CN108072709B - 测定琥珀酸曲格列汀原料药中对映异构体含量的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提出了一种测定琥珀酸曲格列汀原料药中对映异构体含量的方法，该方法包括：通过手性液相色谱分析方法对所述琥珀酸曲格列汀原料药进行分析，以便获得色谱图；以及基于所述色谱图，确定所述对映异构体含量，其中，所述手性液相色谱分析方法采用以下条件：色谱柱为CHIRALPAK AD‑H手性色谱柱，检测器为DAD，检测波长为272nm，柱温为30℃～35℃，采样频率为0.31Hz，流动相是体积比为正己烷:乙醇:三乙胺:三氟乙酸＝900:100:2:2的混合溶液，流速为1.0mL/min～1.2mL/min，洗脱采用等度洗脱，运行时间为30min，利用该方法，可简便、准确、灵敏、专属性地测定琥珀酸曲格列汀原料药中对映异构体含量，从而有效控制琥珀酸曲格列汀原料药的药效、质量和药用安全。

Description

测定琥珀酸曲格列汀原料药中对映异构体含量的方法

技术领域

本发明涉及生物医药领域，具体的，本发明涉及一种测定琥珀酸曲格列汀原料药中对映异构体含量的方法。

背景技术

琥珀酸曲格列汀是由日本武田公司推出的糖尿病新药，是一种新型DPP-IV抑制剂，其结构式为

琥珀酸曲格列汀具有一个手性中心，琥珀酸曲格列汀原料药中对映异构体为杂质成分，会影响琥珀酸曲格列汀产品的质量和疗效。如何准确测定琥珀酸曲格列汀原料药中对映异构体含量，进而有效控制琥珀酸曲格列汀产品的质量，成为拭待解决的关键问题。

现有技术中国专利CN105675733A公开一种用液相色谱法分离测定琥珀酸曲格列汀及其光学异构体的方法，包括以三(S)-α-甲基苯基氨基甲酸酯直链淀粉为填料的手性色谱柱，和正己烷-低级醇溶液为流动相，其中，正己烷与低级醇的体积比为25:75～75:25。

发明人根据现有技术CN105675733A中公开的色谱条件，对琥珀酸曲格列汀原料药中对映异构体进行测定，发现采用乙醇作为稀释剂，溶解性较差，进样量较多，影响峰型，且容易导致柱效下降，同时流动相中单独添加碱性添加剂会导致主峰附近有明显的台阶，影响对映异构体的准确定量。

发明内容

本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提出了一种简便、准确、灵敏、专属地检测琥珀酸曲格列汀原料药中对映异构体含量的方法。

在本发明的第一方面，本发明提出了一种测定琥珀酸曲格列汀原料药中对映异构体含量的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：通过手性液相色谱分析方法对所述琥珀酸曲格列汀原料药中对映异构体进行分析，以便获得色谱图；以及基于所述色谱图，确定所述琥珀酸曲格列汀原料药中对映异构体含量，其中，所述手性液相色谱分析方法采用以下条件：色谱柱为CHIRALPAK AD-H，4.6×250mm，5微米，检测器为DAD，检测波长为272nm，柱温为30℃～35℃，采样频率为0.31Hz，流动相是体积比为正己烷:乙醇:三乙胺:三氟乙酸＝900:100:2:2的混合溶液，流速为1.0mL/min～1.2mL/min，洗脱梯度为等度洗脱，等度洗脱中溶剂体积比为正己烷:乙醇:三乙胺:三氟乙酸＝900:100:2:2，运行时间为30min。

利用根据本发明实施例的检测方法，可简便、准确、灵敏、专属地测定琥珀酸曲格列汀原料药中对映异构体含量，从而有效控制琥珀酸曲格列汀原料药的质量。

根据本发明的实施例，上述测定琥珀酸曲格列汀原料药中对映异构体含量的方法还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：

根据本发明的实施例，在手性液相色谱分析方法中，所述琥珀酸曲格列汀原料药是以供试品溶液的形式提供的，其中，所述供试品溶液为琥珀酸曲格列汀原料药的甲醇溶液，并且基于每毫升所述供试品溶液，琥珀酸曲格列汀原料药的含量为7mg。发明人通过实验发现，琥珀酸曲格列汀原料药在上述甲醇溶液中溶解能力较好，同时，琥珀酸曲格列汀原料药的进样浓度为7mg/mL，既可保证提供足够好的检测灵敏度，同时又保证主峰不因浓度过载而变形及不在紫外的线性响应范围内，即确保不因浓度过高而导致紫外谱变形从而致使纯度因子不合格。

根据本发明的实施例，所述供试品溶液的用量为5微升，对琥珀酸曲格列汀原料药中对映异构体含量的测定更加真实、可靠、准确。

根据本发明的实施例，所述基于所述色谱图，确定所述琥珀酸曲格列汀原料药中对映异构体含量是通过以下公式确定的：

其中：R_i为供试品溶液中对映异构体的峰面积；

R_T为供试品溶液中对映异构体的峰面积和琥珀酸曲格列汀的峰面积之和。根据本发明的实施例，采用上述方式确定琥珀酸曲格列汀原料药中对映异构体含量，准确率高，结果更加真实、可靠。

在本发明的第二方面，本发明提出了一种测定琥珀酸曲格列汀原料药中对映异构体含量的方法。根据本发明的实施例，该方法包括：

仪器与色谱条件

色谱柱为CHIRALPAK AD-H，4.6×250mm，5微米，检测器为DAD，检测波长为272nm，柱温为30℃，采样频率为0.31Hz，流动相是体积比为正己烷:乙醇:三乙胺:三氟乙酸＝900:100:2:2的混合溶液，流速为1.2mL/min，洗脱梯度为等度洗脱，等度洗脱中溶剂体积比为正己烷:乙醇:三乙胺:三氟乙酸＝900:100:2:2，运行时间为30min，

配制供试品溶液

取供试品约35mg，精密称定，置5mL容量瓶中，用4mL甲醇溶解，并做超声处理，用甲醇稀释至刻度，摇匀即得所述供试品溶液；以及

注入色谱仪，进样量为5微升，得到色谱图，根据所述色谱图计算得到所述供试品溶液中对映异构体含量，

其中，按以下公式计算供试品溶液中对映异构体含量，取2次测定结果的平均值作为测定结果：

其中：R_i为供试品溶液中对映异构体的峰面积；

R_T为供试品溶液中对映异构体的峰面积和琥珀酸曲格列汀的峰面积之和。

利用根据本发明实施例的检测方法，可准确、灵敏、快速地测定琥珀酸曲格列汀原料药中对映异构含量，从而有效控制琥珀酸曲格列汀原料药的质量。

需要说明的是，在本发明中，无论是否使用“大约”或“约”等字眼，所有在此公开了的数字均为近似值。每一个数字的数值有可能会出现10％以下的差异或者本领域人员认为的合理的差异，如1％、2％、3％、4％或5％的差异。本发明中描述的“杂质A”是指对映异构体，本发明中mg表示毫克，mm表示毫米，nm表示纳米，mL表示毫升，L表示升，min表示分钟，Hz表示赫兹。

附图说明

图1是根据本发明实施例1的流动相体积比为正己烷:乙醇:二乙胺＝900:100:1条件下的供试品加标溶液的色谱图；

图2为根据本发明实施例1的琥珀酸曲格列汀及对映异构体的紫外吸收光谱；

图3是根据本发明实施例1的添加剂体积比为三氟乙酸:三乙胺＝0.8:1～2:2条件下的供试品加标溶液的色谱图；

图4是根据本发明实施例3的空白溶液的色谱图；

图5是根据本发明实施例3的灵敏度溶液的色谱图。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1

在本实施例中，发明人详细介绍了测定琥珀酸曲格列汀原料药中对映异构体含量的方法的开发过程以及系统适用性标准选择。

1.1 色谱柱及流动相中添加剂的确定

对映异构体的结构和基本信息如表1所示，发明人首先采用大赛璐手性分析柱DAICEL CHIRALPAK AS-H，使用正己烷-乙醇混合溶液为流动相。具体色谱条件如表2所示。

表1 对映异构体的结构和基本信息

表2 色谱条件

在表2色谱条件下，琥珀酸曲格列汀和杂质A基本不成峰形，向流动相中加入碱性调节剂二乙胺，两者未达到基线分离，降低醇的比例后，即流动相的体积比为正己烷:乙醇:二乙胺＝900:100:1，琥珀酸曲格列汀和杂质A的分离情况略有改善，但供试品加标溶液中琥珀酸曲格列汀主峰前有两个小峰，其中琥珀酸曲格列汀主峰的保留时间为17.50min，主峰前两个小峰的保留时间分别为12.53min、14.72min，如图1所示。保留时间14.72min的未知峰与琥珀酸曲格列汀主峰之间呈明显的台阶，这将影响对琥珀酸曲格列汀原料药中对映异构体的准确定量。

发明人采用DAICEL CHIRALPAK AD-H手性柱，琥珀酸曲格列汀主峰前的未知峰与主峰之间台阶减小，因此选择DAICEL CHIRALPAK AD-H手性柱为所建方法的分析柱。

发明人采用三乙胺为添加剂，主峰前的平台减小，保留时间为12.53min的未知峰仍存在，向流动相中添加酸性添加剂三氟乙酸和碱性添加剂三乙胺，使pH试纸显中性，供试品溶液中琥珀酸曲格列汀主峰前的台阶以及未知峰消失，因此，发明人选择在流动相中添加酸性添加剂三氟乙酸和碱性添加剂三乙胺。

1.2 检测波长的确定

上述考察已确定DAICEL CHIRALPAK AD-H手性柱、三氟乙酸和三乙胺添加剂，发明人在此基础上，对检测波长进一步优化。

琥珀酸曲格列汀及杂质A的紫外光谱图一样，如图2所示，在正己烷:乙醇:三乙胺:三氟乙酸＝900:100:1.0:0.8流动相体系下，均在204nm和272nm处有最大吸收，其中在272nm色谱条件下，空白干扰小，灵敏度高，因此，最终选择检测波长为272nm。

1.3 添加剂比例的确定

发明人进一步对酸性添加剂三氟乙酸与碱性添加剂三乙胺的比例进行优化，考察结果如图3所示。考察结果显示，三氟乙酸与三乙胺体积比分别为0.8:1、1:1、1:0.8、2:2时；供试品加标溶液中琥珀酸曲格列汀与其对映异构体分离度分别2.77、2.47、2.56、3.00；琥珀酸曲格列汀对称因子分别为1.58、1.55、1.51、1.39，其中体积比为三氟乙酸:三乙胺＝2:2，琥珀酸曲格列汀与其对映异构体的分离度最大为3.0，琥珀酸曲格列汀对称因子为1.39，峰形较好。因此，发明人最终确定添加剂体积比为三氟乙酸:三乙胺＝2:2，即每1L正己烷-乙醇溶剂中加入0.2％的三氟乙酸和0.2％的三乙胺。

1.4 柱温及流速的选择与优化

基于上述已确定条件，发明人对柱温进行考察，考察的结果如表3所示，在20℃、25℃、30℃、35℃柱温条件下，供试品加标溶液中琥珀酸曲格列汀与杂质A的分离度分别为2.59、3.00、3.34、3.52，均达到了有效分离，且琥珀酸曲格列汀主峰与杂质A出峰时间均合适，其中30℃柱温条件下，琥珀酸曲格列汀与杂质A分离度为3.34，琥珀酸曲格列汀保留时间为23.31min，杂质A的保留时间为17.23min，在综合考虑方法分离度、运行时间及色谱柱寿命情况下，优选柱温为30℃。

表3 柱温考察结果

发明人在柱温为30℃条件下，进一步对流速进行考察。考察结果显示流速为1.0mL/min时，杂质A的保留时间为17.23min，琥珀酸曲格列汀与杂质A的分离度为3.34；流速为1.2mL/min时，杂质A的保留时间为14.33min，琥珀酸曲格列汀与杂质A的分离度为3.17，两个流速下琥珀酸曲格列汀与杂质A均达到基线分离，其中流速为1.2mL/min时，样品出峰时间提前约3min，因此，优选流速为1.2mL/min。

1.5 稀释剂的选择

供试品为琥珀酸曲格列汀原料药，发明人发现当溶剂为乙醇时，供试品的溶解度有限，灵敏度不能满足要求，发明人通过加入碱，来增加供试品的溶解性，用体积比为乙醇:三乙胺＝1000:1的混合溶液作为稀释剂，即乙醇-0.1％三乙胺的混合溶液为稀释剂，样品浓度为2mg/mL，进样体积为20微升，运行多针后，发现峰形前沿，导致柱效下降，进一步往乙醇-0.1％三乙胺混合溶液中加入约一倍体积的正己烷，样品有析出，当向乙醇-0.1％三乙胺混合溶液中加入约一倍体积的体积比为正己烷:乙醇:三乙胺:三氟乙酸＝900:100:2:2的流动相，样品仍有析出，无法完全溶解，增加乙醇-0.1％三乙胺混合溶液中三乙胺的含量为0.2％，样品能够溶解，但溶液不稳定。

发明人以甲醇为稀释剂，样品能够溶解，样品浓度为7.0mg/mL，连续进样多针，峰形对称稳定，增大进样体积时，峰型变宽，对称因子变大，因此最终选择甲醇为稀释剂，进样体积为5微升。

1.6 采样频率及供试品溶液制备方法确定

在仪器默认的采样频率下，背景噪音较大，难以实现0.05％水平信噪比不小于10，主峰峰宽远大于0.85min，发明人最终通过实验，确定采样频率为0.31Hz。上述确定的稀释剂为甲醇，对供试品的溶解能力较好，供试品配制浓度及进样量的确定，原则为一方面提供足够好的检测灵敏度，同时保证主峰不因浓度过载而变形及不在紫外的线性响应范围内，即确保不因浓度过高而导致紫外谱变形从而致使纯度因子不合格，发明人最终通过实验，确定供试品溶液的浓度为7.0mg/mL，进样体积为5微升。

1.7 系统适用性标准选择

基于上述方法开发的数据，选择空白溶液在系统适用性溶液琥珀酸曲格列汀及杂质A保留时间处无干扰；灵敏度溶液信噪比≥10；系统适用性溶液中，琥珀酸曲格列汀与杂质A的分离度≥1.5；主峰对称因子在0.8～1.5之间作为系统适用性标准。

实施例2

在本实施例中，详细介绍了发明人是如何基于实施例1所确定的测定琥珀酸曲格列汀原料药中对映异构体含量的方法的色谱条件获得色谱图的，并利用色谱图如何计算得到对映异构体的含量。

2.1 相关溶液的配制

稀释剂/空白溶液：甲醇；

供试品溶液：取供试品约35mg，精密称定，置5mL容量瓶中，用4mL甲醇溶解，并做超声处理，用甲醇稀释至刻度，摇匀，平行配制2份；

灵敏度溶液：精密移取1.0mL供试品溶液，置100mL容量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀；精密移取5.0mL上述溶液置100mL容量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得，配制1份；

杂质A对照品储备液：称取杂质A对照品约7mg，置50mL容量瓶中，加稀释剂适量超声使溶解，并稀释至刻度，摇匀，即得，配制1份；

杂质A对照品母液：取杂质A对照品储备液5mL，精密移取，置于25mL容量瓶中，加入稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得；

系统适用性溶液：取琥珀酸曲格列汀对照品约35mg，精密称定，置5mL容量瓶中；再精密移取2mL杂质A对照品母液置上述容量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得，配制1份。

2.2 色谱条件

色谱柱为CHIRALPAK AD-H，4.6×250mm，5微米，

检测器为DAD，

检测波长为272nm，

柱温为30℃，

采样频率为0.31Hz，

流动相是体积比为正己烷:乙醇:三乙胺:三氟乙酸＝900:100:2:2的混合溶液，

流速为1.2mL/min，

洗脱梯度为等度洗脱，等度洗脱中溶剂体积比为正己烷:乙醇:三乙胺:三氟乙酸＝900:100:2:2，

运行时间为30min。

2.3 相关检测操作

待基线平衡后，取空白溶液按2.2色谱条件进样1-2针，待系统充分平衡后，然后取灵敏度溶液、系统适用性溶液和供试品溶液按表4序列进样。分别记录色谱图。

表4 进样序列表

样品名	进样针数
		空白溶液	1或2
灵敏度溶液	1
		系统适用性溶液	1
供试品溶液1	1
		供试品溶液2	1
灵敏度溶液	1

注：如果系统适用性不合格，应立即停止进样，并查找原因，排查原因后，再重做系统适用性实验。

2.4 基于色谱图的对映异构体含量的计算方法

按照以下公式计算供试品中对映异构体的含量，以2次测定结果的平均值作为检测结果：

其中：R_i为供试品溶液中对映异构体的峰面积；

R_T为供试品溶液中对映异构体的峰面积和琥珀酸曲格列汀的峰面积之和。

平行测定2次，对映异构体的含量的绝对差值≤0.05％。

实施例3

在本实施例中，发明人对本发明测定琥珀酸曲格列汀原料药中对映异构体含量的方法学考察。

3.1 系统适用性考察

空白溶液的配制：同2.1项下的稀释剂/空白溶液；

灵敏度溶液的配制：同2.1项下的灵敏度溶液；

系统适用性溶液的配制：同2.1项下系统适用性溶液配制方法，配制1份；

操作：待系统平衡后，取空白溶液进样1针、灵敏度溶液和系统适用性溶液各进样1针，记录色谱图。

空白溶液检测结果如图4所示，2.2色谱条件下的检测方法不受干扰结果显示杂质检测不受干扰。

灵敏度溶液检测结果如图5所示，利用2.2色谱条件下的检测方法，琥珀酸曲格列汀信噪比为12，灵敏度符合检测要求。

系统适用性检测结果显示，利用2.2色谱条件下的检测方法，检测系统适用性溶液所得图谱中，琥珀酸曲格列汀与其对映异构体的分离度为2.2，分离度≥1.5，曲格列汀的对称因子为1.2，对称因子在0.8～1.5之间，因此，2.2色谱条件下的检测方法的系统适用性良好。

3.2 专属性考察

空白溶液、供试品溶液、杂质A对照品母液、系统适用性溶液配制方法同2.1项下相应的配制方法，各配制1份；

增敏溶液的配制：取琥珀酸曲格列汀约35mg，精密称定，置5mL量瓶中；再精密移取2mL杂质A对照品母液置上述容量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得。

操作：待系统平衡后，取空白溶液、系统适用性溶液、供试品溶液和增敏溶液各进样1针，记录色谱图。结果如表5所示，系统适用性溶液、供试品溶液与增敏溶液中琥珀酸曲格列汀与其对映异构体的分离度均≥1.5；供试品溶液与增敏溶液和系统适用性溶液中的琥珀酸曲格列汀与其对映异构体保留时间一致；系统适用性溶液、供试品溶液和增敏溶液中琥珀酸曲格列汀的纯度因子≥0.990；与供试品溶液相比，增敏溶液中对映异构体保留时间处的峰的峰面积增强；空白溶液与系统适用性溶液、供试品溶液、增敏溶液比较，空白溶液在琥珀酸曲格列汀及其对映异构体保留时间处无干扰，符合要求。

表5 专属性考察结果

3.3 线性关系考察

空白溶液的配制：配制方法同2.1项，配制1份；

线性储备液的配制：取杂质A对照品约为13mg，精密称定，置于50mL容量瓶中，加入稀释剂超声溶解并稀释至刻度，摇匀，即得，配制1份；

线性母液的配制：取线性储备液5.0mL，精密移取，置于50mL容量瓶中，加入稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得；

定量限溶液的配制：取线性母液1mL，精密移取，置于10mL容量瓶中，加入稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得；

线性溶液的配制：精密移取如表6所示的不同体积的线性母液于以下不同规格容量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得各浓度下的线性溶液。

表6

操作：待系统适用性合格后，取空白溶液进样1针，取定量限溶液和各浓度水平下线性溶液，依次从低浓度到高浓度，每个浓度进样1次，记录色谱图，结果如表7所示。以每个浓度下主峰峰面积对其实际浓度作一元线性回归，得线性方程为y＝10619383.9247x-19.3333，相关系数r为0.9991，r≥0.990，符合要求；Y轴截距与100％限度浓度对应的峰面积的比值0.02％，其比值≤10.0％，符合要求；对映异构体在限度的25％～150％范围内呈线性关系。其中，对映异构体是已知杂质，限度为0.15％。

表7 线性关系考察结果

3.4 稳定性考察

系统适用性溶液、供试品溶液的配制方法同2.1项，各配制1份。

操作：把配制好的供试品溶液和系统适用性溶液放置在室温中。按2.2项下的色谱条件分别于0h、6h、15h、22h和49h，可以根据具体情况延长或缩短考察时间，各进样1针，记录色谱图。

结果显示0h、6h、15h、22h和49h条件下，系统适用性溶液中琥珀酸曲格列汀与其对映异构体之间的分离度分别为2.2、2.2、2.0、2.0、2.0；琥珀酸曲格列汀的峰面积分别为82411699、82329472、82664681、82939464、83733114；对映异构体的峰面积分别为121842、122712、121333、123674、130032；供试品溶液中琥珀酸曲格列汀的峰面积分别为86202953、86736740、87378062、88017211、89528253。系统适用性溶液各时间点琥珀酸曲格列汀主峰与其对映异构体的分离度均大于1.5；系统适用性溶液各时间点对映异构体峰面积与0h测定值的比值在0.90～1.10范围内；系统适用性溶液各时间点琥珀酸曲格列汀主峰峰面积峰面积与0h测定值的比值在0.90～1.10范围内，均符合要求，系统适用性溶液在室温下49h内稳定。考察的各时间点供试品溶液中均未检出对映异构体，所以对映异构体含量的极差为0，极差≤0.05％，符合要求；供试品溶液中各时间点琥珀酸曲格列汀主峰峰面积与0h测定值的比值在0.90～1.10范围内，符合要求，供试品溶液在室温下49h内稳定。

3.5 精密度考察

空白溶液的配制方法同2.1项，配制1份；

100％供试品加标溶液的配制：同3.1项下增敏溶液配制方法，平行配制6份。

操作：待基线平衡后，取空白溶液进样1针，取6份100％供试品加标溶液各进样1针，记录色谱图。计算6份100％供试品加标溶液中对映异构体含量，计算RSD值。具体结果如表8所示，单人重复测定6次，对映异构体含量的RSD值为8.39％，RSD≤10.0％，符合要求。

表8 精密度考察结果

进样次数	供试品称样量(mg)	对映异构体含量(％)
			1	35.30	0.15
2	35.48	0.12
			3	35.46	0.14
4	35.22	0.14
			5	35.46	0.15
6	35.18	0.15

3.6 准确度考察

杂质A对照品母液的配制：同2.1项下杂质A对照品母液配制方法，配制1份；

杂质A对照品准确度溶液按表9配制，每个水平平行配制3份。

表9

杂质A相当于主峰浓度水平	0.075％	0.15％	0.225％
				供试品(mg)	35	35	35
杂质A对照品母液(mL)	1	2	3
				稀释(mL)	5	5	5

操作：待系统适用性合格后，取空白溶液进样1针，再取各浓度水平下回收率实验溶液各进样1针，记录色谱图。计算各准确度溶液中对映异构体的实际测定量、理论量、单个回收率、9次平均回收率和9次回收率的RSD，计算公式如下：

回收率＝测得值/理论值×100％；

测定量(mg)＝W_i+s×(C_i+s-C_i)

理论量＝W_i×P_i

其中：W_i+s为各个浓度的准确度溶液中供试品的称样量；

C_i+s为各个浓度的准确度溶液中对映异构体的含量；

C_i为供试品中对映异构体的含量；

R_i为供试品溶液中对映异构体的峰面积；

R_T为供试品溶液中对映异构体的峰面积和琥珀酸曲格列汀的峰面积之和；

R_i+s为各个浓度的准确度溶液中对映异构体的峰面积；

R_T+s为各个浓度的准确度溶液对映异构体的峰面积和琥珀酸曲格列汀的峰面积之和；

W_i为各个浓度的准确度溶液中对映异构体对照品的加入量，mg；

P_i为对映异构体对照品的含量，％。

具体考察结果如表10所示。

表10 准确度考察结果

结果显示各浓度下的回收率单值均在80.0％～120.0％范围内，满足标准要求；回收率单值的RSD值为1.18％，RSD≤10.0％，满足要求；平均回收率为91.84％；方法准确度良好。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims (5)

1.一种测定琥珀酸曲格列汀原料药中对映异构体含量的方法，其特征在于，包括以下步骤：

通过手性液相色谱分析方法对所述琥珀酸曲格列汀原料药中对映异构体进行分析，以便获得色谱图；以及基于所述色谱图，确定所述琥珀酸曲格列汀原料药中对映异构体含量，

其中，所述手性液相色谱分析方法采用以下条件：

色谱柱为CHIRALPAK AD-H，4.6×250mm，5微米，

检测器为DAD，

检测波长为272nm，

柱温为30℃～35℃，

采样频率为0.31Hz，

流动相是体积比为正己烷:乙醇:三乙胺:三氟乙酸＝900:100:2:2的混合溶液，

流速为1.0mL/min～1.2mL/min，

洗脱梯度为等度洗脱，等度洗脱中溶剂体积比为正己烷:乙醇:三乙胺:三氟乙酸＝900:100:2:2，

运行时间为30min。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在所述手性液相色谱分析方法中，所述琥珀酸曲格列汀原料药是以供试品溶液的形式提供的，其中，所述供试品溶液为琥珀酸曲格列汀原料药的甲醇溶液，并且基于每毫升所述供试品溶液，琥珀酸曲格列汀原料药的含量为7mg。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述供试品溶液的用量为5微升。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述基于所述色谱图，确定所述琥珀酸曲格列汀原料药中对映异构体含量是通过以下公式确定的：

其中：R_i为供试品溶液中对映异构体的峰面积；

R_T为供试品溶液中对映异构体的峰面积和琥珀酸曲格列汀的峰面积之和。

5.一种测定琥珀酸曲格列汀原料药中对映异构体含量的方法，其特征在于，该方法包括：

仪器与色谱条件

色谱柱为CHIRALPAK AD-H，4.6×250mm，5微米，检测器为DAD，检测波长为272nm，柱温为30℃，采样频率为0.31Hz，流动相是体积比为正己烷:乙醇:三乙胺:三氟乙酸＝900:100:2:2的混合溶液，流速为1.2mL/min，洗脱梯度为等度洗脱，等度洗脱中溶剂体积比为正己烷:乙醇:三乙胺:三氟乙酸＝900:100:2:2，运行时间为30min，

配制供试品溶液

取供试品约35mg，精密称定，置5mL容量瓶中，用4mL甲醇溶解，并做超声处理，用甲醇稀释至刻度，摇匀即得所述供试品溶液；以及

注入色谱仪，进样量为5微升，得到色谱图，根据所述色谱图计算得到所述供试品溶液中对映异构体含量，

其中，按以下公式计算供试品溶液中对映异构体含量，取2次测定结果的平均值作为测定结果：

其中：R_i为供试品溶液中对映异构体的峰面积；

R_T为供试品溶液中对映异构体的峰面积和琥珀酸曲格列汀的峰面积之和。

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