CN105203678A - R-苯甲酸阿格列汀光学纯度的测定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种R-苯甲酸阿格列汀光学纯度的测定方法。本发明的技术方案是：色谱系统为高效液相色谱仪，色谱柱填料为直链淀粉-三（3,5-二甲苯基氨基甲酸酯），流速：0.8ml/min，柱温：25℃，检测波长：278nm，进样量20μl，其流动相为：正己烷:含有0.2%三氟乙酸和0.1%二乙胺的乙醇溶液=80:20，首先分别对R,S-苯甲酸阿格列汀对照品溶液与S-苯甲酸阿格列汀对照品溶液进样，进行系统适应性分析，再对R-苯甲酸阿格列汀供试品溶液进行光学纯度测定，按面积归一化法计算样品的光学纯度。
Description
技术领域
本发明涉及一种R-苯甲酸阿格列汀光学纯度的测定方法。
背景技术
苯甲酸阿格列汀，化学名为2-[[6-[(3R)-3-氨基-1-哌啶基]-3,4-二氢-3-甲基-2,4-二氧代-1(2H)-嘧啶基]甲基]苯甲腈苯甲酸盐，是新型的二肽基肽酶-Ⅳ（DPP-Ⅳ）抑制剂，用于治疗Ⅱ型糖尿病，结构式见式1。
式1
R-苯甲酸阿格列汀的合成是以3-甲基-6-氯尿嘧啶与2-溴甲基苄腈反应生成2-[(6-氯-3,4-二氢-3-甲基-2,4-二氧代-1(2H)-嘧啶基)甲基]苯甲腈，2-[(6-氯-3,4-二氢-3-甲基-2,4-二氧代-1(2H)-嘧啶基)甲基]苯甲腈再与R-3-氨基哌啶双盐酸盐反应生成R-阿格列汀，R-阿格列汀再与苯甲酸成盐得到的R-苯甲酸阿格列汀。
目前，R-苯甲酸阿格列汀的光学纯度是通过测定旋光度，计算ee值进行描述。旋光度的测定除了受偏振光波长、溶液的浓度、温度、溶剂等因素影响外，还受旋光性的杂质影响。因此通过测定旋光度计算ee值的方法来测定R-苯甲酸阿格列汀的光学纯度有较大的误差，可信度不够高。
随着手性液相分离技术的发展，高效液相色谱法已经成为能够准确测定物质光学纯度的可靠的方法。但是R-苯甲酸阿格列汀的手性分离方法尚没有公开的文献方法。究其原因，是由于其手性中心能够与手性色谱柱填料产生氢键、偶极-偶极或空间作用的作用力较小，常规手性色谱柱的分离效能较低，无法实现有效的分离。为了有效的控制产品质量，迫切的需要一种快速、准确的检测方法。
本发明的目的：为了解决分离效能较低这一问题，我们开发了采用添加离子对的流动相的手性色谱法测定R-苯甲酸阿格列汀光学纯度的方法。该方法是利用在流动相中添加离子对，使离子对与手性填料先作用，改变了手性填料对R-苯甲酸阿格列汀与S-苯甲酸阿格列汀的键合作用，从而提高了R-苯甲酸阿格列汀与S-苯甲酸阿格列汀之间的分离效能，实现了用手性色谱法进行光学纯度的测定，首次创新性地解决了R-苯甲酸阿格列汀光学纯度测定这一技术难题。
发明内容
本发明的技术方案：
一种R-苯甲酸阿格列汀光学纯度的测定方法，其特征在于，
第一步制备对照品和供试品溶液：
R,S-苯甲酸阿格列汀对照品溶液：分别精密称取R-苯甲酸阿格列汀对照品、S-苯甲酸阿格列汀对照品各适量，置同一容量瓶中，加无水乙醇稀释制成每1ml约含R-苯甲酸阿格列汀0.2mg和S-苯甲酸阿格列汀0.5mg的溶液；
S-苯甲酸阿格列汀对照品溶液：精密称取S-苯甲酸阿格列汀对照品适量，加无水乙醇定量稀释制成每1ml约含0.2mg的溶液；
R-苯甲酸阿格列汀对照品溶液：精密称取R-苯甲酸阿格列汀对照品适量，加无水乙醇定量稀释制成每1ml约含0.2mg的溶液；
R-苯甲酸阿格列汀供试品溶液：精密称取R-苯甲酸阿格列汀供试品适量，加无水乙醇定量稀释制成每1ml约含0.5mg的溶液；
第二步R-苯甲酸阿格列汀光学纯度色谱条件准备及检测
色谱条件：色谱系统为高效液相色谱仪，色谱柱填料为直链淀粉-三（3,5-二甲苯基氨基甲酸酯），即AD-H手性色谱柱（250mm×4.6mm,5μm）；流速：0.8ml/min，柱温：25℃，检测波长：278nm，进样量20μl，
流动相为正己烷：0.2%三氟乙酸和0.1%二乙胺的乙醇溶液=80：20，配制后经0.20μm有机膜过滤，超声脱气；
首先分别对R,S-苯甲酸阿格列汀对照品溶液与S-苯甲酸阿格列汀对照品溶液进样，进行系统适应性分析，再对R-苯甲酸阿格列汀供试品溶液进行光学纯度测定，按面积归一化法计算样品的光学纯度。
系统适应性试验：
R,S-苯甲酸阿格列汀达到了基线分离，分离度约2.0，见说明书附图3，与S-苯甲酸阿格列汀对照品色谱图（说明书附图4）对比，确定RT=8.733为S构型，RT=10.700为R构型。
本发明技术方案中，所述R-苯甲酸阿格列汀对照品与S-苯甲酸阿格列汀对照品的确认：
色谱条件：色谱系统为高效液相色谱仪，色谱柱填料为十八烷基硅烷键合硅胶（250mm×4.6mm,5μm），流速：1.0ml/min，柱温：25℃，检测波长：278nm，进样量20μl，流动相：乙腈为流动相A，含0.2%的三乙胺水溶液（用20%磷酸调节pH值约为6.4)为流动相B，按下表程序进行梯度洗脱：
纯度测定：分别精密称取R-苯甲酸阿格列汀对照品与S-苯甲酸阿格列汀对照品适量，加乙腈定量稀释制成每1ml约含0.5mg的溶液，进样检测，按峰面积归一化法计算纯度，纯度应大于99.0%；
有益效果：本发明通过在流动相中添加离子对，使离子对与手性填料先作用，改变了手性填料对R-苯甲酸阿格列汀与S-苯甲酸阿格列汀的键合作用，从而提高了R-苯甲酸阿格列汀与S-苯甲酸阿格列汀之间的分离效能，使苯甲酸阿格列汀的一对对映异构体在AD-H手性色谱柱上完全分离。首次创新性地建立了在流动相中添加离子对的手性色谱法测定R-苯甲酸阿格列汀的光学纯度的方法，为R-苯甲酸阿格列汀的光学纯度的准确检测提供了保障。
附图说明：
图1：RS-苯甲酸阿格列汀纯度测定色谱图。
图2：RS-苯甲酸阿格列汀色谱峰光谱图。
图3：RS-苯甲酸阿格列汀光学纯度测定色谱图。
图4：S-苯甲酸阿格列汀光学纯度测定色谱图。
图注：EP/JP表示欧洲药典和日本药典高效液相色谱法分离度计算方法。
实施例1R-苯甲酸阿格列汀样品的光学纯度的测定
仪器与试剂：高效液相色谱仪（日本日立公司；赛默飞世尔科技有限公司）；C18色谱柱（250mm×4.6mm,5μm；赛默飞世尔科技有限公司）；AD-H手性色谱柱（250mm×4.6mm,5μm；大赛璐药物手性技术有限公司）；恒温水浴锅（江苏金坛科兴仪器厂）；电子恒速搅拌器（上海申生科技有限公司）。
正己烷（色谱纯，天津市彪士奇科技有限公司）；无水乙醇（色谱纯，天津市彪士奇科技有限公司）；三氟乙酸（色谱纯，阿拉丁试剂公司）；二乙胺（分析纯，天津广成化学试剂有限公司）；R-苯甲酸阿格列汀对照品（纯度≧99.9%，迪沙药业集团药物研究院）；S-苯甲酸阿格列汀对照品（纯度≧99.0%，迪沙药业集团药物研究院）。
按技术方案所述检测方法检测R-苯甲酸阿格列汀的光学纯度。
Claims (2)
1.一种R-苯甲酸阿格列汀光学纯度的测定方法，其特征在于，
第一步制备对照品和供试品溶液：
R,S-苯甲酸阿格列汀对照品溶液：分别精密称取R-苯甲酸阿格列汀对照品、S-苯甲酸阿格列汀对照品各适量，置同一容量瓶中，加无水乙醇稀释制成每1ml约含R-苯甲酸阿格列汀0.2mg和S-苯甲酸阿格列汀0.5mg的溶液；
S-苯甲酸阿格列汀对照品溶液：精密称取S-苯甲酸阿格列汀对照品适量，加无水乙醇定量稀释制成每1ml约含0.2mg的溶液；
R-苯甲酸阿格列汀对照品溶液：精密称取R-苯甲酸阿格列汀对照品适量，加无水乙醇定量稀释制成每1ml约含0.2mg的溶液；
R-苯甲酸阿格列汀供试品溶液：精密称取R-苯甲酸阿格列汀供试品适量，加无水乙醇定量稀释制成每1ml约含0.5mg的溶液；
第二步R-苯甲酸阿格列汀光学纯度色谱条件准备及检测：
色谱条件：色谱系统为高效液相色谱仪，色谱柱填料为直链淀粉-三（3,5-二甲苯基氨基甲酸酯），即AD-H手性色谱柱250mm×4.6mm,5μm；流速：0.8ml/min，柱温：25℃，检测波长：278nm，进样量20μl，
流动相为正己烷：0.2%三氟乙酸和0.1%二乙胺的乙醇溶液=80：20，配制后经0.20μm有机膜过滤，超声脱气；
首先分别对R,S-苯甲酸阿格列汀对照品溶液与S-苯甲酸阿格列汀对照品溶液进样，进行系统适应性分析，再对R-苯甲酸阿格列汀供试品溶液进行光学纯度测定，按面积归一化法计算样品的光学纯度。
2.权利要求1所述R-苯甲酸阿格列汀对照品与S-苯甲酸阿格列汀对照品，其特征在于，按以下方法确认：
色谱条件：色谱系统为高效液相色谱仪，色谱柱填料为十八烷基硅烷键合硅胶250mm×4.6mm,5μm，流速：1.0ml/min，柱温：25℃，检测波长：278nm，进样量20μl，流动相：乙腈为流动相A，pH值约为6.4的0.2%的三乙胺水溶液为流动相B，按下表程序进行梯度洗脱：
纯度测定：分别精密称取R-苯甲酸阿格列汀对照品与S-苯甲酸阿格列汀对照品适量，加乙腈定量稀释制成每1ml约含0.5mg的溶液，进样检测，按峰面积归一化法计算纯度，纯度应大于99.0%。
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