CN114166982A - 一种同时测定氨基己酸注射液中二聚体、三聚体和己内酰胺的方法 - Google Patents

一种同时测定氨基己酸注射液中二聚体、三聚体和己内酰胺的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN114166982A
CN114166982A CN202111348344.8A CN202111348344A CN114166982A CN 114166982 A CN114166982 A CN 114166982A CN 202111348344 A CN202111348344 A CN 202111348344A CN 114166982 A CN114166982 A CN 114166982A
Authority
CN
China
Prior art keywords
solution
aminocaproic acid
caprolactam
reference substance
concentration
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN202111348344.8A
Other languages
English (en)
Other versions
CN114166982B (zh
Inventor
利虔
张执交
刘延奎
康彦龙
方胜
孙志国
张宪美
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
BEIJING BAIAO PHARMACEUTICALS CO LTD
Original Assignee
BEIJING BAIAO PHARMACEUTICALS CO LTD
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by BEIJING BAIAO PHARMACEUTICALS CO LTD filed Critical BEIJING BAIAO PHARMACEUTICALS CO LTD
Priority to CN202111348344.8A priority Critical patent/CN114166982B/zh
Publication of CN114166982A publication Critical patent/CN114166982A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN114166982B publication Critical patent/CN114166982B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/88—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/88—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86
    • G01N2030/8809—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86 analysis specially adapted for the sample
    • G01N2030/884—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86 analysis specially adapted for the sample organic compounds

Landscapes

  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Treatment Of Liquids With Adsorbents In General (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Abstract

本发明公开了一种同时测定氨基己酸注射液中二聚体、三聚体和己内酰胺的方法。本发明方法包括如下步骤：采用HPLC对氨基己酸注射液中的氨基己酸二聚体、氨基己酸三聚体和己内酰胺进行定性检测或定量检测；HPLC条件如下：色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；检测波长：212nm；柱温：25℃±5℃；流速：1.0±0.2mL/min；进样体积：20μL；流动相A：由体积比为90:10的0.08mol/L乙酸铵溶液和1％乙酸溶液组成；流动相B：由体积比为90:10的乙腈和1％乙酸溶液组成；洗脱程序：0～10min，流动相A体积分数为93％；10～25min，流动相A体积分数由93％下降至85％；25～26min，流动相A体积分数由85％上升至93％；26～35min，流动相A体积分数保持93％。本发明方法操作简便、灵敏度高，可利用该方法严格控制氨基己酸注射液的质量。

Description

一种同时测定氨基己酸注射液中二聚体、三聚体和己内酰胺 的方法
技术领域
本发明属于药物分析技术领域，尤其涉及一种利用HPLC法测定氨基己酸注射液中二聚体、三聚体和己内酰胺的药物分析方法。
背景技术
氨基己酸，化学名称：6-氨基己酸
分子式：C6H13NO2
分子量：131.17
其结构式如下：
Figure BDA0003354804520000011
氨基己酸是抗纤维蛋白溶解药。纤维蛋白原通过其分子结构中的赖氨酸结合部位特异性地与纤维蛋白结合，然后在激活物作用下变为纤溶酶，该酶能裂解纤维蛋白中精氨酸和赖氨酸肽链，形成纤维蛋白降解产物，使血凝块溶解。本品能定性阻抑纤溶酶原与纤维蛋白结合，防止其激活，从而抑制纤维蛋白溶解，高浓度(100mg/L)则直接抑制纤溶酶活力，达到止血效果。临床上常用于预防及治疗血纤维蛋白溶解亢进引起的各种出血。
氨基己酸自身结构中含有羧基和氨基，在药物制备及贮存过程中如遇高温，氨基己酸分子间的羧基和氨基会发生缩合反应，生成氨基己酸二聚体和氨基己酸三聚体杂质。同杂质产生机理如下：
氨基己酸二聚体：
Figure BDA0003354804520000012
氨基己酸三聚体：
Figure BDA0003354804520000013
己内酰胺：
氨基己酸原料由己内酰胺为起始物料合成而来，因此起始物料的残留也是氨基己酸注射液的杂质之一，该杂质在产品贮存过程中，也可能重新成环生成。
Figure BDA0003354804520000021
根据ICHQ3B规定，氨基己酸每日最大剂量大于2g，上述三个杂质的鉴定限度均为0.10％。因此，亟需开发一种合理的色谱系统，制定出简单、灵敏度高的杂质检测方法，以便严格控制氨基己酸注射液的质量。
发明内容
本发明的目的是提供一种同时测定氨基己酸注射液中二聚体、三聚体和己内酰胺的方法，该方法利用HPLC法进行测定，操作简单，灵敏度高。
具体而言，所述二聚体为氨基己酸二聚体，简写为AJJ-IM-A，其结构式如式Ⅰ所示，分子式为C12H24N2O3，分子量为244.33；
Figure BDA0003354804520000022
所述二聚体为氨基己酸二聚体，简写为AJJ-IM-B，其结构式如式Ⅱ所示，分子式为C18H35N3O4，分子量为357.49；
Figure BDA0003354804520000023
所述己内酰胺，结构式如式Ⅲ所示，分子式为C6H11NO，分子量为113.16；
Figure BDA0003354804520000024
本发明提供的同时测定氨基己酸注射液中氨基己酸二聚体、氨基己酸三聚体和己内酰胺的方法，包括如下步骤：
采用HPLC对氨基己酸注射液中的氨基己酸二聚体、氨基己酸三聚体和己内酰胺进行定性检测或定量检测；
所述HPLC的检测条件如下：
色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；
检测波长：212nm；
柱温：25℃±5℃；
流速：1.0ml/min±0.2ml/min；
进样体积：20μl；
流动相A：由体积比为90:10的0.08mol/L乙酸铵溶液和质量浓度为1％乙酸溶液组成；
流动相B：由体积比为90:10的乙腈和质量浓度为1％乙酸溶液组成；
洗脱程序如下：0～10min，流动相A的体积分数为93％；10～25min，流动相的体积分数由93％下降至85％；25～26min，流动相的体积分数由85％上升至93％；26～35min，流动相A的体积分数保持为93％。
上述的测定方法中，所述色谱柱的规格可为150mm×4.6mm，3～5μm(如3μm或5μm)；所述色谱柱具体可为下述1)-3)中的任一种：
1)Welch Ultimate LP-C18，规格为150mm×4.6mm，5μm；
2)YMC Hydrosphere C18，规格为150mm×4.6mm，3μm；
3)Ultimate LP-C18，规格为150mm×4.6mm，5μm。
上述的测定方法中，所述定性检测的步骤如下：
(1)分别以氨基己酸二聚体的标准物质、氨基己酸三聚体的标准物质和己内酰胺的标准物质为对照品，以水为溶剂，配制含氨基己酸二聚体对照品、氨基己酸三聚体对照品和己内酰胺对照品的溶液；将所述对照品溶液注入液相色谱仪，记录色谱图；
(2)以待测的氨基己酸注射液为供试品，以水为溶剂，配制供试品溶液；将所述供试品溶液注入液相色谱仪，记录色谱图；
(3)若步骤(2)中供试品的色谱图中出现与步骤(1)中所述氨基己酸二聚体对照品、氨基己酸三聚体对照品和己内酰胺对照品的保留时间一致的色谱峰出现，则待测样品中含有氨基己酸二聚体、氨基己酸三聚体和己内酰胺。
定性检测步骤中，步骤(1)中所述氨基己酸二聚体对照品在所述对照品溶液中的浓度0.00015～0.01mg/mL；
步骤(1)中所述氨基己酸三聚体对照品在所述对照品溶液中的浓度为0.0001～0.01mg/mL；
步骤(1)中所述己内酰胺对照品在所述对照品溶液中的浓度为0.00005～0.01mg/mL。
定性检测步骤中，步骤(2)中所述供试品溶液中氨基己酸的浓度为0.5～10mg/mL。
上述的测定方法中，所述定量检测的步骤如下：
(1)分别以氨基己酸二聚体的标准物质、氨基己酸三聚体的标准物质和己内酰胺的标准物质为对照品，以水为溶剂，配制含氨基己酸二聚体对照品、氨基己酸三聚体对照品和己内酰胺对照品的溶液；所述配制步骤中，每种标准物质分别配制两份对照品溶液；对照品溶液的浓度记为C对照1和C对照2；将所述两份对照品溶液分别注入液相色谱仪，记录色谱图，所述两份对照品溶液的峰面积记为A对照1和A对照2；
(2)以待测的氨基己酸注射液为供试品，以水为溶剂，配制供试品溶液；将所述供试品溶液注入液相色谱仪，记录色谱图，所述供试品溶液的峰面积记为A样品；
(3)按照如下公式(1)和公式(2)计算待测样品中氨基己酸二聚体、氨基己酸三聚体和己内酰胺的含量；
Figure BDA0003354804520000041
Figure BDA0003354804520000042
其中，C对照1为对照溶液1的浓度，以对照品含量计，单位为mg/mL；
C对照2为对照溶液2的浓度，以对照品含量计，单位为mg/mL；
A对照1为对照品溶液1色谱图中杂质峰面积；
A对照2为对照品溶液2色谱图中杂质峰面积；
A样品为供试品溶液色谱图中杂质峰面积；
C氨基己酸为待测样品氨基己酸注射液中氨基己酸的浓度，单位为mg/mL；
V移取为待测样品氨基己酸注射液的移取体积，单位为mL；
V稀释为将移取的待测样品氨基己酸注射液稀释得到的供试品溶液的体积，单位为mL；
W杂质为待测样品氨基己酸注射液中的杂质氨基己酸二聚体、氨基己酸三聚体或己内酰胺的质量百分含量。
定量检测步骤中，步骤(1)中所述氨基己酸二聚体对照品在所述对照品溶液中的浓度为0.0005～0.01mg/mL；
步骤(1)中所述氨基己酸三聚体对照品在所述对照品溶液中的浓度为0.003～0.01mg/mL；
步骤(1)中所述己内酰胺对照品在所述对照品溶液中的浓度为0.0001～0.01mg/mL。
定量检测步骤中，步骤(2)中所述供试品溶液中氨基己酸的浓度为0.5～10mg/mL。
本发明方法的方法学验证结果如下：
已知杂质己内酰胺、AJJ-IM-A、AJJ-IM-B约相当于主成分0.003％以上可被检出；已知杂质己内酰胺、AJJ-IM-A、AJJ-IM-B约相当于主成分0.002％以上可被定量；各杂质3个浓度9份样品回收率结果均在90％～110％范围内；己内酰胺在0.101μg/ml～10.100μg/ml浓度范围内，浓度与峰面积呈良好的线性关系(y＝37708x-1055，r＝1.0000)；AJJ-IM-A在0.302μg/ml～10.070μg/ml浓度范围内，浓度与峰面积呈良好的线性关系(y＝6665x-63，r＝0.9999)；AJJ-IM-B在0.287μg/ml～9.564μg/ml浓度范围内，浓度与峰面积呈良好的线性关系(y＝9454x-208，r＝0.9999)。
本发明测定氨基己酸注射液中二聚体、三聚体和己内酰胺的液相色谱法操作简便、灵敏度高，且具有良好的精密度及回收率，方法呈现良好的线性关系，对流速、柱温、流动相pH及不同品牌色谱柱的耐用性好，适用于氨基己酸注射液中二聚体、三聚体和己内酰胺杂质的检测，可利用该方法严格控制氨基己酸注射液的质量。
附图说明
图1为本发明实施例1中利用方法1进行色谱分析的色谱图。
图2为本发明实施例1中利用方法2进行色谱分析的色谱图，其中，黑色圆圈出的AJJ-IM-B杂质前的空白溶剂。
图3为本发明实施例1中利用方法3进行色谱分析的色谱图。
图4为本发明实施例2中空白溶剂的色谱图。
图5为本发明实施例2中氨基己酸对照品溶液的色谱图。
图6为本发明实施例2中己内酰胺对照品溶液的色谱图。
图7为本发明实施例2中氨基己酸二聚体对照品溶液的色谱图。
图8为本发明实施例2中氨基己酸三聚体对照品溶液的色谱图。
图9为本发明实施例2中系统适用性溶液的色谱图。
图10为本发明实施例2中系统适用性实验中各杂质检测限的色谱图。
图11为本发明实施例2中系统适用性实验中各杂质定量限的色谱图。
图12为本发明实施例9中己内酰胺的线性关系曲线。
图13为本发明实施例9中氨基己酸二聚体的线性关系曲线。
图14为本发明实施例9中氨基己酸三聚体的线性关系曲线。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。下述实施例中的各标准物质均可从商业途径购买得到。
下述实施例中所用的仪器与试剂：高效液相色谱仪(岛津1260/LC，二极管阵列检测器)，电子天平(梅特勒，十万分之一精度)，乙腈(MREDA，色谱纯)，乙酸铵(天津光复，分析纯)，乙酸(北化，分析纯)。
所用氨基己酸注射液样品中氨基己酸的浓度为200mg/mL。
实施例1、检测条件的确定
通过调整流动相配比及洗脱方式对检测条件进行筛选和优化，具体采用如下三种方法：
方法1：HPLC等度法
色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(岛津ODS-2 250mm×4.6mm，5μm)
检测波长：212nm；
柱温：25℃；
流速：1.0ml/min；
进样体积：20μl；
流动相：流动相A：0.08mol/L乙酸铵溶液-1％乙酸溶液(90:10)：乙腈＝95:5
分别取氨基己酸二聚体对照品、氨基己酸三聚体对照品和己内酰胺对照品各约5mg，分别置100mL量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，作为各杂质贮备液。精密量取氨基己酸注射液5ml，至20mL量瓶中，加入上述各杂质贮备液各2ml，加水溶解稀释制成每1mL中含氨基己酸5mg、各杂质分别约5μg的溶液，作为系统适用性试验溶液。
结果：此条件下，各相邻峰均能有效分离，但AJJ-IM-B的峰型较差，检测灵敏度不高(见图1)。
方法2：HPLC梯度法-1
色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(Welch Ultimate LP-C18150mm×4.6mm，5μm)；
检测波长：212nm；
柱温：25℃；
流速：1.0ml/min；
进样体积：20μl；
流动相：流动相A：0.08mol/L乙酸铵溶液-1％乙酸溶液(90:10)
流动相B：乙腈-1％乙酸溶液(90:10)
分别取氨基己酸二聚体对照品、氨基己酸三聚体对照品和己内酰胺对照品各约5mg，分别置100mL量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，作为各杂质贮备液。精密量取氨基己酸注射液5ml，至20mL量瓶中，加入上述各杂质贮备液各2ml，加水溶解稀释制成每1mL中含氨基己酸5mg、各杂质分别约5μg的溶液，作为系统适用性试验溶液，注入液相色谱仪，记录色谱图。
照下表进行梯度洗脱。
表1、方法2洗脱程序
Figure BDA0003354804520000071
结果：此条件下，各相邻峰均能有效分离，各杂质的峰型较好，灵敏度高，但AJJ-IM-B杂质前的空白溶剂可能对AJJ-IM-B的检测有影响(图2)。
方法3：HPLC梯度法-2
色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(Welch Ultimate LP-C18150mm×4.6mm，5μm)
检测波长：212nm；
柱温：25℃；
流速：1.0ml/min；
进样体积：20μl；
流动相：流动相A：0.08mol/L乙酸铵溶液-1％乙酸溶液(90:10)
流动相B：乙腈-1％乙酸溶液(90:10)
分别取氨基己酸二聚体对照品、氨基己酸三聚体对照品和己内酰胺对照品各约5mg，分别置100mL量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，作为各杂质贮备液。精密量取氨基己酸注射液5ml，至20mL量瓶中，加入上述各杂质贮备液各2ml，加水溶解稀释制成每1mL中含氨基己酸5mg、各杂质分别约5μg的溶液，作为系统适用性试验溶液，注入液相色谱仪，记录色谱图。
照下表进行梯度洗脱。
表2、方法3洗脱程序
Figure BDA0003354804520000072
Figure BDA0003354804520000081
结果：此条件下，各相邻峰均能有效分离，各杂质的峰型较好，灵敏度高，可作为检测杂质的检测方法。
因此，将方法3中的各条件确定为本发明检测方法的检测条件。
实施例2、系统适用性测定
1、色谱条件
色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(Welch Ultimate LP-C18 150mm×4.6mm5μm或效能相当的色谱柱)
检测波长：212nm；
柱温：25℃；
流速：1.0ml/min；
进样体积：20μl；
流动相：流动相A：0.08mol/L乙酸铵溶液-1％乙酸溶液(90:10)
流动相B：乙腈-1％乙酸溶液(90:10)
照表2进行梯度洗脱。
2、溶液配制
供试品溶液：精密量取本品适量，用水定量稀释制成每1ml中约含5mg的溶液(5mg/ml)。
对照品溶液：取己内酰胺、AJJ-IM-A、AJJ-IM-B各适量，精密称定，加水溶解并定量稀释制成每1ml中约含5μg的溶液，摇匀。
系统适用性溶液：分别取氨基己酸二聚体对照品、氨基己酸三聚体对照品和己内酰胺对照品各约5mg，分别置100mL量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，作为各杂质贮备液。精密量取氨基己酸注射液5ml，至20mL量瓶中，加入上述各杂质贮备液各2ml，加水溶解稀释制成每1mL中含氨基己酸5mg、各杂质分别约5μg的溶液，作为系统适用性试验溶液。
测定方法：分别精密量取系统适用性溶液、对照品溶液和空白溶剂各20μl，注入液相色谱仪，记录色谱图。实验结果见图4-图9。
表3、系统适用性结果
Figure BDA0003354804520000082
Figure BDA0003354804520000091
由表3中可以看出，系统适应性溶液的出峰顺序依次为氨基乙酸二聚体、己内酰胺和氨基乙酸三聚体，各杂质与主峰分离度均大于1.5，分离度良好，理论板数较高，拖尾因子符合检测要求。
图4-图9依次为空白溶剂、氨基己酸对照品溶液、己内酰胺对照品溶液、氨基己酸二聚体对照品溶液、氨基己酸三聚体对照品溶液和系统适用性溶液的色谱图。空白溶剂不干扰杂质的检测。
取AJJ-IM-A约3mg、AJJ-IM-B约15mg和己内酰胺对照品约9mg，精密称定，加水溶解，并用水稀释100000倍作为进样溶液，取20μl注入色谱仪。实验结果见图10，由图10可以看出，氨基乙酸二聚体(保留时间8.835)、己内酰胺(保留时间11.861)和氨基乙酸三聚体(保留时间22.562)的信噪比分别为5.53、5.42和4.95(表4)。氨基乙酸二聚体、己内酰胺和氨基乙酸三聚体的检测限分别可达3.02ng、1.72ng和0.60ng。
表4、各杂质检测限色谱峰结果
样品名称 保留时间 面积 峰高 理论板数 拖尾因子 分离度 信噪比(s/n)
AJJ-IM-A 8.835 1122 75 6777 1.15 -- 5.53
己内酰胺 11.861 1012 73 16317 1.23 7.86 5.42
AJJ-IM-B 22.562 662 67 103266 -- 32.61 4.95
取AJJ-IM-A约3mg、AJJ-IM-B约15mg和己内酰胺对照品约9mg，精密称定，加水溶解，并用水稀释30000倍作为进样溶液，取20μl注入色谱仪。实验结果见图11，由图11可以看出，氨基乙酸二聚体、己内酰胺和氨基乙酸三聚体的信噪比分别为15.57、12.35和14.11(表5)。氨基乙酸二聚体、己内酰胺和氨基乙酸三聚体的定量限分别可达10.08ng、5.74ng和2.02ng。
表5、各杂质定量限色谱峰结果
样品名称 保留时间 面积 峰高 理论板数 拖尾因子 分离度 信噪比(s/n)
AJJ-IM-A 8.914 3222 257 11736 1.00 -- 15.57
己内酰胺 11.950 3384 204 11858 1.05 7.64 12.35
AJJ-IM-B 22.624 2488 233 104157 1.07 28.41 14.11
实施例3、方法学验证-专属性
空白溶剂：水
对照品贮备液：取AJJ-IM-A、AJJ-IM-B和己内酰胺对照品适量，精密称定，分别加水溶解并定量稀释制成每1ml约含50μg的溶液，作为各杂质的贮备液。
杂质定位溶液：取各杂质贮备液，作为各杂质的定位溶液。
供试品溶液：精密量取氨基己酸注射液2ml，置20ml量瓶中，用溶剂稀释至刻度，摇匀，精密量取贮备液5ml，置20ml量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。
精密量取上述空白溶剂和供试品溶液各20μl、各杂质定位溶液各10μl注入液相色谱仪，记录色谱图。
结论：空白溶剂不干扰对各已知杂质测定。
实施例4、方法学验证-检测限
取AJJ-IM-A、AJJ-IM-B和己内酰胺对照品适量，精密称定，加水溶解，并用水逐级稀释至适宜浓度，在上述色谱条件下，以信噪比为3︰1时对应的注入色谱仪的进样量确定检测限。结果如下表：
表6、检测限结果
Figure BDA0003354804520000101
结论：在拟定氨基己酸注射液有关物质II检查浓度下(5mg/ml)，己内酰胺、AJJ-IM-A、AJJ-IM-B限度为0.1％，已知杂质己内酰胺、AJJ-IM-A、AJJ-IM-B的约相当于主成分0.003％以上可被检出，能够满足检测需求。精密量取检测限溶液5μl注入液相色谱仪，连续进样3次，测得氨基己酸保留时间的相对标准偏差不得大于1.0％。实验结果见表7。
表7、检测限进样精密度
Figure BDA0003354804520000102
结论：检测限溶液连续进样3针，各已知杂质保留时间RSD均小于1.0％，验证了己内酰胺、AJJ-IM-A、AJJ-IM-B检测限重复性较好。
实施例5、方法学验证-定量限
分别取己内酰胺、AJJ-IM-A、AJJ-IM-B对照品各适量，精密称定，加水溶解，并用水逐级稀释至适宜浓度，在上述色谱条件下，以信噪比为10︰1时注入色谱仪的量确定定量限。结果如下表：
表8、定量限结果
Figure BDA0003354804520000111
结论：在拟定氨基己酸注射液杂质检查浓度下(5mg/ml)，己内酰胺、AJJ-IM-A、AJJ-IM-B限度为0.1％，已知杂质己内酰胺、AJJ-IM-A、AJJ-IM-B约相当于主成分0.002％以上可被定量，能够满足它们的拟定限度(≤0.1％)的定量需求。
精密量取上述各杂质定量限溶液20μl注入液相色谱仪，连续进样6次，测得6次主峰及各已知杂质保留时间的相对标准偏差不得大于1.0％，峰面积的相对标准偏差应不得大于5.0％。实验结果见表9。
表9、定量限进样精密度
Figure BDA0003354804520000112
结论：定量限溶液连续进样6针，各杂质的保留时间RSD均小于1.0％，峰面积RSD均小于5.0％，验证了杂质定量限的重复性较好。
实施例6、方法学验证-进样精密度
对照品溶液：分别取氨基己酸二聚体对照品、氨基己酸三聚体对照品和己内酰胺对照品各约5mg，置同一100mL量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀。精密量取上述溶液1mL，置10mL量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。
精密量取对照品溶液20μl注入液相色谱仪，连续进样5次，记录色谱图，结果见下表。
表10、系统适用性-进样精密度结果
Figure BDA0003354804520000121
结论：对照品溶液连续进样5次，己内酰胺、AJJ-IM-A和AJJ-IM-B保留时间RSD均小于1.0％；峰面积RSD均小于2.0％，即系统适用性符合要求。
实施例7、方法学验证-准确度
考察杂质的准确度，各杂质限度均为0.1％，回收率的设计范围为限度的50％、限度100％、限度150％。
考察有关物质II中各杂质的准确度，己内酰胺、AJJ-IM-A和AJJ-IM-B限度均为0.1％，回收率的设计范围为限度的50％、限度100％、限度150％。
杂质贮备液：取己内酰胺、AJJ-IM-A和AJJ-IM-B对照品各5mg，精密称定，分别置不同的100ml量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，作为各杂质贮备液(50μg/ml)。
对照品溶液：取各杂质贮备液各2ml，置同一20ml量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。平行配制2份。
本底溶液：精密量取氨基己酸注射液(19122521批)10ml，置100ml量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，作为本底溶液。
本底测试溶液：精密量取本底溶液5ml，置20ml量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，作为本底测试溶液。
限度50％供试品溶液：精密量取本底溶液5ml、各杂质贮备液各1ml，置同一20ml量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。平行配制三份。
限度100％供试品溶液：精密量取本底溶液5ml、各杂质贮备液各2ml，置同一20ml量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。平行配制三份。
限度150％供试品溶液：供试品溶液：精密量取本底溶液5ml、各杂质贮备液各3ml，置同一20ml量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。平行配制三份。
精密量取上述溶液各20μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，结果如下：
表11己内酰胺回收率结果
Figure BDA0003354804520000131
表12 AJJ-IM-A回收率结果
Figure BDA0003354804520000132
Figure BDA0003354804520000141
表13 AJJ-IM-B回收率结果
Figure BDA0003354804520000142
结论：结果显示，本方法测得各杂质3个浓度9份样品回收率结果均在90％～110％范围内，可以判断该方法的准确度良好。
实施例8、方法学验证-精密度
6.1重复性
在相同条件下，照HPLC测定方法，由同一个分析人员，平行配制6份的结果进行评价该方法的重复性。
溶液配制如下：
杂质贮备液：取己内酰胺、AJJ-IM-A和AJJ-IM-B对照品各5mg，精密称定，分别置不同的100ml量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，作为各杂质贮备液(50μg/ml)。
对照品溶液：取各杂质贮备液各2ml，置同一20ml量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液(5μg/ml)。平行配制2份。
供试品溶液：精密量取本品2ml，置20ml量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，精密量取5ml和各杂质贮备液各2ml，置同一20ml量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，作为加标供试品溶液(氨基己酸浓度5mg/ml，各杂质的加标浓度为5μg/ml)。同法配制6份，考察方法的重复性。
精密量取上述溶液各20μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，结果如下表。
表14重复性试验结果
Figure BDA0003354804520000151
结论：平行配制的六份样品测定的结果中，各杂质均无明显差异，RSD％均小于10％，表明本方法重复性较好。
6.2中间精密度
由不同实验员于不同时间采用不同仪器进行中间精密度考察，所得6份数据合并重复性试验中的6份结果，比较见下表：
表15中间精密度试验结果
Figure BDA0003354804520000152
结论：由中间精密度试验所得12组数据可知：氨基己酸三聚体检出量的RSD％均远小于15％。综上结果可知此检测方法的精密度较好。
实施例9、方法学验证-线性和范围
AJJ-IM-A、AJJ-IM-B对照品贮备液：AJJ-IM-A和AJJ-IM-B对照品适量，精密称定，加水溶解并定量稀释制成每1ml约含50μg的溶液，分别作为AJJ-IM-A、AJJ-IM-B杂质贮备液。
己内酰胺贮备液：己内酰胺对照品适量，精密称定，加水溶解并定量稀释制成每1ml约含100μg的溶液，作为己内酰胺贮备液。
线性贮备液：精密量取AJJ-IM-A、AJJ-IM-B杂质贮备液各5ml、己内酰胺杂质贮备液2.5ml，置同一25ml量瓶中，摇匀，加水稀释至刻度，作为线性贮备液
分别精密量取线性贮备液适量，加水稀释制成一系列的浓度，作为一系列浓度的线性溶液。
分别精密量取线性贮备液适量，加水稀释制成一系列的浓度，作为一系列浓度的线性溶液。
表16线性溶液配制方式
Figure BDA0003354804520000161
精密量取上述系列浓度的溶液各20μl，注入液相色谱仪，记录色谱图。以浓度(C)为横坐标(X轴)，以峰面积为纵坐标(Y轴)，进行线性回归分析，结果如下：
表17各杂质线性结果
Figure BDA0003354804520000162
Figure BDA0003354804520000171
结论：己内酰胺在0.101μg/ml～10.100μg/ml浓度范围内，浓度与峰面积呈良好的线性关系，线性方程为：y＝37708x-1055，r＝1.0000。
AJJ-IM-A在0.302μg/ml～10.070μg/ml浓度范围内，浓度与峰面积呈良好的线性关系，线性方程为：y＝6665x-63，r＝0.9999。
AJJ-IM-B在0.287μg/ml～9.564μg/ml浓度范围内，浓度与峰面积呈良好的线性关系，线性方程为：y＝9454x-208，r＝0.9999。
实施例10、方法学验证-耐用性
耐用性考察的是色谱条件发生微小变化，测定结果不受影响的程度，目的是为方法用于日常检验时的注意事项提供依据。本法耐用性主要考察了色谱条件中的流速、柱温、色谱柱、流动相pH值及供试品溶液稳定性等因素。
1溶液稳定性(室温)
各杂质贮备液：取己内酰胺、AJJ-IM-A和AJJ-IM-B对照品各5mg，精密称定，分别置不同的100ml量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，作为各杂质贮备液。
对照品溶液：取各杂质贮备液各2ml，置同一20ml量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。平行配制2份。
供试品溶液：精密量取本品2ml，置20ml量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，精密量取5ml，置20ml量瓶中，加各杂质贮备液各2ml，用水稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。
精密量取上述对照品溶液、供试品溶液各20μl注入液相色谱仪，并取供试品溶液、对照品溶液于室温条件放置一定时间，于以下时间点取样测定，记录色谱图。
表18供试品溶液稳定性结果-室温
Figure BDA0003354804520000172
Figure BDA0003354804520000181
表19对照品溶液稳定性结果-室温
时间(H) 己内酰胺峰面积 AJJ-IM-A峰面积 AJJ-IM-B峰面积
0 162869 25910 36144
4 162469 26154 35794
8 161436 25690 36029
11 161477 25704 36068
14 162259 25940 35998
17 161625 25954 36053
25 161887 26156 36823
28 162205 25858 36146
31 161692 25597 36126
34 161698 25506 36038
RSD(％) 0.3 0.9 0.7
结论：①在不同时间下的有关物质结果与0小时应相差不大，杂质检出量的RSD％均不过10％，供试品溶液在室温条件下26小时内稳定。
②对照品溶液峰面积的RSD小于2％，对照溶液在室温条件下34小时内稳定性较好。
综上所述，对照品溶液和供试品溶液在室温26小时内稳定。
2色谱条件耐用性
通过改变流速、柱温、流动相pH值、色谱柱品牌来考察色谱参数微小变动后，测定结果不受影响的承受程度。测定条件变化范围如下：
表20检查测定条件耐用性范围
Figure BDA0003354804520000182
Figure BDA0003354804520000191
配制供试品溶液，在上述不同色谱条件下考察该批样品的有关物质结果变化情况，以考察色谱条件微小变动时对测定结果的影响程度。
具体配制如下：
溶液配制：
杂质贮备液：取各杂质对照品各约5mg，精密称定，分别置不同的100ml量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，作为各杂质贮备液。
对照品溶液：取各杂质贮备液各2ml，置同一20ml量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。平行配制2份。
供试品溶液：精密量取氨基己酸注射液2ml，置20ml量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，精密量取5ml，置20ml量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。
精密量取上述对照品溶液与供试品溶液各20μl注入液相色谱仪，记录色谱图。
表21流速耐用性
Figure BDA0003354804520000192
表22柱温耐用性
Figure BDA0003354804520000193
表23流动相pH耐用性
Figure BDA0003354804520000194
表24不同色谱柱耐用性
Figure BDA0003354804520000201
结论：对色谱条件中色谱参数进行耐用性试验，结果表明：当色谱条件中流动相流速、柱温、流动相pH发生微小变化时，当更换相同品牌不同批号和不同品牌色谱柱进行试验时，此检测方法测定结果均无不干扰各杂质的检测，表明本方法的耐用性良好。

Claims (8)

1.一种同时测定氨基己酸注射液中氨基己酸二聚体、氨基己酸三聚体和己内酰胺的方法，包括如下步骤：
采用HPLC对氨基己酸注射液中的氨基己酸二聚体、氨基己酸三聚体和己内酰胺进行定性检测或定量检测；
所述HPLC的检测条件如下：
色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；
检测波长：212nm；
柱温：25℃±5℃；
流速：1.0mL/min±0.2mL/min；
进样体积：20μL；
流动相A：由体积比为90:10的0.08mol/L乙酸铵溶液和质量浓度为1％乙酸溶液组成；
流动相B：由体积比为90:10的乙腈和质量浓度为1％乙酸溶液组成；
洗脱程序：0～10min，流动相A的体积分数为93％；10～25min，流动相的体积分数由93％下降至85％；25～26min，流动相的体积分数由85％上升至93％；26～35min，流动相A的体积分数保持为93％。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述色谱柱的规格为150mm×4.6mm，3～5μm。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述定性检测的步骤如下：
(1)分别以氨基己酸二聚体的标准物质、氨基己酸三聚体的标准物质和己内酰胺的标准物质为对照品，以水为溶剂，配制含氨基己酸二聚体对照品、氨基己酸三聚体对照品和己内酰胺对照品的溶液；将所述对照品溶液注入液相色谱仪，记录色谱图；
(2)以待测的氨基己酸注射液为供试品，以水为溶剂，配制供试品溶液；将所述供试品溶液注入液相色谱仪，记录色谱图；
(3)若步骤(2)中供试品的色谱图中出现与步骤(1)中所述氨基己酸二聚体对照品、氨基己酸三聚体对照品和己内酰胺对照品的保留时间一致的色谱峰出现，则待测样品中含有氨基己酸二聚体、氨基己酸三聚体和己内酰胺。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：步骤(1)中所述氨基己酸二聚体的标准物质在所述对照品溶液中的浓度为0.00015～0.01mg/mL；
步骤(1)中所述氨基己酸三聚体的标准物质在所述对照品溶液中的浓度为0.0001～0.01mg/mL；
步骤(1)中所述己内酰胺的标准物质在所述对照品溶液中的浓度为0.00005～0.01mg/mL。
5.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于：步骤(2)中所述供试品溶液中氨基己酸的浓度为0.5～10mg/mL。
6.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述定量检测的步骤如下：
(1)分别以氨基己酸二聚体的标准物质、氨基己酸三聚体的标准物质和己内酰胺的标准物质为对照品，以水为溶剂，配制含氨基己酸二聚体对照品、氨基己酸三聚体对照品和己内酰胺对照品的溶液；所述配制步骤中，每种标准物质分别配制两份对照品溶液；对照品溶液的浓度记为C对照1和C对照2；将所述两种不同浓度的对照品溶液分别注入液相色谱仪，记录色谱图，所述两种不同浓度的对照品溶液的峰面积记为A对照1和A对照2；
(2)以待测的氨基己酸注射液为供试品，以水为溶剂，配制供试品溶液；将所述供试品溶液注入液相色谱仪，记录色谱图，所述供试品溶液的峰面积记为A样品；
(3)按照如下公式(1)和公式(2)计算待测样品中氨基己酸二聚体、氨基己酸三聚体和己内酰胺的含量；
Figure FDA0003354804510000021
Figure FDA0003354804510000022
其中，C对照1为对照溶液1的浓度，以对照品含量计，单位为mg/mL；
C对照2为对照溶液2的浓度，以对照品含量计，单位为mg/mL；
A对照1为对照品溶液1色谱图中杂质峰面积；
A对照2为对照品溶液2色谱图中杂质峰面积；
A样品为供试品溶液色谱图中杂质峰面积；
C氨基己酸为待测样品氨基己酸注射液中氨基己酸的浓度，单位为mg/mL；
V移取为待测样品氨基己酸注射液的移取体积，单位为mL；
V稀释为将移取的待测样品氨基己酸注射液稀释得到的供试品溶液的体积，单位为mL；
W杂质为待测样品氨基己酸注射液中的杂质氨基己酸二聚体、氨基己酸三聚体或己内酰胺的质量百分含量。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：步骤(1)中所述氨基己酸二聚体对照品在所述对照品溶液中的浓度为0.0005～0.01mg/mL；
步骤(1)中所述氨基己酸三聚体对照品在所述对照品溶液中的浓度为0.003～0.01mg/mL；
步骤(1)中所述己内酰胺对照品在所述对照品溶液中的浓度为0.0001～0.01mg/mL。
8.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于：步骤(2)中所述供试品溶液中氨基己酸的浓度为0.5～10mg/mL。
CN202111348344.8A 2021-11-15 2021-11-15 一种同时测定氨基己酸注射液中二聚体、三聚体和己内酰胺的方法 Active CN114166982B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202111348344.8A CN114166982B (zh) 2021-11-15 2021-11-15 一种同时测定氨基己酸注射液中二聚体、三聚体和己内酰胺的方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202111348344.8A CN114166982B (zh) 2021-11-15 2021-11-15 一种同时测定氨基己酸注射液中二聚体、三聚体和己内酰胺的方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN114166982A true CN114166982A (zh) 2022-03-11
CN114166982B CN114166982B (zh) 2023-11-10

Family

ID=80478976

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202111348344.8A Active CN114166982B (zh) 2021-11-15 2021-11-15 一种同时测定氨基己酸注射液中二聚体、三聚体和己内酰胺的方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN114166982B (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN117092254A (zh) * 2023-10-18 2023-11-21 吉林四环制药有限公司 氨基己酸或其制剂中杂质的检测方法

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101857550A (zh) * 2009-04-09 2010-10-13 宁波大学 一种用尼龙-6废弃物解聚生产6-氨基己酸盐酸盐和6-氨基己酸的方法
CN105181849A (zh) * 2015-10-08 2015-12-23 湖北三宁化工股份有限公司 采用高效液相色谱法测定己内酰胺中氨基己酸含量的方法
CN105238823A (zh) * 2015-09-22 2016-01-13 成都川科化工有限公司 一种6-氨基己酸的制备方法
CN108685843A (zh) * 2018-05-31 2018-10-23 常州兰陵制药有限公司 氨基己酸注射液及其制备方法
CN111983064A (zh) * 2020-08-07 2020-11-24 扬州中宝药业股份有限公司 一种氨基己酸及其制剂中聚合体的检测方法
CN113156024A (zh) * 2020-12-31 2021-07-23 常州兰陵制药有限公司 高效液相色谱法测定氨基己酸及其注射液中有关物质的方法

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101857550A (zh) * 2009-04-09 2010-10-13 宁波大学 一种用尼龙-6废弃物解聚生产6-氨基己酸盐酸盐和6-氨基己酸的方法
CN105238823A (zh) * 2015-09-22 2016-01-13 成都川科化工有限公司 一种6-氨基己酸的制备方法
CN105181849A (zh) * 2015-10-08 2015-12-23 湖北三宁化工股份有限公司 采用高效液相色谱法测定己内酰胺中氨基己酸含量的方法
CN108685843A (zh) * 2018-05-31 2018-10-23 常州兰陵制药有限公司 氨基己酸注射液及其制备方法
CN111983064A (zh) * 2020-08-07 2020-11-24 扬州中宝药业股份有限公司 一种氨基己酸及其制剂中聚合体的检测方法
CN113156024A (zh) * 2020-12-31 2021-07-23 常州兰陵制药有限公司 高效液相色谱法测定氨基己酸及其注射液中有关物质的方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
张静等: "HPLC法测定氨基己酸注射液的含量及有关物质", 今日药学, vol. 29, no. 2, pages 101 *
江文明等: "氨基己酸注射液中有关物质检查方法的研究", 药物分析杂志, vol. 36, no. 7, pages 1258 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN117092254A (zh) * 2023-10-18 2023-11-21 吉林四环制药有限公司 氨基己酸或其制剂中杂质的检测方法
CN117092254B (zh) * 2023-10-18 2024-01-26 吉林四环制药有限公司 氨基己酸或其制剂中杂质的检测方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN114166982B (zh) 2023-11-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN112394127B (zh) 一种测定维格列汀中3-氨基-1-金刚烷醇和l-脯氨酰胺含量的方法
CN111289676B (zh) 一种检测硫酸特布他林原料药中残留叔丁胺的方法
CN112611820A (zh) 奥扎格雷钠残留溶剂的测定方法
CN114166982A (zh) 一种同时测定氨基己酸注射液中二聚体、三聚体和己内酰胺的方法
CN111679029A (zh) 一种盐酸伊托必利中对羟基苯甲醛的检测方法
CN114264765B (zh) 一种利用hplc测定格列美脲中间体中有关物质的分析方法
CN113030328B (zh) 一种检测盐酸伊伐布雷定中基因毒性杂质的方法
CN109633046B (zh) 一种从盐酸度洛西汀中检测二甲胺的方法
CN109633027B (zh) 一种l-谷氨酸二乙酯盐酸盐中氯乙烷的气相色谱检测方法
CN114324703A (zh) 一种同时检测多种氨基酸的方法
CN109765317B (zh) 一种组合物及枸橼酸托法替布中有关物质的检测方法
CN113484450A (zh) 药物对映异构体检测用衍生化处理方法及测定方法、应用
CN116124926B (zh) 一种测定质粒中2-巯基吡啶含量的方法
CN117074578B (zh) 一种2-（甲氨基）-乙醇的lc-ms/ms定量检测方法
CN115436525B (zh) Llts-m3及其有关物质的检测方法和应用
CN114646700B (zh) 一种（s）-吡咯烷-2-甲腈盐酸盐的检测方法
CN112034058B (zh) 一种长春胺中异构体杂质的检测方法
CN116500172B (zh) 一种酸性底物中胺类溶剂的检测方法
CN112858511B (zh) 维生素冻干粉针剂中n-(4-氨基苯甲酰)-l-谷氨酸的检测方法
CN117538457A (zh) 一种丁二酸酐中1，4-丁内脂的检测方法
CN116183759A (zh) 盐酸培唑帕尼中间体pzp-m1的有关物质的检测方法和应用
CN115825253A (zh) 一种2-酰基氨基噻唑类化合物有关物质的检测方法
CN115856120A (zh) 拉洛他赛有关物质的检测方法和应用
CN117630202A (zh) 盐酸丁螺环酮中间体杂质的检测方法
CN113984921A (zh) 一种测定基因毒杂质1,3-二氯-2-丙醇的气相色谱质谱联用方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant