CN115327006B

CN115327006B - 一种氧化氯吡格雷异构体的检测方法

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Publication number: CN115327006B
Application number: CN202210964674.8A
Authority: CN
Inventors: 陆瑶; 张海; 徐霞
Original assignee: Chengdu Shibeikang Biological Medicine Technology Co ltd
Current assignee: Chengdu Shibeikang Biological Medicine Technology Co ltd
Priority date: 2022-08-12
Filing date: 2022-08-12
Publication date: 2024-01-26
Anticipated expiration: 2042-08-12
Also published as: CN115327006A

Abstract

本发明涉及药物检测分析领域，具体涉及一种(7aS,2'S)‑2‑氧‑氯吡格雷异构体的检测方法。本发明的(7aS,2'S)‑2‑氧‑氯吡格雷异构体检测方法采用高效液相色谱法，烷烃和醇混合溶液为流动相，采用手性色谱柱，检测波长220±2nm，操作步骤包括：（1）取2‑氧化氯吡格雷，溶剂稀释后，得供试品溶液；（2）将供试品溶液注入高效液相色谱仪中，采集色谱图即可。本发明提供的检测方法专属性好、灵敏度和准确度高，适合用于(7aS,2'S)‑2‑氧‑氯吡格雷的异构体质量研究。

Description

一种氧化氯吡格雷异构体的检测方法

技术领域

本发明涉及药物检测分析领域，具体涉及一种(7aS, 2'S)-2-氧-氯吡格雷异构体的检测方法。

背景技术

(7aS, 2’S)-2-氧-氯吡格雷（以下用“化合物A”表示），为氯吡格雷在人体的代谢产物，是一款活性更高且更安全的血小板聚集抑制剂，其化学名为：（S）-2-（2-氯苯基）-2-（（S）-2-氧代-2,6,7,7a-四氢噻吩[3,2-c]并吡啶-5（4H）基）乙酸甲酯：

。

根据化合物A的分子结构可以看出其有两个手性中心，因此除了化合物A，还有三个异构体，分别是P1Z2、P1Z3、P1Z4，结构如下：

。

由于异构体结构高度近似，一般的检测方法难以分离，因此需要针对性开发异构体检测方法。目前，现有技术没有关于涉及异构体质量研究方面的报道，而现有技术（CN111943958A）的说明书仅公开了一种标定式I化合物的检测方法，该方法完全无法满足检测异构体的需求。因此，为了更好地控制化合物A的质量，尤其进行关于异构体方面的质量研究，开发适合化合物A的异构体控制方法，是保证药品上市质量安全亟待解决的技术问题。

发明内容

为解决(7aS, 2'S)-2-氧-氯吡格雷的质量控制需求，本发明提供一种(7aS, 2'S)-2-氧-氯吡格雷有关物质的检测方法。

本发明提供的(7aS, 2'S)-2-氧-氯吡格雷有关物质检测方法，采用高效液相色谱法，能够检测包括异构体在内的杂质，包括但不限于杂质P1Z2、P1Z3和P1Z4。

一种(7aS, 2'S)-2-氧-氯吡格雷有关物质的检测方法，所述方法采用高效液相色谱法，操作步骤包括：

（1）取(7aS, 2'S)-2-氧-氯吡格雷，溶剂稀释后，得供试品溶液；

（2）将供试品溶液注入高效液相色谱仪中，采用色谱条件检测即可。

在某些实施例中，上述色谱条件包含：

固定相：手性色谱柱；

流动相：烷烃和醇混合溶液，且醇至少为两种；

检测波长220±2nm。

在某些实施例中，上述色谱柱的填料包含直链淀粉-三（3，5-二甲苯基氨基甲酸酯）。

在某些实施例中，上述溶剂包含乙腈、醇或流动相。

在某些实施例中，上述流动相包含烷烃和两种醇，且烷烃、醇、醇体积比为80～95：10～3：12～2。

在某些实施例中，上述醇包含甲醇、乙醇、丙醇或异丙醇中的一种或几种。

在某些实施例中，上述烷烃包含正己烷或正庚烷。

在某些实施例中，上述流动相为正己烷、异丙醇和乙醇的混合溶液。

在某些实施例中，上述流动相中正己烷、异丙醇和乙醇的体积比为80～95：10～3：12～2。

在某些实施例中，上述色谱条件的流速为0.5～2.0ml/min。

进一步地，上述色谱条件的流速为0.8～1.5ml/min。

在某些实施例中，上述色谱条件的柱温0～40℃；优选20～40℃。

在某些实施例中，上述有关物质包含异构体杂质；优选地，上述异构体包含P1Z3、P1Z2、P1Z4中的一种或几种。

在某些实施例中，上述供试品溶液的色谱图中，如有异构体杂质，单个异构体不超过0.1%。

在某些实施例中，上述供试品溶液的色谱图中，如有异构体杂质，按自身对照法以峰面积计算，单个杂质不超过0.1%。

有益效果：本发明的(7aS, 2'S)-2-氧-氯吡格雷有关物质检测方法各峰的峰型好，各峰之间分离度均大于1.5，分离度良好，方法专属性好、灵敏度和准确度高，符合质量分析检测要求，适合本品的异构体杂质有关物质质量研究。

附图说明

图1：系统适用性溶液色谱图。

具体实施方式

下面将结合实验例和实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的各例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。各例中未注明的具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为通过市购获得的常规产品。

化合物A在乙腈中溶解，在甲醇中微溶，在水中几乎不溶。以下实验例和实施例所用的化合物A工作对照品（批号：201113-D，纯度99.6%）和供试品（批号：59201001）均来源于成都施贝康生物医药科技有限公司，杂质P1Z2、P1Z3、P1Z4对照品均来源于成都施贝康生物医药科技有限公司。

实验例1：化合物A有关物质检测方法的方法学考察

⒈各种对照品溶液和供试品溶液的配制

供试品溶液：取样品（化合物A，批号：59201001）适量，精密称定，加无水乙醇溶解并定量稀释制成每1ml约含1mg的溶液。

对照溶液：精密量取供试品溶液1ml，置100ml量瓶中，用无水乙醇稀释至刻度，摇匀。

系统适用性溶液：取2-氧-氯吡格雷（四个异构体）混合对照品适量，精密称定，用无水乙醇溶解并定量稀释制成每1ml中约含1mg的溶液。

说明：上述溶液还可以使用包含乙腈、甲醇、丙醇或异丙醇或直接使用流动相溶解配制，以及其他可以溶解本品的试剂。

⒉色谱条件

（1）流动相的选择

本品结构式有硫酯键、酯键等中性键，异构体检测的流动相首选正己烷-异丙醇（90：10），色谱柱选择范围较广泛的直链淀粉-三（3，5-二甲基苯基氨基甲酸酯）柱（4.6×250mm，5μm），检测波长220nm，柱温30℃。经系统适用性溶液进样检测，采集色谱图。检测结果发现，化合物A与P1Z3的分离度为1.48，不能达到基线分离。

在此基础上，在其他条件不变的情况下，发明人又筛选了3个流动相，分别是：（1）正己烷-乙醇（90：10）；（2）正己烷-异丙醇-乙醇（91：7：2）；（3）正己烷-异丙醇-乙醇（90：4：6）。分别将系统适用性溶液注入液相，采集色谱图。

结果说明：条件（1）的色谱图中杂质P1Z3与P1Z2的分离度为1.98，不能达到基线分离；条件（2）中化合物A与P1Z3的分离度为2.00，分离度较好；条件（3）中化合物A与P1Z3分离度为2.74，P1Z3与P1Z2的分离度为4.65，P1Z2与P1Z4的分离度为12.78，完全达到基线分离的要求。根据筛选的结果，条件（2）和（3）均符合分析要求，但条件（3）中各异构体杂质能较大距离地均匀分开，为较理想的异构体检测的色谱条件。

（2）柱温的选择

在其他条件不变的情况下，选择四种色谱柱温度进行试验，柱温1（0℃）、柱温2（20℃）、柱温3（30℃）、柱温4（40℃）。采用上述四种条件，分别对系统适用性溶液进样检测，采集色谱图。

结果说明：四种柱温条件下，峰型均好，主峰与各杂质均能达到良好的分离，杂质峰之间也能达到良好的分离，各峰分离度均大于1.5，且测得的已知杂质含量及杂质个数无明显变化。表明柱温对有关物质测定结果无影响。

（3）流速的选择

在其他条件不变的情况下，选择五种色谱流速进行试验，流速1（0.5ml/min）、流速2（0.8ml/min）、流速3（1.0ml/min）、流速4（1.5ml/min）、流速5（2.0ml/min）。采用上述五种条件，分别对系统适用性溶液进样检测，采集色谱图。

结果说明：五种流速条件下，峰型均好，主峰与各杂质均能达到良好的分离，杂质峰之间也能达到良好的分离，各峰分离度均大于1.5，且测得的已知杂质含量及杂质个数无明显变化。表明流速对有关物质测定结果无影响。

（4）色谱柱型号考察

在其他条件不变的情况下，选择三种不同色谱型号：型号1：CHIRALPAK® AD-H ，型号2：CHIRALPAK® AD-3，型号3：CHIRALPAK® AD，分别对系统适用性溶液进样检测，采集色谱图。

结果说明：三种型号条件下，峰型均好，主峰与各杂质均能达到良好的分离，杂质峰之间也能达到良好的分离，各峰分离度均大于1.5，且测得的已知杂质含量及杂质个数无明显变化。表明硅胶表面涂敷有直链淀粉-三（3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯）的手性色谱柱均可适用于对本品有关物质的测定，且不受色谱柱品牌影响。

实验例2：方法学验证

（1）专属性验证

色谱条件：采用高效液相色谱法，用直链淀粉-三（3，5-二甲基苯基氨基甲酸酯）为填充剂的色谱柱（4.6×250mm，5μm），检测波长220nm，流速1.0ml/min，柱温30℃，进样量10μl。

对照品溶液、供试品溶液和系统适用性溶液同实验例1。

取各溶液在拟定的色谱条件下检测，试验结果见表1，系统适用性溶液的色图谱见附图1。

以上试验结果表明，在拟定的色谱条件下，各色谱峰均能达到基线分离，溶剂峰及供试品中的杂质峰对被检测峰无干扰，表明拟定色谱条件专属性好。

（2）检测限、定量限

取各杂质适量，用无水乙醇稀释制成一定浓度的对照品溶液，当峰高约为基线噪音的3倍，即信噪比约等于3:1时，为其检测限；当峰高约为基线噪音的10倍，即信噪比约等于10:1时，为其定量限。结果见表2。

本品异构体检查拟定的进样浓度为1mg/ml，进样量为10μl，绝对进样量为10000ng，远大于P1Z4的检测限的10000倍，表明拟定的进样浓度能够保证异构体的有效检出。

（3）线性及范围

取各异构体杂质适量，精密称定，加无水乙醇稀释制成相当于限度浓度定量限、50%、80%、100%、120%、150%的对照品溶液。照拟定的色谱条件，取线性溶液，注入液相色谱仪，记录色谱图。以进样浓度为横坐标，峰面积为纵坐标进行线性回归，结果见表3所述。

以上试验结果表明：P1Z3浓度在0.1754μg/ml～1.7538μg/ml范围内，与峰面积呈良好的线性关系；P1Z4浓度在0.2246μg/ml～2.2459μg/ml范围内，与峰面积呈良好的线性关系；化合物A浓度在0.0255μg/ml～2.0440μg/ml范围内，与峰面积呈良好的线性关系，且杂质与主成分峰的斜率比值均在0.95～1.05之间。

（4）重现性试验

由不同分析人员测定同一批样品，考察测定结果的接近程度。

试验结果说明：12份样品P1Z3、P1Z4均未检出，P1Z2均有检出，且峰面积RSD分别为0.5%和0.9%，表明拟定的异构体测定方法重现性良好。

（5）回收率试验

为了验证方法的准确性，采用了加样回收的方式进行考察。

取P1Z3、P1Z4杂质对照品适量，按拟定方法制备供试品溶液，在供试品溶液中分别加入限度浓度80%、100%、120%的杂质对照品后进样测定，计算回收率。试验结果见表4。

以上试验结果表明，9份样品中，P1Z3的回收率在93.23%～103.33%之间，平均回收率为：96.5%，RSD为4.82%；P1Z4的回收率在96.73%～106.12%之间，平均回收率为：100.9%，RSD为3.34%；满足相关技术要求，表明拟定色谱条件准确度良好。

（6）耐用性

为了验证拟定的液相条件发生微小变动时，测定结果的准确性不受影响的程度，对拟定色谱条件的耐用性进行了考察。

取系统适用性溶液、供试品溶液、自身对照溶液，按拟定色谱条件进行测定。

试验结果表明，当流速、柱温、色谱柱及流动相比例发生微小变动时，如流速±0.2ml/min、柱温±5℃、变换不同型号色谱柱（填料不变）、流动相中正己烷比例变化±2，结果显示异构体P1Z2、P1Z3、P1Z4的含量检测结果均无明显变化，表明拟定方法耐用性好。

实施例1：异构体检查1（正己烷、异丙醇、乙醇体积比为80:8:12为流动相）

各溶液配制和色谱条件同实验例2，其中色谱条件中流动相为正己烷、异丙醇、乙醇体积比为80:8:12的混合溶液，其他条件不变。

测定法：将各溶液注入色谱系统，采集色谱图。

实施例2：异构体检查2（正己烷、异丙醇、乙醇体积比为95:3:2为流动相）

各溶液配制和色谱条件同实验例2，其中色谱条件中流动相为正己烷、异丙醇、乙醇体积比为95:3:2的混合溶液，其他条件不变。

测定法：将各溶液注入色谱系统，采集色谱图。

实施例3：异构体检查3（正己烷、异丙醇、甲醇体积比为84:10:6为流动相）

各溶液配制和色谱条件同实验例2，其中色谱条件中流动相为正己烷、异丙醇、甲醇体积比为84:10:6的混合溶液，其他条件不变。

测定法：将各溶液注入色谱系统，采集色谱图。

实施例4：异构体检查4（正庚烷、异丙醇、乙醇体积比为90:4:6为流动相）

各溶液配制和色谱条件同实验例2，其中色谱条件中流动相为正庚烷、异丙醇、乙醇体积比为90:4:6的混合溶液，其他条件不变。

测定法：将各溶液注入色谱系统，采集色谱图。

实施例5：异构体检查5（正己烷、甲醇、乙醇体积比为90:3:7为流动相）

各溶液配制和色谱条件同实验例2，其中色谱条件中流动相为正己烷、甲醇、乙醇体积比为90:3:7的混合溶液，其他条件不变。

测定法：将各溶液注入色谱系统，采集色谱图。

实施例6：有关物质测定6

各溶液配制和色谱条件同实验例2，其中流速由原来的1.0ml/min改为2.0ml/min，其他条件不变。

测定：将各溶液注入色谱系统，采集色谱图。

实施例7：有关物质测定7

各溶液配制和色谱条件同实验例2，其中流速由原来的1.0ml/min改为0.5ml/min，其他条件不变。

测定：将各溶液注入色谱系统，采集色谱图。

数据统计和总结：汇总实验例2“专属性项下”和“重现性试验样品”以及上述实施例1～7的各色谱图，统计峰面积、保留时间和分离度，结果显示：（1）各系统适用性溶液色谱图中：各峰的峰型良好，各主峰与杂质峰以及杂质峰与杂质峰之间的分离度位于1.5～15.0之间，均大于1.5，各峰之间分离度较好，各方法专属性好，符合质量分析要求。（2）各供试品溶液色谱图中：各主峰化合物A，按外标法以峰面积计算，与实验例2的含量误差在0.10%以内；异构体P1Z3和P1Z4均未检出；异构体P1Z2均有检出，按自身对照法以峰面积计算，含量在0.08%～0.10%之间；表明各色谱条件专属性好、准确度高且重现性良好。据此可以确定本品的异构体质量控制标准，若样品中含有异构体杂质，按自身对照法以峰面积计算，单个杂质不超过0.1%。

Claims

1.一种(7aS , 2 'S)-2-氧化氯吡格雷及其异构体的检测方法，其特征在于，所述方法采用高效液相色谱法，操作步骤包括：

取(7aS , 2 'S)-2-氧化氯吡格雷，溶剂稀释后，得供试品溶液；

将供试品溶液注入高效液相色谱仪中，采用色谱条件检测即可；

系统适用性溶液：取(7aS , 2 'S)-2-氧-氯吡格雷及其异构体混合对照品适量，精密称定，用溶剂溶解并定量稀释制成溶液；

将系统适用性溶液注入高效液相色谱仪中，采用色谱条件检测即可；

所述色谱条件包括：

固定相：手性色谱柱；所述色谱柱的填料包含直链淀粉-三（3，5-二甲苯基氨基甲酸酯）；

流动相：烷烃和醇混合溶液，且醇至少为两种，且烷烃、醇、醇体积比为80～95：10～3：12～2；

检测波长220±2nm；

所述异构体包含P1Z2、P1Z3、P1Z4中的一种或几种；所述P1Z2、P1Z3、P1Z4的结构分别如下：

。

2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述溶剂包含乙腈、醇或流动相。

3.根据权利要求1～2任一所述的检测方法，其特征在于，所述烷烃和醇混合溶液中的醇包含甲醇、乙醇、丙醇或异丙醇中的至少两种。

4.根据权利要求1~2任一所述的检测方法，其特征在于，所述烷烃包含正己烷或正庚烷。

5.根据权利要求1~2任一所述的检测方法，其特征在于，所述色谱条件中的流动相为正己烷、异丙醇和乙醇的混合溶液。

6.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述供试品溶液的色谱图中，如有异构体杂质，单个异构体不超过0.1%。