CN117054579B - 处理样品的方法、测定样品中的有关物质含量的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于医药领域，具体涉及一种处理样品的方法，其中，所述样品包含表柔比星或其可药用盐；所述方法包括如下步骤：将所述样品与醇类试剂混合，以溶剂稀释，得到稀释物；其中，所述醇类试剂选自乙二醇、丙三醇和1,2‑丙二醇中的一种或多种；所述溶剂为包含0.1%w/v~0.3%w/v十二烷基硫酸钠的乙腈‑水‑甲醇‑80%w/v~85%w/v磷酸水溶液的混合液。本发明还涉及一种测定样品中的有关物质含量的方法。本发明方法能有效改善液相色谱图的基线波动问题，测定有关物质含量的准确度高、重复性好、中间精密度高、可靠性和耐用性高。
Description
技术领域
本发明属于医药领域，具体涉及一种处理样品的方法，还涉及一种测定样品中的有关物质含量的方法。
背景技术
目前，采用现有的液相色谱法测定含有表柔比星或其可药用盐的样品中的有关物质时，表柔比星色谱峰后会出现明显的基线波动，严重影响了表柔比星的色谱峰形及样品中的有关物质含量检测。
发明内容
本发明目的之一在于提供一种处理样品的方法；本发明另一目的在于提供一种测定样品中的有关物质含量的方法；所述样品包含表柔比星或其可药用盐。本发明的处理方法和测定方法能有效改善液相色谱图的基线波动问题，并且，本发明方法测定有关物质含量的准确度高、重复性好、中间精密度高、可靠性和耐用性高。
本发明第一方面涉及一种处理样品的方法，其中，所述样品包含表柔比星或其可药用盐；
所述方法包括如下步骤：
将所述样品与醇类试剂混合，以溶剂稀释，得到稀释物；
其中，所述醇类试剂选自乙二醇、丙三醇和1,2-丙二醇中的一种或多种；所述溶剂为包含0.1 %w/v~0.3 %w/v（例如0.15 %w/v、0.2 %w/v、0.25 %w/v）十二烷基硫酸钠的乙腈-水-甲醇-80 %w/v ~85 %w/v（例如85 %w/v）磷酸水溶液的混合液。
本发明第一方面的任意实施方式中，所述样品与醇类试剂的比例为1~10 mg/mL，例如1 mg/mL、2 mg/mL、3 mg/mL、5 mg/mL、6 mg/mL、7 mg/mL、8 mg/mL、9 mg/mL。
本发明第一方面的任意实施方式中，所述混合溶液中，乙腈、水、甲醇和磷酸水溶液的体积比为(285-295):(535-545):(165-175):1，优选为(285-290):(535-540):(165-170):1，例如290:540:170:1。
本发明第一方面的任意实施方式中，所述样品在所述稀释物中的含量为0.3~0.7mg/mL，例如0.4 mg/mL、0.5 mg/mL、0.6 mg/mL、0.65 mg/mL。
本发明第一方面的任意实施方式中，所述样品为注射用冻干粉。
本发明第二方面提供了一种测定样品中的有关物质含量的方法，其中，所述样品包含表柔比星或其可药用盐；
所述方法包括如下步骤：
按照本发明第一方面的方法处理样品，得到稀释物；
取稀释物进一步稀释，得到对照物；
采用液相色谱检测稀释物和对照物，根据检测结果得到所述样品中的有关物质含量，所述有关物质包括多柔比星酮、多柔比星、其他单个最大杂质、二氢柔红霉素及总杂质中的一项或多项，优选地，所述有关物质为二氢柔红霉素；
其中，液相色谱的操作条件包括：色谱柱为Agilent ZORBAX SB-C3色谱柱；柱温为32~38 ℃，例如32 ℃、33 ℃、34 ℃、35 ℃、36 ℃、37 ℃；流动相为本发明第一方面中的溶剂；流动相的流速为1.8~2.2 mL/min，例如1.9 mL/min、2.0 mL/min、2.1 mL/min、2.2 mL/min。
本发明第二方面的任意实施方式中，液相色谱的操作条件还包括如下的一项或多项：
采用紫外检测器；
紫外检测器的检测波长为254 nm；
检测时间大于或等于表柔比星的保留时间的2倍，可选为大于或等于表柔比星的保留时间的4倍；
进样量为20 μL。
本发明第二方面的任意实施方式中，所述样品在所述对照物中的含量为3~7 μg/mL，例如3μg/mL、4μg/mL、5μg/mL、6μg/mL、7μg/mL。
本发明第二方面的任意实施方式中，采用本发明第一方面的溶剂进一步稀释所述稀释物。
本发明第二方面的任意实施方式中，所述方法包括如下的一项或多项：
1）按照如下公式计算稀释物中的多柔比星酮含量，然后计算样品中的多柔比星酮含量：
；
2）按照如下公式计算稀释物中的多柔比星含量，然后计算样品中的多柔比星含量：
；
3）按照如下公式计算稀释物中的其他单个最大杂质含量，然后计算样品中的其他单个最大杂质含量：
；
4）按照如下公式计算稀释物中的总杂质含量，然后计算样品中的总杂质含量：
。
本发明中，总杂质是指样品中除表柔比星或其可药用盐以外的其他所有物质。
本发明中，其他单个最大杂质是指色谱图中除了表柔比星主峰、多柔比星酮峰、多柔比星峰以外的峰面积最大的色谱峰对应的杂质物质。
本发明取得的有益效果：
1、本发明的处理方法和测定方法能有效改善液相色谱图的基线波动问题。
2、本发明方法测定有关物质含量的准确度高、重复性好、中间精密度高、可靠性和耐用性高。
3、本发明的处理方法得到的物质的稳定性高，长时间放置后仍可用于检测。
附图说明
为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面根据本发明的具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明，其中：
图1：实施例1中采用对比方法处理的空白溶液的色谱图；
图2：实施例1中的溶剂中加乙醇处理的空白溶液的色谱图；
图3：实施例1中的溶剂中加乙二醇处理的空白溶液的色谱图；
图4：实施例1中的溶剂中加丙三醇处理的空白溶液的色谱图；
图5：实施例1中的溶剂中加1,2-丙二醇处理的空白溶液的色谱图；
图6：实施例1中的溶剂中加二乙二醇处理的空白溶液的色谱图；
图7：实施例1中的溶剂中加1,3-丁二醇处理的空白溶液的色谱图；
图8：实施例1中的系统适用性溶液的色谱图；
图9：实施例1中采用对比方法处理的供试溶液的色谱图；
图10：实施例1中的溶剂中加乙醇处理的供试溶液的色谱图；
图11：实施例1中的溶剂中加乙二醇处理的供试溶液的色谱图；
图12：实施例1中的溶剂中加丙三醇处理的供试溶液的色谱图；
图13：实施例1中的溶剂中加1,2丙二醇处理的供试溶液的色谱图；
图14：实施例1中的溶剂中加二乙二醇处理的供试溶液的色谱图；
图15：实施例1中的溶剂中加1,3丁二醇处理的供试溶液的色谱图；
图16：实施例2中采用对比方法处理的空白溶液的色谱图；
图17：实施例2中的溶剂中加乙二醇处理的空白溶液的色谱图；
图18：实施例2中的系统适用性溶液的色谱图；
图19：实施例2中采用对比方法处理的供试溶液的色谱图；
图20：实施例2中的溶剂中加0.5 mL乙二醇处理的供试溶液的色谱图；
图21：实施例2中的溶剂中加1 mL乙二醇处理的供试溶液的色谱图；
图22：实施例2中的溶剂中加2 mL乙二醇处理的供试溶液的色谱图；
图23：实施例2中的溶剂中加3 mL乙二醇处理的供试溶液的色谱图；
图24：实施例2中的溶剂中加5 mL乙二醇处理的供试溶液的色谱图；
图25：实施例3中的加标供试溶液的色谱图；
图26：实施例3中在柱温35℃、流速2mL/min 下的系统适用性溶液的色谱图；
图27：实施例3中在柱温32℃、流速2mL/min 下的系统适用性溶液的色谱图；
图28：实施例3中在柱温38℃、流速2mL/min 下的系统适用性溶液的色谱图；
图29：实施例3中在柱温 35℃、流速2.2mL/min 下的系统适用性溶液的色谱图；
图30：实施例3中在柱温 35℃、流速1.8ml/min 下的系统适用性溶液的色谱图。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。以下对至少一个示例性实施例的描述实际上仅仅是说明性的，决不作为对本发明及其应用或使用的任何限制。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例使用的仪器：
电子天平：METTLER XS 205、METTLER XPE 205
超纯水机：Sartorius arium pro UV型超纯水机
色谱柱：Agilent ZORBAX SB-C3色谱柱，柱长250mm，内径4.6mm，填料粒径5μm
实施例使用的材料和试剂：
注射用盐酸表柔比星（冻干粉；批号：210602，规格：10mg，北京协和药厂有限公司，同一批次）；
多柔比星酮对照品（批号：130676-201801，中国食品药品检定研究院）；
盐酸多柔比星对照品（批号：130509-202104，中国食品药品检定研究院）；
盐酸表柔比星对照品（批号：E0550000 7.0，EP）；
二氢柔红霉素对照品（批号：1200881 F022NO，USP）；
甲醇（批号：218267，色谱纯，Fisher）；
乙腈（批号：F22M7J201，色谱纯，Fisher）；
十二烷基硫酸钠（批号：20981001，优级纯，Scharlau）；
85%磷酸（批号：183354，色谱纯，Fisher）；
乙二醇（批号：D2127121，色谱纯，阿拉丁）；
丙三醇（批号：20220105，分析纯，国药集团）；
无水乙醇（批号：20220104，优级纯，国药集团）；
1,2-丙二醇（批号：20210518，分析纯，国药集团）；
二乙二醇（批号： H1601033，分析纯，阿拉丁）；
1,3-丁二醇（批号：H1621080，分析纯，阿拉丁）。
实施例1
（a）对比方法处理样品
取注射用盐酸表柔比星，用第（i）项中的流动相溶解并稀释制成每1 mL中含盐酸表柔比星0.5 mg的溶液，作为供试溶液；精密量取供试溶液适量，用第（i）项中的流动相定量稀释制成每1 mL中含盐酸表柔比星5 μg的溶液，作为对照溶液。其中，以第（i）项中的流动相作为对比方法处理的空白溶液。
（b）溶剂中加入乙醇处理样品
取注射用盐酸表柔比星10mg，加2 mL乙醇，振摇使溶解，用第（i）项中的流动相稀释制成每1 mL中含盐酸表柔比星0.5 mg的溶液，作为供试溶液；精密量取供试溶液适量，用第（i）项中的流动相定量稀释制成每1 mL中含盐酸表柔比星5 μg的溶液，作为对照溶液。其中，以2 mL乙醇与18 mL第（i）项中的流动相混合作为溶剂中加乙醇处理的空白溶液。
（c）溶剂中加入乙二醇处理样品
取注射用盐酸表柔比星10mg，加2 mL乙二醇，振摇使溶解，用第（i）项中的流动相稀释制成每1 mL中含盐酸表柔比星0.5 mg的溶液，作为供试溶液；精密量取供试溶液适量，用第（i）项中的流动相定量稀释制成每1 mL中含盐酸表柔比星5 μg的溶液，作为对照溶液。其中，以2 mL乙二醇与18 mL第（i）项中的流动相混合作为溶剂中加乙二醇处理的空白溶液。
（d）溶剂中加入丙三醇处理样品
取注射用盐酸表柔比星10mg，加2 mL丙三醇，振摇使溶解，用第（i）项中的流动相稀释制成每1 mL中含盐酸表柔比星0.5 mg的溶液，作为供试溶液；精密量取供试溶液适量，用第（i）项中的流动相定量稀释制成每1 mL中含盐酸表柔比星5 μg的溶液，作为对照溶液。其中，以2 mL丙三醇与18 mL第（i）项中的流动相混合作为溶剂中加丙三醇处理的空白溶液。
（e）溶剂中加入1,2-丙二醇处理样品
取注射用盐酸表柔比星10mg，加2 mL 1,2-丙二醇，振摇使溶解，用第（i）项中的流动相稀释制成每1 mL中含盐酸表柔比星0.5 mg的溶液，作为供试溶液；精密量取供试溶液适量，用第（i）项中的流动相定量稀释制成每1 mL中含盐酸表柔比星5 μg的溶液，作为对照溶液。其中，以2 mL 1,2-丙二醇与18 mL第（i）项中的流动相混合作为溶剂中加1,2-丙二醇处理的空白溶液。
（f）溶剂中加入二乙二醇处理样品
取注射用盐酸表柔比星10mg，加2 mL二乙二醇，振摇使溶解，用第（i）项中的流动相稀释制成每1 mL中含盐酸表柔比星0.5 mg的溶液，作为供试溶液；精密量取供试溶液适量，用第（i）项中的流动相定量稀释制成每1 mL中含盐酸表柔比星5 μg的溶液，作为对照溶液。其中，以2 mL 二乙二醇与18 mL第（i）项中的流动相混合作为溶剂中加二乙二醇处理的空白溶液。
（g）溶剂中加入1,3-丁二醇处理样品
取注射用盐酸表柔比星10mg，加2 mL 1,3丁二醇，振摇使溶解，用第（i）项中的流动相稀释制成每1 mL中含盐酸表柔比星0.5 mg的溶液，作为供试溶液；精密量取供试溶液适量，用第（i）项中的流动相定量稀释制成每1 mL中含盐酸表柔比星5 μg的溶液，作为对照溶液。其中，以2 mL 1,3-丁二醇与18 mL第（i）项中的流动相混合作为溶剂中加1,3-丁二醇处理的空白溶液。
（h）系统适用性溶液配制
精密称取多柔比星酮对照品3 mg、盐酸多柔比星对照品3 mg和盐酸表柔比星对照品10 mg，置100 mL量瓶中，加第（i）项中的流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，制成每1 mL中分别含多柔比星酮30 μg、盐酸多柔比星30 μg与盐酸表柔比星100 μg的混合溶液，作为系统适用性溶液。
（i）液相色谱检测
采用高效液相色谱对上述各项中的对比方法处理的供试溶液、对比方法处理的空白溶液、不同溶剂处理的供试溶液、不同溶剂处理的空白溶液和系统适用性溶液进行检测。
高效液相色谱（赛默飞U3000）的操作条件：
色谱柱：Agilent ZORBAX SB-C3色谱柱，柱长250 mm，内径4.6 mm，填料粒径5 μm；以乙腈-水-甲醇-85 %w/v磷酸水溶液（290 : 540 : 170 : 1，v/v/v/v）并含0.2 %w/v十二烷基硫酸钠的混合溶液为流动相，流速为每分钟2.0 mL；采用紫外检测器，检测波长为254nm；柱温为35 ℃；进样量为20 μL；记录色谱图至少至主成分表柔比星保留时间的4倍。
（j）结果
图1-7为对比方法及不同溶剂处理的空白溶液的色谱图；图8为系统适用性溶液的色谱图；图9为对比方法处理的供试溶液的色谱图；图10为溶剂中加乙醇处理的供试溶液的色谱图；图11为溶剂中加乙二醇处理的供试溶液的色谱图；图12为溶剂中加丙三醇处理的供试溶液的色谱图；图13为溶剂中加1,2-丙二醇处理的供试溶液的色谱图；图14为溶剂中加二乙二醇处理的供试溶液的色谱图；图15为溶剂中加1,3-丁二醇处理的供试溶液的色谱图。
由图1-15可知，图9、10、14、15表柔比星主峰后有明显的基线波动，图11、12、13表柔比星主峰后基线波动基本消除，并且，图11的杂质谱与对比方法的杂质谱一致。与对比方法相比，溶剂中加乙二醇、丙三醇、1,2-丙二醇的处理方法可显著改善表柔比星色谱峰后的基线波动。
实施例2
（a）对比方法处理样品
取注射用盐酸表柔比星，用第（d）项中的流动相溶解并稀释制成每1 mL中含盐酸表柔比星0.5 mg的溶液，作为供试溶液；精密量取供试溶液适量，用第（d）项中的流动相定量稀释制成每1 mL中含盐酸表柔比星5 μg的溶液，作为对照溶液。其中，以第（d）项中的流动相作为对比方法处理的空白溶液。
（b）溶剂中加入不同量乙二醇处理样品
取注射用盐酸表柔比星10mg，分别加0.5 mL、1 mL、2 mL、3 mL、5 mL乙二醇，振摇使溶解，用第（d）项中的流动相稀释制成每1 mL中含盐酸表柔比星0.5 mg的溶液，作为供试溶液；精密量取供试溶液适量，用第（d）项中的流动相定量稀释制成每1 mL中含盐酸表柔比星5 μg的溶液，作为对照溶液。其中，以2 mL乙二醇与18 mL第（d）项中的流动相混合作为溶剂中加乙二醇处理的空白溶液。
（c）系统适用性溶液配制
精密称取多柔比星酮对照品3 mg、盐酸多柔比星对照品3 mg和盐酸表柔比星对照品10 mg，置100 mL量瓶中，加第（d）项中的流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，制成每1 mL中分别含多柔比星酮30 μg、盐酸多柔比星30 μg与盐酸表柔比星100 μg的混合溶液，作为系统适用性溶液。
（d）液相色谱检测
采用高效液相色谱对上述各项中的对比方法处理的供试溶液、对比方法处理的空白溶液、不同量乙二醇处理的供试溶液、加乙二醇处理的空白溶液和系统适用性溶液进行检测。
高效液相色谱（赛默飞U3000）的操作条件：
色谱柱：Agilent ZORBAX SB-C3色谱柱，柱长250 mm，内径4.6 mm，填料粒径5 μm；以乙腈-水-甲醇-85 %w/v磷酸水溶液（290 : 540 : 170 : 1，v/v/v/v）并含0.2 %w/v十二烷基硫酸钠的混合溶液为流动相，流速为每分钟2.0 mL；采用紫外检测器，检测波长为254nm；柱温为35 ℃；进样量为20 μL；记录色谱图至少至主成分表柔比星保留时间的4倍。
（e）结果
图16为采用对比方法处理的空白溶液的色谱图；图17为溶剂中加乙二醇处理的空白溶液的色谱图；图18为系统适用性溶液的色谱图；图19为采用对比方法处理的供试溶液的色谱图；图20-24为溶剂中加不同量乙二醇处理的供试溶液的色谱图。
由图16-24可知：图19表柔比星主峰后有明显的基线波动；图20-24表柔比星主峰后基线波动均显著改善，且杂质谱与图19采用对比方法处理的供试溶液的杂质谱基本一致；其中，图22-24表柔比星主峰后基线波动基本消除。因此，与对比方法相比，溶剂中加入不同量的乙二醇可显著改善表柔比星主峰后出现的基线波动。
实施例3
本实施例对采用本发明新的供试溶液配制方法下的有关物质分析方法进行验证，进一步证明分析方法的准确可靠性。由于表柔比星色谱峰后基线波动处的主要杂质为二氢柔红霉素，准确度及检出限主要针对该杂质进行验证。
（a）样品处理方法：
供试溶液的制备：取注射用盐酸表柔比星10mg，加2 mL乙二醇，振摇使溶解，用第（b）项中的流动相稀释制成每1 mL中含盐酸表柔比星0.5 mg的溶液，作为供试溶液。
对照溶液的制备：精密量取供试溶液适量，用第（b）项中的流动相定量稀释制成每1 mL中含盐酸表柔比星5 μg的溶液，作为对照溶液。
系统适用性溶液的制备：取多柔比星酮3 mg、盐酸多柔比星3 mg和盐酸表柔比星10 mg，置100 mL量瓶中，加第（b）项中的流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，制成每1 mL中分别含多柔比星酮30 μg、盐酸多柔比星30 μg与盐酸表柔比星100 μg的混合溶液，作为系统适用性溶液。
二氢柔红霉素对照贮备液的制备：取二氢柔红霉素20 mg，精密称定，至20 mL量瓶中，加第（b）项中的流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，作为二氢柔红霉素溶液（1 mg/mL）；取上述溶液1 mL至20 mL量瓶中，用第（b）项中的流动相稀释至刻度，摇匀，作为二氢柔红霉素对照贮备液（0.05 mg/mL）；
二氢柔红霉素对照溶液的制备：精密量取二氢柔红霉素对照贮备液1 mL，至20 mL量瓶中，用第（b）项中的流动相稀释至刻度，摇匀，作为二氢柔红霉素对照溶液（0.0025 mg/mL）；
加标供试溶液的制备：取注射用盐酸表柔比星10mg，加乙二醇2 mL，振摇使溶解，全部转移至20 mL量瓶中，精密加入二氢柔红霉素对照溶液1 mL，加第（b）项中的流动相稀释至刻度，摇匀，制成每1 mL中含盐酸表柔比星0.5 mg、二氢柔红霉素0.0025 mg的溶液，作为加标供试溶液。
（b）液相色谱检测：
采用高效液相色谱对上述的供试溶液、对照溶液、系统适用性溶液、二氢柔红霉素对照溶液和加标供试溶液进行检测。加标供试溶液的色谱图如图25所示。
高效液相色谱（安捷伦1260）的操作条件：
色谱柱：Agilent ZORBAX SB-C3色谱柱，柱长250 mm，内径4.6 mm，填料粒径5 μm；以乙腈-水-甲醇-85 %w/v磷酸水溶液（290 : 540 : 170 : 1，v/v/v/v）并含0.2 %w/v十二烷基硫酸钠的混合溶液为流动相，流速为每分钟2.0 mL；采用紫外检测器，检测波长为254nm；柱温为35 ℃；进样量为20 μL；记录色谱图至少至保留时间为40 min。
（c）计算
（c-1）准确度：
采用液相色谱对加标供试溶液和供试溶液重复检测6次，根据每次检测的加标供试溶液谱图、供试溶液谱图采用外标法计算加标供试溶液和供试溶液中的二氢柔红霉素含量，按照如下公式计算加标回收率，并计算平均加标回收率和RSD，结果见表1。
加标回收率=100%×(加标供试溶液中的二氢柔红霉素含量-供试溶液中的二氢柔红霉素含量)/二氢柔红霉素加标量
将加标供试品溶液逐级稀释并分别采用液相色谱检测，稀释至10倍时的浓度为0.25µg/mL，信噪比4.4，证明方法的检出限为0.25µg/mL。
表1加标回收率、平均加标回收率及RSD的结果
由表1可知，本发明方法测定主要杂质二氢柔红霉素的加标回收率为在104.58%-108.78%之间，平均加标回收率为107.2%、RSD为1.5%（n=6），可见，本发明方法测定主要杂质二氢柔红霉素的准确度高、重复性好。
（c-2）重复性：
实验者1#按照上述配制供试溶液和对照溶液各6份，采用液相色谱对供试溶液和对照溶液进行检测。
按照如下公式（根据《中国药典》中的自身对照法、面积归一化法及杂质校正因子确定）计算供试溶液中的各有关物质含量，并计算平均值和极差S，见表2；其中，其他单个最大杂质峰是指色谱图中除了表柔比星主峰、多柔比星酮峰、多柔比星峰以外的峰面积最大的色谱峰。其中，“稀释物”代表供试溶液，“对照物”代表对照溶液。
表2 供试溶液中的各有关物质含量、平均值及极差的结果
由表2可知，本发明方法测定供试溶液中的多柔比星酮的极差为0.01 %w/w、多柔比星的极差为0.02 %w/w、其他单个最大杂质的极差为0.04 %w/w、总杂质的极差为0.04 %w/w，可见，本发明方法测定各有关物质的重复性良好。
（c-3）中间精密度：
实验者2#按照上述配制供试溶液和对照溶液各6份，采用液相色谱对供试溶液和对照溶液进行检测，按照（c-2）中的公式计算供试溶液中的各有关物质含量并计算平均值，计算出与第（c-2）项中的重复性的平均值的差值S，结果见表3。
表3 供试溶液中的各有关物质含量、平均值及与重复性平均值的差值的结果
由表3可知，本发明方法测定供试溶液中的各有关物质的平均值与（c-2）项重复性平均值的差值S分别为：多柔比星酮0 %w/w、多柔比星0.01 %w/w，其他单个最大杂质0.01 %w/w，总杂质0.02 %w/w。可见，本发明方法测定各有关物质的中间精密度良好。
（c-4）供试溶液的稳定性：
按照供试溶液的制备方法得到供试溶液，放置0小时、2小时、4小时、6小时、8小时后分别采用液相色谱对进行检测，得到供试溶液中的各有关物质的峰面积，并计算RSD，结果见表4。
表4 供试溶液中的各有关物质峰面积及RSD的结果
由表4可知，本发明的供试溶液在8小时内，表柔比星酮的RSD为2.62%，多柔比星的RSD为1.39%，其他单个最大杂质的RSD为4%，总杂质的RSD为3%，可见，本发明供试溶液的稳定性好。
（c-5）耐用性：
i. 高效液相色谱Agilent 1260与Thermo U-3000仅品牌不同，采用的参数条件相同，具体参数条件同第（b）项。分别采用Agilent 1260与Thermo U-3000检测系统适用性溶液，根据谱图得到表柔比星峰与多柔比星峰分离度、表柔比星峰的拖尾因子，结果见表5。
表5 耐用性（仪器）系统适用性数据
由表5可知，改变仪器后，表柔比星峰与多柔比星峰的分离度仍大于5.0，表柔比星峰的拖尾因子在0.92～0.95之间，证明本发明方法的耐用性良好。
ii. 改变液相色谱操作条件中的柱温和流速，对系统适用性溶液进行检测。多柔比星酮、表柔比星、多柔比星的出峰时间，表柔比星峰与多柔比星峰的分离度，表柔比星峰的拖尾因子（不对称度）结果见表6。液相色谱见图26-30。
表6 液相色谱操作条件、出峰时间、分离度及拖尾因子的结果
由表6可知，改变柱温、流速后，表柔比星峰与多柔比星峰的分离度仍大于5.0，表柔比星峰的拖尾因子在0.92～0.95之间，证明本发明方法的耐用性良好。其中，柱温35℃、流速1.8mL/min条件下，表柔比星峰与多柔比星峰的分离度最大。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。
Claims (6)
1.一种测定样品中的有关物质含量的方法，其中，所述样品为表柔比星或其可药用盐的注射用冻干粉；
所述方法包括如下步骤：
将所述样品与醇类试剂混合，以溶剂稀释，得到稀释物；其中，所述醇类试剂选自乙二醇、丙三醇和1,2-丙二醇中的一种或多种；所述溶剂为乙腈-水-甲醇-80 %w/v ~85 %w/v磷酸水溶液的混合液，所述溶剂中的乙腈、水、甲醇和磷酸水溶液的体积比为(285-295) :(535-545) : (165-175) : 1，所述溶剂中包含0.1 %w/v~0.3 %w/v十二烷基硫酸钠；所述样品与醇类试剂的比例为1~10 mg/mL；
取稀释物进一步稀释，得到对照物；
采用液相色谱检测稀释物和对照物，根据检测结果得到所述样品中的有关物质含量，所述有关物质为多柔比星酮、多柔比星和二氢柔红霉素；
其中，液相色谱的操作条件包括：色谱柱为Agilent ZORBAX SB-C3色谱柱，柱长250mm，内径4.6 mm，填料粒径5 μm；柱温为32~38 ℃；流动相为乙腈-水-甲醇-85 %w/v磷酸水溶液的混合液，所述流动相中的乙腈、水、甲醇和磷酸水溶液的体积比为290:540:170:1，所述流动相中包含0.2 %w/v十二烷基硫酸钠；流动相的流速为1.8~2.2 mL/min；采用紫外检测器；紫外检测器的检测波长为254 nm。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述样品在所述稀释物中的含量为0.3~0.7 mg/mL。
3.根据权利要求1所述的方法，其中，液相色谱的操作条件还包括如下的一项或多项：
检测时间大于或等于表柔比星的保留时间的2倍；
进样量为20 μL。
4.根据权利要求1所述的方法，其中，所述样品在所述对照物中的含量为3~7 μg/mL。
5.根据权利要求1所述的方法，其中，采用所述溶剂进一步稀释所述稀释物。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其特征在于如下的一项或多项：
1）根据《中国药典》中的自身对照法计算样品中的多柔比星酮、多柔比星含量；
2）按照外标法计算样品中的二氢柔红霉素含量。
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