯酸、氨甲环酸、环烯烃、Z-异构体和酰胺聚合物，氨甲环酸和环烯烃的分离度应大于2.0，其他各组分间分离度应符合规定。结果见表1和图6。
表1
化合物 保留时间 分离度 理论塔板数
氨甲苯酸 4.28 \ 9954
氨甲环酸 9.87 20.3 10785
环烯烃 10.81 2.4 11658
Z-异构体 12.61 4.2 12285
酰胺聚合物 15.03 4.6 9873
(2)线性及范围
为准确测定本品及各杂质，进行线性考察，各线性浓度均从定量限浓度开始试验，取各对照品储备液适量，稀释制成一系列浓度的对照溶液，进样分析，以各组分的浓度(μg/ml)为横坐标，相应的峰面积为纵坐标，进行线性回归。结果显示：氨甲环酸在0.6768～54.1424μg/ml范围内，标准曲线方程为Y＝0.0148x+0.0082，r＝0.9997；氨甲苯酸在0.007042～11.2666μg/ml范围内，标准曲线方程为Y＝0.9425x+0.0076，r＝1.0000；环烯烃在0.02238～8.9526μg/ml范围内，标准曲线方程为Y＝0.9559x-0.0018，r＝1.0000；Z-异构体在1.0007～20.0131μg/ml范围内，标准曲线方程为Y＝0.0120x+0.0083，r＝0.9990；酰胺聚合物在0.2412～9.6480μg/ml范围内，标准曲线方程为Y＝0.1063x+0.0028，r＝0.9999。
(3)检测限、定量限
取各组分贮备液，逐级稀释，以信噪比3:1计算检测限，信噪比10:1计算定量限，结果显示：氨甲苯酸检测限为0.24μg/ml，定量限为0.75μg/ml；氨甲环酸检测限为0.001μg/ml，定量限为0.005μg/ml；环烯烃检测限为0.003μg/ml，定量限为0.02μg/ml；Z-异构体检测限为0.37μg/ml，定量限为1.22μg/ml；酰胺聚合物检测限为0.07μg/ml，定量限为0.24μg/ml。
(4)进样精密度
取对照品溶液注入液相色谱仪，连续进样6次，记录色谱图，考察进样精密度，结果氨甲环酸峰面积RSD为0.31％；氨甲苯酸峰面积RSD为0.18％；环烯烃峰面积RSD为0.11％；Z-异构体峰面积RSD为0.94％；酰胺聚合物峰面积RSD为0.96％。
(5)重复性
取氨甲环酸注射液，平行制备六份供试品溶液，进样测定，结果样品中各杂质检出量：氨甲苯酸含量极差为0.00％，环烯烃含量极差为0.00％，Z-异构体含量极差为0.01％，酰胺聚合物含量极差为0.00％，其他最大单杂含量极差为0.01％，总杂含量极差为0.01％。
(6)准确度
取氨甲环酸注射液，精密加入氨甲苯酸、环烯烃、Z-异构体和酰胺聚合物对照品储备液各适量，制备低、中、高三个浓度的回收供试品溶液，其中低浓度水平：氨甲环酸12.5μg/ml，环烯烃和氨甲苯酸2.5μg/ml，Z-异构体5μg/ml，酰胺聚合物2.5μg/ml；中浓度水平：氨甲环酸25μg/ml，环烯烃和氨甲苯酸5μg/ml，Z-异构体10μg/ml，酰胺聚合物5μg/ml；高浓度水平：氨甲环酸37.5μg/ml，环烯烃和氨甲苯酸7.5μg/ml，Z-异构体15μg/ml，酰胺聚合物7.5μg/ml。
计算回收率，结果显示：氨甲苯酸平均回收率为98.38％，RSD为0.52％；环烯烃平均回收率为100.5％，RSD为0.24％；Z-异构体平均回收率为97.42％，RSD为3.87％；酰胺聚合物平均回收率为96.56％，RSD为1.37％。
(7)溶液稳定性
精密量取对照品溶液，于0、2、4、6、8、10、22h注入液相色谱仪，记录色谱图，考察溶液稳定性，结果氨甲环酸峰面积RSD为1.89％，氨甲苯酸峰面积RSD为0.67％，Z-异构体峰面积RSD为0.21％，环烯烃峰面积RSD为1.86％，酰胺聚合物峰面积RSD为1.41％，说明对照品溶液在22h内稳定。
实施例4
(1)取本品，制备供试品溶液。
(2)采用实施例2的测试方法测试，得图7。
(3)采用实施例2计算方法计算含量。
实施例5
与实施例2相比，本实施例的色谱条件的柱温30℃，其余同实施例2。
取系统适用性溶液10μL，注入液相色谱仪，记录色谱图。
系统适用性溶液检测结果见表2，所得HPLC图谱见图8，通过表2可以看出，所有色谱峰均能达到基线分离，主峰与相邻环烯烃杂质峰分离度大于2.0。
表2
Figure BDA0004119922700000111
Figure BDA0004119922700000121
实施例6
与实施例2相比，本实施例的色谱条件的流速0.9ml/min，其余同实施例2。
取系统适用性溶液10μL，注入液相色谱仪，记录色谱图。
系统适用性溶液检测结果见表3，所得HPLC图谱见图9，通过表3可以看出，所有色谱峰均能达到基线分离，主峰与相邻环烯烃杂质峰分离度大于2.0。
表3
化合物 保留时间 分离度 理论塔板数
氨甲苯酸 4.46 \ 10068
氨甲环酸 10.21 19.8 10221
环烯烃 11.25 2.5 11629
Z-异构体 13.24 4.4 11822
酰胺聚合物 15.99 4.9 9721
实施例7
与实施例2相比，本实施例色谱条件的流速1.1ml/min，其余色谱条件同实施例2。
取系统适用性溶液10μL，注入液相色谱仪，记录色谱图。
系统适用性溶液检测结果见表4，所得HPLC图谱见图10，通过表4可以看出，所有色谱峰均能达到基线分离，主峰与相邻环烯烃杂质峰分离度大于2.0。
表4
化合物 保留时间 分离度 理论塔板数
氨甲苯酸 3.65 \ 8994
氨甲环酸 8.35 19.0 9532
环烯烃 9.19 2.4 10782
Z-异构体 10.82 4.3 11414
酰胺聚合物 13.07 4.7 8926
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种氨甲环酸注射液有关物质的HPLC测试方法，该测试方法色谱条件包括：
色谱柱，色谱柱为反相/阳离子混合模式色谱柱；
流速：0.5-1.5ml/min；
检测波长：208-226nm；
柱温：20-35℃；
进样量：5-20μl；
流动相：磷酸二氢钠溶液、水和乙腈，其中，磷酸二氢钠溶液：水：乙腈体积比为45:5:50～55:5:40；
所述氨甲环酸注射液中有关物质是指在氨甲环酸原料合成工艺及氨甲环酸注射液制剂工艺中引入或降解产生的杂质。
2.根据权利要求1所述的氨甲环酸注射液有关物质的HPLC测试方法，其特征在于，氨甲环酸在0.6768～54.1424μg/ml范围内，标准曲线方程为Y＝0.0148x+0.0082，r＝0.9997；氨甲苯酸在0.007042～11.2666μg/ml范围内，标准曲线方程为Y＝0.9425x+0.0076，r＝1.0000；环烯烃在0.02238～8.9526μg/ml范围内，标准曲线方程为Y＝0.9559x-0.0018，r＝1.0000；Z-异构体在1.0007～20.0131μg/ml范围内，标准曲线方程为Y＝0.0120x+0.0083，r＝0.9990；酰胺聚合物在0.2412～9.6480μg/ml范围内，标准曲线方程为Y＝0.1063x+0.0028，r＝0.9999。
3.根据权利要求1或2任一所述的氨甲环酸注射液有关物质的HPLC测试方法，其特征在于，所述磷酸二氢钠溶液的制取包括以下步骤：
取10mmol/L磷酸二氢钠溶液；
用0.1mol/L氢氧化钠溶液调pH值至5.2±0.05。
4.根据权利要求1-3任一所述的氨甲环酸注射液有关物质的HPLC测试方法，其特征在于，所述氨甲环酸注射液有关物质的HPLC测试方法还包括计算方法：供试品溶液中各已知杂质按外标法计算含量，其他单个杂质按主成分外标法计算含量；或/和
所述氨甲环酸注射液有关物质的HPLC测试方法还包括供试品溶液的溶剂为水。
5.根据权利要求1-4任一所述的氨甲环酸注射液有关物质的HPLC测试方法，其特征在于，所述色谱柱为Thermo Mixed-mode WCX，150mm×4.6mm，5μm；或/和
所述柱温为25℃或30℃；或/和
所述流速为0.9ml/min、1ml/min、1.1ml/min中的一种；
所述检测波长为210nm。
6.一种测试方法的应用，其特征在于，该应用将权利要求1-5任一所述的氨甲环酸注射液有关物质的HPLC测试方法应用于检测中。
7.根据权利要求6所述的测试方法的应用，其特征在于，所述检测为氨甲环酸原料、氨甲环酸注射液、注射用氨甲环酸的有关物质测定。
8.一种专用于氨甲环酸注射液有关物质的HPLC测试方法的流动相，其特征在于，所述流动相由磷酸二氢钠溶液、水和乙腈组成，其中，磷酸二氢钠溶液：水：乙腈体积比为45:5:50～55:5:40。
9.根据权利要求8所述的专用于氨甲环酸注射液有关物质的HPLC测试方法的流动相，其特征在于，所述磷酸二氢钠溶液：水：乙腈体积比为50：5：45。
10.根据权利要求8-9任一所述的专用于氨甲环酸注射液有关物质的HPL C测试方法的流动相，其特征在于，所述磷酸二氢钠溶液的制取包括以下步骤：
取10mmol/L磷酸二氢钠溶液；
用0.1mol/L氢氧化钠溶液调pH值至5.2±0.05。
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