CN111208215A - 头孢曲松钠中杂质2-巯基苯并噻唑的检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及利用高效液相色谱检测头孢曲松钠中杂质2‑巯基苯并噻唑的方法。所述检测方法包括采用以下色谱条件：流动相A：pH6.05～6.45的磷酸盐缓冲溶液与甲醇的混合溶液；流动相B：乙腈水溶液；其中，采用流动相A和流动相B进行梯度洗脱。本发明的方法的检测专属性好、线性拟合较好、检测限低、灵敏度高、定量限重复性好、耐用性好。

Description

头孢曲松钠中杂质2-巯基苯并噻唑的检测方法

技术领域

本发明涉及2-巯基苯并噻唑的检测方法，特别是涉及利用高效液相色谱检测头孢曲松钠中杂质2-巯基苯并噻唑的方法。

背景技术

2-巯基苯并噻唑是一种常见的通用型硫化促进剂，广泛用于橡胶工业，目前，世界卫生组织国际癌症研究机构公布初步整理的致癌物清单中，2-巯基苯并噻唑属于2A类致癌物。其结构式为：

头孢曲松钠是瑞士Roche公司开发的第三代具有广谱抗菌活性的头孢菌素，用于敏感致病菌所致的各类感染型病症。2-巯基苯并噻唑是头孢曲松钠原料制备过程中可能产生的副产物杂质(见下表杂质G)。

表头孢曲松钠原料可能产生的杂质

然而，如上表所示，在各国药典中均未收录杂质2-巯基苯并噻唑，也未见头孢曲松钠制备过程中2-巯基苯并噻唑相关检测的报道。欧洲药典和英国药典仅提及了头孢曲松钠的杂质A～E，美国药典仅控制了头孢曲松钠的杂质A～F和H。

杨伟峰等(“假药中添加2-巯基苯并噻唑的鉴定”，《药物鉴定》，2010年，第19卷，第13期)研究了采用了用液相色谱-串联四极杆质谱联用来鉴定假药中添加的2-巯基苯并噻唑，然而，该文献记载的检测方法过于复杂，且该检测的方法仅适合定性地鉴定假药中是否含有2-巯基苯并噻唑，因此也不适用于头孢曲松钠制备过程中2-巯基苯并噻唑的检测。

因此有必要开发一种针对头孢曲松钠中的2-巯基苯并噻唑的简单方便的检测方法。

发明内容

有鉴于此，本发明的主要目的在于提供一种在头孢曲松钠制备过程中利用高效液相色谱法检测包括2-巯基苯并噻唑的有关物质的方法。

为达到上述目的，本发明的技术方案是这样实现的：

本发明提供了一种头孢曲松钠中杂质2-巯基苯并噻唑的检测方法，其中，采用如下色谱条件：

流动相A：pH6.05～6.45的磷酸盐缓冲溶液与甲醇的混合溶液；

流动相B：乙腈水溶液；

其中，采用流动相A和流动相B进行梯度洗脱。

根据一种实施方式，本方法使用选自：ODS柱、C18柱中的一种色谱柱，优选使用Inertsil ODS-3，4.6mm×250mm,5μm。

根据一种实施方式，其中流动相A中的磷酸盐为Na₂HPO₄或K₂HPO₄。

根据一种实施方式，其中流动相A为摩尔浓度为0.015mol/L～0.025mol/L、pH为6.05～6.45的Na₂HPO₄缓冲溶液与甲醇以88～84:12～16的体积比混合的溶液；流动相B的乙腈浓度为70vol％～90vol％。

根据一种实施方式，其中柱温为25～35℃，优选30℃。

根据一种实施方式，其中流速为0.9～1.2ml/min，优选1ml/min。

根据一种实施方式，其中洗脱梯度为：

时间(分钟)	流动相A(％)	流动相B(％)
			0	90～100	0～10
5	70～90	10～30
			25	0～10	90～100
28	0～10	90～100
			30	90～100	0～10
35	90～100	0～10

，

优选地，所述洗脱梯度为：

时间(分钟)	流动相A(％)	流动相B(％)
			0	100	0
5	80	20
			25	0	100
28	0	100
			30	100	0
35	100	0

。

根据一种实施方式，其中，检测波长约为235nm或315nm，所述pH约为6.25。

本发明具有以下有益效果：

(1)本发明的方法能使2-巯基苯并噻唑的检测不受头孢曲松钠及其他有关物质干扰，其检测专属性好；

(2)本发明的方法中2-巯基苯并噻唑液相色谱峰面积与其浓度的回归方程为线性相关，且其线性拟合较好，因此使用方便；

(3)本发明的方法中2-巯基苯并噻唑液相色谱的检测限低，灵敏度高。

(4)本发明的方法中对2-巯基苯并噻唑的定量限重复性好，RSD(n＝6)为1.86％，能获得准确的定量结果；

(5)本发明耐用性好，在柱温、检测波长、流速发生细微改变时，测定出2-巯基苯并噻唑的回收率与基本条件下测定结果相差很小。

附图说明

图1为空白溶液的液相色谱检测结果图。

图2为供试品溶液的液相色谱检测结果图。

图3为杂质混合对照品溶液的液相色谱检测结果图。

图4为杂质D单标溶液的液相色谱检测结果图。

图5为杂质G对照品溶液的液相色谱检测结果图。

具体实施方式

实施例1

S1.溶液的制备：

1.制备空白溶液：50％乙腈水；

2.制备供试品溶液：称取头孢曲松钠供试品(齐鲁安替制药有限公司，下同)约0.7g置10ml量瓶，加50％乙腈水溶解稀释至刻度，混匀即得；

3.制备杂质G对照品溶液：(1)首先制备杂质G对照品贮备液：精密称取杂质G对照品约1mg，置25ml量瓶中，加50％乙腈稀释至刻度，摇匀，作为杂质G对照品贮备液；(2)再制备杂质G对照品溶液：精密量取(1)杂质G对照品贮备液0.9ml，置100ml量瓶中，用50％乙腈水稀释至刻度，摇匀，作为杂质G对照品溶液；平行配制2份。

S2.色谱条件：

色谱柱：Inertsil ODS-3 4.6mm×250mm,5μm

流动相A：7.1g/L Na₂HPO₄·12H₂O(磷酸调pH至6.25):MeOH＝86:14

流动相B：80％乙腈水

按下表进行梯度洗脱：

时间(分钟)	流动相A(％)	流动相B(％)
			0	100	0
5	80	20
			25	0	100
28	0	100
			30	100	0
35	100	0

检测波长为315nm，流速为1.0ml/min，柱温：30℃，进样量10μl。

S3.色谱检测：

分别取S1步骤中的供试品溶液和杂质G对照品溶液，按S2中的色谱条件进行检测。

实施例2检测方法的专属性实验

S1.溶液的制备：

1.制备空白溶液：50％乙腈水；

2.制备供试品溶液：称取头孢曲松钠供试品约0.7g置10ml量瓶，加50％乙腈水溶解稀释至刻度，混匀即得；

3.制备杂质混合对照品溶液：(1)首先杂质混合对照品贮备液：称取杂质A、C各约1.2mg置10ml量瓶，称取杂质B、E、F、H各约1.2mg置50ml量瓶，分别加50％乙腈水溶解，稀释至刻度，混匀得杂质混合对照品贮备液；(2)再制备杂质混合对照品溶液：精密量取(1)杂质混合对照品贮备液1ml置10ml量瓶，加50％乙腈水稀释至刻度，混匀即得；

4.制备杂质D单标溶液：称取杂质D对照品约1mg置20ml量瓶，加少量乙腈溶解，50％乙腈水稀释定容至刻度(高浓度)，取高浓度杂质D单标溶液0.1ml置5ml量瓶，加50％乙腈水稀释定容，即得；

5.制备杂质G对照品溶液：(1)首先制备杂质G对照品贮备液：称取杂质G对照品约1mg置50ml量瓶，加50％乙腈水溶解稀释至刻度，混匀得杂质G原液，取杂质G原液2ml置20ml量瓶，加50％乙腈水稀释至刻度，混匀得杂质G对照品贮备液；(2)再制备杂质G对照品溶液：精密量取(1)杂质G对照品贮备液0.88ml置5ml量瓶，加50％乙腈水稀释至刻度，混匀即得。

S2.色谱条件：

同实施例1。

S3.色谱检测：

分别取S1步骤中的空白溶液、供试品溶液、杂质混合对照品溶液、杂质D单标溶液和杂质G对照品溶液，按S2中的色谱条件进行检测，记录色谱图。

结果

空白溶液、供试品溶液、杂质混合对照品溶液、杂质D单标溶液和杂质G对照品溶液的检测结果如附图1至附图5所示。空白溶剂、供试品溶液及各已知杂质(A、B、C、D、E、F、H)在杂质G出峰位置均不存在干扰，方法专属性良好。

实施例3检测方法的线性方法学实验

S1.溶液的制备：

精密称取杂质G对照品约1mg置5ml量瓶，加50％乙腈水溶解稀释定容后作为杂质G线性贮备液L₀，并逐级稀释至不同浓度，作为系列线性溶液。

线性溶液配制过程见下表1

S2.色谱条件：

同实施例1

S3.色谱检测：

分别取S1步骤中的L₁～L₉，按S2中色谱条件的进行检测。记录色谱图。

结果

以浓度为横坐标(X)，峰面积为纵坐标(Y)，进行线性回归分析。计算回归线的相关系数的平方(R²)。结果如下表2。

表2

结果表明，杂质G线性相关系数R＞0.999，线性关系良好，杂质线性范围为定量限至限度浓度的30067.71％左右，满足检测需要。

实施例4定量限和检测限重复性实验

实施例4A定量限重复性实验

S1:定量限的确定

取实施例3中线性方法学实验项下各级线性溶液L₁～L₉ 20μl注入液相色谱仪，记录色谱图，按信噪比S/N≈10/1确定定量限；杂质G定量限溶液为线性溶液L₈。

S2.溶液的制备：

取其中定量限溶液L₈平行配制六份1#、2#、3#、4#、5#、6#。

S3.色谱条件：

同实施例1

S4.色谱检测：

分别将S2步骤中的6份L₈溶液1#、2#、3#、4#、5#和6#，按S3中的色谱条件进行检测。记录色谱图。测定峰面积并计算峰面积的RSD。

结果

表3定量限重复试验结果

杂质G定量限溶液峰面积RSD(n＝6)小于5％，因此表3说明，本方法的定量限重复性好，满足杂质G的测定。

实施例4B检测限重复性实验

S1:检测限的确定

取实施例3中线性方法学实验项下各级线性溶液L₁～L₉ 20μl注入液相色谱仪，记录色谱图，按信噪比S/N≈3/1确定检测限；杂质G检测限溶液为线性溶液L₉。

S2.溶液的制备：

取其中定量限溶液L₉平行配制三份1#、2#、3#。

S3.色谱条件：

同实施例1

S4.色谱检测：

分别将S2步骤中的三份L₉溶液1#、2#和3#，按S3中的色谱条件进行检测。记录色谱图。测定峰面积并计算峰面积的RSD。

结果

表4检测限重复试验结果

检测限溶液峰面积RSD(n＝3)小于5％，因此表4说明，本方法的检测限重复性好，满足杂质G的测定。

实施例5准确度实验

因头孢曲松钠原料药中控制杂质G限度为5ppm，准确度试验拟考察杂质G在2.5ppm～10ppm范围内回收率情况。

S1.溶液的制备：

1.样品空白：称取头孢曲松钠原料药约0.35g置5ml量瓶，加50％乙腈水溶解稀释至刻度，混匀后进样分析(用于确定样品溶液中杂质G的已知量)

2.制备杂质G对照品溶液：(1)首先制备杂质G对照品贮备液：精密称取杂质G对照品约1mg，置50ml量瓶中，加50％乙腈稀释至刻度，摇匀，作为杂质G对照品原液；取杂质G对照品原液2ml至20ml量瓶，加50％乙腈稀释至刻度，摇匀，作为杂质G对照品贮备液；(2)再制备杂质G对照品溶液：精密量取(1)杂质G对照品贮备液0.88ml，置5ml量瓶中，用50％乙腈水稀释至刻度，摇匀，作为杂质G对照品溶液；平行配制2份。

3.50％回收溶液(杂质G浓度约为0.18μg/ml)：称取头孢曲松钠原料约0.35g置5ml量瓶，加入杂质G对照品贮备液0.44ml，50％乙腈水溶解定容，平行配制3份，编号为1#、2#和3#；

4.100％回收溶液(杂质G浓度约为0.35μg/ml)：称取头孢曲松钠原料约0.35g置5ml量瓶，加入杂质G对照品贮备液0.88ml，50％乙腈水溶解定容，平行配制3份，编号为4#、5#和6#；

5.200％回收溶液(杂质G浓度约为0.7μg/ml)：称取头孢曲松钠原料约0.35g置5ml量瓶，加入杂质G对照品贮备液1.76ml，50％乙腈水溶解定容，平行配制3份，编号为7#、8#和9#；

S2.色谱条件：

同实施例1

S3.色谱检测：

分别将S1步骤中的9份溶液1#～9#溶液，按S2中的色谱条件进行检测。记录色谱图。按下式计算回收率，并计算RSD。

结果见表5

表5杂质G方法准确度结果

通过在头孢曲松钠原料中加入限度50％～200％的杂质G，杂质G单个回收率均在90％～105％之间，平均回收率高达98.44％，(RSD＜5％，n＝9)，方法的准确度良好。

实施例6精密度实验

实施例6A重复性实验

S1.溶液的制备：

制备供试品溶液：按照实施例5中的S1步骤中100％回收溶液的配制方法再重新配制3份，编号为1#、2#和3#；与实施例5中S1步骤中剩下的3份100％回收溶液，编号为4#、5#和6#；

制备杂质G对照品溶液：同实施例5中的S1步骤中杂质G对照品相同。

S2.色谱条件：

同实施例1。

S3.色谱检测：

由操作者A分别将S1步骤中的6份溶液1#～6#溶液，按S2中的色谱条件进行检测。记录色谱图。按外标法计算杂质G的含量，并计算RSD％，结果见表6。

表6杂质G重复性试验结果(操作者A)

结果：6份杂质G浓度(100％限度)相同的供试品溶液检出的杂质类别、杂质含量及杂质个数均一致，杂质G测得含量的RSD不大于5.0％，方法的重复性良好。

实施例6B中间精密度实验

由操作人员B按实施例6A重复性实验下的方法平行配制供试品溶液6份，编号为1#、2#、3#、4#、5#和6#，并制备杂质G对照品溶液2份。分别于不同时间在不同仪器上使用不同色谱柱测定6份样品中有关物质，按外标法计算杂质G的含量，并计算RSD％，(中间精密度，n＝6；精密度，n＝12)结果见表7。

表7杂质G中间精密度试验结果(操作者B)

结果：不同人员、不同日期，分别使用不同的仪器测试，测得6份供试品溶液的杂质个数，类别，杂质含量均一致，杂质G含量RSD小于5％，符合规定，中间精密度良好。

实施例7溶液的稳定性实验

S1.溶液的制备：

1.供试品溶液：称取头孢曲松钠原料约0.35g置5ml量瓶，加50％乙腈水溶解稀释定容，于室温放置；

2.杂质G对照品溶液：使用实施例3中制备的线性溶液L6。

S2.色谱条件：

同实施例1

S3.色谱检测：

a.分别取S1步骤中杂质G对照品溶液，按S2中色谱条件，在0h、3h、7h、12h、18h、23h、27.5时进行检测。记录色谱图。计算杂质G峰面积变化值和RSD％。结果见表8。

表8杂质G对照品溶液稳定性结果

结论：杂质G峰面积变化值＜5％，RSD％＜2％，因此杂质G对照品溶液室温27.5h内稳定，满足测定要求。

b.取S1步骤中供试品溶液室温放置29h。

结果与结论：在杂质G出峰位置未降解出干扰杂质，故供试品溶液室温29h内稳定，满足测定要求。

实施例8耐用性实验

S1.溶液的制备：同实施例6A重复性实验中的制备供试品溶液和杂质G对照品溶液。

S2.色谱条件：

标准条件：同实施例1：

在标准条件下改变单一变量进行实验，即分别对柱温、流速、pH、甲醇比例进行考察。

结果

精密量取各溶液，考察杂质G的含量，具体结果见下表9。

表9耐用性实验结果

结论：表10表明，在柱温、流速、pH、甲醇比例发生细微改变时，测得杂质G的浓度与标准条件下相差很小，说明该方法耐用性良好。

以上所述，仅为本发明的较佳实施例而已，并非用于限定本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种头孢曲松钠中杂质2-巯基苯并噻唑的检测方法，其中，采用如下色谱条件：

流动相A：pH6.05～6.45的磷酸盐缓冲溶液与甲醇的混合溶液；

流动相B：乙腈水溶液；

其中，采用流动相A和流动相B进行梯度洗脱。

2.根据权利要求1所述的方法，其中使用选自：ODS柱、C18柱中的一种色谱柱，优选使用Inertsil ODS-3，4.6mm×250mm,5μm。

3.根据权利要求1至2任一项所述的方法，其中，所述流动相A中的磷酸盐为Na₂HPO₄或K₂HPO₄。

4.根据权利要求3所述的方法，其中，所述流动相A为摩尔浓度为0.015mol/L～0.025mol/L、pH为6.05～6.45的Na₂HPO₄缓冲溶液与甲醇以88～84:12～16的体积比混合的溶液。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中，所述流动相B的乙腈浓度为70vol％～90vol％。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中，所述柱温为25～35℃，优选30℃。

7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中，所述流速为0.9～1.2ml/min，优选1ml/min。

8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中，所述洗脱梯度为：

时间(分钟) 流动相A(％) 流动相B(％) 0 90～100 0～10 5 70～90 10～30 25 0～10 90～100 28 0～10 90～100 30 90～100 0～10 35 90～100 0～10

，

优选地，所述洗脱梯度为：

时间(分钟) 流动相A(％) 流动相B(％) 0 100 0 5 80 20 25 0 100 28 0 100 30 100 0 35 100 0

。

9.根据权利要求8所述的方法，其中，所述检测波长约为235nm或315nm，所述pH约为6.25。

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