CN108572223B - 一种测定多肽中活性诱导物质的方法 - Google Patents

一种测定多肽中活性诱导物质的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种测定多肽中活性诱导物质的方法，具体涉及多肽药物检测技术领域，包括如下步骤：S1、取IPTG对照品，以50％乙腈水溶液为溶剂，配制IPTG对照品溶液，取多肽制剂，用50％乙腈水溶液溶解，得供试品溶液；S2、平行配制两份IPTG对照品溶液，经UPLC‑MS法检测，分别获得对照品溶液中IPTG的峰面积，计算峰面积与对照品溶液的浓度的比值，得IPTG的响应因子；S3、取供试品溶液经UPLC‑MS法检测，获得供试品溶液的峰面积，用响应因子计算供试品溶液中IPTG的含量。本发明具有检测时间短，准确度好，精密度高，重复性好的优点。

Description

一种测定多肽中活性诱导物质的方法
技术领域
本发明属于多肽药物检测技术领域，具体涉及一种测定多肽中活性诱导物质的方法。
背景技术
异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)是β-半乳糖苷酶的活性诱导物质，诱导效率高，同时不被菌体代谢，诱导效果稳定，而被实验室广泛应用，但因为IPTG对细胞存在毒性，使得含质粒细菌丢失质粒，因此需要控制其在药物的含量，但目前并无质量标准收录IPTG的含量测定方法。
因此，急需一种检测时间短，准确度好，精密度高，重复性好的测定多肽中活性诱导物质的方法。
发明内容
为了解决现有异丙基硫代半乳糖苷含量测定无质量标准可查的问题，本发明的目的是提供一种测定多肽中活性诱导物质的方法，具有检测时间短，准确度好，精密度高，重复性好的优点。
本发明提供了如下的技术方案：
一种测定多肽中活性诱导物质的方法，包括如下步骤：
S1、取IPTG对照品，以50％乙腈水溶液为溶剂，配制IPTG对照品溶液，取多肽制剂，用50％乙腈水溶液溶解，得供试品溶液；
S2、平行配制两份IPTG对照品溶液，经UPLC-MS法检测，分别获得对照品溶液中IPTG的峰面积，计算峰面积与对照品溶液的浓度的比值，得IPTG的响应因子；
S3、取供试品溶液经UPLC-MS法检测，获得供试品溶液的峰面积，用响应因子计算供试品溶液中IPTG的含量。
优选的，所述S2步骤和所述S3步骤中UPLC-MS法的色谱条件为：采用HILIC色谱柱，柱温为35℃，选择正离子模式，定量离子为261，以甲酸-乙腈为流动相A，甲酸-水为流动相B，流动相流速为1mL/min；梯度洗脱程序为：0～2min，流动相B的体积百分数为3％；2～3min，流动相B的体积百分数由3％至15％；3～5min，流动相B的体积百分数为15％；5～5.1min，流动相B的体积百分数由15％至3％；5.1～7min，流动相B的体积百分数为3％。
梯度洗脱程序
T(min) 0.1％HCOOH in H<sub>2</sub>O 0.1％HCOOH in ACN
0 3 97
2 3 97
3 15 85
5 15 85
5.1 3 97
7 3 97
本发明的有益效果是：
1、本发明采用UPLC-MS方法测定IPTG含量，由于化合物IPTG紫外响应极弱，并且不适合用气相色谱，因此选择液相色谱，同时采用MS检测器，可准确定位IPTG。
2、IPTG极性大，用液相普通色谱柱不能使得IPTG与其他物质有效分离，本发明采用两性离子色谱柱，可实现IPTG与其他物质基线分离。
3、采用质谱检测器，灵敏度高，可以检测样品中ppm级的IPTG。
4、采用UPLC-MS法，色谱方法时间短，不仅节省了检测时间而且大大减少了有机溶剂的使用，提高效率的同时减少了对环境的危害。
5、在本发明提供的UPLC-MS条件下，通过外标一点法测定供试品溶液中的IPTG含量，操作简单，并进行了系列的方法学验证，试验结果表明本发明的检测方法专属性强、准确度好、精密度高、重复性好，符合药物的质量标准研究的技术要求。
附图说明
附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：
图1是实施例1对照品溶液和供试品溶液色谱图；
图2是实施例2线性范围考察的IPTG标准曲线图；
图3是实施例5专属性试验的专属性图谱。
具体实施方式
实施例1
一种测定多肽中活性诱导物质的方法，包括如下步骤：
S1、取IPTG对照品适量，加50％乙腈溶解并制成每1mL含IPTG 0.1μg的溶液，作为对照品溶液，取多肽制剂适量，加50％乙腈溶解并制成每1mL含多肽制剂1mg的溶液，作为供试品溶液；
S2、平行配制两份IPTG对照品溶液，经UPLC-MS法检测，分别获得对照品溶液中IPTG的峰面积，计算峰面积与对照品溶液的浓度的比值，得IPTG的响应因子；
S3、取供试品溶液经UPLC-MS法检测，获得供试品溶液的峰面积，用响应因子计算供试品溶液中IPTG的含量。
具体的，S2步骤和S3步骤中UPLC-MS法的色谱条件为：采用HILIC色谱柱，柱温为35℃，以甲酸-乙腈为流动相A，甲酸-水为流动相B，流动相流速为1mL/min；梯度洗脱，流速为每分钟0.3mL；进样量为2μL；检测器为质谱，离子源为ESI，正离子模式，定量离子为261；梯度洗脱程序为：0～2min，流动相B的体积百分数为3％；2～3min，流动相B的体积百分数由3％至15％；3～5min，流动相B的体积百分数为15％；5～5.1min，流动相B的体积百分数由15％至3％；5.1～7min，流动相B的体积百分数为3％。
梯度洗脱程序的试验数据如表1所示。
表1梯度洗脱程序
T(min) 0.1％HCOOH in H<sub>2</sub>O 0.1％HCOOH in ACN
0 3 97
2 3 97
3 15 85
5 15 85
5.1 3 97
7 3 97
采用实施例1中提供的梯度洗脱程序，分别对对照品溶液和供试品溶液进行UPLC-MS分析，所得色谱图如图1所示，图中标号1是对照品溶液，标号2是供试品溶液，显示IPTG的保留时间为1.465min。
实施例2
实施例1提供的测定方法的线性范围考察
取IPTG 10mg置于10mL容量瓶中，用50％乙腈溶解稀释至刻度，摇匀，作为对照品贮备液1；精密量取100μL对照品贮备液1置于10mL容量瓶中，用15％乙腈稀释至刻度线，摇匀，作为对照品贮备液2；精密量取1000μL对照品贮备液2置于10mL容量瓶中，用15％乙腈稀释至刻度线，摇匀，作为对照品贮备液3；分别移取0.1mL、0.2mL、0.5mL、0.8mL、1mL、1.5mL、2mL对照品贮备液3分别置于10mL容量瓶中，用15％乙腈稀释至刻度，摇匀，分别标记为L-10、L-20、L-50、L-80、L-100、L-150和L-200。
按实施例1提供的测定方法，依次进样测定，以峰面积为纵坐标，对照品溶液浓度为横坐标(μg/mL)绘制标准曲线，其结果见表2，绘制的IPTG标准曲线如图2所示。
表2 IPTG标准曲线
Figure BDA0001637081370000051
实施例3
实施例1提供的测定方法的加样回收试验
通过加样回收的方法，对实施1提供的测定方法的准确度进行分析，取多肽制剂2mg，精密称定，平行11份，取其中2份，测定样品中的IPTG含量；取其中3份，分别用L-50稀释，定容和混匀，作为50％加标回收率溶液；取其中3份，分别用L-100稀释，定容和混匀，作为100％加标回收率溶液；取其中3份，分别用L-150稀释，定容和混匀，作为150％加标回收率溶液。按实施例1的UPLC-MS法测定，结果见表3，结果显示，IPTG回收率为109～122％，9针的回收率RSD％为4，表明实施例1提供的测定方法具有良好的准确度。
表3 IPTG回收率
Figure BDA0001637081370000061
试验结果表明：IPTG的回收率均在80～120％范围内，且RSD小于20％，说明实施例1提供的测定方法准确度较好。
实施例4
实施例1提供的测定方法的精密度试验
通过100％加样回收的方法，对实施例1提供的测定方法的精密度进行分析，取多肽制剂2mg，精密称定，平行8份，取其中2份，测定样品中的IPTG含量；取其中6份，分别用L-100稀释，定容和混匀，作为100％加标回收率溶液，按实施例1的UPLC-MS法测定，结果见表4，结果显示，IPTG回收率为112～122％，6针回收率RSD％为4，表明实施例1提供的测定方法具有良好的准确度。
表4重复性结果
Figure BDA0001637081370000071
实施例5
实施例1提供的测定方法的专属性试验
取15％乙腈作为空白溶剂，实施例1中对照品溶液和供试品溶液，实施例3中100％回收率溶液各5μL，分别注入UPLC-MS，按本实施例1的UPLC-MS法测定，记录色谱图，结果见图3，图中标号1为实施例1中的对照品溶液，标号2位实施例1中的供试品溶液，标号3为100％样品加标溶液，标号4位空白溶剂，结果表明，空白溶剂和供试品溶液对IPTG的测定无干扰。
实施例6
实施例1提供的测定方法的稳定性试验。
取实施例1中的对照品溶液和实施例3中的100％回收率溶液，在室温下，考察24h内溶液稳定性，按实施例1的UPLC-MS法，分别进样，记录IPTG的峰面积，计算对照品溶液的check回收率和100％回收率溶液的加标回收率，结果见表5～6，结果表明24h内，对照品溶液的check回收率94～102％；100％回收率溶液的回收率101～125％，说明实施例1提供的测定方法具有良好的稳定性。
表5对照品溶液稳定性结果
Figure BDA0001637081370000072
表6 100％回收率溶液稳定性结果
Figure BDA0001637081370000081
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (1)

1.一种测定多肽中活性诱导物质的方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1、取IPTG对照品，以50％乙腈水溶液为溶剂，配制IPTG对照品溶液，取多肽制剂，用50％乙腈水溶液溶解，得供试品溶液；
S2、平行配制两份IPTG对照品溶液，经UPLC-MS法检测，分别获得对照品溶液中IPTG的峰面积，计算峰面积与对照品溶液的浓度的比值，得IPTG的响应因子；
S3、取供试品溶液经UPLC-MS法检测，获得供试品溶液的峰面积，用响应因子计算供试品溶液中IPTG的含量；
所述S2步骤和所述S3步骤中UPLC-MS法的色谱条件为：采用HILIC色谱柱，柱温为35℃，选择正离子模式，定量离子为261，以甲酸-乙腈为流动相A，甲酸-水为流动相B，流动相流速为1mL/min；梯度洗脱程序为：0～2min，流动相B的体积百分数为3％；2～3min，流动相B的体积百分数由3％至15％；3～5min，流动相B的体积百分数为15％；5～5.1min，流动相B的体积百分数由15％至3％；5.1～7min，流动相B的体积百分数为3％。
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