CN115656394A

CN115656394A - 一种氧化氯吡格雷有关物质的检测方法

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Publication number: CN115656394A
Application number: CN202210964665.9A
Authority: CN
Inventors: 陆瑶; 张海; 徐霞
Original assignee: Chengdu Shibeikang Biological Medicine Technology Co ltd
Current assignee: Chengdu Shibeikang Biological Medicine Technology Co ltd
Priority date: 2022-08-12
Filing date: 2022-08-12
Publication date: 2023-01-31

Abstract

本发明涉及药物检测分析领域，具体涉及一种(7aS,2'S)‑2‑氧‑氯吡格雷基毒杂质S3Z4的检测方法。本发明的(7aS,2'S)‑2‑氧‑氯吡格雷有关物质检测方法采用高效液相色谱法，操作步骤包括：（1）取(7aS,2'S)‑2‑氧‑氯吡格雷，溶剂稀释后，得供试品溶液；（2）将供试品溶液注入高效液相色谱仪中检测；色谱条件的固定相为十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱，流动相为稀酸和醇的混合溶液；检测波长210±2nm；流速为0.8～1.5ml/min。本发明提供的检测方法专属性好、灵敏度和准确度高，适合用于(7aS,2'S)‑2‑氧‑氯吡格雷的药品注册质量研究。

Description

一种氧化氯吡格雷有关物质的检测方法

技术领域

本发明涉及药物检测分析领域，具体涉及一种(7aS, 2'S)-2-氧-氯吡格雷有关物质的检测方法。

背景技术

(7aS, 2’S)-2-氧-氯吡格雷（以下简称“化合物A”），为氯吡格雷在人体的代谢产物，是一款活性更高且更安全的血小板聚集抑制剂，其化学名为：（S）-2-（2-氯苯基）-2-（（S）-2-氧代-2,6,7,7a-四氢噻吩[3,2-c]并吡啶-5（4H）基）乙酸甲酯：

。

目前化合物A的制备工艺主要为专利CN104245707A报道的路线，以R-(-)-邻氯扁桃酸（SM1）为起始物料，经甲酯化后生成中间体I，与对硝基苯磺酰氯(SM2)缩合生成关键中间体II，再经取代、提纯生成目标化合物化合物A。大致反应路线如下：

。

根据该合成路线，起始物料SM3的合成过程参考文献（DOI: 10.1021/acs.joc.5b00632）将采用三苯基氯甲烷（化合物编码S3Z4）作为反应试剂,结构如下：

该化合物为警示结构，属于3类杂质，具有导致基因毒性风险，有可能最终残留在SM3中，一旦流入样品将影响药品安全，因此需要将该化合物作为基毒杂质在样品中控制。对于化合物A的基毒杂质目前未见报道，也没有相关质量研究方面信息。因此，开发适合分析化合物A基毒杂质的质量研究方法，提高药物质量监控可靠度，是目前该药物质量研究值得重视的亟待解决的技术问题。

发明内容

为解决(7aS, 2'S)-2-氧-氯吡格雷的质量控制需求，本发明提供一种(7aS, 2'S)-2-氧-氯吡格雷有关物质的检测方法。

本发明提供的(7aS, 2'S)-2-氧-氯吡格雷有关物质检测方法，采用高效液相色谱法，至少能检测大部分杂质，包括但不限于杂质S3Z4。

本发明提供一种(7aS, 2'S)-2-氧-氯吡格雷有关物质检测方法，所述方法采用高效液相色谱法，操作步骤如包括：

（1）取(7aS, 2'S)-2-氧-氯吡格雷，溶剂稀释后，得供试品溶液；

（2）将供试品溶液注入高效液相色谱仪中，采用色谱条件检测即可。

在某些实施方式中，上述色谱条件包含：

固定相：十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱；

流动相：稀酸和醇的混合溶液；

检测波长210±2nm。

在某些实施方式中，上述溶剂包含乙腈或醇。

在某些实施方式中，上述流动相中稀酸和醇的体积比为30～10：70～90；优选20：80。

在某些实施方式中，上述稀酸的酸包含甲酸、冰醋酸、磷酸或盐酸。

在某些实施方式中，上述稀酸的浓度为0.01%～2.0%；优选0.05%～1.0%。

在某些实施方式中，上述醇包含甲醇、乙醇、丙醇或异丙醇。

在某些实施方式中，上述色谱条件的流速为0.5～2.0ml/min，优选0.8～1.5ml/min。

在某些实施方式中，上述色谱条件的柱温为0～40℃；优选20～40℃。

在某些实施方式中，上述有关物质包含基毒杂质；进一步的，上述基毒杂质包含S3Z4。

在某些实施方式中，上述供试品溶液的色谱图中，如果有基毒杂质，按外标法以峰面积计算，单个基毒杂质不超过62.5ppm。

在某些实施方式中，上述供试品溶液的色谱图中，如果有基毒杂质，单个基毒杂质的含量不超过62.5ppm。

在某些实施方式中，上述供试品溶液的色谱图中，如果有基毒杂质，所述基毒杂质的总和不超过200ppm。

有益效果：本发明的(7aS, 2'S)-2-氧-氯吡格雷有关物质检测方法各峰的峰型好，各峰之间分离度均大于1.5，分离度良好，方法专属性好、灵敏度和准确度高，符合质量分析检测要求，适合本品的基毒杂质有关物质质量研究。

说明：（1）本发明色谱条件中所使用的“0.1%甲酸溶液-甲醇（20：80，v/v）”流动相中，“0.1%”或者“20：80”，均是体积比，其中“0.1%”指100ml溶液中含有0.1ml，“20：80”指体积比为20：80。其他流动相中用量在没有特别说明情况下作类似解释。（2）上述稀酸为稀酸水溶液。

附图说明

图1：系统适用性溶液色谱图。

具体实施方式

下面将结合实验例和实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的各例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。各例中未注明的具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为通过市购获得的常规产品。

化合物A在乙腈中溶解，在甲醇中微溶，在水中几乎不溶。以下实验例和实施例所用的化合物A工作对照品（批号：201113-D，纯度99.6%）和供试品（批号：39201001）均来源于成都施贝康生物医药科技有限公司，杂质S3Z4自九鼎化学购买。

S3Z4属于3类基毒杂质，无阈值证据，根据ICH M7法规规定，可接受其风险的摄入量为1.5μg/天，化合物A的临床剂量约为6mg/天，按最大爬坡剂量为24mg/天，我们通过TTC方法计算出杂质的控制限度为62.5ppm（即1.5μg/24mg）。

实验例1：化合物A有关物质检测方法的方法学考察

⒈各种对照品溶液和供试品溶液的配制

供试品溶液：取样品（化合物A，批号：39201001）适量，精密称定，加乙腈溶解并定量稀释制成每1ml约含2mg的溶液。

对照品溶液：取S3Z4对照品适量，用乙腈溶解并定量稀释制成每1ml约含0.3μg的溶液。

系统适用性溶液：取S3Z4对照品适量，用乙腈溶解并定量稀释制成每1ml约含3μg的溶液，作为杂质储备液；取化合物A适量，加入精密量取的杂质储备液1ml，用乙腈溶解并定量稀释制成每1ml中S3Z4约含0.3μg、化合物A约含2mg的混合溶液。

说明：上述溶液还可以使用包含甲醇、乙醇、丙醇或异丙醇溶解配制，以及其他可以溶解本品的溶剂。

⒉色谱条件

（1）检测波长的选择

取杂质S3Z4和主成分化合物A的供试品溶液，在190～400nm扫描，试验结果见表1-1。

根据上述试验结果，杂质及化合物A没有相同的最大吸收，由于所定方法为杂质限度法，波长对杂质检出的影响较微小，因此选择末端吸收210nm作为检测波长。

（2）方法的选择

根据化合物结构差异，初步拟定如下色谱条件：

条件1：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以含0.1%甲酸溶液为流动相；检测波长为210nm；柱温30℃，流速1.0ml/min，进样体积20μl。

条件2：含0.1%甲酸的甲醇溶液为流动相，其他同条件1。

条件3：用0.1%甲酸溶液-甲醇（20：80，v/v）为流动相，其他同条件1。

结果说明：色谱条件1所得的供试品溶液色谱图显示待测杂质附近有一干扰峰；色谱条件2的主峰前的峰未达到基线分离；色谱条件3能够对各个杂质有效地分离。

（3）柱温的选择

在上述色谱条件3基础上，在其他条件不变的情况下，选择四种色谱柱温度进行试验，柱温1（0℃）、柱温2（20℃）、柱温3（30℃）、柱温4（40℃）。采用上述四种条件，分别对系统适用性溶液进样检测，采集色谱图。

结果说明：四种柱温条件下，峰型均好，主峰与各杂质均能达到良好的分离，杂质峰之间也能达到良好的分离，各峰分离度均大于1.5，且测得的已知杂质含量及杂质个数无明显变化。表明柱温对有关物质测定结果无影响。

（4）流速的选择

在上述色谱条件3基础上，在其他条件不变的情况下，选择五种色谱流速进行试验，流速1（0.5ml/min）、流速2（0.8ml/min）、流速3（1.0ml/min）、流速4（1.5ml/min）、流速5（2.0ml/min）。采用上述三种条件，分别对系统适用性溶液进样检测，采集色谱图。

结果说明：五种流速条件下，峰型均好，主峰与各杂质均能达到良好的分离，杂质峰之间也能达到良好的分离，各峰分离度均大于1.5，且测得的已知杂质含量及杂质个数无明显变化。表明流速对有关物质测定结果无影响。

（5）色谱柱型号的选择

在上述色谱条件3基础上，在其他条件不变的情况下，选择三种不同色谱型号：型号1： C18柱，250*4.6mm，5µm，型号2：C18柱，250*4.6mm，3.5µm，型号3：C18柱，250*3.0mm，3.0µm，分别对系统适用性溶液进样检测，采集色谱图。

结果说明：三种型号条件下，峰型均好，主峰与各杂质均能达到良好的分离，杂质峰之间也能达到良好的分离，各峰分离度均大于1.5，且测得的已知杂质含量及杂质个数无明显变化。表明C18柱的型号对有关物质测定结果无影响。此外，本发明人基本尝试过常见的C18柱，都能满足分离度大于1.5，且各峰型良好，证明本发明的色谱方法不受柱子型号和品牌的影响。

实验例2：方法验证

本实验下所用溶液及其配制同实验例1，色谱条件如下：

用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以含0.1%甲酸溶液-甲醇（20：80）为流动相；检测波长为210nm；柱温30℃；流速为1.0ml/min；进样体积20μl。

⒈专属性

取各溶液在拟定的色谱条件下检测，试验结果见表2-1，系统适用性溶液的色谱图见附图1。

以上试验结果表明，在拟定的色谱条件下，各色谱峰均能达到基线分离，溶剂峰及供试品中的杂质峰对被检测峰无干扰，表明拟定色谱条件专属性良好。

⒉检测线、定量限

取S3Z4适量，用乙腈稀释制成一定浓度的对照溶液，当峰高约为基线噪音的3倍，即信噪比约等于3:1时，为S3Z4的检测限；当峰高约为基线噪音的10倍，即信噪比约等于10:1时，为S3Z4的定量限。结果见表2-2。

本品S3Z4检查拟定的进样浓度为2mg/ml，进样量为20μl，其绝对进样量为S3Z4的检测限浓度的100000倍，表明拟定的进样浓度能够保证S3Z4的有效检出。

⒊线性范围

取S3Z4适量，精密称定，加乙腈稀释制成相当于限度浓度定量限、50%、80%、100%、120%、150%的对照品溶液。照拟定的色谱条件，取线性溶液，注入液相色谱仪，记录色谱图。以进样浓度为横坐标，峰面积为纵坐标进行线性回归，结果见表2-3。

结果表明S3Z4浓度在0.0100μg/ml～0.4698μg/ml范围内，与峰面积呈良好的线性关系。

⒋进样精密度

取100%限度浓度对照品溶液，连续进样6次，记录色谱图，考察进样精密度，其结果见表2-4。

以上结果显示，连续进样6次，S3Z4的峰面积RSD为0.8%，满足液相色谱测定的精密度要求。

⒌重复性试验

取样品适量，平行制备6份，考察供试品S3Z4含量RSD。试验结果见表2-5。

以上试验结果表明，测定6份样品S3Z4均未检出，方法重复性良好。

⒍回收率

为了验证方法的准确性，采用了加样回收的方式进行考察。

取S3Z4杂质对照品适量，按拟定方法制备供试品溶液，在供试品溶液中分别加入限度浓度50%、100%、150%的S3Z4后进样测定，计算回收率。试验结果见表2-6。

以上试验结果表明，9份样品中，S3Z4回收率在94.08%～96.99%之间，平均回收率为：96.2%，RSD为1.1%，满足相关技术要求，表明拟定色谱条件准确度良好。

⒎耐用性

为了验证拟定的液相条件发生微小变动时，测定结果的准确性不受影响的程度，对拟定色谱条件的耐用性进行了考察。

取系统适用性溶液、供试品溶液、自身对照溶液，按拟定色谱条件进行测定。

试验结果表明，当流速、柱温、色谱柱及流动相发生微小变动时，如流速变化±0.2ml/min、柱温变化±5℃、变换不同型号色谱柱（填料不变）、流动相中有机相的比例变化±2，流动相中酸的用量变化±0.05%，在各条件下，测得的已知杂质含量及杂质个数无明显变化。表明柱温、流速、色谱柱、流动相对有关物质测定结果无影响。

实施例1：有关物质测定1（流动相1）

各溶液配制和色谱条件同实验例2，其中色谱条件的流动相由0.1%甲酸溶液-甲醇（20：80）换为0.1%甲酸溶液-甲醇（10：90），其他条件不变。

测定：将各溶液注入色谱系统，采集色谱图。

实施例2：有关物质测定2（流动相2）

各溶液配制和色谱条件同实验例2，其中色谱条件的流动相由0.1%甲酸溶液-甲醇（20：80）换为0.1%甲酸溶液-甲醇（30：70），其他条件不变。

测定：将各溶液注入色谱系统，采集色谱图。

实施例3：有关物质测定3（流动相3）

各溶液配制和色谱条件同实验例2，其中色谱条件的流动相由0.1%甲酸溶液-甲醇（20：80）换为0.1%甲酸溶液-异丙醇（20：80），其他条件不变。

测定：将各溶液注入色谱系统，采集色谱图。

实施例4：有关物质测定4（流动相4）

各溶液配制和色谱条件同实验例2，其中色谱条件的流动相由0.1%甲酸溶液-甲醇（20：80）换为0.01%盐酸溶液-甲醇（20：80），其他条件不变。

测定：将各溶液注入色谱系统，采集色谱图。

实施例5：有关物质测定5（流动相5）

各溶液配制和色谱条件同实验例2，其中色谱条件的流动相由0.1%甲酸溶液-甲醇（20：80）换为2.0%磷酸溶液-甲醇（20：80），其他条件不变。

测定：将各溶液注入色谱系统，采集色谱图。

实施例6：有关物质测定6

各溶液配制和色谱条件同实验例2，其中流速由原来的1.0ml/min改为2.0ml/min，其他条件不变。

测定：将各溶液注入色谱系统，采集色谱图。

实施例7：有关物质测定7

各溶液配制和色谱条件同实验例2，其中流速由原来的1.0ml/min改为0.5ml/min，其他条件不变。

测定：将各溶液注入色谱系统，采集色谱图。

数据统计和总结：汇总实验例2“专属性项下”和上述实施例1～7的色谱图，统计峰面积、保留时间和分离度，结果显示：（1）各系统适用性溶液色谱图中：各峰的峰型良好，各主峰与杂质峰以及杂质峰与杂质峰之间的分离度均大于1.5，各峰之间分离度较好，各方法专属性好，符合质量分析要求。（2）各供试品溶液色谱图中：各主峰化合物A，按外标法以峰面积计算，含量相较于实验例2的差值在±0.1%以内；杂质S3Z4均未检出，表明拟定的杂质测定方法准确度高、重现性良好。据此可以确定本品的质量标准，如果样品中有基毒杂质S3Z4，按外标法以峰面积计算，含量不超过62.5ppm；进一步地，样品中基毒杂质总和不超过200ppm。

Claims

1.一种(7aS, 2'S)-2-氧-氯吡格雷有关物质的检测方法，其特征在于，所述方法采用高效液相色谱法，操作步骤包括：

2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述色谱条件包含：

固定相：十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱；

流动相：稀酸和醇的混合溶液；

检测波长210±2nm。

3.根据权利要求1～2任一所述的检测方法，其特征在于，所述溶剂包含乙腈或醇。

4.根据权利要求2～3所述的检测方法，其特征在于，所述流动相中稀酸和醇的体积比为30～10：70～90；优选20：80。

5.根据权利要求2～4任一所述的检测方法，其特征在于，所述稀酸的酸包含甲酸、冰醋酸、磷酸或盐酸。

6.根据权利要求2～5任一所述的检测方法，其特征在于，所述稀酸的浓度为0.01%～2.0%。

7.根据权利要求2～6所述的检测方法，其特征在于，所述醇包含甲醇、乙醇、丙醇或异丙醇。

8.根据权利要求2～7所述的检测方法，其特征在于，所述色谱条件的流速为0.5ml/min～2.0ml/min。

9.根据权利要求1～8任一所述的检测方法，其特征在于，所述有关物质包含基毒杂质；优选地，所述基毒杂质包含S3Z4。

10.根据权利要求1～9任一所述的检测方法，其特征在于，所述供试品溶液的色谱图中如果有基毒杂质，单个基毒杂质的含量不超过62.5ppm；进一步地，上述供试品溶液的色谱图中，如果有基毒杂质，所述基毒杂质总和不超过200ppm。