CN115453025A - 一种水合氯醛的有关物质检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及药物检测分析领域，具体涉及一种水合氯醛的羧酸类和醛类降解杂质的检测方法。本发明的检测方法采用高效液相色谱法，采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，采用紫外检测器，检测波长210nm±2nm，以含酸水溶液为流动相A，乙腈为流动相B，按梯度洗脱。本发明提供的检测方法稳定、专属性好、灵敏度和准确度高，适合用于水合氯醛及其制剂的药品注册质量研究。
Description
技术领域
本发明涉及药物检测分析领域，具体涉及一种水合氯醛的有关物质检测方法。
背景技术
水合氯醛，一款催眠和抗惊厥药，其化学名为：2,2,2-三氯-1,1-乙二醇，结构如下：
水合氯醛易于在热、氧化、光照等条件下降解，性质不稳定，尤其是在水溶液中稳定性很差。目前国内外临床上水合氯醛多为其糖浆剂或者口服溶液，在我国常在儿科检查时被用作镇静催眠剂，因此本品的质量研究慎之又慎。根据水合氯醛的结构特征和降解特性，将其杂质谱大致分为三类：一是氯代烷烃类杂质，如三氯甲烷、二氯甲烷；二是醛类杂质，如氯乙醛、水合二氯乙醛、5-羟甲基糠醛；三是羧酸类杂质，如甲酸、乙酸、三氯乙酸等。
水合氯醛的醛类杂质中，5-羟甲基糠醛属于醛基警示结构杂质，而羧酸杂质中，三氯乙酸属于3类具有致癌风险的杂质，均需要在产品中严格控制。但现有技术缺乏完整的控制两类杂质的检测方法。
现有技术CN112656758A 说明书第0059至0066段记载了一种高效液相色谱法检测5-羟甲基糠醛杂质，但不适用于检测羧酸类杂质。而现有技术CN112345651B、CN109406690B均是气相色谱法，且只能检测部分羧酸杂质。
因此，开发更科学精准且适用性广的检测方法，以方便水合氯醛的药物质量研究，意义重大。
发明内容
为解决现有技术存在的技术问题，本发明提供一种水合氯醛有关物质的检测方法。该方法采用液相色谱法，能够同时方便又科学地检测水合氯醛的羧酸类和醛类降解杂质，且方法灵敏度高、专属性好、准确度和精密度高。
本发明提供一种水合氯醛有关物质的检测方法，所述检测方法采用液相色谱法，包括如下步骤：
（1）精密称取水合氯醛或其制剂适量，用溶剂稀释制成供试品溶液；
（2）将供试品溶液注入高效液相色谱仪中，按照色谱条件检测。
进一步地，上述色谱条件包括：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，采用紫外检测器，检测波长210nm±2nm，以含酸水溶液为流动相A，乙腈为流动相B，按梯度洗脱。
进一步地，上述流动相A的酸包括磷酸、盐酸、柠檬酸或酒石酸。
进一步地，上述流动相A中酸的用量为0.01%～2%；优选0.01%～0.2%；更优选0.1%。所述用量百分数“%”是体积比，即酸与水的体积比。
进一步地，上述溶剂包含流动相A、流动相B或流动相A和B的混合溶液；优选地，上述溶剂选自0.01%～2%磷酸水溶液与乙腈的混合溶液；更优选地，上述溶剂选自0.01%～2%磷酸水溶液与乙腈的体积比为（80～95）：（20～5）的混合溶液。
进一步地，上述梯度洗脱包含如下程序：0分钟时流动相A的比例为80～95，流动相B的比例为20～5，并维持至2～5分钟；8～15分钟时流动相A的比例下降至60～90，流动相B的比例上升至40～10；20～30分钟时流动相A的比例下降至10～40，流动相B的比例上升至90～60，并维持至30～40分钟；31～41分钟时，流动相A的比例上升为80～95，流动相B的比例下降为20～5。
进一步地，上述梯度洗脱包含如下程序：0分钟时流动相A的比例为80～95，流动相B的比例为20～5，并维持至3分钟；10分钟时流动相A的比例下降至60～90，流动相B的比例上升至40～10；25分钟时流动相A的比例下降至10～40，流动相B的比例上升至90～60，并维持至35分钟；36分钟时，流动相A的比例上升为80～95，流动相B的比例下降为20～5。
进一步地，上述梯度洗脱包含如下程序：0分钟时流动相A的比例为85～95，流动相B的比例为15～5，并维持至3分钟；10分钟时流动相A的比例下降至80～90，流动相B的比例上升至20～10；25分钟时流动相A的比例下降至10～20，流动相B的比例上升至90～80，并维持至35分钟；36分钟时，流动相A的比例上升为85～95，流动相B的比例下降为15～5。
进一步地，上述梯度洗脱包含如下程序：0分钟时流动相A的比例为95，流动相B的比例为5，并维持至3分钟；10分钟时流动相A的比例下降至90，流动相B的比例上升至10；25分钟时流动相A的比例下降至20，流动相B的比例上升至80，并维持至35分钟；36分钟时，流动相A的比例上升为95，流动相B的比例下降为5。
进一步地，上述梯度洗脱还包含如下平衡程序：所述平衡程序是维持上述末端流动性比例5～15分钟，优选10分钟。
进一步地，上述色谱条件的柱温为10～40℃；优选25℃。
进一步地，上述色谱条件的流速为0.5～2.0ml/min；优选1.0ml/min。
进一步地，上述色谱条件的进样量为20～40μl；优选30μl。
进一步地，上述色谱条件的柱温进一步地，上述水合氯醛的制剂包括水合氯醛或其盐与药学上可接受的辅料组成的药物组合物；优选地，所述制剂包含糖浆剂、口服溶液、灌肠液、栓剂或待灌液。
进一步地，上述有关物质包含甲酸、乙酸、5-羟甲基糠醛、三氯乙酸中的一种或几种。
进一步地，上述供试品溶液的色谱图中，如有有关物质，5-羟甲基糠醛的含量不超0.1%；或/和三氯乙酸的含量不超过0.1%，优选不超过0.05%；或/和甲酸的含量不超过0.5；或/和乙酸的含量不超过0.5%。
进一步地，上述供试品的每1ml中含有水合氯醛0.5～40mg；优选1～20mg；更优选10mg。
有益效果：本发明的水合氯醛有关物质检测方法专属性好，各峰峰型好，杂质峰与主峰以及杂质峰与杂质峰之间的分离度均符合药典要求；方法灵敏度、准确度高，重复性和重现性好，精密度高，符合质量分析检测要求，适合用于本品的醛类和羧酸类降解杂质的有关物质质量研究。
附图说明
图1：系统适用性溶液图谱。
具体实施方式
下面将结合试验例和实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的各例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。各例中未注明的具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为通过市购获得的本领域常规产品。
以下试验例和实施例所用的部分物料来源如下：
水合氯醛对照品：购自LGC，纯度99.4%；供试品：又称“本品”，为水合氯醛糖浆，自制，批号：5201101；5-羟甲基糠醛：购自中国食品药品检定研究院，纯度99.5%。
供试品（批号：5201101）处方及制备方法：参见专利CN 112656758 A实施例5的水合氯醛糖浆处方和制备方法（配液温度为25℃）。
试验例1：水合氯醛有关物质检测方法的方法学考察
⒈溶液配制和计算方法
供试品溶液制备：取本品适量（约相当于含水合氯醛100mg），精密称定，加溶剂溶解并定量稀释制成每1ml约含水合氯醛10mg的溶液。
对照品溶液制备：分别取甲酸、乙酸、5-羟甲基糠醛及三氯乙酸各适量，用溶剂溶解并稀释制成每1ml含甲酸50μg、乙酸50μg、5-羟甲基糠醛10μg、三氯乙酸5μg的混合溶液。
系统适用性溶液：取供试品适量（约相当于含水合氯醛100mg），量取甲酸、乙酸、5-羟甲基糠醛及三氯乙酸储备液1ml，加溶剂溶解并定量稀释制成每1ml约含水合氯醛10mg、甲酸50μg、乙酸50μg、5-羟甲基糠醛10μg、三氯乙酸5μg的混合溶液。
空白辅料溶液：按供试品溶液配制方法同法配制空白辅料溶液。
备注：上述溶剂为0.1%磷酸水溶液和乙腈的体积比为95:5的混合溶液（以下同）。而经过探索可以发现，本发明范围内的流动相均可以适用，且不限于本发明的流动相。
测定法：精密量取各溶液，分别注入液相色谱仪中，记录色谱图。
计算方法：按外标法以峰面积计算。
⒉色谱条件
（1）波长测定
通过PDA检测器测定各杂质紫外吸收图，各物质最大紫外吸收波长如表1-1所示。
由上表结果可知，在波长205~215nm波长范围内，可能满足检测需求。
（1）方法筛选
根据现有技术和水合氯醛、甲酸、乙酸、三氯乙酸的结构及性质，我们进行了一系列的色谱条件筛选，其中较为典型的色谱条件见表1-2和表1-3。
色谱条件2至4的梯度洗脱程序如下表：
综上研究结果，为了同时满足检测灵敏度、分离度和峰型，暂定色谱条件4作为有关物质检测条件，并对方法进行验证。
（2）流动相水相（流动相A）的选择
在上述初步拟定色谱条件基础上，在其他条件不变的情况下，在水相中添加不同的酸，如磷酸、盐酸、柠檬酸或酒石酸，分别进样检测上述各溶液，采集色谱图。
结果说明：上述不同盐的色谱条件下，主峰和杂质峰以及杂质峰与杂质峰之间均能有效分离，拖尾因子均小于1.2，各峰峰型好。
（3）柱温的选择
在上述初步拟定色谱条件基础上，在其他条件不变的情况下，选择四种色谱柱温度进行试验，柱温1（10℃）、柱温2（20℃）、柱温3（30℃）、柱温4（40℃）。采用上述四种条件，分别进样检测上述各溶液，采集色谱图。
结果说明：四种柱温条件下，主峰和杂质峰以及杂质峰与杂质峰之间均能有效分离，拖尾因子均小于1.2，各峰峰型好。表明柱温对测定结果无影响。
（4）流速的选择
在上述初步拟定色谱条件基础上，在其他条件不变的情况下，选择三种色谱流速进行试验，流速1（0.5ml/min）、流速2（1.0ml/min）、流速3（2.0ml/min）。采用上述三种条件，分别进样检测上述各溶液，采集色谱图。
结果说明：三种流速条件下，主峰和杂质峰以及杂质峰与杂质峰之间均能有效分离，拖尾因子均小于1.2，各峰峰型好。表明流速对有关物质测定结果无影响。
试验例2：方法验证
本试验下所用溶液及其配制同试验例1，色谱条件为：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以0.1%磷酸水溶液为流动相A，乙腈为流动相B，按上表1-3进行梯度洗脱；检测波长为210nm；进样体积30μl，柱温25℃，流速1.0ml/min。
⒈专属性
取已知杂质、空白溶剂、系统适用性、供试品适量，按拟定的色谱条件进样测定。结果见表2-1。系统适用性溶液图谱见附图1。
试验结果表明：出峰顺序依次为甲酸、乙酸、5-羟甲基糠醛、三氯乙酸和主成分，在拟定的色谱条件下，各杂质同主成分之间的分离度均大于1.5，专属性良好。空白溶剂及空白辅料对杂质峰的检测无干扰。
⒉破坏实验
本品为小儿水合氯醛糖浆剂，为了考察本品可能的降解途径及拟定色谱条件对潜在降解产物与主成分峰的分离能力，我们对供试品进行了强制降解试验。
样品制备方法：称取本品（批号：5201101）适量，经常规强制破坏后用溶剂溶解并稀释制成每1ml含水合氯醛约10mg的溶液，即得。
试验结果表明：本品经酸、碱、氧化、高温和光照破坏后，被测杂质峰和主成分峰均能很好的分离，强制降解试验所产生的杂质与被测杂质峰的分离度均大于1.5，且已知杂质峰和主峰的最小纯度指数均大于1，符合相关技术要求。
⒊检测限、定量限
取本品各已知杂质适量，分别用溶剂适量溶解，用溶剂逐级稀释，当信噪比约为10：1时，确定为该物质的定量限，当信噪比约为3：1时，确定为该物质的检测限。本品及已知杂质的定量限与检测限试验结果见表2-2。
试验结果表明：本品有关物质检查拟定的进样浓度为10mg/ml，进样30µl，绝对进样量为300000ng。绝对进样量大于乙酸检测限的10000倍，表明拟定的进样浓度能够保证本品杂质的有效检出。
⒋线性
取甲酸、乙酸、5-羟甲基糠醛和三氯乙酸对照品适量，精密称定，用溶剂稀释制成定量限浓度、12.5%、25%、50%、100%、200%的对照品溶液，精密量取上述各溶液30μl，注入液相色谱仪，记录各浓度的峰面积，以浓度为横坐标、相应的峰面积为纵坐标作线性回归，结果见表2-3。
综上，当甲酸的浓度在0.5334μg/ml～106.6800μg/ml之间时，浓度与峰面积呈良好的线性关系；乙酸的浓度在1.9916μg/ml～99.5800μg/ml之间时，浓度与峰面积呈良好的线性关系；5-羟甲基糠醛的浓度在0.0738μg/ml～19.6707μg/ml之间时，浓度与峰面积呈良好的线性关系；三氯乙酸的浓度在0.2145μg/ml～10.7264μg/ml之间时，浓度与峰面积呈良好的线性关系。
⒌进样精密度
将对照品溶液连续进样6次，记录色谱图，计算峰面积的RSD。试验结果见表2-4。
由上表可知，对照品溶液各峰面积的RSD均≤2%，进样精密度良好。
⒍重复性和重现性
为了考察本品甲酸、乙酸、5-羟甲基糠醛、三氯乙酸测定方法的精密度，取同一批供试品在不同实验室由两名分析人员，分别制备6份供试品溶液，按拟定方法进行检测。试验结果见表2-5。
由上表可知，同一批供试品在不同实验室由两名分析人员测定结果无明显差异。表明拟定的有关物质方法重复性和重现性良好。
⒎准确度
为了验证该甲酸、乙酸、5-羟甲基糠醛、三氯乙酸测定方法的准确性，采用了向供试品中加杂质对照品的方式进行考察。按拟定方法制备供试品溶液，在供试品溶液中分别加入限度测定浓度50%、100%、150%的已知杂质对照品进样测定，计算回收率。试验结果见表2-6、表2-7、表2-8、表2-9。
由上表可知，甲酸的回收率在101.34%~107.70%之间，平均回收率为103.8%，RSD=2.7%；乙酸的回收率在104.05%~113.33%之间，平均回收率为107.6%，RSD=3.6%；5-羟甲基糠醛的回收率在101.18%~107.05%之间，平均回收率为103.5%，RSD=2.3%；三氯乙酸的回收率在104.05%~112.50%之间，平均回收率为107.5%，RSD=3.0%，说明拟定的检测方法准确度高。
⒏耐用性
为了验证拟定的液相条件发生微小变动时，测定结果的准确性不受影响的程度，对拟定色谱条件的耐用性进行了考察。
取各溶液，按拟定色谱条件进行测定。
试验结果表明，当检测波长、流速、柱温、色谱柱、流动相发生微小变动时，如检测波长变化±2nm、流速变化±0.2ml/min、柱温变化±5℃、进样量变化±5μl、变换不同型号色谱柱（填料不变），在各条件下，有关物质测定结果无显著差异，均符合药典可接受标准。
实施例1：
色谱条件：梯度程序见下表3-1，其他条件同试验例2。
测定：将各溶液注入各色谱系统，采集色谱图。
实施例2：
色谱条件：梯度程序见下表3-2，其他条件同试验例2。
测定：将各溶液注入各色谱系统，采集色谱图。
实施例3：
色谱条件：梯度程序见下表3-3，其他条件同试验例2。
测定：将各溶液注入各色谱系统，采集色谱图。
数据统计和总结：汇总试验例2“专属性项下”和上述实施例1～3的色谱图，统计峰面积、保留时间和分离度，结果显示：（1）各对照品溶液色谱图中：各峰的峰型好，各水合氯醛峰、甲酸峰、乙酸峰、三氯乙酸峰以及其它杂质峰等之间的分离度均在2.0以上，均大于1.5，各峰之间分离度较好，各方法专属性好，符合质量分析要求。（2）各供试品溶液色谱图中：按外标法计算，各5-羟甲基糠醛的含量与试验例2的差值在0.003%以内，各甲酸、乙酸和三氯乙酸的含量分别与试验例2中相应组分的差值在0.03%以内，表明各实施例的测定方法准确度高、重现性良好。
Claims (10)
1.一种水合氯醛有关物质检测方法，采用液相色谱法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
（1）精密称取水合氯醛或其制剂适量，用溶剂稀释制成供试品溶液；
（2）将供试品溶液注入高效液相色谱仪中，按照色谱条件检测。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述色谱条件包括：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，采用紫外检测器，检测波长210nm±2nm，以含酸水溶液为流动相A，乙腈为流动相B，按梯度洗脱。
3.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述流动相A的酸包括磷酸、盐酸、柠檬酸或酒石酸。
4.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述流动相A中酸的用量为0.01%～2%。
5.根据权利要求1～2任一所述的检测方法，其特征在于，所述溶剂包含流动相A、流动相B或流动相A和B的混合溶液。
6.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述梯度洗脱包含如下程序：0分钟时流动相A的比例为80～95，流动相B的比例为20～5，并维持至2～5分钟；8～15分钟时流动相A的比例下降至60～90，流动相B的比例上升至40～10；20～30分钟时流动相A的比例下降至10～40，流动相B的比例上升至90～60，并维持至30～40分钟；31～41分钟时，流动相A的比例上升为80～95，流动相B的比例下降为20～5。
7.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述梯度洗脱包含如下程序：0分钟时流动相A的比例为80～95，流动相B的比例为20～5，并维持至3分钟；10分钟时流动相A的比例下降至60～90，流动相B的比例上升至40～10；25分钟时流动相A的比例下降至10～40，流动相B的比例上升至90～60，并维持至35分钟；36分钟时，流动相A的比例上升为80～95，流动相B的比例下降为20～5。
8.根据权利要求1～2任一所述的检测方法，其特征在于，所述水合氯醛的制剂包括糖浆剂、口服溶液、灌肠液、栓剂或待灌液。
9.根据权利要求1～2任一所述的检测方法，其特征在于，所述有关物质包含甲酸、乙酸、5-羟甲基糠醛、三氯乙酸中的一种或几种。
10.根据权利要求1～2任一所述的检测方法，其特征在于，所述供试品溶液的色谱图中，如有有关物质，5-羟甲基糠醛的含量不超0.1%；或/和三氯乙酸的含量不超过0.1%，优选不超过0.05%；或/和甲酸的含量不超过0.5%；或/和乙酸的含量不超过0.5%。
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