CN109900830A - 采用hplc分离测定塞来昔布中磺酰胺类杂质的方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种采用HPLC分离测定塞来昔布中磺酰胺类杂质的方法及应用，该方法中高效液相色谱仪的色谱柱以苯基键合硅胶为固定相，采用无机酸‑有机相为流动相进行梯度洗脱；所述固定相的温度为25～35℃，流速为0.9～1.1 mL/min，检测波长为254±6 nm，样品室温度为4～10℃；所述流动相中无机酸‑有机相的初始体积比为（72:28）～（85:15）。本发明的方法能较好地同时分离并定量测定塞来昔布及含有磺酰胺类杂质的化学药品中的这三种磺酰胺类杂质磺胺、4‑SAPH和YF042‑14，同时不受干扰，且峰型较好，能完全有效控制塞来昔布原料的质量。该方法专属性强，灵敏度高，准确度良好。
Description
技术领域
本发明涉及化学药品分析技术领域，具体是一种采用HPLC分离测定塞来昔布中磺酰胺类杂质的方法及应用，尤其涉及一种运用高效液相色谱法能同时分离测定塞来昔布药品中存在的磺酰胺类基因毒性杂质磺胺、4-SAPH、YF042-14的方法及应用。
技术背景
磺胺和4-SAPH（4-磺酰基苯肼盐酸盐）是合成塞来昔布原料药的起始原料；YF042-14(三氟酮基对氨基磺酰基苯肼)是合成塞来昔布原料药的过程中起始物料4-SAPH与未反应完的三氟乙酸乙酯发生缩合反应生成的副产物。三者都是塞来昔布中可能出现的杂质。三者的化学结构式分别如下所示：
磺胺 4-SAPH YF042-14
基因毒性杂质是指直接或间接损伤细胞DNA，使其产生基因突变或体内诱变，具有致癌可能或者倾向的化合物。而潜在基因毒性的杂质是指从结构上看类似基因毒性杂质，有警示性，但未经实验证明。
欧盟发布的基因毒性结构警示指导《Development of structural alerts forthe in vivo micronucleus assay in rodents》提示芳香胺类化合物和肼化合物均具有潜在基因毒性。根据结构式推知，磺胺属于芳香胺类化合物，4-SAPH和YF042-14具有肼的结构，均可认为是潜在的基因毒性杂质，需进行质量控制。根据ICH M7（R1）基因毒性杂质限度指导原则计算残留化学药物塞来昔布中单个基因毒性杂质的限度：
限度 (ppm) = TTC/MDD
TTC：每日最大耐受量，μg/天，
MDD：最大日给药剂量，g/天；
塞来昔布的最大日给药剂量为0.4g/天，用药周期为终生用药。根据ICH-M7（R1)（诱变性杂质评估和控制）可知，给药周期为终生用药的药品中潜在基因毒性杂质的每日最大耐受量为1.5μg，计算出塞来昔布中单个基因毒性杂质磺胺、4-SAPH和YF042-14的控制限度应均为3.75ppm。
USP（美国药典） PF43(6)中提到一种检测磺胺和4-SAPH的现有方法，该方法为高效液相色谱法：以苯基键合硅胶为填充剂（Supelcosil LC-DP 4.6*250mm，5μm），以0.1%三氟乙酸溶液-甲醇为流动相，按梯度洗脱，洗脱程序如表1，检测波长为254nm。
表1.1 USP美国药典中检测磺胺和4-SAPH的洗脱梯度表
但是采用上述美国药典（USP）记载的方法对磺胺、4-SAPH和YF042-14这三种化合物混合溶液进行了检测，进样混合定位溶液（浓度为0.06μg/ml，稀释剂为0.1M氢氧化钾溶液-甲醇（40:60））10μl，记录HPLC图谱，结果详见附图1及下表1.2的峰结果：
表1.2 USP美国药典中检测磺胺和4-SAPH的HPLC图谱峰结果
采用该方法，灵敏度溶液4-SAPH为两个峰且信噪比不符合＞10的要求，且YF042-14未出峰加大浓度至1μg/ml后发现其在梯度峰中出峰。
另王崇益等人申请的专利（CN 104977372 A）公开了一种高效液相色谱测定塞来昔布原料药中对磺酰胺基苯肼盐酸盐含量的方法，但该专利中只提到对磺酰胺基苯肼盐酸盐（4-SAPH）检测，并未提到磺胺与YF042-14的检测，且采用的检测器为荧光检测，灵敏度相对紫外检测器来说较低，所以该方案不适用于磺胺、4-SAPH和YF042的检测。
CN104897841A公开一种高效液相色谱测定塞来昔布胶囊中对磺酰胺基苯肼盐酸盐含量的方法，它包括如下步骤：高效液相色谱仪的固定相为十八烷基键合石墨碳，流动相A为10mmol/L乙酸铵水溶液-甲醇=45：55～55：45，流动相B为甲醇，柱温为30℃～40℃，检测波长为218nm～222nm。
CN103454370A公开一种利用HPLC测定原料药中基因毒性杂质（或疑似基因毒性）的苯肼类化合物残留的方法，其选择苯基键合硅胶为固定相的色谱柱，以有机相与缓冲液的混合溶剂梯度洗脱作为流动相直接进行检测，柱温为20℃～30℃，流速为0.8～1.2mL/min，检测波长为260±10 nm。
由此可见，上述现有的分析方法均不能较好地实现同时分离定量测定磺胺、4-SAPH和YF042-14三个杂质。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种采用HPLC分离定量测定磺酰胺类杂质的方法及应用，该方法通过HPLC（高效液相色谱法，High Performance LiquidChromatography）测定化学药品塞来昔布中的磺酰胺类基因毒性杂质磺胺、4-SAPH和YF042-14，该方法能较好地同时分离并定量测定塞来昔布中的这三种磺酰胺类杂质磺胺、4-SAPH和YF042-14。
为了解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：
提供一种采用HPLC分离定量测定磺酰胺类杂质的方法，包括如下步骤：
（1）供试品溶液的制备：
精密称定待测定拟含有磺酰胺类杂质磺胺、4-SAPH和YF042-14的塞来昔布原料药，采用稀释剂稀释，具体是加入乙腈溶解后再在冰浴条件下加水稀释，其中，乙腈：水的体积比为20：80；然后充分振摇使药品充分析出后过滤，取滤液作为供试品溶液待用；
（2）色谱条件：
色谱柱以苯基键合硅胶为固定相，采用无机酸-有机相为流动相进行梯度洗脱；所述固定相的温度为25～35℃，流速为0.9～1.1 mL/min，检测波长为254±6nm；样品室温度为4～10℃；所述流动相中无机酸-有机相的初始体积比为（72:28）～（85:15）；
（3）分离及定量测定：
吸取供试品溶液20～25μl，注入高效液相色谱仪，记录色谱图并读取数据，完成对塞来昔布原料药中磺酰胺类杂质磺胺、4-SAPH和YF042-14的分离及测定。
进一步地，进行梯度洗脱的流动相中：无机酸-有机相初始体积比为85：15，洗脱梯度情况具体如下：
0min的时候 ,流动相中无机酸与有机相的体积比为85%：15%；
20min的时候，流动相中的无机酸的体积比减少到20%，有机相的体积比增加到80%；
30min的时候，流动相中的无机酸的体积比又增加到85%，有机相的体积比减少到15%。
进一步地，所述无机酸为1%冰醋酸、0.1%三氟乙酸、0.05%磷酸中的一种。
进一步地，所述有机相为甲醇或乙腈。
优选地，所述无机酸为0.05%的磷酸。
优选地，固定相（即柱温）的温度为30℃。
优选地，所述有机相为乙腈。
优选地，所述样品室的温度为10℃。
优选地，所述检测波长为254nm。
优选地，所述流速为1ml/min。
本发明还提供上述采用HPLC分离定量测定磺酰胺类杂质的方法在塞来昔布药品或其他待测定拟含有磺酰胺类杂质磺胺、4-SAPH和YF042-14的药品的质量控制方法中的应用，用于同时分离及定量测定所述药品中的磺胺、4-SAPH和YF042-14，以有效控制药品的质量。
基于相同的原理，本方法也同样适用于其他拟含有磺酰胺类杂质磺胺、4-SAPH和YF042-14的药品，用于分离测定其他药品中含有的磺胺、4-SAPH和YF042-14，以有效控制药品的质量。
本发明的有益效果：本方法可以同时分离及定量测定磺胺、4-SAPH和YF042-14，尤其适用于定量测定塞来昔布原料中所含磺酰胺类杂质：磺胺、4-SAPH和YF042-14的含量。本发明能够完全分离塞来昔布中的磺胺、4-SAPH和YF042-14杂质，不受干扰，且峰型较好，完全有效控制塞来昔布原料的质量。
本发明的意义在于能提供一种可较好地同时分离定量磺胺、4-SAPH和YF042-14的分析方法，采用本发明的方法，经一次试验即可对这三种杂质分别定量。本方法专属性强，灵敏度高，准确度良好。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
附图1为按USP药典标准论坛PF43(6)中提到的现有方法检测磺胺、4-SAPH和YF042-14混合溶液的图谱。
附图2为本发明磺胺、4-SAPH和YF042-14波长选择依据的图谱。
附图3为采用本发明方法检测空白溶液的图谱。
附图4为采用本发明方法检测对照品溶液的图谱。
附图5为采用本发明方法检测塞来昔布供试品溶液的图谱。
附图6为采用本发明所述方法检测加杂质的塞来昔布供试品溶液的图谱。
附图7为磺胺、4-SAPH和YF042-14的线性关系图，其中：7a为磺胺的线性关系图；7b为4-SAPH的线性关系图；7c为YF042-14的线性关系图；
附图8采用本发明方法检测在不同流速下加杂质的塞来昔布溶液的图谱。
附图9采用本发明方法检测在不同柱温下加杂质的塞来昔布溶液的图谱。
附图10为采用本发明方法检测加杂质的塞来昔布制剂溶液的图谱。
具体实施方式
为了更好地阐述该发明的内容，下面通过具体实施例对本发明进一步的验证。特在此说明，实施例只是为更直接地描述本发明，它们只是本发明的一部分，不能对本发明构成任何限制。
本发明已在下述实施例中公开一种采用HPLC（高效液相色谱）分离及测定塞来昔布原料药中所含杂质磺胺、4-SAPH和YF042-14的方法。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现；基于本发明的原理，本领域的技术人员还可以将本发明的方案用于其他含杂质磺胺、4-SAPH和YF042-14的药品的检测和质量控制。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的产品及方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明提供的采用高效液相色谱测定塞来昔布中所含杂质磺胺、4-SAPH和YF042-14的方法进行详细说明。在具体实施方式中，所用各试剂、药品、试验环境等在未经特殊说明下，均来源相同和一致。
实施例1：检测波长的确定
仪器：Waters e2695-2489高效液相色谱仪
色谱柱：苯基键合硅胶为填充剂（Supelcosil LC-DP 4.6*250mm，5um）
流动相：以乙腈为流动相A，0.05%磷酸溶液为流动相B按如下表2进行梯度洗脱：
表2 流动相的梯度洗脱表
| 时间（min） | 流动相A（%） | 流动相B（%） |
| 0 | 15 | 85 |
| 15 | 15 | 85 |
| 20 | 80 | 20 |
| 25 | 80 | 20 |
| 30 | 15 | 85 |
| 35 | 15 | 85 |
0min的时候,流动相中无机酸与有机相的体积比为85%：15%（即起始体积比）；20min的时候，流动相中的无机酸的体积比减少到20%，有机相的体积比增加到80%；30min的时候，流动相中的无机酸的体积比又增加到85%，有机相的体积比减少到15%。
稀释剂：乙腈-水（20:80）
检测波长：200～400nm全波长扫描
柱温：30℃
样品室温度：10℃
流速：1.0ml/min
进样量：20μl
工作站：Empower 3
取磺胺对照品、4-SAPH对照品和YF042-14对照品各约10mg，精密称定，分置100ml量瓶中，加稀释剂溶解并稀释至刻度，取上述三种溶液各1ml置同一200ml量瓶中，加稀释剂稀释至刻度，作为对照品贮备液（4-SAPH需临用新制）。精密移取对照品贮备液1.5ml，置20ml量瓶中，加稀释剂稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液（临用新制）。
取对照品溶液按上述色谱条件进行测定，记录色谱图，结果见附图2。
附图2的检测结果表明：在该色谱系统下，乙腈-水（20:80）为溶剂，磺胺最大紫外吸收为259.8nm（取整数260nm），4-SAPH最大紫外吸收为247.9nm（取整数248nm），YF042-14最大紫外吸收为253.8nm（取整数254nm），在同等浓度下YF042-14的响应最低，而在254nm左右磺胺与4-SAPH的响应都较高，为了在同一个方法中保证3个杂质在同一波长下响应都高，将去YF042-14的最大吸收波长254nm作为检测波长。
实施例2：塞来昔布原料药的HPLC检测
仪器与试剂同实施例1。
取磺胺对照品、4-SAPH对照品和YF042-14对照品各约10mg，精密称定，分置100ml量瓶中，加稀释剂溶解并稀释至刻度，取上述三种溶液各1ml置同一200ml量瓶中，加稀释剂稀释至刻度，作为对照品贮备液（4-SAPH需临用新制）。精密移取对照品贮备液1.5ml，置20ml量瓶中，加稀释剂稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液（临用新制）。
取塞来昔布约100mg，精密称定，置10ml量瓶中加乙腈2ml溶解后再加水稀释至刻度，充分振摇5min使塞来昔布充分析出后过滤，取续滤液作为供试品溶液（冰浴，临用新制）。
分别取空白溶液、对照品溶液、塞来昔布供试品溶液，按上述色谱条件（实施例1提供的）进行测定，记录色谱图，结果分别见附图3（空白溶液检测图谱）、附图4（对照品溶液的检测图谱）、附图5（供试品溶液的检测图谱）以及表4。图4的峰结果如下：
表4 图4对照品溶液的检测图谱的峰结果
由图5可见，采用本方法检测塞来昔布供试品溶液时不出峰。
图6为采用本发明所述方法检测加入了磺胺、4-SAPH和YF042-14三种杂质相当于供试品主成分（塞来昔布）浓度3.75ppm的塞来昔布供试品溶液的图谱。由图6可见，采用本方法检测加了磺胺、4-SAPH和YF042-14杂质对照品的塞来昔布供试品溶液时，保留时间分别为4.886min、5.972min、7.839min的磺胺、4-SAPH和YF042-14色谱峰，均能实现良好的分离。因此说明采用本方法检测塞来昔布中的磺胺、4-SAPH和YF042-14杂质不受塞来昔布本身的干扰。
表5 图6对照品溶液的检测图谱的峰结果
采用本发明所述方法检测塞来昔布供试品时的各组分分离情况如下表6所示，表6中：磺胺不显示分离度是因为磺胺之前没有所需的目标峰。
表6 本发明方法检测塞来昔布供试品时的各组分分离情况表
实施例3：系统适用性试验
仪器与试剂同实施例1。本实施例的系统适用性同时考察了连续进样时仪器的系统适用性，由于4-SAPH不稳定，所以考察仪器系统适用性时只用了其他两个杂质磺胺、YF042-14考察。
取磺胺对照品和YF042-14对照品各约10mg，精密称定，分置100ml量瓶中，加稀释剂溶解并稀释至刻度，取上述两种溶液各1ml置同一200ml量瓶中，加稀释剂稀释至刻度，作为系统适用性贮备液。精密移取对照品贮备液1.5ml，置20ml量瓶中，加稀释剂稀释至刻度，摇匀，作为系统适用性溶液。
取系统适用性溶液按上述色谱条件连续进样6次，记录色谱图，计算每次进样各待测物的保留时间及峰面积，求得相对标准偏差应不大于5.0％，结果见表7。
表7 实施例3磺胺、YF042-14的保留时间及峰面积结果
结论：试验表明本色谱条件系统适用性良好。
实施例4：检测限和定量限
仪器与试剂同实施例1。
根据检测限信噪比法一般以信噪比为3：1或2：1 时相应浓度或注人仪器的量确定检测限，定量限信噪比法一般以信噪比为10： 1时相应浓度或注入仪器的量确定定量限，将磺胺、4-SAPH和YF042-14分别稀释至1.2ng/ml、3.9ng/ml，1.8ng/ml、6.0ng/ml，2.3ng/ml、7.7ng/ml浓度进样，记录色谱图，结果见表8。
表8 实施例4磺胺、4-SAPH 、YF042-14的保留时间、峰面积及S/N结果
| 名称 | 磺胺浓度ng/ml | 磺胺峰面积 | 磺胺的S/N | 4-SAPH浓度ng/ml | 4-SAPH峰面积 | 4-SAPH的S/N | YF042-14浓度ng/ml | YF042-14峰面积 | YF042-14的S/N |
| LOQ-1 | 3.9 | 371 | 12.4 | 6.0 | 575 | 13.7 | 7.7 | 452 | 10.3 |
| LOQ-2 | 3.9 | 327 | 11.1 | 6.0 | 552 | 13.3 | 7.7 | 490 | 10 |
| LOQ-3 | 3.9 | 343 | 12.1 | 6.0 | 546 | 13.7 | 7.7 | 493 | 10.4 |
| RSD% | / | 7 | / | / | 2.8 | / | / | 5 | / |
| LOD | 1.2 | 114 | 2.9 | 1.8 | 361 | 5.4 | 2.3 | 117 | 2.3 |
结论：磺胺检出限浓度为1.2ng/ml，4-SAPH检出限浓度为1.8ng/ml，YF042-14检出限浓度为2.3ng/ml；磺胺定量限浓度为3.9ng/ml，4-SAPH定量限浓度为6.0ng/ml，YF042-14定量限浓度为7.7ng/ml，3份定量限溶液中3个基因毒性杂质峰面积RSD（相对标准偏差，relative standard deviation，简称RSD）未超过10.0%。
实施例5：线性及范围
仪器与试剂同实施例1。
取浓度为0.0039ug/ml、0.0231ug/ml、0.0308ug/ml、0.0385ug/ml、0.0462ug/ml、0.0616ug/ml的磺胺对照品，取浓度为0.006ug/ml、0.0226ug/ml、0.0309ug/ml、0.0375ug/ml、0.0456ug/ml、0.0639ug/ml的4-SAPH对照品，取浓度为0.0077ug/ml、0.0231ug/ml、30.0308ug/ml、0.0385ug/ml、0.0462ug/ml、0.0616ug/ml的YF042-14对照品，分别作为LOQ、60%、80%、100%、120%、160%限度的对照品溶液；按上述色谱条件分别测定，记录色谱图，测定峰面积，以峰面积为纵坐标，浓度为横坐标作线性回归图，结果见表9、图7：
表9 实施例5磺胺、4-SAPH 、YF042-14的进样浓度、峰面积及线性回归方程
结论：结果表明，磺胺浓度分别在0.0039-0.0616ug/ml 范围内进样浓度与峰面积值有良好的线性关系；4-SAPH浓度分别在0.0060-0.0639ug/ml 范围内进样浓度与峰面积值有良好的线性关系；YF042-14浓度分别在0.0077-0.0616ug/ml 范围内进样浓度与峰面积值有良好的线性关系。
实施例6：回收率试验
仪器与试剂同实施例1，对照品溶液配制同实施例1。
分别称取塞来昔布适量置合适的容量瓶中使塞来昔布的浓度为10mg/ml，分为3组，每组3份。分别加入适量的磺胺、4-SAPH和YF042-14对照品使其3组的浓度分别为0.015ug/ml、0.0375ug/ml、0.045ug/ml，相当于含限度浓度的40%、100%、120%的加样回收率溶液，将制备好的上述溶液按上述色谱条件测定，记录色谱图，按下式计算回收率，结果见表10。
回收率计算公式：
表10 不同含限度浓度下的加样回收率溶液中的磺胺、4-SAPH 、YF042-14的回收率
| 名称 | 磺胺加入量/ug | 磺胺测得量/ug | 磺胺回收率% | 4-SAPH加入量/ug | 4-SAPH测得量/ug | 4-SAPH回收率% | YF042-14加入量/ug | YF042-14测得量/ug | YF042-14回收率% |
| 40%回收率-1 | 0.1533 | 0.1537 | 100.26 | 0.1522 | 0.1507 | 99.01 | 0.1507 | 0.1472 | 97.68 |
| 40%回收率-2 | 0.1533 | 0.1522 | 99.28 | 0.1528 | 0.1533 | 100.33 | 0.1507 | 0.1441 | 95.62 |
| 40%回收率-3 | 0.1533 | 0.1577 | 102.87 | 0.1587 | 0.172 | 108.38 | 0.1507 | 0.1487 | 98.67 |
| 100%回收率-1 | 0.7665 | 0.7625 | 99.48 | 0.7463 | 0.7507 | 100.59 | 0.7537 | 0.7549 | 100.16 |
| 100%回收率-2 | 0.7665 | 0.7709 | 100.57 | 0.753 | 0.7552 | 100.29 | 0.7537 | 0.6975 | 92.54 |
| 100%回收率-3 | 0.7665 | 0.7955 | 103.78 | 0.7762 | 0.7801 | 100.5 | 0.7537 | 0.7448 | 98.82 |
| 120%回收率-1 | 0.4599 | 0.4543 | 98.78 | 0.4531 | 0.4513 | 99.6 | 0.4522 | 0.4331 | 95.78 |
| 120%回收率-2 | 0.4599 | 0.4622 | 100.5 | 0.4738 | 0.5406 | 114.1 | 0.4522 | 0.4206 | 93.01 |
| 120%回收率-3 | 0.4599 | 0.4599 | 100 | 0.4549 | 0.4631 | 101.8 | 0.4522 | 0.4072 | 90.05 |
| RSD% | / | / | 1.7 | / | / | 5 | / | / | 4 |
结论：试验结果表明该法的准确度良好。
实施例7：重复性试验
仪器与试剂同实施例1，对照品溶液配制同实施例1。
取塞来昔布原料药100mg，加磺胺、4-SAPH和YF042-14对照品母液，再加适量稀释剂溶解并稀释制成塞来昔布10mg/ml、磺胺、4-SAPH和YF042-14各0.0375μg/ml的加杂质供试品溶液。
按上述色谱条件，对6份同一批加了杂质的供试品溶液进行测定，求得相对标准偏差，记录色谱图，结果见表11。
表11 不同浓度杂质供试品溶液的相对标准偏差（RSD%）
| 编号 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | RSD% |
| 磺胺含量ppm | 3.75 | 3.86 | 3.86 | 3.96 | 3.82 | 3.84 | 1.8 |
| 4-SAPH含量ppm | 3.33 | 3.48 | 4.00 | 3.78 | 4.31 | 4.41 | 12 |
| YF042-14含量ppm | 3.72 | 3.69 | 4.23 | 3.72 | 3.92 | 4.05 | 6 |
结论：不弄浓度杂质供试品溶液的相对标准偏差基本控制在10%以内，考虑到同时加样三个杂质且4-SAPH不稳定，且每一个母液都是临用新制的，有称样量的差异及稀释过程，因而4-SAPH相对标准偏差在12%是可以接受的。因此，该试验结果表明该法重现性良好。
实施例8：在不同流速下用本方法检查塞来昔布中磺胺、4-SAPH和YF042-14
仪器与试剂同实施例1，除流速外的其他色谱条件同实施例1。本研究的流速为0.9ml/min、1.0ml/min和1.1ml/min。
取塞来昔布原料药100mg，加磺胺、4-SAPH和YF042-14对照品母液，再加适量稀释剂溶解并稀释制成塞来昔布10mg/ml、磺胺、4-SAPH和YF042-14各0.0375μg/ml的加杂质供试品溶液。另取磺胺、4-SAPH和YF042-14对照品母液适量加稀释剂稀释成每1mL中各含0.0375μg的混合溶液，作为对照品溶液。
分别取空白溶液、对照品溶液、加杂质的塞来昔布供试品溶液，按上述色谱条件进行测定，记录色谱图，见附图8，图8中：三条曲线代表三种流速下的色谱图，由上至下依次为：1.1ml/min、1.0 ml/min、0.9ml/min。图8的峰结果如下表12：
表12 实施例8的检测图谱图8的峰结果
检测结果：按外标法计算，流速在0.9ml/min~1.1ml/min范围内，对照品溶液中磺胺、4-SAPH和YF042-14的信噪比均大于25，加杂质的塞来昔布供试品溶液中测得的各基因毒性杂质含量的标准偏差相当于限度值的百分比均小于20%。
实施例9：
在不同柱温（即固定相温度）下用本方法检查塞来昔布中磺胺、4-SAPH和YF042-14，仪器与试剂同实施例1，除柱温外的其他色谱条件同实施例1，本实施例选定柱温为25℃、30℃和35℃。溶液配制同实施例8。
分别取空白溶液、对照品溶液、加杂质的塞来昔布供试品溶液，按上述色谱条件进行测定，记录色谱图，见附图9，图9中：三条曲线代表三种不同柱温下的色谱图，由上至下依次为：35℃、30℃、25℃。
图9的检测结果显示：按外标法计算，柱温在25℃~35℃范围内，对照品溶液中磺胺、4-SAPH和YF042-14的信噪比均大于25，加杂质的塞来昔布供试品溶液中测得的各基因毒性杂质含量的标准偏差相当于限度值的百分比均小于20%。
实施例10：
塞来昔布制剂的HPLC检测，仪器与试剂同实施例1，对照品溶液配制同实施例1。
取塞来昔布胶囊细粉适量（相当于塞来昔布原料药100mg），配制方法同实施例1中供试品溶液的制备。
分别取空白溶液、对照品溶液、供试品溶液，按上述色谱条件进行测定，记录色谱图，结果见附图10及表13：
表13 实施例10的检测图谱图10的峰结果
以上所述为本发明的具体实施方式，但不能对本发明构成任何限制，因此需特别指出，凡是以本发明为基础，做得任何修改与改进均落在本发明保护范围之内。
Claims (9)
1.一种采用HPLC分离测定塞来昔布中磺酰胺类杂质的方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）供试品溶液的制备：
精密称定待测定拟含有磺酰胺类杂质磺胺、4-SAPH和三氟酮基对氨基磺酰基苯肼的塞来昔布原料药，采用稀释剂稀释，具体是加入乙腈溶解后再在冰浴条件下加水稀释，其中，乙腈：水的体积比为20：80；然后充分振摇使药品充分析出后过滤，取滤液作为供试品溶液待用；
（2）色谱条件：
色谱柱以苯基键合硅胶为固定相，采用无机酸-有机相为流动相进行梯度洗脱；所述固定相的温度为25～35℃，流速为0.9～1.1 mL/min，检测波长为254±6nm；样品室温度为4～10℃；所述流动相中无机酸-有机相的初始体积比为（72:28）～（85:15）；
（3）分离及定量测定：
吸取供试品溶液20～25μl，注入高效液相色谱仪，记录色谱图并读取数据，完成对塞来昔布原料药中磺酰胺类杂质磺胺、4-SAPH和三氟酮基对氨基磺酰基苯肼的分离及测定。
2.根据权利要求1所述的采用HPLC分离测定塞来昔布中磺酰胺类杂质的方法，其特征在于，
进行梯度洗脱的流动相中：无机酸-有机相初始体积比为85：15，洗脱梯度情况具体如下：
0min的时候 ,流动相中无机酸与有机相的体积比为85%：15%；
20min的时候，流动相中的无机酸的体积比减少到20%，有机相的体积比增加到80%；
30min的时候，流动相中的无机酸的体积比又增加到85%，有机相的体积比减少到15%。
3.根据权利要求1或2所述的采用HPLC分离测定塞来昔布中磺酰胺类杂质的方法，其特征在于，
所述无机酸为1%冰醋酸、0.1%三氟乙酸、0.05%磷酸中的一种。
4.根据权利要求3所述的采用HPLC分离测定塞来昔布中磺酰胺类杂质的方法，其特征在于，
所述有机相为甲醇或乙腈。
5.根据权利要求4所述的采用HPLC分离测定塞来昔布中磺酰胺类杂质的方法，其特征在于，
所述无机酸为0.05%的磷酸；所述有机相为乙腈。
6.根据权利要求5所述的采用HPLC分离测定塞来昔布中磺酰胺类杂质的方法，其特征在于，
所述固定相的温度为30℃；所述样品室的温度为10℃。
7.根据权利要求5或6所述的采用HPLC分离测定塞来昔布中磺酰胺类杂质的方法，其特征在于，
所述检测波长为254nm。
8.根据权利要求7所述的采用HPLC分离测定塞来昔布中磺酰胺类杂质的方法，其特征在于，
所述流速为1ml/min。
9.权利要求1或2所述采用HPLC分离测定塞来昔布中磺酰胺类杂质的方法在塞来昔布药品的质量控制方法中的应用，用于同时分离及定量测定塞来昔布药品中的磺胺、4-SAPH和三氟酮基对氨基磺酰基苯肼，以有效控制药品的质量。
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Denomination of invention: Separation and determination of Sulfonamide impurities in Celecoxib by HPLC and its application Effective date of registration: 20230605 Granted publication date: 20210723 Pledgee: Hunan Xiangjiang Times Financial Leasing Co.,Ltd. Pledgor: TIANDI HENGYI PHARMACEUTICAL Co.,Ltd. Registration number: Y2023980042799 |
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