CN116124926B - 一种测定质粒中2-巯基吡啶含量的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及成分分析技术领域，特别是涉及一种测定质粒中2‑巯基吡啶含量的方法，具体的，所述检测方法包括如下步骤：1)配制标准溶液：取2‑巯基吡啶标准品用溶剂溶解后，梯度稀释配成标准溶液；2)配制供试品溶液：将待测质粒用溶剂溶解；3)样品检测：采用HPLC分别检测标准溶液和供试品溶液，获得关于峰面积和2‑巯基吡啶含量的标准曲线，将供试品溶液的峰面积代入标准曲线计算获得供试品溶液中2‑巯基吡啶的含量。本发明的方法可以有效测定质粒中2‑巯基吡啶含量，可以运用到生产检验，改进质粒生产工艺中2‑巯基吡啶的残留量提供重要参考，降低2‑巯基吡啶杂质，以得到相对纯净的质粒。

Description

一种测定质粒中2-巯基吡啶含量的方法
技术领域
本发明涉及成分分析技术领域，特别是涉及一种测定质粒中2-巯基吡啶含量的方法。
背景技术
质粒作为细胞与基因治疗药品的生产原料，需要对其功能进行鉴定和控制；为保证安全性，对溶剂或杂质残留(乙醇、异丙醇、醋酸、2-巯基吡啶)需进行检测，限度标准控制在≤0.5％。质粒生产过程中常用层析法进行纯化，不同开发阶段和使用级别对质粒的质量要求不同。质粒纯化的目的在于去除宿主DNA、RNA、蛋白和内毒素以及非超螺旋的质粒变体，以满足针对目标产品的使用要求，纯化过程的优化可提高质粒产量、降低成本。
然而质粒在使用层析法进行纯化时，属于亲和层析填料配基的2-巯基吡啶在纯化过程中有可能掉落，会随着收集的样品共同流穿，为确定配基是否存在掉落的可能，可通过检测质粒中2-巯基吡啶的含量来确定。
文献记载给小鼠腹腔和静脉注射LD50(mouse)＝250mg/kg的2-巯基吡啶，会造成皮肤刺激及眼部严重刺激，可引起呼吸道刺激。足以证明2-巯基吡啶残留量达到一定程度造成的危害还是比较大的。
发明内容
鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种测定质粒中2-巯基吡啶含量的方法，用于解决现有技术中的问题。
为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供一种测定质粒中2-巯基吡啶含量的方法，包括如下步骤：将待测质粒用溶剂溶解后采用HPLC检测其中的2-巯基吡啶含量。
具体的，所述检测方法包括如下步骤：
1)配制标准溶液：取2-巯基吡啶标准品用溶剂溶解后，梯度稀释配成标准溶液；
2)配制供试品溶液：将待测质粒用溶剂溶解；
3)样品检测：采用HPLC分别检测标准溶液和供试品溶液，获得关于峰面积和2-巯基吡啶含量的标准曲线，将供试品溶液的峰面积代入标准曲线计算获得供试品溶液中2-巯基吡啶的含量。
在一种实施方式中，步骤3)中HPLC的色谱柱为C18柱。
在一种实施方式中，检测波长为260～300nm。
如上所述，本发明的测定质粒中2-巯基吡啶含量的方法，具有以下有益效果：HPLC可以有效测定质粒中2-巯基吡啶含量，可以运用到生产检验，改进质粒生产工艺中2-巯基吡啶的残留量提供重要参考，降低2-巯基吡啶杂质，以得到相对纯净的质粒。
附图说明
图1显示为本发明的标准曲线溶液色谱图。
图2显示为本发明的回收率样品溶液色谱图。
图3显示为本发明2-巯基吡啶的线性图。
具体实施方式
本发明提供一种测定质粒中2-巯基吡啶含量的方法，包括如下步骤：将待测质粒用溶剂溶解后采用HPLC检测其中的2-巯基吡啶含量。
2-巯基吡啶CAS登录号为2637-34-5。
本发明中质粒为本领域常规意义的质粒，即为一种小型、环状DNA或RNA分子。
质粒选自克隆质粒、表达质粒、基因敲减质粒、基因工程质粒、报告质粒、病毒质粒等。
在一种实施方式中，采用外标法检测2-巯基吡啶含量。
具体的，所述检测方法包括如下步骤：
1)配制标准溶液：取2-巯基吡啶标准品用溶剂溶解后，梯度稀释配成标准溶液；
2)配制供试品溶液：将待测质粒用溶剂溶解；
3)样品检测：采用HPLC分别检测标准溶液和供试品溶液，获得关于峰面积和2-巯基吡啶含量的标准曲线，将供试品溶液的峰面积代入标准曲线计算获得供试品溶液中2-巯基吡啶的含量。
在本发明的某些实施方式中，步骤1)中标准品溶液中2-巯基吡啶的浓度为1～50μg/mL。在一种实施方式中，所述标准品溶液包括1、5、10、20、50μg/mL系列梯度浓度。
在本发明的某些实施方式中，步骤1)中溶剂为有机溶剂和/或水。所述有机溶剂选自甲醇、乙醇、乙腈中的任一种或多种。在一种实施方式中，所述溶剂为有机溶剂和水。在一较佳的实施方式中，甲醇和水的体积比为2～4:7，优选的为2.5～3.5:7。
具体的，步骤2)中将待测质粒使用有机溶剂和/或水溶解。所述有机溶剂选自甲醇、乙醇、乙腈中的任一种或多种。在一种实施方式中，使用有机溶剂和水的混合溶剂溶解待测质粒。在一较佳的实施方式中，甲醇和水的体积比为2～4:7。优选的，为2.5～3.5:7。
在一种实施方式中，质粒与溶剂的质量体积比为1:(30～500)，单位分别为μg和μL。
在一种实施方式中，步骤3)中HPLC的色谱柱为C18柱。C18色谱柱是一种十八烷基硅烷键合硅胶填料的反相色谱柱，它对化合物分离的作用力单一。
在一种实施方式中，色谱柱的柱长×内径×固定相膜厚度为250～300mm×4.0～5.0mm×4～6μm。
在一种实施方式中，色谱柱的填料为十八烷基键合硅胶。
在一种实施方式中，流动相为甲醇：水＝2～4:7。优选的为2.5～3.5:7。使用等度洗脱，分析时间为5～15min。优选的的，分析时间为8～12分钟。
在一种实施方式中，进样量为5～50μL。在一较佳实施方式中，进样量为5～10μL。
在一种实施方式中，检测器为紫外检测器VWD，柱温为20～30℃，流速为0.5～1.0mL/min。
在一种实施方式中，检测波长为260～300nm。在一较佳实施方式中，检测波长为270～290nm。根据2-巯基吡啶的化合物结构含吡啶，吡啶的紫外吸收光谱260～300nm会有强烈吸收，利用紫外分光光度计进行400nm～190nm光谱扫描，在270～290nm吸收最大，因此选择检测波长为270～290nm。
在一种实施方式中，所述标准工作曲线中，以2-巯基吡啶的色谱峰面积为纵坐标(Y轴)，其浓度为横坐标(X轴)，得到相应的标准工作曲线的回归方程，Y＝aX+b，其中a为斜率，b为截距。
本发明的方法加样回收率为97％～103％，RSD≤2.0％；R2≥0.998。
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围；在本发明说明书和权利要求书中，除非文中另外明确指出，单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。
当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
实施例1质粒中2-巯基吡啶含量测定
1.HPLC色谱系统
仪器：Agilent 1260Ⅱ
色谱柱：Agilent C18柱250×4.6mm，5μm，货号：959990-902
流动相：甲醇：水(30:70)
检测波长：280nm
检测器为紫外检测器VWD，柱温为20～30℃，流速为0.5～1.0mL/min。
采用等度洗脱，分析时间为10min。
2.对照品储备液：取2-巯基吡啶约50mg作为对照品，精密称定，置100ml量瓶中，加甲醇：水(30:70)适量使溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品储备液。
3.标准曲线溶液：
3.1.1μg/ml对照品溶液：精密量取对照品储备液20μL置10ml量瓶中，加甲醇：水(30:70)稀释至刻度，摇匀。
3.2.5μg/ml对照品溶液：精密量取对照品储备液100μL置10ml量瓶中，加甲醇：水(30:70)稀释至刻度，摇匀。
3.3.10μg/ml对照品溶液：精密量取对照品储备液200μL置10ml量瓶中，加甲醇：水(30:70)稀释至刻度，摇匀。
3.4.20μg/ml对照品溶液：精密量取对照品储备液400μL置10ml量瓶中，加甲醇：水(30:70)稀释至刻度，摇匀。
3.5.50μg/ml对照品溶液：精密量取对照品储备液1000μL置10ml量瓶中，加甲醇：水(30:70)稀释至刻度，摇匀。
4.供试品溶液：从-20℃冰箱取出质粒(核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示)，恢复至室温，精密量取质粒50μL，加甲醇：水(30:70)450μL，混匀，作为供试品溶液。
atggccttaccagtgaccgccttgctcctgccgctggccttgctgctccacgccgccaggccggaggtgcagctggtggagagc
ggcggcggcagcgtgcaggccggcggcagcctgagactgagctgcaccgccagcggctacagcgacagcaactactgcatggcct
ggttcagacaggcccccggcaaggccagacagggcgtggccttcatcaacggcgacggcgtgattacgtacaccgacagcgtgaag
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gctgtagctgccgatttccagaagaagaagaaggaggatgtgaactgagagtgaagttcagcaggagcgcagacgcccccgcgtaca
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ctgagatggggggaaagccgagaaggaagaaccctcaggaaggcctgtacaatgaactgcagaaagataagatggcggaggcctac
agtgagattgggatgaaaggcgagcgccggaggggcaaggggcacgatggcctttaccagggtctcagtacagccaccaaggacacctacgacgcccttcacatgcaggccctgccccctcgctga(SEQ ID NO.1)
5.测定法：精密量取上述溶液适量至微量内插管中，将内插管置于液相小瓶中，取10μL，注入液相色谱仪，记录色谱法。
6.计算：根据线性回归方程计算出2-巯基吡啶的含量。从表中可知，各批次质粒中无2-巯基吡啶的残留，故检验结果为未检出。
实施例2质粒中2-巯基吡啶含量测定的方法验证
1.专属性测定
1.1.接收标准：空白溶液色谱图在2-巯基吡啶保留时间未出杂质峰，供试品溶液色谱图中2-巯基吡啶与其他杂质峰分离度≥1.5。
1.2.溶液配制
1.2.1.空白溶液：取甲醇：水(30:70)适量作为空白溶液。
1.2.2.专属性对照品溶液：精密量取对照品储备液100μL置10ml量瓶中，加甲醇：水(30:70)稀释至刻度，摇匀。
1.2.3.供试品溶液：从-20℃冰箱取出质粒，恢复至室温，精密量取质粒50μL，加甲醇：水(30:70)450μL，混匀，作为供试品溶液。
1.3.测定：取空白溶液、专属性对照品溶液、供试品溶液适量至微量内插管中，将内插管置于液相小瓶中，取10μL注入液相色谱仪，记录色谱图。
1.4.专属性测定结果：空白溶液色谱图在2-巯基吡啶保留时间未出杂质峰，供试品溶液色谱图中2-巯基吡啶与其他杂质峰分离度≥1.5。
2.回收率测定
2.1.接收标准：加样回收率97％～103％；RSD≤2.0％
2.2.溶液的配制
2.2.1.对照品储备液：取2-巯基吡啶50mg，精密称定，置100ml量瓶中，加甲醇：水(30:70)适量使溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品储备液。
2.2.2.标准曲线溶液
2.2.2.1.1μg/ml对照品溶液：精密量取对照品储备液20μL置10ml量瓶中，加甲醇：水(30:70)稀释至刻度，摇匀。
2.2.2.2.5μg/ml对照品溶液：精密量取对照品储备液100μL置10ml量瓶中，加甲醇：水(30:70)稀释至刻度，摇匀。
2.2.2.3.10μg/ml对照品溶液：精密量取对照品储备液200μL置10ml量瓶中，加甲醇：水(30:70)稀释至刻度，摇匀。
2.2.2.4.20μg/ml对照品溶液：精密量取对照品储备液400μL置10ml量瓶中，加甲醇：水(30:70)稀释至刻度，摇匀。
2.2.2.5.50μg/ml对照品溶液：精密量取对照品储备液1000μL置10ml量瓶中，加甲醇：水(30:70)稀释至刻度，摇匀。
2.2.3.供试品溶液：从-20℃冰箱取出质粒，恢复至室温，精密量取质粒50μL，加甲醇：水(30:70)450μL，混匀，作为供试品溶液。
2.2.4.回收率样品溶液(20μg/ml)：精密量取质粒50μL，加对照品储备液20μL，加甲醇：水(30:70)430μL作为回收率样品溶液，同法制备6份。
2.3.测定：取标准曲线溶液、供试品组溶液、对照组溶液适量至微量内插管中，将内插管置于液相小瓶中，取10μL注入液相色谱仪，记录色谱图。标准曲线溶液色谱图如图1所示。
2.4.质粒中2-巯基吡啶含量回收率结果表
回收率样品溶液色谱图如图2所示。可见回收率和RSD均满足接收标准。
3.线性
3.1.线性接收标准：R2≥0.998
3.2.标准曲线溶液：
3.2.1.1μg/ml对照品溶液：精密量取对照品储备液20μL置10ml量瓶中，加甲醇：水(30:70)稀释至刻度，摇匀。
3.2.2.5μg/ml对照品溶液：精密量取对照品储备液100μL置10ml量瓶中，加甲醇：水(30:70)稀释至刻度，摇匀。
3.2.3.10μg/ml对照品溶液：精密量取对照品储备液200μL置10ml量瓶中，加甲醇：水(30:70)稀释至刻度，摇匀。
3.2.4.20μg/ml对照品溶液：精密量取对照品储备液400μL置10ml量瓶中，加甲醇：水(30:70)稀释至刻度，摇匀。
3.2.5.50μg/ml对照品溶液：精密量取对照品储备液1000μL置10ml量瓶中，加甲醇：水(30:70)稀释至刻度，摇匀。
3.3.测定：取标准曲线适量至微量内插管中，将内插管置于液相小瓶中，取10μL注入液相色谱仪，记录色谱图。
3.4.2-巯基吡啶线性方程结果
线性图如图3所示。从结果可知，相关系数满足线性接收标准。
4.精密度(重复性)
4.1.接收标准：6份对照组溶液检验结果RSD均应≤2％。
4.2.对照组溶液：制备6份对照组溶液，精密量取质粒50μL，加对照品储备液20μL，加甲醇：水(30:70)430μL作为对照组溶液。
4.3.测定：分别量取标准曲线对照品各溶液及对照组溶液适量至微量内插管中，将内插管置于液相小瓶中，取10μL注入液相色谱仪，记录色谱图。
4.4.计算：根据线性回归方程计算出2-巯基吡啶的含量。
4.5.重复性检验结果
可见RSD满足接收标准。
5.精密度中间精密度
5.1.接收标准：不同检验员不同时间检验结果RSD均应≤2％。
5.2.两位检验员在不同时间分别制备6份对照组溶液，精密量取质粒50μL，加对照品储备液20μL，加甲醇：水(30:70)430μL作为对照组溶液。
5.3.测定：分别量取对照组溶液适量至微量内插管中，将内插管置于液相小瓶中，取10μL注入液相色谱仪，记录色谱图。
5.4.计算：根据线性回归方程计算出2-巯基吡啶的含量。
5.5.中间精密度检验结果
可见RSD满足接收标准。
6.检测限
6.1.接受标准：检测限溶液中2-巯基吡啶峰信噪比均应≥3；检测限溶液连续进样5针，2-巯基吡啶峰面积的RSD均应≤10％。
6.2.检测限溶液：精密称定量取对照品储备液，根据信噪比稀释标准品至适宜浓度，注入液相色谱仪测定，重复进样5次。
6.3.检测限检验结果
可见信噪比均≥3；检测限溶液连续进样5针，2-巯基吡啶峰面积的RSD均≤10％，因此满足接收标准。
总结：
从上述汇总表和数据中可以看出，该方法的准确度、精密度、检测限、线性、均符合规定，回收率实验室中，2-巯基吡啶平均回收率98.38％，回收率RSD值为0.24％，线性相关系数R＝1；均符合标准。该方法可以运用于HPLC测定质粒中2-巯基吡啶含量的实际检验，可以为纯化过程中亲和层析填料的配基有可能掉落提供重要参考。
以上的实施例是为了说明本发明公开的实施方案，并不能理解为对本发明的限制。此外，本文所列出的各种修改以及发明中方法的变化，在不脱离本发明的范围和精神的前提下对本领域内的技术人员来说是显而易见的。虽然已结合本发明的多种具体优选实施例对本发明进行了具体的描述，但应当理解，本发明不应仅限于这些具体实施例。事实上，各种如上所述的对本领域内的技术人员来说显而易见的修改来获取发明都应包括在本发明的范围内。

Claims (5)

1.一种测定质粒中2-巯基吡啶含量的方法，其特征在于，包括如下步骤：将待测质粒用溶剂溶解后采用HPLC检测其中的2-巯基吡啶含量；
采用外标法检测2-巯基吡啶含量；
所述方法包括如下步骤：
1）配制标准溶液：取2-巯基吡啶标准品用体积比为2~4 : 7的甲醇和水溶解后，梯度稀释配成标准溶液；
2）配制供试品溶液：将待测质粒用体积比为2~4 : 7的甲醇和水溶解配成供试品溶液；
3）样品检测：采用HPLC分别检测标准溶液和供试品溶液，根据标准品溶液中2-巯基吡啶的浓度和峰面积获得标准曲线，将供试品溶液的峰面积代入标准曲线计算获得供试品溶液中2-巯基吡啶的含量，检测时流动相为甲醇：水=2~4:7；HPLC的色谱柱为C18柱；分析时间为5~15 min；检测波长为260~300 nm。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1）中标准品溶液中2-巯基吡啶的浓度为1~50μg/mL。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2）中待测质粒与溶剂的质量体积比为1:（30~500）。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3）中色谱柱的柱长×内径×固定相膜厚度为250~300mm×4.0~5.0mm×4~6μm。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述标准曲线中，以2-巯基吡啶的色谱峰面积为纵坐标，其浓度为横坐标，得到标准曲线的回归方程Y=aX+b，其中a为斜率，b为截距。
CN202211642342.4A 2022-12-20 2022-12-20 一种测定质粒中2-巯基吡啶含量的方法 Active CN116124926B (zh)

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