CN115856120A - 拉洛他赛有关物质的检测方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种拉洛他赛有关物质的检测方法和应用，根据拉洛他赛合成工艺，对拉洛他赛中含有的有关物质I1、I2、I3、I4、I5、I6、I7、I8、I9、I10和I11进行控制，通过特定的高效液相色谱检测条件，可以实现一次性高效的分离出上述十一种有关物质，且专属性强，耐用性好，灵敏度高，便于建立拉洛他赛有关物质研究方法以及对拉洛他赛原料进行质量控制。
Description
技术领域
本发明涉及化学药物分析方法技术领域，具体而言，涉及一种拉洛他赛有关物质的检测方法和应用。
背景技术
拉洛他赛原料药，其结构如下所示：
拉洛他赛作为原料药，如果其本身含有杂质(即有关物质)，那么在进行制剂生产过程中，杂质或杂质的转化物也有可能随之带入后期的生产中，而影响制剂成品的质量。因此，对于拉洛他赛中的杂质控制至关重要。
各国药典均未收载拉洛他赛有关物质的检测方法，因此，亟需建立一种对拉洛他赛有关物质的全面检测方法，以实现对其质量进行有效控制。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一种拉洛他赛有关物质的检测方法和应用，以改善上述技术问题。
本发明是这样实现的：
第一方面，本发明提供了一种拉洛他赛有关物质的检测方法，其包括：采用高效液相色谱对供试品溶液进行检测；所述高效液相色谱的检测条件包括：
检测波长213～217nm；
流动相A：0.04wt％～0.06wt％磷酸水溶液；流动相B：乙腈；
按照以下程序进行梯度洗脱：
拉洛他赛有关物质包括：拉洛他赛-I1、拉洛他赛-I2、拉洛他赛-I3、拉洛他赛-I4、拉洛他赛-I5、拉洛他赛-I6、拉洛他赛-I7、拉洛他赛-I8、拉洛他赛-I9、拉洛他赛-I10、拉洛他赛-I11，结构式依次为：
第二方面，本发明提供了上述拉洛他赛有关物质的检测方法在拉洛他赛的质量控制中的应用。
本发明具有以下有益效果：根据拉洛他赛合成工艺，对拉洛他赛中含有的有关物质I1、I2、I3、I4、I5、I6、I7、I8、I9、I10和I11进行控制，通过本发明实施方式的高效液相色谱检测条件，可以实现一次性高效的分离出上述十一种有关物质，且专属性强，耐用性好，灵敏度高，便于建立拉洛他赛有关物质研究方法以及对拉洛他赛原料进行质量控制。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为试验例1的空白溶液的色谱图；
图2为试验例1的拉洛他赛-I1定位溶液的色谱图；
图3为试验例1的拉洛他赛-I2定位溶液的色谱图；
图4为试验例1的拉洛他赛-I3定位溶液的色谱图；
图5为试验例1的拉洛他赛-I4定位溶液的色谱图；
图6为试验例1的拉洛他赛-I5定位溶液的色谱图；
图7为试验例1的拉洛他赛-I6定位溶液的色谱图；
图8为试验例1的拉洛他赛-I7定位溶液的色谱图；
图9为试验例1的拉洛他赛-I8定位溶液的色谱图；
图10为试验例1的拉洛他赛-I9定位溶液的色谱图；
图11为试验例1的拉洛他赛-I10定位溶液的色谱图；
图12为试验例1的拉洛他赛-I11定位溶液的色谱图；
图13为试验例1的供试品溶液的色谱图；
图14为本发明试验例3提供拉洛他赛-I1的线性关系图；
图15为本发明试验例3提供拉洛他赛-I2的线性关系图；
图16为本发明试验例3提供拉洛他赛-I3的线性关系图；
图17为本发明试验例3提供拉洛他赛-I4的线性关系图；
图18为本发明试验例3提供拉洛他赛-I5的线性关系图；
图19为本发明实施例10提供拉洛他赛-I6的线性关系图；
图20为本发明试验例3提供拉洛他赛-I7的线性关系图；
图21为本发明试验例3提供拉洛他赛-I8的线性关系图；
图22为本发明试验例3提供拉洛他赛-I9的线性关系图；
图23为本发明试验例3提供拉洛他赛-I10的线性关系图；
图24为本发明试验例3提供拉洛他赛-I11的线性关系图；
图25为本发明试验例3提供拉洛他赛的线性关系图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
具体实施方式中的对专属性、检测限与定量限、精密度、线性与范围、准确度、溶液稳定性等项目的验证，按照《化学药物质量控制分析方法验证技术指导原则》、《化学药物质量标准建立的规范化过程技术指导原则》、《化学药物杂质研究技术指导原则》、《化学药物残留溶剂研究技术指导原则》以及现行版《中华人民共和国药典》附录中有关的指导原则进行方法学验证。
下面对本发明提供的一种拉洛他赛有关物质的检测方法和应用进行具体说明。
本发明的一些实施方式提供了一种拉洛他赛有关物质的检测方法，其包括：采用高效液相色谱对供试品溶液进行检测；所述高效液相色谱的检测条件包括：
检测波长213～217nm；
流动相A：0.04wt％～0.06wt％磷酸水溶液；流动相B：乙腈；
按照以下程序进行梯度洗脱：
拉洛他赛有关物质包括：拉洛他赛-I1、拉洛他赛-I2、拉洛他赛-I3、拉洛他赛-I4、拉洛他赛-I5、拉洛他赛-I6、拉洛他赛-I7、拉洛他赛-I8、拉洛他赛-I9、拉洛他赛-I10、拉洛他赛-I11，结构式依次为：
其中，拉洛他赛-I1的分子式为C47H57NO16，分子量为891.96；拉洛他赛-I2的分子式为C45H55NO15，分子量为849.93；拉洛他赛-I3的分子式为C45H55NO15，分子量为849.93；拉洛他赛-I4的分子式为C47H58N2O15，分子量为890.98；拉洛他赛-I5的分子式为C31H36O10，分子量为568.62；拉洛他赛-I6的分子式为C59H70N2O18，分子量为1095.21；拉洛他赛-I7的分子式为C43H51NO13，分子量为789.88；拉洛他赛-I8的分子式为C45H53NO14，分子量为831.91；拉洛他赛-I9的分子式为C49H61NO15，分子量为904.02；拉洛他赛-I10的分子式为C33H38O11，分子量为610.66；拉洛他赛-I11的分子式为C18H25NO5，分子量为335.40；根据拉洛他赛合成工艺，对拉洛他赛中含有的有关物质拉洛他赛-I1、拉洛他赛-I2、拉洛他赛-I3、拉洛他赛-I4、拉洛他赛-I5、拉洛他赛-I6、拉洛他赛-I7、拉洛他赛-I8、拉洛他赛-I9、拉洛他赛-I10、拉洛他赛-I11进行控制，通过本发明的高效液相色谱检测条件，可以实现一次性高效的分离出上述十一种有关物质，建立拉洛他赛有关物质研究方法。
需要说明的是，0～20min内，流动相A和流动相B的体积比保持不变。
进一步地，对洗脱程序进行优化，优化后的洗脱程序为：
进一步地，一些实施方式中，梯度洗脱的流速为0.9～1.1mL/min，例如，可选择0.9mL/min、1.0mL/min或1.1mL/min，优选1.0mL/min。
一些实施方式中，高效液相色谱的色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱，高效液相色谱的柱温为23～27℃，例如柱温可为23℃、24℃、25℃、26℃或27℃等。
例如，色谱柱为Agilent 5TC-C18(2)4.6mm×250mm,5μm或效能相当的其他色谱柱；柱温为25℃。
一些实施方中，高效液相色谱的进样量为10-25μL，例如可为10μL、12μL、15μL、18μL、20μL或25μL等，优选进样量为20μL。
具体地，本发明的一些实施方式通过自身对照法对所述供试品溶液中的拉洛他赛-I1、拉洛他赛-I2、拉洛他赛-I3、拉洛他赛-I4、拉洛他赛-I5、拉洛他赛-I6、拉洛他赛-I7、拉洛他赛-I8、拉洛他赛-I9、拉洛他赛-I10和拉洛他赛-I11的有关物质的含量进行计算。
其中，有关物质的含量的计算方法包括：将供试品溶液、对照溶液分别注入高效液相色谱仪中，测定相应的色谱峰面积，以自身对照法计算得到所述供试品溶液中拉洛他赛-I1、拉洛他赛-I2、拉洛他赛-I3、拉洛他赛-I4、拉洛他赛-I5、拉洛他赛-I6、拉洛他赛-I7、拉洛他赛-I8、拉洛他赛-I9、拉洛他赛-I10和拉洛他赛-I11的有关物质的含量。
承上，一些实施方式中，配置所述供试品溶液和所述对照溶液的溶剂为乙腈。具体地，用于检测的溶液可以按照以下过程配制：
拉洛他赛-I1贮备液：取拉洛他赛-I1约2mg，精密称定，置50ml量瓶中，加溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀，作为拉洛他赛-I1贮备液(40μg/ml)。
拉洛他赛-I2贮备液：取拉洛他赛-I2约2mg，精密称定，置50ml量瓶中，加溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀，作为拉洛他赛-I2贮备液(40μg/ml)。
拉洛他赛-I3贮备液：取拉洛他赛-I3约2mg，精密称定，置50ml量瓶中，加溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀，作为拉洛他赛-I3贮备液(40μg/ml)。
拉洛他赛-I4贮备液：取拉洛他赛-I4约2mg，精密称定，置50ml量瓶中，加溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀，作为拉洛他赛-I4贮备液(40μg/ml)。
拉洛他赛-I5贮备液：取拉洛他赛-I5约2mg，精密称定，置50ml量瓶中，加溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀，作为拉洛他赛-I5贮备液(40μg/ml)。
拉洛他赛-I6贮备液：取拉洛他赛-I6约2mg，精密称定，置50ml量瓶中，加溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀，作为拉洛他赛-I6贮备液(40μg/ml)。
拉洛他赛-I7贮备液：取拉洛他赛-I7约2mg，精密称定，置50ml量瓶中，加溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀，作为拉洛他赛-I7贮备液(40μg/ml)。
拉洛他赛-I8贮备液：取拉洛他赛-I8约2mg，精密称定，置50ml量瓶中，加溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀，作为拉洛他赛-I8贮备液(40μg/ml)。
拉洛他赛-I9贮备液：取拉洛他赛-I9约2mg，精密称定，置50ml量瓶中，加溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀，作为拉洛他赛-I9贮备液(40μg/ml)。
拉洛他赛-I10贮备液：取拉洛他赛-I10约2mg，精密称定，置50ml量瓶中，加溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀，作为拉洛他赛-I10贮备液(40μg/ml)。
拉洛他赛-I11贮备液：取拉洛他赛-I11约2mg，精密称定，置50ml量瓶中，加溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀，作为拉洛他赛-I11贮备液(40μg/ml)。
供试品溶液：取本品约10mg，精密称定，置10ml量瓶中，加溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液(1mg/ml)。
对照溶液：精密量取供试品溶液1ml，置100ml量瓶中，用溶剂稀释至刻度，摇匀。
(浓度约10μg/ml)。
系统适用性溶液：称取本品约10mg，置10ml量瓶中，精密量取拉洛他赛-I1、拉洛他赛-I2、拉洛他赛-I3、拉洛他赛-I4、拉洛他赛-I5、拉洛他赛-I6、拉洛他赛-I7、拉洛他赛-I8、拉洛他赛-I9、拉洛他赛-I10、拉洛他赛-I11贮备液0.5ml，用溶剂溶解并稀释制成每1ml中约含拉洛他赛1.0mg、拉洛他赛-I1、拉洛他赛-I2、拉洛他赛-I3、拉洛他赛-I4、拉洛他赛-I5、拉洛他赛-I6、拉洛他赛-I7、拉洛他赛-I8、拉洛他赛-I9、拉洛他赛-I10、拉洛他赛-I11各2μg的混合溶液。
本发明的一些实施方式提供了一种较佳的检测方法，其高效液相色谱的条件满足：
检测波长为215nm；
流动相A：0.05％磷酸水溶液；流动相B：乙腈；
所述梯度洗脱的流速1.0ml/min；
梯度洗脱程序为：
色谱柱为Agilent 5TC-C18(2)4.6mm×250mm,5μm，所述色谱柱的柱温为25℃；
进样量为20μL；
溶剂：乙腈。
本发明的一些实施方式还提供了上述实施方式的拉洛他赛有关物质的检测方法在拉洛他赛的质量控制中的应用。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
下述实施例中的供试品溶液主要是以拉洛他赛、拉洛他赛-I1、拉洛他赛-I2、拉洛他赛-I3、拉洛他赛-I4、拉洛他赛-I5、拉洛他赛-I6、拉洛他赛-I7、拉洛他赛-I8、拉洛他赛-I9、拉洛他赛-I10和拉洛他赛-I11配制而成，实际检测中，将待检测拉洛他赛溶解稀释配制成供试品溶液即可。
实施例1
本实施例提供了一种拉洛他赛有关物质的检测方法，其具体包括：
(1)样品配制
溶剂：乙腈；
供试品溶液：取本品约10mg，精密称定，置10ml量瓶中，加溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液(1mg/ml)。
(2)采用高效液相色谱对供试品溶液进行检测；高效液相色谱检测条件：
色谱柱：Agilent 5TC-C18(2)4.6mm×250mm，5μm；
流动相A：0.05％磷酸水溶液；
流动相B：乙腈；
按下表进行梯度洗脱：
流速：1.0ml/min；
检测波长：215nm；
柱温：25℃；
进样量：20μL。
实施例2
本实施例参考实施例1的检测方法，区别仅在于：步骤(2)的高效液相色谱检测条件中，柱温为23℃。
实施例3
本实施例参考实施例1的检测方法，区别仅在于：步骤(2)的高效液相色谱检测条件中，柱温为27℃。
实施例4
本实施例参考实施例1的检测方法，区别仅在于：步骤(2)的高效液相色谱检测条件中，波长为213nm。
实施例5
本实施例参考实施例1的检测方法，区别仅在于：步骤(2)的高效液相色谱检测条件中，柱温为217nm。
实施例6
本实施例参考实施例1的检测方法，区别仅在于：步骤(2)的高效液相色谱检测条件中，流速为0.9ml/min。
实施例7
本实施例参考实施例1的检测方法，区别仅在于：步骤(2)的高效液相色谱检测条件中，流速为1.1ml/min。
实施例8
本实施例参考实施例1的检测方法，区别仅在于：步骤(2)的高效液相色谱检测条件中，色谱柱为Agilent 5TC-C18(2)4.6mm×250mm，5μm(同厂家不同批号)。
试验例1
系统适用性试验
(1)溶液配制
溶剂：乙腈；
空白溶液：溶剂
拉洛他赛-I5贮备液：取拉洛他赛-I5约2mg，精密称定，置50ml量瓶中，加乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀，作为拉洛他赛-I5贮备液(40μg/ml)。
拉洛他赛-I10贮备液：取拉洛他赛-I10约2mg，精密称定，置50ml量瓶中，加乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀，作为拉洛他赛-I10贮备液(40μg/ml)。
拉洛他赛-I4贮备液：取拉洛他赛-I4约2mg，精密称定，置50ml量瓶中，加乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀，作为拉洛他赛-I4贮备液(40μg/ml)。
拉洛他赛-I7贮备液：取拉洛他赛-I7约2mg，精密称定，置50ml量瓶中，加乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀，作为拉洛他赛-I7贮备液(40μg/ml)。
拉洛他赛-I3贮备液：取拉洛他赛-I3约2mg，精密称定，置50ml量瓶中，加乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀，作为拉洛他赛-I3贮备液(40μg/ml)。
拉洛他赛-I11贮备液：取拉洛他赛-I11约2mg，精密称定，置50ml量瓶中，加乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀，作为拉洛他赛-I11贮备液(40μg/ml)。
拉洛他赛-I8贮备液：取拉洛他赛-I8约2mg，精密称定，置50ml量瓶中，加乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀，作为拉洛他赛-I8贮备液(40μg/ml)。
拉洛他赛-I2贮备液：取拉洛他赛-I2约2mg，精密称定，置50ml量瓶中，加乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀，作为拉洛他赛-I2贮备液(40μg/ml)。
拉洛他赛-I1贮备液：取拉洛他赛-I1约2mg，精密称定，置50ml量瓶中，加乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀，作为拉洛他赛-I1贮备液(40μg/ml)。
拉洛他赛-I9贮备液：取拉洛他赛-I9约2mg，精密称定，置50ml量瓶中，加乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀，作为拉洛他赛-I9贮备液(40μg/ml)。
拉洛他赛-I6贮备液：取拉洛他赛-I6约2mg，精密称定，置50ml量瓶中，加乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀，作为拉洛他赛-I6贮备液(40μg/ml)。
系统适用性溶液：取拉洛他赛10mg置10ml量瓶中，加乙腈溶解，精密量取拉洛他赛-I5、拉洛他赛-I10、拉洛他赛-I4、拉洛他赛-I7、拉洛他赛-I11、拉洛他赛-I3、拉洛他赛-I8、拉洛他赛-I2、拉洛他赛-I1、拉洛他赛-I9、拉洛他赛-I6贮备液各0.5ml置上述量瓶中，用乙腈稀释并定容至刻度，摇匀，即得。
LLTS-I5定位溶液：精密量取LLTS-I5贮备液1ml，置20ml量瓶中，用乙腈稀释至刻度，摇匀(浓度约2μg/ml)。
LLTS-I10定位溶液：精密量取LLTS-I10贮备液1ml，置20ml量瓶中，用乙腈稀释至刻度，摇匀(浓度约2μg/ml)。
LLTS-I4定位溶液：精密量取LLTS-I4贮备液1ml，置20ml量瓶中，用乙腈稀释至刻度，摇匀(浓度约2μg/ml)。
LLTS-I7定位溶液：精密量取LLTS-I7贮备液1ml，置20ml量瓶中，用乙腈稀释至刻度，摇匀(浓度约2μg/ml)。
LLTS-I11定位溶液：精密量取LLTS-I11贮备液1ml，置20ml量瓶中，用乙腈稀释至刻度，摇匀(浓度约2μg/ml)。
LLTS-I3定位溶液：精密量取LLTS-I3贮备液1ml，置20ml量瓶中，用乙腈稀释至刻度，摇匀(浓度约2μg/ml)。
LLTS-I8定位溶液：精密量取LLTS-I8贮备液1ml，置20ml量瓶中，用乙腈稀释至刻度，摇匀(浓度约2μg/ml)。
LLTS-I2定位溶液：精密量取LLTS-I2贮备液1ml，置20ml量瓶中，用乙腈稀释至刻度，摇匀(浓度约2μg/ml)。
LLTS-I1定位溶液：精密量取LLTS-I1贮备液1ml，置20ml量瓶中，用乙腈稀释至刻度，摇匀(浓度约2μg/ml)。
LLTS-I9定位溶液：精密量取LLTS-I9贮备液1ml，置20ml量瓶中，用乙腈稀释至刻度，摇匀(浓度约2μg/ml)。
LLTS-I6定位溶液：精密量取LLTS-I6贮备液1ml，置20ml量瓶中，用乙腈稀释至刻度，摇匀(浓度约2μg/ml)。
供试品溶液：取本品约10mg，精密称定，置10ml量瓶中，加乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀(浓度约1mg/ml)。
对照溶液：精密量取供试品溶液1ml，置100ml量瓶中，用乙腈稀释至刻度，摇匀(浓度约10μg/ml)。
(2)检测步骤
取空白溶液、对照溶液、系统适用性溶液、供试品溶液(参见实施例1)以及各杂质定位溶液各20μl，进样检测，记录色谱图，色谱图如图1～13所示。其中，按表1的顺序进样，按照实施例1-8中的检测条件进行检测。
表1进样顺序及要求
3)结果分析
实施例1-8改变不同参数结果如下。
表2系统适用性检测结果-保留时间
表3系统适用性检测结果-理论板数
表4系统适用性检测结果-拖尾因子
表5系统适用性检测结果-分离度
从上述结果可知：
各条件下，空白溶液不干扰主成分和杂质测定；
系统适用性溶液中，主峰及已知杂质与相邻杂质峰之间分离度大于1.5，主峰和各已知杂质理论板数均不小于5000，拖尾因子大于2.0；
因此，本发明实施方式的检测方法能稳定有效地检测拉洛他赛的有关物质。
试验例2
灵敏度试验
(1)样品配制
溶剂：乙腈
空白溶液：溶剂
拉洛他赛对照品母液：精密称取拉洛他赛10mg，置10ml量瓶中，加乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀(1mg/ml)。
拉洛他赛对照品稀释液：精密量取拉洛他赛母液1ml，置100ml量瓶中，用乙腈定容至刻度，摇匀(10μg/ml)。
拉洛他赛-I1母液：称取拉洛他赛-I1 2mg，置10ml量瓶中，加乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀(200μg/ml)。
拉洛他赛-I1稀释液：精密量取拉洛他赛-I1母液2ml，置10ml量瓶中，用乙腈定容至刻度，摇匀；精密量取1ml，置20ml量瓶中，用乙腈定容至刻度，摇匀(2μg/ml)。
拉洛他赛-I2母液：称取拉洛他赛-I2 2mg，置10ml量瓶中，加乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀(200μg/ml)。
拉洛他赛-I2稀释液：精密量取拉洛他赛-I2母液2ml，置10ml量瓶中，用乙腈定容至刻度，摇匀；精密量取1ml，置20ml量瓶中，用乙腈定容至刻度，摇匀(2μg/ml)。
拉洛他赛-I3母液：称取拉洛他赛-I3 2mg，置10ml量瓶中，加乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀(200μg/ml)。
拉洛他赛-I3稀释液：精密量取拉洛他赛-I3母液2ml，置10ml量瓶中，用乙腈定容至刻度，摇匀；精密量取1ml，置20ml量瓶中，用乙腈定容至刻度，摇匀(2μg/ml)。
拉洛他赛-I4母液：称取拉洛他赛-I4 2mg，置10ml量瓶中，加乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀(200μg/ml)。
拉洛他赛-I4稀释液：精密量取拉洛他赛-I4母液2ml，置10ml量瓶中，用乙腈定容至刻度，摇匀；精密量取1ml，置20ml量瓶中，用乙腈定容至刻度，摇匀(2μg/ml)。
拉洛他赛-I5母液：称取拉洛他赛-I5 2mg，置10ml量瓶中，加乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀(200μg/ml)。
拉洛他赛-I5稀释液：精密量取拉洛他赛-I5母液2ml，置10ml量瓶中，用乙腈定容至刻度，摇匀；精密量取1ml，置20ml量瓶中，用乙腈定容至刻度，摇匀(2μg/ml)。
拉洛他赛-I6母液：称取拉洛他赛-I6 2mg，置10ml量瓶中，加乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀(200μg/ml)。
拉洛他赛-I6稀释液：精密量取拉洛他赛-I6母液2ml，置10ml量瓶中，用乙腈定容至刻度，摇匀；精密量取1ml，置20ml量瓶中，用乙腈定容至刻度，摇匀(2μg/ml)。
拉洛他赛-I7母液：称取拉洛他赛-I7 2mg，置10ml量瓶中，加乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀(200μg/ml)。
拉洛他赛-I7稀释液：精密量取拉洛他赛-I7母液2ml，置10ml量瓶中，用乙腈定容至刻度，摇匀；精密量取1ml，置20ml量瓶中，用乙腈定容至刻度，摇匀(2μg/ml)。
拉洛他赛-I8母液：称取拉洛他赛-I5 2mg，置10ml量瓶中，加乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀(200μg/ml)。
拉洛他赛-I8稀释液：精密量取拉洛他赛-I8母液2ml，置10ml量瓶中，用乙腈定容至刻度，摇匀；精密量取1ml，置20ml量瓶中，用乙腈定容至刻度，摇匀(2μg/ml)。
拉洛他赛-I9母液：称取拉洛他赛-I9 2mg，置10ml量瓶中，加乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀(200μg/ml)。
拉洛他赛-I9稀释液：精密量取拉洛他赛-I9母液2ml，置10ml量瓶中，用乙腈定容至刻度，摇匀；精密量取1ml，置20ml量瓶中，用乙腈定容至刻度，摇匀(2μg/ml)。
拉洛他赛-I10母液：称取拉洛他赛-I10 2mg，置10ml量瓶中，加乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀(200μg/ml)。
拉洛他赛-I10稀释液：精密量取拉洛他赛-I10母液2ml，置10ml量瓶中，用乙腈定容至刻度，摇匀；精密量取1ml，置20ml量瓶中，用乙腈定容至刻度，摇匀(2μg/ml)。
拉洛他赛-I11母液：称取拉洛他赛-I11 2mg，置10ml量瓶中，加乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀(200μg/ml)。
拉洛他赛-I11稀释液：精密量取拉洛他赛-I11母液2ml，置10ml量瓶中，用乙腈定容至刻度，摇匀；精密量取1ml，置20ml量瓶中，用乙腈定容至刻度，摇匀(2μg/ml)。
系统适用性溶液：用“试验例1”项下配制好的“系统适用性溶液”。
定量限溶液：精密量取拉洛他赛对照品稀释液0.1ml、拉洛他赛-I1稀释液0.7ml、拉洛他赛-I2稀释液0.5ml、拉洛他赛-I3稀释液1ml、拉洛他赛-I4稀释液0.6ml、拉洛他赛-I5稀释液0.3ml、拉洛他赛-I6稀释液1ml、拉洛他赛-I7稀释液0.5ml、拉洛他赛-I8稀释液0.5ml、拉洛他赛-I9稀释液0.5ml、拉洛他赛-I10稀释液0.4ml、拉洛他赛-I11稀释液0.4ml，置同一10ml量瓶中，用乙腈稀释至刻度，摇匀；制成信噪比≥10的溶液，作为定量限溶液(S/N≈10)。
检测限溶液配制：精密量取定量限溶液3ml，置10ml量瓶中，用乙腈-稀释至刻度，摇匀，作为检测限溶液(S/N≈3)。
(2)高效液相色谱检测条件
同实施例1
(3)检测步骤
取空白溶液、系统适用性溶液、对照品溶液及定量限、检测限溶液各20μl，进样检测，记录色谱图，按下表的顺序进样。
表6进样顺序及次数要求
| 顺序 | 样品名称 | 针数 |
| 1 | 空白溶液 | 1针 |
| 2 | 系统适用性溶液 | 1针 |
| 3 | 定量限溶液 | 6针 |
| 4 | 检测限限溶液 | 2针 |
(4)分析结果
灵敏度试验结果见下表。
表7拉洛他赛-I5定量限测试结果
| 名称 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 平均 | RSD |
| 峰面积 | 1.65 | 1.62 | 1.63 | 1.71 | 1.67 | 1.65 | 1.66 | 1.93 |
| 保留时间 | 9.126 | 9.110 | 9.087 | 9.083 | 9.070 | 9.075 | 9.092 | 0.239 |
表8拉洛他赛-I10定量限测试结果
| 名称 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 平均 | RSD(％) |
| 峰面积 | 2.33 | 2.35 | 2.45 | 2.51 | 2.38 | 2.37 | 2.40 | 2.84 |
| 保留时间 | 15.125 | 15.098 | 15.074 | 15.055 | 15.038 | 15.041 | 15.072 | 0.228 |
表9拉洛他赛-I4定量限测试结果
表10拉洛他赛-I7定量限测试结果
表11拉洛他赛-I11定量限测试结果
表12拉洛他赛-I3定量限测试结果
表13拉洛他赛定量限测试结果
| 名称 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 平均 | RSD(％) |
| 峰面积 | 3.56 | 3.71 | 3.65 | 3.59 | 3.57 | 3.54 | 3.60 | 1.79 |
| 保留时间 | 34.453 | 34.379 | 34.304 | 34.285 | 34.239 | 34.218 | 34.313 | 0.258 |
表14拉洛他赛-I8定量限测试结果
| 名称 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 平均 | RSD(％) |
| 峰面积 | 3.12 | 2.70 | 3.00 | 2.88 | 3.01 | 2.74 | 2.91 | 5.67 |
| 保留时间 | 38.392 | 38.312 | 38.24 | 38.221 | 38.171 | 38.165 | 38.250 | 0.229 |
表15拉洛他赛-I2定量限测试结果
表16拉洛他赛-I1定量限测试结果
| 名称 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 平均 | RSD(％) |
| 峰面积 | 2.91 | 2.91 | 2.81 | 2.76 | 2.73 | 2.84 | 2.83 | 2.65 |
| 保留时间 | 44.959 | 44.892 | 44.817 | 44.788 | 44.755 | 44.744 | 44.826 | 0.188 |
表17拉洛他赛-I9定量限测试结果
| 名称 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 平均 | RSD(％) |
| 峰面积 | 2.99 | 2.94 | 3.44 | 2.94 | 2.82 | 2.80 | 2.99 | 7.81 |
| 保留时间 | 64.188 | 64.148 | 64.079 | 64.151 | 64.101 | 64.107 | 64.129 | 0.063 |
表18拉洛他赛-I6定量限测试结果
| 名称 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 平均 | RSD(％) |
| 峰面积 | 5.04 | 4.80 | 4.79 | 4.74 | 4.73 | 4.75 | 4.81 | 2.43 |
| 保留时间(min) | 68.282 | 68.155 | 68.069 | 68.00 | 67.96 | 67.941 | 68.069 | 0.191 |
表19灵敏度测试结果
计算公式：
定量限/检测限浓度(μg/ml)＝称样量×杂质含量/稀释倍数
定量限/检测限(ng)＝浓度×进样量
定量限占供试品比(％)＝定量限浓度/供试品浓度×100％
从上述灵敏度试验结果可知：
定量限溶液连续测试6次，拉洛他赛与各杂质峰面积RSD均不大于10.0％，保留时间RSD均不大于2.0％；定量限均小于报告限度(0.05％的供试品浓度)。
试验例3
线性试验
(1)样品配制
溶剂：乙腈
空白溶液：溶剂
拉洛他赛-I1对照品贮备液：取拉洛他赛-I1对照品约2mg，精密称定，置10ml量瓶中，加乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀(200μg/ml)。
同“拉洛他赛-I1对照品贮备液”配制拉洛他赛-I2、拉洛他赛-I3、拉洛他赛-I4、拉洛他赛-I5、拉洛他赛-I6、拉洛他赛-I7、拉洛他赛-I8、拉洛他赛-I9、拉洛他赛-I10、拉洛他赛-I11对照品贮备液。
拉洛他赛-I1对照品溶液：精密量取拉洛他赛-I1对照品贮备液2ml，置10ml量瓶中，用乙腈稀释至刻度，摇匀(40μg/ml)。
同“拉洛他赛-I1对照品溶液”配制拉洛他赛-I2、拉洛他赛-I3、拉洛他赛-I4、拉洛他赛-I5、拉洛他赛-I6、拉洛他赛-I7、拉洛他赛-I8、拉洛他赛-I9、拉洛他赛-I10、拉洛他赛-I11对照品溶液。
系统适用性溶液：取拉洛他赛对照品约10mg，置10ml量瓶中，加乙腈使溶解，精密加入拉洛他赛-I1、拉洛他赛-I2、拉洛他赛-I3、拉洛他赛-I4、拉洛他赛-I5、拉洛他赛-I6、拉洛他赛-I7、拉洛他赛-I8、拉洛他赛-I9、拉洛他赛-I10、拉洛他赛-I11对照品溶液各0.5ml，用乙腈稀释至刻度，摇匀(拉洛他赛：1mg/ml各杂质：2μg/ml)。
拉洛他赛对照品溶液：取拉洛他赛对照品约10mg，精密称定，置10ml量瓶中，加乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀；精密量取1ml，置10ml量瓶中，用乙腈稀释至刻度，摇匀(100μg/ml)。
线性贮备液：精密量取对照品溶液5ml、拉洛他赛-I1、拉洛他赛-I2、拉洛他赛-I3、拉洛他赛-I4、拉洛他赛-I5贮备液各2.5ml，置同一50ml量瓶中，用乙腈稀释至刻度，摇匀。
线性溶液1(定量限溶液)：配制同实施例9检测限和定量限”项下。
线性溶液2(相当于供试品浓度的0.05％)：精密量取线性贮备液1 1ml，置20ml量瓶中，用溶剂稀释至刻度，摇匀(浓度约0.5μg/ml)。
线性溶液3(相当于供试品浓度的0.1％)：精密量取线性贮备液1 2ml，置20ml量瓶中，用溶剂稀释至刻度，摇匀(浓度约1μg/ml)。
线性溶液4(相当于供试品浓度的0.2％)：精密量取线性贮备液1 4ml，置20ml量瓶中，用溶剂稀释至刻度，摇匀(浓度约2μg/ml)。
线性溶液5(相当于供试品浓度的0.3％)：精密量取线性贮备液1 6ml，置20ml量瓶中，用溶剂稀释至刻度，摇匀(浓度约3μg/ml)。
线性溶液6(相当于供试品浓度的0.5％)：精密量取线性贮备液1 10ml，置20ml量瓶中，用溶剂稀释至刻度，摇匀(浓度约5μg/ml)。
(2)高效液相色谱检测条件
同实施例1
(3)检测步骤
取空白溶液、系统适用性溶液、各线性溶液各20μl，进样检测，记录色谱图。按下表的顺序进样。
表20进样顺序及要求
| 顺序 | 样品名称 | 针数 |
| 1 | 空白溶液 | 1针 |
| 2 | 系统适用性溶液 | 1针 |
| 3 | 线性溶液1～6 | 各1针 |
(4)分析结果
线性试验结果见下表。
表21拉洛他赛-I5线性测试结果
表22拉洛他赛-I10线性测试结果
表23拉洛他赛-I4线性测试结果
表24拉洛他赛-I7线性测试结果
表25拉洛他赛-I11线性测试结果
表26拉洛他赛-I3线性测试结果
表27拉洛他赛线性测试结果
表28拉洛他赛-I8线性测试结果
表29拉洛他赛-I2线性测试结果
表30拉洛他赛-I1线性测试结果
表31拉洛他赛-I9线性测试结果
表32拉洛他赛-I6线性测试结果
线性相关系数r均≥0.990；y轴截距均小于100％限度浓度峰面积的25％，响应因子的RSD均不大于10.0％。以浓度C(μg/mL)为横坐标，对应的峰面积为纵坐标，得到线性回归方程，线性关系图如图14、图15、图16、图17、图18、图19、图20、图21、图22、图23、图24、图25所示。拉洛他赛-I5、拉洛他赛-I10、拉洛他赛-I4、拉洛他赛-I7、拉洛他赛-I11、拉洛他赛-I3、拉洛他赛、拉洛他赛-I8、拉洛他赛-I2、拉洛他赛-I1、拉洛他赛-I19、拉洛他赛-I6浓度与峰面积的线性关系良好，符合验证要求。
试验例4
准确度试验，包括如下步骤：
(1)样品配制
溶剂：乙腈
空白溶液：溶剂
系统适用性溶液：用“试验例1”项下配制好的“系统适用性溶液”。
供试品溶液：取本品约10mg，精密称定，置10ml量瓶中，加溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液(1mg/ml)。
对照品贮备液：取拉洛他赛-I5、拉洛他赛-I10、拉洛他赛-I4、拉洛他赛-I7、拉洛他赛-I11、拉洛他赛-I3、拉洛他赛、拉洛他赛-I8、拉洛他赛-I2、拉洛他赛-I1、拉洛他赛-I9、拉洛他赛-I6对照品各约2mg，精密称定，置同一20ml量瓶中，加溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀；精密量取5ml，置50ml量瓶中，用溶剂稀释至刻度，摇匀。(各杂质浓度约10μg/ml，平行配制两份)。
对照品溶液：精密量取对照品贮备液2ml，置10ml量瓶中，用溶剂稀释至刻度，摇匀。(各杂质浓度约2μg/ml，与对照品贮备液一一对应，平行配制两份)。
回收率溶液(取对照品贮备液-1配制回收率溶液)。
50％溶液：取本品约10mg，精密称定，置10ml量瓶中，加溶剂适量使溶解，精密加入对照品贮备液-1 1ml，用溶剂稀释至刻度，摇匀。平行配制3份。
100％溶液：取本品约10mg，精密称定，置10ml量瓶中，加溶剂适量使溶解，精密加入对照品贮备液-1 2ml，用溶剂稀释至刻度，摇匀。平行配制3份。
150％溶液：取本品约10mg，精密称定，置10ml量瓶中，加溶剂适量使溶解，精密加入对照品贮备液-1 3ml，用溶剂稀释至刻度，摇匀。平行配制3份。
(2)高效液相色谱检测条件
同实施例1
(3)检测步骤
取空白溶液、系统适用性溶液、对照品溶液、供试品溶液及回收率溶液各20μl，进样检测，记录色谱图。按下表的顺序进样。
表33进样顺序及要求
注：计算公式：回收率％＝(测得量-样品中含量)/加入量×100％(4)分析结果
准确度试验结果见下表。
表34拉洛他赛-I5回收率测试结果
表35拉洛他赛-I10回收率测试结果
表36拉洛他赛-I4回收率测试结果
表37拉洛他赛-I7回收率测试结果
表38拉洛他赛-I11回收率测试结果
表39拉洛他赛-I3回收率测试结果
表40拉洛他赛-I8回收率测试结果
表41拉洛他赛-I2回收率测试结果
表42拉洛他赛-I1回收率测试结果
表43拉洛他赛-I9回收率测试结果
表44拉洛他赛-I6回收率测试结果
以杂质限度浓度作为100％，按50％、100％和150％三种浓度向样品中定量添加杂质，各浓度水平下，杂质回收率均应90.0％～110.0％范围内，9份回收率RSD均小于10.0％，准确度良好。
试验例4
重复性用性试验
(1)样品配制
溶剂：乙腈
空白溶液：溶剂
系统适用性溶液：用“试验例1”项下配制好的“系统适用性溶液”。
供试品溶液：取本品约10mg，精密称定，置10ml量瓶中，加溶剂适量使溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液(平行配制6份)。
对照溶液：精密量取供试品溶液1ml，置100ml量瓶中，用溶剂稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液(平行配制6份)。
(2)高效液相色谱检测条件
同实施例1
(3)检测步骤
取空白溶液、系统适用性溶液、对照溶液以及供试品溶液各20μl，进样检测，记录色谱图。按下表的顺序进样。
表45进样顺序及要求
| 顺序 | 样品 | 针数 |
| 1 | 空白溶液 | 1针 |
| 2 | 系统适用性溶液 | 1针 |
| 3 | 供试品-1～6 | 各1针 |
| 4 | 对照溶液-1～6 | 各1针 |
(4)分析结果
重复性试验结果见下表。
表46重复性测试结果
注：ND表示未检出
6份供试品，杂质检出基本一致，总杂及杂质个数无明显变化，重复性良好。
试验例5
溶液稳定性试验，
(1)样品配制
系统适用性溶液：用“试验例1”项下配制好的“系统适用性溶液”。
供试品溶液、对照溶液配制同试验例1溶液配制。
溶剂：乙腈
空白溶液：溶剂
(2)高效液相色谱检测条件
同实施例1
(3)检测步骤
取空白溶液、系统适用性溶液、对照溶液以及供试品溶液各20μl，进样检测，记录色谱图。按下表的顺序进样。
表47进样顺序及要求
(4)分析结果
溶液稳定性试验结果见下表。
表48供试品溶液稳定性结果
表49对照溶液稳定性测试结果
| 时间(h) | 保留时间(min) | 峰面积 |
| 1.5 | 34.444 | 288.36 |
| 7.5 | 34.340 | 288.59 |
| 13.5 | 34.334 | 288.55 |
| 19.5 | 34.481 | 288.95 |
| 25.5 | 34.411 | 289.95 |
| 31.5 | 34.603 | 290.95 |
| 37.5 | 34.639 | 290.65 |
| 43.5 | 34.642 | 291.87 |
| 均值 | 34.487 | 289.73 |
| RSD(％) | 0.369 | 0.45 |
供试品溶液室温放置42小时，杂质拉洛他赛-I10、拉洛他赛-I4、拉洛他赛-I7、拉洛他赛-I11、拉洛他赛-I3、拉洛他赛-I2、拉洛他赛-I1、拉洛他赛-I6均未检出；杂质拉洛他赛-I5各时间点含量均值为0.005％，相对符合；杂质拉洛他赛-I8各时间点含量均值为0.031％，相对符合；杂质拉洛他赛-I9各时间点含量均值为0.038％，相对符合；最大未知单杂各时间点含量均值为0.028％，相对符合；总杂各时间点含量均值为0.119％，RSD为3.32％，小于15.0；杂质个数无明显变化，表明供试品溶液室温放置42小时稳定。对照溶液室温放置43.5小时，主峰峰面积RSD为0.45％，不大于5.0％，表明对照溶液室温放置43.5小时稳定。
综上所述，本发明实施方式的检测方法，能够实现一次性高效分离拉洛他赛中所控的十一种杂质的有关物质，且专属性强，耐用性好，灵敏度高，可用于拉洛他赛原料的质量控制中。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种拉洛他赛有关物质的检测方法，其特征在于，其包括：采用高效液相色谱对供试品溶液进行检测；所述高效液相色谱的检测条件包括：
检测波长213～217nm；
流动相A：0.04wt％～0.06wt％磷酸水溶液；流动相B：乙腈；
按照以下程序进行梯度洗脱：
所述拉洛他赛有关物质包括：拉洛他赛-I1、拉洛他赛-I2、拉洛他赛-I3、拉洛他赛-I4、拉洛他赛-I5、拉洛他赛-I6、拉洛他赛-I7、拉洛他赛-I8、拉洛他赛-I9、拉洛他赛-I10、拉洛他赛-I11，结构式依次为：
/>
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，洗脱程序为：
3.根据权利要求1或2所述的检测方法，其特征在于，所述梯度洗脱的流速为0.9～1.1mL/min，优选1.0mL/min。
4.根据权利要求1或2所述的检测方法，其特征在于，所述高效液相色谱的色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱，所述高效液相色谱的柱温为23～27℃；
优选地，所述色谱柱为Agilent 5TC-C18(2)4.6mm×250mm,5μm；所述柱温为25℃。
5.根据权利要求1或2所述的检测方法，其特征在于，所述高效液相色谱的进样量为10-25μL，更优选地，进样量为20μL。
6.根据权利要求1或2所述的检测方法，其特征在于，通过自身对照法对所述供试品溶液中的拉洛他赛-I1、拉洛他赛-I2、拉洛他赛-I3、拉洛他赛-I4、拉洛他赛-I5、拉洛他赛-I6、拉洛他赛-I7、拉洛他赛-I8、拉洛他赛-I9、拉洛他赛-I10和拉洛他赛-I11的有关物质的含量进行计算。
7.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于，优选地，所述有物质的含量的计算方法包括：将供试品溶液、对照溶液分别注入高效液相色谱仪中，测定相应的色谱峰面积，以自身对照法计算得到所述供试品溶液中拉洛他赛-I1、拉洛他赛-I2、拉洛他赛-I3、拉洛他赛-I4、拉洛他赛-I5、拉洛他赛-I6、拉洛他赛-I7、拉洛他赛-I8、拉洛他赛-I9、拉洛他赛-I10和拉洛他赛-I11的有关物质的含量。
8.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于，配置所述供试品溶液和所述对照溶液的溶剂为乙腈。
9.根据权利要求1或2所述的检测方法，其特征在于，所述高效液相色谱的条件满足：
检测波长为215nm；
流动相A：0.05％磷酸水溶液；流动相B：乙腈；
所述梯度洗脱的流速1.0ml/min；
色谱柱为Agilent 5TC-C18(2)4.6mm×250mm,5μm，所述色谱柱的柱温为25℃；
进样量为20μL；
溶剂：乙腈。
10.如权利要求1～9任一项所的拉洛他赛有关物质的检测方法在拉洛他赛的质量控制中的应用。
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2022
- 2022-11-23 CN CN202211472396.0A patent/CN115856120A/zh active Pending
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