CN109470798A - 一种液相色谱法测定苯甲酸阿格列汀对映异构体的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种液相色谱法测定苯甲酸阿格列汀对映异构体及其含量的方法。所述一种液相色谱法测定苯甲酸阿格列汀对映异构体的方法，采用以下的色谱的条件：色谱柱：以直链淀粉‑三(3,5‑二甲基苯基氨基甲酸酯)硅胶为填充剂；流动相：由烷烃、醇以及三氟乙酸组成；流速：0.9～1.1ml/min；柱温：25～35℃；检测波长：273～283nm。根据本发明的测定方法，能够有效分离苯甲酸阿格列汀及其对映异构体，而且操作简单、运行时间短。
Description
技术领域
本发明涉及药物制剂领域，具体涉及一种液相色谱法测定苯甲酸阿格列汀对映异构体的方法。
背景技术：
苯甲酸阿格列汀的学名为2-({6-[(3R)-3-氨基-1-哌啶基]-3,4-二氢-3-甲基-2,4-二氧代-1(2H)-嘧啶基}甲基)苄腈苯甲酸盐(2-({6-[(3R)-3-aminopiperidin-1-yl]-3-methyl-2,4-dioxo-3,4-dihydropyrimidin-1(2H)-yl}methyl)benzonitrilemonobenzoate)，是一种高度选择性的二肽基肽酶-4(DPP-4)抑制剂，用于治疗2型糖尿病。但同时苯甲酸阿格列汀也是一种手性药物，存在立体异构现象，具有R构型和S构型，因此，苯甲酸阿格列汀中往往会存在少量的S型对映异构体。经过20世纪50至60年代初期发生的“反应停”事件，对手性药物的对映异构体杂质进行控制受到制药行业的广泛重视，因此检测和分离出苯甲酸阿格列汀对映异构体(S构型)，可以保证苯甲酸阿格列汀产品的有效性和安全性。而现有的测定方法复杂，效果不理想。因此需要一种简便、高效的测定苯甲酸阿格列汀对映异构体的方法。
发明内容：
本发明的目的之一提供一种液相色谱法测定苯甲酸阿格列汀对映异构体的方法，所述方法操作简便、运行时间短，测定效果理想。
本发明的另一个目的是提供采用上述色谱条件测定苯甲酸阿格列汀对映异构体含量的方法。
为实现上述目的及其他相关目的，本发明是通过包括以下技术方案实现的：
一种液相色谱法测定苯甲酸阿格列汀对映异构体的方法，采用以下的色谱的条件：色谱柱：以直链淀粉-三(3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯)硅胶为填充剂；流动相：由烷烃、醇以及三氟乙酸组成；流速：0.9～1.1ml/min；柱温：25～35℃；检测波长：273～283nm。
可选地，所述流动相中所述烷烃选自正庚烷或正己烷，所述醇为乙醇或异丙醇。
可选地，所述流动相中所述烷烃、所述醇以及所述三氟乙酸的体积比为75～85：15～25：0.1～0.3，其中所述烷烃和所述醇的总体积与所述三氟乙酸的体积比为100：0.1～0.3。
可选地，所述液相色谱法的进样体积为10μl～50μl。
采用上述色谱条件测定苯甲酸阿格列汀对映异构体含量的方法，包括以下步骤：
提供一溶剂，由醇和三氟乙酸组成；提供一供试品溶液：用所述溶剂溶解苯甲酸阿格列汀供试品；提供一对照溶液：用所述溶剂将所述供试品溶液稀释1000倍；提供一系统适用性溶液：用所述溶剂溶解苯甲酸阿格列汀对照品和苯甲酸阿格列汀对映异构体对照品；将等量的所述系统适用性溶液、所述对照溶液、所述供试品溶液注入液相色谱仪，按照如上所述的色谱条件进行液相色谱分析，测定所述供试品溶液中所述供试品苯甲酸阿格列汀中的对映异构体的含量。
可选地，所述溶剂中，所述醇选自乙醇或异丙醇。
可选地，所述溶剂中，所述醇和所述三氟乙酸的体积比为100：0.1～0.3。
可选地，所述供试品溶液中每1ml所述溶剂中含所述苯甲酸阿格列汀供试品的质量与所述系统适用性溶液中每1ml所述溶剂中含所述苯甲酸阿格列汀对照品和所述苯甲酸阿格列汀对映异构体的质量比为1：1：0.001。
可选地，所述供试品溶液浓度为每1ml所述溶剂中含0.2～1.0mg苯甲酸阿格列汀供试品。
如上所述，本发明提供的一种液相色谱法测定苯甲酸阿格列汀对映异构体的方法，具有以下有益效果：
根据本发明液相色谱法设定的色谱条件检测苯甲酸阿格列汀对映异构体，操作简便、运行时间短，测定效果理想。此外，利用体积比为100：0.1～0.3的醇与三氟乙酸混合物能够较好的溶解供试品苯甲酸阿格列汀，在上述的色谱条件下，能够快速、简便分离并测定并出苯甲酸阿格列汀对映异构体，符合市场对苯甲酸阿格列汀产品的要求。
附图说明
图1示出了实施例1条件下系统适用性溶液的液相色谱图。
图2示出了实施例1条件下供试品溶液的液相色谱图。
图3示出了实施例2条件下系统适用性溶液的液相色谱图。
图4示出了实施例2条件下供试品溶液的液相色谱图。
图5示出了实施例3条件下系统适用性溶液的液相色谱图。
图6示出了实施例3条件下供试品溶液的液相色谱图。
具体实施方式
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
本发明提供了一种液相色谱法检测苯甲酸阿格列汀对映异构体的方法，采用以下的色谱的条件：色谱柱：以直链淀粉-三(3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯)硅胶为填充剂；流动相：由烷烃、醇以及三氟乙酸组成；流速：0.9～1.1ml/min；柱温：25～35℃；检测波长：273～283nm。
色谱柱以直链淀粉-三(3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯)硅胶为填充剂，例如，色谱柱的型号及规格为大赛璐手型色谱柱AD-H，柱长为250mm，内径为4.6mm，粒径为5μm(DaicelChirapak AD-H，4.6mm×250mm，5μm)或效能相当的色谱柱。流动相中烷烃例如选自正庚烷或正己烷，例如为正己烷。所述醇例如选自乙醇或异丙醇，例如异丙醇。所述流动相由烷烃、醇以及三氟乙酸组成例如他们的体积比为75～85：15～25：0.1～0.3，其中烷烃和醇的总体积与三氟乙酸的体积比为100：0.1～0.3。具体地，在本发明的公开的一个实施例中采用正己烷：异丙醇：三氟乙酸＝80：20：0.2(体积比)作为流动相，在本发明的公开的另一个实施例中正己烷：乙醇：三氟乙酸＝75：25：0.3(体积比)作为流动相，在本发明的公开的另一个实施例中正己烷：异丙醇：三氟乙酸＝85：15：0.2(体积比)作为流动相。流速为0.9～1.1ml/min，例如1.0ml/min、1.1ml/min。柱温为25～35℃，例如25℃、30℃。检测器为紫外检测器，例如采用岛津SPD-15C检测器，检测波长为273～283nm，例如278nm、280nm。所述液相色谱法的进样体积为10μl～50μl，例如为10μl、20μl、30μl。
需要说明的是，通过液相色谱法测定苯甲酸阿格列汀对映异构体需要测定方法的专属性。验证苯甲酸阿格列汀及其对映异构体在上述色谱条件下能否有效分离。具体地，专属性测定方法为：精密称取苯甲酸阿格列汀对照品适量，用如上所述、如下详述的溶剂溶解并制成每1ml含苯甲酸阿格列汀0.5mg的溶液作为溶液A；精密称取苯甲酸阿格列汀对映异构体对照品适量，用如上所述、如下详述的溶剂溶解并制成每1ml含苯甲酸阿格列汀对映异构体0.5μg的溶液作为溶液B；再精密称取苯甲酸阿格列汀对照品和对映异构体对照品适量，用如上所述、如下详述的溶剂溶解并制成每1ml含阿格列汀为0.5mg和阿格列汀对映异构体为0.5μg的溶液，作为溶液C。精密量取上述溶液A、B、C与空白溶剂各20μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。验证结果如表1所示，结果表明上述色谱条件专属性较好，苯甲酸阿格列汀与其对映异构体能有效分离，分离度为2.370。
表1专属性验证结果表
需要说明的是，通过液相色谱法测定苯甲酸阿格列汀对映异构体需要测定方法的回收率。验证苯甲酸阿格列汀及其对映异构体在上述色谱条件下测定的准确度。具体地。精密称取苯甲酸阿格列汀异构体对照品适量，加溶剂溶解并稀释制成每1ml约含苯甲酸阿格列汀异构体12.5μg的溶液，摇匀，作为异构体对照品贮备液；精密称取苯甲酸阿格列汀供试品约25mg置50ml量瓶中，加适量溶剂溶解，共配制9份，再分别精密加入上述异构体对照品贮备液1ml、2ml、3ml置上述9个量瓶中，每个浓度三份；用溶剂稀释至刻度，摇匀，作为回收率50％、100％、150％溶液；分别精密量取上述溶液20μl，注入液相色谱仪，记录峰面积，外标法计算对映异构体的含量。结果表明，苯甲酸阿格列汀对映异构体的回收率为92.22％～97.15％，平均回收率为94.97％，其RSD为1.49％，准确度好。
需要说明的是，通过液相色谱法测定苯甲酸阿格列汀对映异构体还需要测定检测限和定量限。检测限和定量限分别用于确定苯甲酸阿格列汀对映异构体在上述色谱条件下定性和定量检出的最低含量。
具体地，检测限的测定方法为：精密称取苯甲酸阿格列汀对映异构体对照品适量，加如上所述、如下详述的溶剂适量，超声使溶解，用如上所述、如下详述的溶剂进一步稀释成最终浓度为0.060μg/ml的溶液，注入液相色谱仪，例如精密量取20μl，按如上所述的色谱条件测定，记录色谱图，并对色谱系统进行基线噪音检测，结果表明，色谱图的信噪比约为3，经计算苯甲酸阿格列汀对映异构体在该色谱条件下的检测限为1.2ng，方法灵敏。
具体地，定量限的的测定方法为：精密称取苯甲酸阿格列汀对映异构体对照品适量，加用如上所述、如下详述的溶剂适量，超声使溶解，用用如上所述、如下详述的进一步稀释成最终浓度为0.1506μg/ml的溶液，注入液相色谱仪，例如精密量取20μl，按如上所述的色谱条件测定，记录色谱图，并对色谱系统进行基线噪音检测，结果表明，色谱图的信噪比约为10，经计算苯甲酸阿格列汀对映异构体在该色谱条件下的定量限为3ng。
本发明提供了一种测定苯甲酸阿格列汀对映异构体含量的方法，包括以下步骤：提供一溶剂，由醇和三氟乙酸组成。
具体地，所述溶剂中醇例如选自乙醇或异丙醇，例如为异丙醇。溶剂由醇和三氟乙酸组成例如他们的体积比为100：0.1～0.3。例如100：0.2、100：0.3。具体地，在本发明的公开的一个实施例中采用异丙醇：三氟乙酸＝100:0.2(体积比)作为溶剂，在本发明的公开的另一个实施例中采用异丙醇：三氟乙酸＝100:0.3(体积比)作为溶剂。
测定苯甲酸阿格列汀对映异构体含量的方法，还包括：提供一供试品溶液：用如上所述的溶剂溶解供试品苯甲酸阿格列汀；提供一对照溶液：用所述溶剂将所述供试品溶液稀释1000倍；和提供一系统适用性溶液：用所述溶剂溶解苯甲酸阿格列汀对照品和苯甲酸阿格列汀对映异构体对照品。
具体地，配置供试品溶液、对照溶液、系统适用性溶液。精密称定苯甲酸阿格列汀供试品，用如上所述的溶剂溶解并稀释制成每1ml所述溶剂中含0.2～1.0mg苯甲酸阿格列汀供试品，例如0.2mg/ml、0.5mg/ml，摇匀，作为供试品溶液；提供一对照溶液；用所述溶剂将所述供试品溶液稀释1000倍；精密称定苯甲酸阿格列汀对照品和苯甲酸阿格列汀对映异构体对照品，用如上所述的溶剂溶解并稀释制成每1ml所述溶剂中含与所述苯甲酸阿格列汀供试品等量的苯甲酸阿格列汀对照品，例如0.2mg/ml、0.5mg/ml和所述苯甲酸阿格列汀供试品量千分之一的苯甲酸阿格列汀对映异构体对照品，例如0.2μg/ml、0.5μg/ml，摇匀，作为系统适用性溶液。
测定苯甲酸阿格列汀对映异构体含量的方法，还包括：将等量的所述系统适用性溶液、所述对照溶液、所述供试品溶液注入液相色谱仪，按照如上所述的色谱条件进行液相色谱分析，测定所述供试品溶液中所述供试品苯甲酸阿格列汀中的其对映异构体的含量。
具体地，在本发明公开的实施方式中，取系统适用性溶液，例如20μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，各峰间的分离度应符合要求。精密量取等量的供试品溶液与对照溶液，例如各20μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图，比对所述系统适用性溶液、所述对照溶液、所述供试品溶液的保留时间和积分面积，测定所述供试品溶液中所述供试品苯甲酸阿格列汀中的其对映异构体的含量。
以下，将引入具体的实施例对本发明进行更详细的阐述。
实施例1
按以下步骤进行操作以测定苯甲酸阿格列汀对映异构体含量：
(1)异丙醇：三氟乙酸＝100：0.2(体积比)，混合摇匀，作为溶剂。
(2)取苯甲酸阿格列汀供试品(批次001)适量，精密称定，加(1)中的溶剂溶解并稀释制成每1ml含0.5mg的溶液，摇匀，作为供试品溶液。
(3)精密量取1ml，置100ml量瓶中，用溶剂稀释至刻度，摇匀，再精密量取1ml，置10ml量瓶中，用溶剂稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液。
(4)取对照品苯甲酸阿格列汀和对照品苯甲酸阿格列汀对映异构体各适量，精密称定，加(1)中的溶剂溶解并稀释制成每1ml中分别含0.5mg和0.5μg的溶液，摇匀，作为系统适用性溶液。
(5)设定液相色谱条件：
色谱仪：高效液相色谱仪(Shimadzu LC-15C泵，CBM-20Alite控制器，SPD-15C检测器，CTO-15C柱温箱，LCsolution工作站)；
色谱柱：Daicel Chirapak AD-H，4.6mm×250mm，5μm；
流动相：正己烷：异丙醇：三氟乙酸＝80：20：0.2(体积比)；
流速：1.0ml/min；
柱温：30℃；
检测波长：278nm；
进样体积：20μl。
(6)取系统适用性溶液20μl注入液相色谱仪，记录色谱图；精密量取供试品溶液与对照溶液各20μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。测试结果如图1和图2所示。
实施例2
按以下步骤进行操作以测定苯甲酸阿格列汀对映异构体含量：
(1)异丙醇：三氟乙酸＝100：0.2(体积比)，混合摇匀，作为溶剂。
(2)取苯甲酸阿格列汀供试品(批次002)适量，精密称定，加(1)中的溶剂溶解并稀释制成每1ml含0.5mg的溶液，摇匀，作为供试品溶液。
(3)精密量取1ml，置100ml量瓶中，用溶剂稀释至刻度，摇匀，再精密量取1ml，置10ml量瓶中，用溶剂稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液。
(4)取对照品苯甲酸阿格列汀和对照品苯甲酸阿格列汀对映异构体各适量，精密称定，加(1)中的溶剂溶解并稀释制成每1ml中分别含0.5mg和0.5μg的溶液，摇匀，作为系统适用性溶液；
(5)设定液相色谱条件：
色谱仪：高效液相色谱仪(Shimadzu LC-15C泵，CBM-20Alite控制器，SPD-15C检测器，CTO-15C柱温箱，LCsolution工作站)；
色谱柱：Daicel Chirapak AD-H，4.6mm×250mm，5μm；
流动相：正己烷：乙醇：三氟乙酸＝75：25：0.3(体积比)；
流速：1.1ml/min；
柱温：27℃；
检测波长：278nm；
进样体积：20μl。
(6)取系统适用性溶液20μl注入液相色谱仪，记录色谱图；精密量取供试品溶液与对照溶液各20μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。测试结果如图3和图4所示。
实施例3
按以下步骤进行操作以测定苯甲酸阿格列汀对映异构体含量：
(1)异丙醇：三氟乙酸＝100:0.3(体积比)，混合摇匀，作为溶剂。
(2)取苯甲酸阿格列汀供试品(批次003)适量，精密称定，加(1)中的溶剂溶解并稀释制成每1ml含0.5mg的溶液，摇匀，作为供试品溶液。
(3)精密量取1ml，置100ml量瓶中，用溶剂稀释至刻度，摇匀，再精密量取1ml，置10ml量瓶中，用溶剂稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液。
(4)取对照品苯甲酸阿格列汀和对照品苯甲酸阿格列汀对映异构体各适量，精密称定，加(1)中的溶剂溶解并稀释制成每1ml中分别含0.5mg和0.5μg的溶液，摇匀，作为系统适用性溶液。
(5)设定液相色谱条件：
色谱仪：高效液相色谱仪(Shimadzu LC-15C泵，CBM-20Alite控制器，SPD-15C检测器，CTO-15C柱温箱，LCsolution工作站)；
色谱柱：Daicel Chirapak AD-H，4.6mm×250mm，5μm；
流动相：正己烷：异丙醇：三氟乙酸＝85：15：0.2(体积比)；
流速：1.0ml/min；
柱温：25℃；
检测波长：278nm；
进样体积：20μl。
(6)取系统适用性溶液20μl注入液相色谱仪，记录色谱图；精密量取供试品溶液与对照溶液各20μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。测试结果如图5和图6所示。
试验结果表明，运用本发明的液相色谱法测定苯甲酸阿格列汀异构体操作简便、运行时间均在25min以内、分离度均大于2.0，能够有效分离苯甲酸阿格列汀与其对映异构体。
以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还将可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，当可利用以上所揭示的技术内容而做出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对上述实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。
Claims (9)
1.一种液相色谱法测定苯甲酸阿格列汀对映异构体的方法，其特征在于：采用以下的色谱的条件：
色谱柱：以直链淀粉-三(3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯)硅胶为填充剂；
流动相：由烷烃、醇以及三氟乙酸组成；
流速：0.9～1.1ml/min；
柱温：25～35℃；
检测波长：273～283nm。
2.如权利要求1所述的液相色谱法检测苯甲酸阿格列汀对映异构体的方法，其特征在于，所述流动相中所述烷烃选自正庚烷或正己烷，所述醇为乙醇或异丙醇。
3.如权利要求1所述的液相色谱法检测苯甲酸阿格列汀对映异构体的方法，其特征在于，所述流动相中所述烷烃、所述醇以及所述三氟乙酸的体积比为75～85：15～25：0.1～0.3，其中所述烷烃和所述醇的总体积与所述三氟乙酸的体积比为100：0.1～0.3。
4.如权利要求1-3任意一项所述的液相色谱法检测苯甲酸阿格列汀对映异构体的方法，其特征在于，所述液相色谱法的进样体积为10μl～50μl。
5.一种液相色谱法测定苯甲酸阿格列汀对映异构体含量的方法，其特征在于：包括以下步骤：
提供一溶剂，由醇和三氟乙酸组成；
提供一供试品溶液：用所述溶剂溶解苯甲酸阿格列汀供试品；
提供一对照溶液：用所述溶剂将所述供试品溶液稀释1000倍；
提供一系统适用性溶液：用所述溶剂溶解苯甲酸阿格列汀对照品和苯甲酸阿格列汀异构体对照品；
将等量的所述系统适用性溶液、所述对照溶液、所述供试品溶液注入液相色谱仪，按照权利要求1-4中任一项所述的色谱条件进行液相色谱分析，测定所述供试品溶液中所述供试品苯甲酸阿格列汀中的对映异构体的含量。
6.如权利要求5所述的液相色谱法检测苯甲酸阿格列汀对映异构体的方法，其特征在于，所述溶剂中，所述醇选自乙醇或异丙醇。
7.如权利要求5所述的液相色谱法测定苯甲酸阿格列汀对映异构体含量的方法，其特征在于：所述溶剂中，所述醇和所述三氟乙酸的体积比为100：0.1～0.3。
8.如权利要求5所述的液相色谱法检测苯甲酸阿格列汀对映异构体的方法，其特征在于，所述供试品溶液中每1ml所述溶剂中含所述苯甲酸阿格列汀供试品的质量与所述系统适用性溶液中每1ml所述溶剂中含所述苯甲酸阿格列汀对照品和所述苯甲酸阿格列汀对映异构体的质量比为1：1：0.001。
9.如权利要求5所述的液相色谱法检测苯甲酸阿格列汀对映异构体的方法，其特征在于，所述供试品溶液浓度为每1ml所述溶剂中含0.2～1.0mg苯甲酸阿格列汀供试品。
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