CN113484430A - 一种采用高效液相色谱法测定l-丙氨酸异丙酯盐酸盐有关物质的方法 - Google Patents

一种采用高效液相色谱法测定l-丙氨酸异丙酯盐酸盐有关物质的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种采用高效液相色谱法测定L‑丙氨酸异丙酯盐酸盐有关物质的方法。采用高效液相色谱法测定L‑丙氨酸异丙酯盐酸盐，采用十八烷基键合硅胶为填充剂的色谱柱。有关物质包括杂质L‑丙氨酸甲酯盐酸盐、L‑丙氨酸乙酯盐酸盐。以庚烷磺酸钠为离子对试剂。在本发明的分析方法中，分析所需时间短，峰形对称性好，回收率高，且灵敏度高。采用本发明的方法能快速分离检测L‑丙氨酸异丙酯盐酸盐的有关物质，并能准确测定L‑丙氨酸异丙酯盐酸盐中杂质(L‑丙氨酸甲酯、L‑丙氨酸乙酯)的含量。

Description

一种采用高效液相色谱法测定L-丙氨酸异丙酯盐酸盐有关物 质的方法
技术领域
本发明涉及药物的检测方法，具体涉及一种测定L-丙氨酸异丙酯盐酸盐有关物质的高效液相色谱分析方法。
背景技术
L-丙氨酸异丙酯盐酸盐(参见图1左)作为一种重要的起始原料，被广泛用于药物的合成，比如富马酸丙酚替诺福韦(TAF)(参见图1右)等。L-丙氨酸异丙酯盐酸盐中的L-丙氨酸甲酯盐酸盐和L-丙氨酸乙酯盐酸盐可以引起TAF杂质，需要严格控制其有关物质的含量。
近年来，对原料药的有关物质控制要求越来越严格，不只是限度的要求，而是要求准确测定其含量。目前，L-丙氨酸异丙酯盐酸盐有关物质尚无药典标准，文献中尚未报道L-丙氨酸异丙酯盐酸盐有关物质测定方法。因此建立一种能准确测定L-丙氨酸异丙酯盐酸盐有关物质的液相色谱方法是很有必要的。
发明内容
本发明的目的是提供一种采用高效液相色谱法测定L-丙氨酸异丙酯盐酸盐有关物质的方法，其特征在于:采用高效液相色谱法测定L-丙氨酸异丙酯盐酸盐，采用十八烷基键合硅胶为填充剂的色谱柱；有关物质包括杂质L-丙氨酸甲酯盐酸盐、L-丙氨酸乙酯盐酸盐；以庚烷磺酸钠为离子对试剂。
进一步，以十八烷基键合硅胶为填充剂的色谱柱；以缓冲盐溶液-乙腈为流动相。
进一步，所述流动相中缓冲盐溶液的溶质为磷酸二氢钾和庚烷磺酸钠，溶剂为纯化水。
进一步，缓冲盐溶液中，磷酸二氢钾浓度为10mmol/L，庚烷磺酸钠浓度为20mmol/L。
进一步，缓冲盐溶液中，pH＝4.0。
进一步，缓冲盐溶液与乙腈的体积比为70：30～80：20，优选为75：25
进一步，检测波长为205±2nm。
进一步，流速为0.9mL/min～1.1mL/min，优选为1.0mL/min。
进一步，进样量为5μL～20μL，优选为5μL。
进一步，柱温为25℃～35℃。
本发明的优选色谱条件为：以十八烷基键合硅胶为填充剂的色谱柱；以缓冲盐-乙腈(75：25)为流动相；流速为1.0ml/min；检测波长为205nm；进样量为5μl。
样品溶液的制备：
稀释剂：25％乙腈水溶液
供试品溶液：取本品约50mg，置5ml量瓶中，加稀释剂适量使溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。
对照溶液：精密量取供试品溶液1ml，置100ml量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀；再精密量取1ml，置10ml量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得。
测定方法
精密量取系统适用性溶液5μl，注入液相色谱仪，记录色谱图。主峰信噪比必不应低于30，再精密量取供试品溶液和对照溶液各5μl，注入液相色谱仪，记录色谱图。
计算方法以及接受限度
供试品溶液中如有与L-丙氨酸甲酯(相对保留时间约为0.65)、L-丙氨酸乙酯(相对保留时间约为0.77)相对保留时间一致的峰，其峰面积均不得大于对照溶液主峰面积(0.1％)，其他单个杂质峰面积均不得大于对照溶液主峰面积的5倍(0.5％)，各杂质峰面积的和不得大于对照溶液主峰面积的10倍(1.0％)。供试品溶液中任何小于对照溶液主峰面积的0.3倍的杂质峰可忽略不计。
在一般条件下，L-丙氨酸异丙酯盐酸盐在一般色谱柱上基本无保留，很难进行分离测定，采用离子对色谱方法，可增强此类化合物的保留；使其可以有效分离。
本发明所述的高效液相色谱分析方法，以庚烷磺酸钠为离子对试剂，实现了L-丙氨酸异丙酯盐酸盐有关物质(L-丙氨酸甲酯、L-丙氨酸乙酯)在色谱柱上的分离，并准确定量，控制了L-丙氨酸异丙酯盐酸盐的有关物质。
在本发明的分析方法中，L-丙氨酸异丙酯保留时间约为5.656min，L-丙氨酸甲酯保留时间3.593min，L-丙氨酸乙酯保留时间4.285min，分离度大于3.0，分析所需时间短，峰形对称性好。本发明方法的回收率高，平均回收率为90.0％和107.4％，且灵敏度高，检测限达0.5μg/ml。且溶液稳定性达到48h。采用本发明的方法能快速分离检测L-丙氨酸异丙酯盐酸盐的有关物质，并能准确测定L-丙氨酸异丙酯盐酸盐中杂质(L-丙氨酸甲酯、L-丙氨酸乙酯)的含量。
附图说明
图1为L-丙氨酸异丙酯盐酸盐和富马酸丙酚替诺福韦(TAF)。
图2为100％供试品溶液的液相色谱图，L-丙氨酸异丙酯保留时间5.656min，L-丙氨酸甲酯保留时间3.593min，L-丙氨酸乙酯保留时间4.285min。
图3为对照溶液的相色谱图。
图4为L-丙氨酸异丙酯盐酸盐的标准曲线图。
图5为L-丙氨酸甲酯盐酸盐的标准曲线图。
图6为L-丙氨酸乙酯盐酸盐的标准曲线图。
图7为样品检测的液相色谱图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明，但不应该理解为本发明上述主题范围仅限于下述实施例。在不脱离本发明上述技术思想的情况下，根据本领域普通技术知识和惯用手段，做出各种替换和变更，均应包括在本发明的保护范围内。
主要仪器及色谱条件：
安捷伦1200系列高效液相色谱仪；配VWD紫外检测器，自动进样器，Waters色谱工作站。
试剂与药品：
磷酸二氢钾(分析纯)、庚烷磺酸钠(HPLC级)、磷酸(HPLC级)、乙腈(HPLC级)、L-丙氨酸甲酯盐酸盐对照品、L-丙氨酸乙酯盐酸盐对照品、L-丙氨酸异丙酯盐酸盐对照品、L-丙氨酸异丙酯盐酸盐(样品)
实施例1色谱条件的选择
1.1波长的选择
稀释剂：25％乙腈水。
L-丙氨酸异丙酯盐酸盐溶液配制：称取L-丙氨酸异丙酯盐酸盐约10mg，置于10ml量瓶中，加稀释剂溶解，并稀释至刻度，摇匀，即得。
取L-丙氨酸异丙酯盐酸盐溶液作为供试品，以稀释剂为空白校正液，按照紫外-可见分光光度法(中国药典2020年版)于190nm～400nm进行扫描。结果显示，供试品溶液在205nm处有最大吸收峰。因此将205nm±2nm确定为检测波长。
1.2方法的耐用性试验
本试验通过调整流动相比例、流速、柱温等，来筛选本试验的色谱方法。具体方案见表1。
表1方法的筛选方案
Figure BDA0003089015950000031
Figure BDA0003089015950000041
溶液的配制：
L-丙氨酸甲酯盐酸盐储备液：精密称取L-丙氨酸甲酯盐酸盐对照品约20mg，置20ml量瓶中，加稀释剂使溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。
L-丙氨酸乙酯盐酸盐储备液：精密称取L-丙氨酸乙酯盐酸盐对照品约20mg，置20ml量瓶中，加稀释剂使溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。
杂质混合储备液：精密量取L-丙氨酸甲酯盐酸盐对照品储备液、L-丙氨酸乙酯盐酸盐对照品储备液各1ml，置于20ml量瓶中，稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得
100％浓度水平供试品溶液：取本品约50mg，精密称定，置5ml量瓶中，加适量稀释剂使溶解，加入1ml杂质储备液，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得。
取100％浓度水平供试品溶液作为供试品。精密量取5μl供试品溶液，注入液相色谱仪中，记录色谱图。考察L-丙氨酸甲酯、L-丙氨酸乙酯与相邻峰分离度的变化。结果见表2。方案1所得的色谱图见图2。
表2方法的筛选试验结果
Figure BDA0003089015950000042
结果表明，方案1到7的色谱条件下，L-丙氨酸甲酯、L-丙氨酸乙酯、L-丙氨酸异丙酯与相邻峰的分离度均大于1.5；L-丙氨酸甲酯、L-丙氨酸乙酯的峰形较好，对称因子都在1.0～1.5之间，可以用于测定L-丙氨酸异丙酯盐酸盐的有关物质。其中，方案1和方案3得到的L-丙氨酸甲酯、L-丙氨酸乙酯峰形更好，对称因子均是1.0和1.1；在方案2的色谱条件下，L-丙氨酸甲酯与相邻峰的分离度也大于1.5，但是L-丙氨酸甲酯的峰形较差，对称因子只有1.5。
实施例2专属性
色谱条件：同实施例1方案1。
溶液配制：
空白溶液：稀释剂
酸破坏空白溶液：加入2.5ml0.1mol/L盐酸溶液于5ml量瓶中，室温静置4h；0.1mol/L氢氧化钠稀释至刻度，摇匀，既得。
酸破环供试品溶液：精密称定供试品约50mg，置于5ml量瓶中，加入2.5ml0.1mol/L盐酸溶液，室温静置4h；0.1mol/L氢氧化钠稀释至刻度，摇匀，既得。
碱破坏空白供试品溶液：加入2.5ml0.1mol/L氢氧化钠溶液于5ml量瓶中，室温静置4h；0.1mol/L盐酸稀释至刻度，摇匀，既得。
碱破坏供试品溶液：精密称定供试品约50mg置于5ml量瓶中，加入2.5ml0.1mol/L氢氧化钠溶液,室温静置4h，0.1mol/L盐酸稀释至刻度，摇匀，既得。
热破坏空白溶液：加入2.5ml纯化水于5ml量瓶中，置于80℃水浴4h，静置至室温，纯化水稀释至刻度，摇匀，既得。
热破坏供试品溶液：精密称定供试品约50mg置于5ml量瓶中，加入2.5ml纯化水，置于80℃水浴4h，静置至室温，纯化水稀释至刻度，摇匀，既得。
氧化破坏空白溶液：加入2.5ml 30％过氧化氢溶液于5ml量瓶中。室温静置4h，纯化水稀释至刻度，摇匀，既得。
氧化破坏供试品溶液：精密称定供试品约50mg置于5ml量瓶中，加入2.5ml 30％过氧化氢溶液。室温静置4h，纯化水稀释至刻度，摇匀，既得。
光照破坏供试品溶液：精密称定供试品约50mg置于5ml量瓶中，置于光照条件15天，加纯化水使溶解并稀释至刻度，摇匀，既得。
取上述溶液各进样5ul，记录色谱图。
各破坏溶液主峰纯度角小于纯度阈值；破坏溶液物料守恒在95％～105％之间；各溶液不干扰有关物质的测定。
物料守恒(％)＝(破坏后样品主峰峰面积+破坏后样品杂质峰峰面积)/破坏前主峰峰面积*100％。
表3专属性试验结果
Figure BDA0003089015950000051
结果显示，稀释剂、供试品、各破坏溶液对有关物质的测定不产生干扰，专属性符合规定。
实施例3溶液的稳定性
色谱条件：同实施例1方案1。
溶液的配制：
供试品溶液：按实施例1中100％浓度水平供试品溶液的相同方法配制；
对照溶液：精密移取供试品溶液1ml，置100ml量瓶，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，再精密移取1ml，置10ml量瓶，用稀释剂作为稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得。
分别在0小时、12小时、24小时、48h精密量取供试品溶液、对照溶液各10μl进行试验，记录不同时间点的色谱图。结果见表4。
表4溶液稳定性结果
Figure BDA0003089015950000061
结果显示，供试品溶液、对照溶液均在48h内稳定。
实施例4标准曲线的制作
色谱条件：同实施例1方案1。
溶液的配制：
L-丙氨酸异丙酯盐酸盐线性储备液：称取L-丙氨酸异丙酯盐酸盐20mg，精密称定，置20ml量瓶中，加适量稀释剂使溶解，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得。
L-丙氨酸甲酯盐酸盐线性储备液：精密称取L-丙氨酸甲酯盐酸盐对照品约20mg，置20ml量瓶中，加稀释剂使溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。
L-丙氨酸乙酯盐酸盐线性储备液：精密称取L-丙氨酸乙酯盐酸盐对照品约20mg，置20ml量瓶中，加稀释剂使溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。
混合储备液：精密量取L-丙氨酸异丙酯盐酸盐线性储备液、L-丙氨酸甲酯盐酸盐线性储备液、L-丙氨酸乙酯盐酸盐线性储备液各2ml，置于20ml量瓶中，稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得。
标准曲线溶液：用流动相对混合储备液进行稀释，制备得到不同浓度的L-丙氨酸异丙酯盐酸盐、L-丙氨酸甲酯盐酸盐、L-丙氨酸乙酯盐酸盐溶液，见表5：
表5标准曲线溶液的配制
Figure BDA0003089015950000062
Figure BDA0003089015950000071
结果显示，L-丙氨酸异丙酯盐酸盐在5.2μg/ml～15.6μg/ml范围内，线性方程为y＝1036.5x-292.69，线性相关系数(r)为1.000，峰面积与浓度线性关系良好；L-丙氨酸甲酯盐酸盐在5.0μg/ml～14.9μg/ml范围内，线性方程为y＝1219.5x-555.66，线性相关系数(r)为0.999，峰面积与浓度线性关系良好；L-丙氨酸乙酯盐酸盐在4.9μg/ml～14.6μg/ml范围内，线性方程为y＝1059.1x+222.26，线性相关系数(r)为0.999，峰面积与浓度线性关系良好。标准曲线分别见图4、图5和图6。
L-丙氨酸甲酯盐酸盐校正因子1036.5÷1219.5＝0.85。
L-丙氨酸乙酯盐酸盐校正因子1036.5÷1059.1＝0.98。
当信噪比为10：1时，测得L-丙氨酸异丙酯盐酸盐有关物质的定量限为0.5μg/ml。
但信噪比为3：1时，测得L-丙氨酸异丙酯盐酸盐有关物质的定量限为0.2μg/ml。
结果表明，在方案1的色谱条件下，线性良好，定量限完全能满足准确测定L-丙氨酸异丙酯盐酸盐有关物质的要求。
实施例5回收率试验
色谱条件：同实施例1方案1。
溶液配制：
L-丙氨酸甲酯盐酸盐储备液：精密称取L-丙氨酸甲酯盐酸盐对照品约20mg，置20ml量瓶中，加稀释剂使溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。
L-丙氨酸乙酯盐酸盐储备液：精密称取L-丙氨酸乙酯盐酸盐对照品约20mg，置20ml量瓶中，加稀释剂使溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。
杂质混合储备液：精密量取L-丙氨酸甲酯盐酸盐对照品储备液、L-丙氨酸乙酯盐酸盐对照品储备液各1ml，置于20ml量瓶中，稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得。
空白供试品溶液：称取本品约50mg，精密称定，置5ml量瓶中，加适量稀释剂使溶解并稀释至刻度，摇匀，即得(平行配制3份)。
空白供试品对照溶液：取空白供试品溶液1ml，置100ml量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀；再精密量取1ml，置10ml量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得。
LOQ浓度水平供试品溶液：取本品约50mg，精密称定，置5ml量瓶中，加适量稀释剂使溶解，加入0.5ml杂质储备液，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得(平行配制3份)。
LOQ浓度水平供试品溶液对照溶液：取LOQ浓度水平供试品溶液1ml，置100ml量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀；再精密量取1ml，置10ml量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得。
100％浓度水平供试品溶液：取本品约50mg，精密称定，置5ml量瓶中，加适量稀释剂使溶解，加入1ml杂质储备液，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得(平行配制3份)。
100％浓度水平供试品溶液对照溶液：取100％浓度水平供试品溶液1ml，置100ml量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀；再精密量取1ml，置10ml量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得。
150％浓度水平供试品溶液：取本品约50mg，精密称定，置5ml量瓶中，加适量稀释剂使溶解，加入1.5ml杂质储备液，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得(平行配制3份)。
150％浓度水平供试品溶液对照溶液：取150％浓度水平供试品溶液1ml，置100ml量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀；再精密量取1ml，置10ml量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得。
分别精密量取上述空白供试品、定量限浓度水平供试品、100％浓度水平供试品和150％浓度水平供试品溶液共12份，以及空白供试品对照、定量限浓度水平供试品对照、100％浓度水平供试品对照和150％浓度水平供试品对照溶液共12份，各5μl，注入高效液相色谱仪中，记录色谱图，按加校正因子的主成分自身对照法以峰面积计算回收率。回收率在98.5％～114.6％之间。100％浓度水平对照溶液色谱图见图3。结果见表6-7。
表6L-丙氨酸甲酯盐酸盐加样回收率测定结果
Figure BDA0003089015950000081
表7L-丙氨酸乙酯盐酸盐加样回收率测定结果
Figure BDA0003089015950000082
Figure BDA0003089015950000091
结果显示，L-丙氨酸甲酯的平均回收率为90.0％；RSD为1.4％；L-丙氨酸乙酯的平均回收率为107.4％，RSD为3.8％；表明该方法回收率好，准确度高。
实施例6重复性试验
色谱条件：同实施例1方案1。
溶液配制：
供试品溶液：同实施例1中100％浓度水平供试品溶液的相同方法配制；
对照溶液：同实施例2中对照溶液的相同方法配制。
取供试品溶液及对照溶液按照本发明的色谱条件进样，记录色谱图。按加校正因子的主成分自身对照法计算L-丙氨酸异丙酯盐酸盐异构体的含量。结果见表8。
表8加样重复性回收率检测结果
测定次数 1 2 3 4 5 6 RSD(％)
L-丙氨酸甲酯含量(％) 98.8 103.3 100.3 100.1 101.4 103.1 1.8
L-丙氨酸乙酯酯含量(％) 108.4 106.1 105.9 105.7 109.6 106.3 1.6
结果表示，重复性试验RSD为1.8％和1.6％，该方法的重复性好。
实施例7样品的测定
色谱条件：同实施例1中方案1中所述的色谱条件。
溶液的配制：
供试品溶液：取本品约50mg，置5ml量瓶中，加稀释剂适量使溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。
对照溶液：精密量取供试品溶液1ml，置100ml量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀；再精密量取1ml，置10ml量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得。
取供试品溶液及对照溶液按照色谱条件进样，记录色谱图。按加校正因子的主成分自身对照法计算L-丙氨酸异丙酯盐酸盐有关物质(供试品溶液中如有与L-丙氨酸甲酯(相对保留时间约为0.65)、L-丙氨酸乙酯(相对保留时间约为0.77)相对保留时间一致的峰，其峰面积均不得大于对照溶液主峰面积(0.1％)，其他单个杂质峰面积均不得大于对照溶液主峰面积的5倍(0.5％)，各杂质峰面积的和不得大于对照溶液主峰面积的10倍(1.0％))。结果见表9。
表9L-丙氨酸异丙酯盐酸盐有关物质的测定结果
Figure BDA0003089015950000092
Figure BDA0003089015950000101
结果表明，本方法的专属性强、灵敏度高、精密度好，能准确快速地测定L-丙氨酸异丙酯盐酸盐有关物质的含量。

Claims (10)

1.一种采用高效液相色谱法测定L-丙氨酸异丙酯盐酸盐有关物质的方法，其特征在于:采用高效液相色谱法测定L-丙氨酸异丙酯盐酸盐，采用十八烷基键合硅胶为填充剂的色谱柱；有关物质包括杂质L-丙氨酸甲酯盐酸盐、L-丙氨酸乙酯盐酸盐；以庚烷磺酸钠为离子对试剂。
2.根据权利要求1所述的一种采用高效液相色谱法测定L-丙氨酸异丙酯盐酸盐有关物质的方法，其特征在于：以十八烷基键合硅胶为填充剂的色谱柱；以缓冲盐溶液-乙腈为流动相。
3.根据权利要求2所述的一种采用高效液相色谱法测定L-丙氨酸异丙酯盐酸盐有关物质的方法，其特征在于：所述流动相中缓冲盐溶液的溶质为磷酸二氢钾和庚烷磺酸钠，溶剂为纯化水。
4.根据权利要求3所述的一种采用高效液相色谱法测定L-丙氨酸异丙酯盐酸盐有关物质的方法，其特征在于：缓冲盐溶液中，磷酸二氢钾浓度为10mmol/L，庚烷磺酸钠浓度为20mmol/L。
5.根据权利要求3所述的一种采用高效液相色谱法测定L-丙氨酸异丙酯盐酸盐有关物质的方法，其特征在于：缓冲盐溶液中，pH＝4.0。
6.根据权利要求2所述的一种采用高效液相色谱法测定L-丙氨酸异丙酯盐酸盐有关物质的方法，其特征在于：缓冲盐溶液与乙腈的体积比为70：30～80：20。
7.根据权利要求1所述的一种采用高效液相色谱法测定L-丙氨酸异丙酯盐酸盐有关物质的方法，其特征在于：检测波长为205±2nm。
8.根据权利要求1所述的一种采用高效液相色谱法测定L-丙氨酸异丙酯盐酸盐有关物质的方法，其特征在于：流速为0.9mL/min～1.1mL/min。
9.根据权利要求1所述的一种采用高效液相色谱法测定L-丙氨酸异丙酯盐酸盐有关物质的方法，其特征在于：进样量为5μL～20μL。
10.根据权利要求1所述的一种采用高效液相色谱法测定L-丙氨酸异丙酯盐酸盐有关物质的方法，其特征在于：柱温为25℃～35℃。
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