CN115128184B - 一种利用hplc外标法测定盐酸普拉克索原料中硫脲含量的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种利用HPLC外标法测定盐酸普拉克索原料中硫脲含量的方法，该方法以Waters X‑Bridge RP‑18色谱柱为分离色谱柱，以5%乙腈水溶液为流动相A，以0.1%三氟乙酸水溶液（三乙胺调节pH至5.0）‑乙腈（90：10）为流动相B，采用梯度洗脱方式，以硫脲为对照品按外标法以峰面积计算盐酸普拉克索原料中硫脲含量。本方法专属性好，硫脲与盐酸普拉克索及盐酸普拉克索的有关物质均可良好分离，经方法学验证可知，本方法可对盐酸普拉克索中的低含量硫脲进行定量和定性检测。
Description
技术领域
本发明属于分析检测技术领域，涉及盐酸普拉克索原料中基因毒性杂质硫脲的定量分析方法，具体涉及一种利用HPLC外标法测定盐酸普拉克索原料中硫脲含量的方法。
技术背景
基因毒性杂质是指能直接或间接损害DNA，导致基因突变或具有致癌倾向的物质。基因毒性杂质的特点是可与DNA反应，造成DNA损伤，在很低水平下即可诱发基因突变，并可能致癌，在用药过程中严重威胁到人类的健康。基因毒性杂质的来源主要为原料药合成过程中的起始物料、中间体、试剂和反应副产物，此外，药物在合成、储存或者制剂过程中也可能因降解而产生基因毒性杂质。
由于基因毒性杂质在很低的浓度下即可诱导基因突变并导致染色体的断裂和重排，因此具有潜在的致癌性，近年来对其关注也越来越重，欧盟、美国等药品监管机构也相继发布了关于基因毒和致癌性杂质的指导原则。我国加入ICH以后，药品研发技术要求势必与国际接轨，对于基因毒性杂质的评估要求也必然与ICH成员国要求统一甚至趋于更加严格。
硫脲是重要的化工中间体，在2017年10月27日世界卫生组织国际癌症研究机构公布的致癌物清单中，硫脲属于3类致癌物。盐酸普拉克索作为治疗帕金森病的特效药，在生产过程中由于相关试剂的使用，会产生痕量的硫脲。因此，对于盐酸普拉克索中的硫脲这一基因毒性杂质的质量控制对于保障药物安全非常重要，需要建立分析方法，实现该物质的准确和快速的定量分析。据文献报道，目前硫脲的检测方法主要有化学分析法、电化学法、光度法、离子色谱法等。目前我国尚无盐酸普拉克索原料中硫脲的标准检测方法。
发明内容
针对现有技术中存在的不足，本发明提供了一种利用HPLC外标法测定盐酸普拉克索原料中硫脲含量的方法，该方法基于高效液相色谱技术对盐酸普拉克索中的基因毒性杂质硫脲含量进行检测，具有分析速度快、灵敏度高、检测限低等优势。
本发明具体技术方案如下：
一种利用HPLC外标法测定盐酸普拉克索原料中硫脲含量的方法，该方法采用高效液相色谱仪对盐酸普拉克索原料进行检测，采用外标法进行定量分析，色谱条件如下：
色谱柱：Waters X-Bridge RP-18；
流动相A：水：乙腈体积比95:5的混合物；
流动相B：体积分数0.1％的三氟乙酸水溶液(用三乙胺调节pH至5.0)：乙腈体积比90:10的混合物；
流动相采用梯度洗脱，洗脱程序如下：
| 时间(min) | 流动相A(体积％) | 流动相B(体积％) |
| 0 | 100 | 0 |
| 3 | 100 | 0 |
| 4 | 0 | 100 |
| 15 | 0 | 100 |
| 16 | 100 | 0 |
| 22 | 100 | 0 |
进一步的，检测波长为240-250nm。
进一步的，色谱柱柱温为32-37℃。
进一步的，流动相流速为0.5-1.0mL/min，进样体积为15-20μL。
进一步的，Waters X-Bridge RP-18色谱柱的尺寸为150mm×3.0mm×3.5μm。
进一步的，检测时，取硫脲对照品适量，精密称定，用流动相A稀释制成不同浓度的硫脲对照品溶液，分别注入高效液相色谱检测，得到硫脲浓度和峰面积的标准曲线；然后，取待测的盐酸普拉克索原料样品适量，精密称定，用流动相A稀释配成供试品溶液，注入高效液相色谱检测，所得硫脲峰面积带入标准曲线，即得样品中硫脲含量。
进一步的，供试品溶液中盐酸普拉克索原料的浓度为1mg/ml。
进一步的，在实验的过程中，还包括单独对稀释剂即流动相A进行检测的步骤，以证明该流动相中是否有干扰硫脲的物质的存在。
进一步的，在实验的过程中，还包括单独对盐酸普拉克索对照品及盐酸普拉克索有关物质对照品进行检测的步骤，以证明盐酸普拉克索及盐酸普拉克索5种有关物质[N-(4-氧-环己基)-乙酰胺、N-(4-羟基-环己基)-乙酰胺、4-乙酰氨基酚、L-酒石酸和(S)-2,6-二氨基-4,5,6,7-四氢苯并噻唑]对硫脲的测试无干扰。经实验验证，本发明方法对上述有关物质均能良好的分离，互不干扰。
进一步的，在实验的过程中，还包括对盐酸普拉克索供试品进样检测的步骤，以证明供试品溶液中的其他物质对硫脲的测试无干扰。
进一步的，在实验的过程中，配制浓度为0.0053μg/mL的硫脲对照品溶液，进样体积20.0μL，使硫脲峰值的信噪比不小于10，测定该方法的灵敏度。
上述检测方法经验证具有以下优异性能：
本发明方法以Waters X-Bridge RP-18色谱柱为分离色谱柱，采用紫外光检测器，以体积分数5％的乙腈水溶液和体积比90:10的0.1体积％三氟乙酸水溶液(三乙胺调节pH至5.0)与乙腈的混合液作为流动相，采用梯度洗脱方式，以硫脲为对照品，用外标法绘制硫脲标准物质浓度-峰面积标准曲线，得出标准曲线的回归方程，通过该回归方程以盐酸普拉克索原料中硫脲峰面积计算得到硫脲含量。本发明具有以下有益效果：
1、目前我国尚无盐酸普拉克索原料中硫脲的标准检测方法，本发明首次建立了硫脲的高效液相色谱检测方法，实现了对盐酸普拉克索原料中硫脲的定量分析。
2、本发明检测方法准确度高，灵敏度高，检测限低，检测限为1.3ppm，定量限为5.3ppm，可以实现对盐酸普拉克索中的低含量硫脲进行定量和定性检测。
3、本发明检测方法硫脲与盐酸普拉克索及其有关物质N-(4-氧-环己基)-乙酰胺、N-(4-羟基-环己基)-乙酰胺、4-乙酰氨基酚、L-酒石酸、(S)-2,6-二氨基-4,5,6,7-四氢苯并噻唑都有良好的分离效果，互不干扰。
4、本发明检测方法所得的硫脲浓度线性范围为0.0053μg/mL～0.678μg/mL，线性方程的相关系数R2为1.000，可以实现较大浓度范围内对盐酸普拉克索原料中硫脲的定量检测，加标回收率都在100％附近，具有较好的检测准确度。
5、在不同时间点对同一硫脲对照品溶液进行检测，目标物峰面积的偏差均小于2.0％，表明配制的对照品溶液和检测方法都具有良好的溶液稳定性，受外界环境干扰较小。
6、该方法色谱条件的微小改变(色谱柱流量、柱温)，硫脲的分离度均符合要求，供试品溶液中硫脲检出差异不大，该法耐用性良好。
附图说明
图1为空白稀释剂的HPLC色谱图；
图2为N-(4-氧-环己基)-乙酰胺的HPLC色谱图；
图3为N-(4-羟基-环己基)-乙酰胺的HPLC色谱图；
图4为4-乙酰氨基酚的HPLC色谱图；
图5为L-酒石酸的HPLC色谱图；
图6为(S)-2,6-二氨基-4,5,6,7-四氢苯并噻唑的HPLC色谱图；
图7为盐酸普拉克索对照品的HPLC色谱图；
图8为硫脲对照品的HPLC色谱图；
图9为本发明检测方法的线性曲线。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本申请进行进一步解释和说明，本申请的示意性实施例及其说明用于解释本申请，并不构成对本申请的不当限定。
除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
如无特别说明，在下述实施例中所使用的单数形式也包括复数形式。
实施例1
本发明经过试验优化筛选得到的盐酸普拉克索中杂质硫脲的检测方法如下：
1、色谱条件
高效液相色谱仪：Agilent 1100；
色谱柱：Waters X-Bridge RP-18 150mm×3.0mm×3.5μm；
色谱柱固定相：C18
流动相：流动相A为水：乙腈(体积比)＝95:5，流动相B为0.1％三氟乙酸水溶液(用三乙胺调节pH至5.0)：乙腈(体积比)＝90:10；
色谱柱温度：35℃；
梯度洗脱程序：
| 时间(min) | 流动相A(体积％) | 流动相B(体积％) |
| 0 | 100 | 0 |
| 3 | 100 | 0 |
| 4 | 0 | 100 |
| 15 | 0 | 100 |
| 16 | 100 | 0 |
| 22 | 100 | 0 |
检测器波长：244nm；
流速：0.7mL/min；
进样体积：20.0μL。
2、试剂/样品
其中乙腈，色谱纯，购自Panreac；三氟乙酸，色谱纯，购自阿拉丁；三乙胺，纯度大于99.5％，购自润捷化学；水，纯水机自制纯水；
硫脲对照品，纯度99.69％，购自北京博德联康科学有限公司；N-(4-氧-环己基)-乙酰胺对照品，纯度99.5％，购自北京博德联康科学有限公司；N-(4-羟基-环己基)-乙酰胺对照品，纯度98.0％，购自萨恩化学技术(上海)有限公司；4-乙酰氨基酚对照品，纯度99.45％，购自心邀(深圳)生物科技有限公司；L-酒石酸对照品，纯度99.81％，购自北京博德联康科学有限公司；(S)-2,6-二氨基-4,5,6,7-四氢苯并噻唑对照品，纯度100％，购自中国食品药品检定研究院；盐酸普拉克索对照品，购自美国Hic-Chemcial公司；
盐酸普拉克索原料，购自印度Macleods Pharmaceticals Limited。
3、检测方法
(1)溶液的配制
稀释溶剂：流动相A
供试品溶液：取盐酸普拉克索原料适量，精密称定，加稀释溶剂溶解并稀释制成每1ml约含盐酸普拉克索1.0mg的溶液。
盐酸普拉克索定位溶液：取盐酸普拉克索对照品适量，精密称定，加稀释溶剂溶解并稀释制成每1ml约含盐酸普拉克索0.2mg的溶液。
硫脲对照品溶液：取硫脲对照品适量，精密称定，加稀释溶剂稀释制成每1ml约含硫脲0.33μg的溶液。
盐酸普拉克索有关物质定位溶液：分别取N-(4-氧-环己基)-乙酰胺、N-(4-羟基-环己基)-乙酰胺、4-乙酰氨基酚、L-酒石酸、(S)-2,6-二氨基-4,5,6,7-四氢苯并噻唑各适量，分别加稀释溶剂溶解制成每1ml约含上述有关物质各40μg的定位溶液。
(2)检测方法
将各所需样品按照上述色谱条件的进样量进行进样，然后用流动相进行洗脱。
(3)对上述检测方法的各项指标进行验证，如下：
(3.1)专属性
a)流动相A作为空白溶剂按上述色谱条件进行检测，所得色谱图如图1所示。
b)取盐酸普拉克索有关物质定位溶液，按照上述色谱条件分别进行检测，所得色谱图如图2-6所示。
c)取盐酸普拉克索定位溶液，按照上述色谱条件进行检测，所得色谱图如图7所示。
d)取硫脲对照品溶液，按照上述色谱条件进行检测，所得色谱图如图8所示，该色谱图作为供试品中硫脲测定的对照图谱。
通过图1-8的对比可以看出，空白溶剂无干扰，盐酸普拉克索有关物质和盐酸普拉克索保留时间均与硫脲的保留时间差异较大，因此这些物质的存在对硫脲的检测均无干扰。
(3.2)系统精密度
取硫脲对照品溶液，连续进样6针并记录色谱图，目标化合物硫脲的峰面积的RSD值如表1所示。
表1系统精密度结果
| 名称 | 硫脲(mAU*s) |
| 1 | 63.57 |
| 2 | 63.58 |
| 3 | 62.98 |
| 4 | 62.67 |
| 5 | 62.59 |
| 6 | 62.79 |
| 平均值 | 63.03 |
| RSD％ | 0.8 |
(3.3)检测限及定量限
精密量取硫脲对照品溶液适量，加稀释溶剂逐步稀释至信噪比(S/N)约为3，即为检测限溶液；信噪比约为10，即为定量限溶液；检测限浓度与供试品溶液理论浓度的比值即为检测限；定量限浓度与供试品理论浓度的比值即为定量限。
取上述溶液各20μL，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。
记录被测物峰值对应的信噪比，结果见下表2。
表2定量限与检测限试验结果
| 名称 | 浓度(μg/mL) | 峰面积(mAU*s) | 信噪比 | 灵敏度 |
| 定量限LOQ | 0.0053 | 0.79 | 13.6 | 0.00053％ |
| 检测限LOD | 0.00132 | 0.282 | 3.8 | 0.00013％ |
(3.4)线性及范围
分别配制下述线性溶液：
线性溶液1：精密量取浓度0.34μg/mL的硫脲对照品溶液，稀释64倍，作为线性溶液1。
线性溶液2：精密量取浓度0.34μg/mL的硫脲对照品溶液，稀释32倍，作为线性溶液2。
线性溶液3：精密量取浓度0.34μg/mL的硫脲对照品溶液，稀释16倍，作为线性溶液3。
线性溶液4：精密量取浓度0.34μg/mL的硫脲对照品溶液，稀释8倍，作为线性溶液4。
线性溶液5：精密量取浓度0.34μg/mL的硫脲对照品溶液，稀释4倍，作为线性溶液5。
线性溶液6：精密量取浓度0.34μg/mL的硫脲对照品溶液，稀释2倍，作为线性溶液6。
线性溶液7：精密量取浓度0.34μg/mL的硫脲对照品溶液，作为线性溶液7。
线性溶液8：精密称定硫脲对照品，用稀释溶剂稀释制成0.68μg/mL的对照品溶液，作为线性溶液8。
取上述线性溶液各20.0μL进样，记录色谱图数据，结果见下表3。
表3硫脲线性结果
以硫脲浓度和峰面积为横纵坐标得到的标准曲线如图9所示。
(3.5)重复性试验
取盐酸普拉克索原料适量，精密称定，用稀释溶剂溶解并稀释制成每1mL中约含盐酸普拉克索1mg的溶液。平行制备6份。精密量取上述溶液20μl注入液相色谱仪进样，记录色谱图。结果见下表4。
表4样品重复性结果
| 名称 | 样品-1 | 样品-2 | 样品-3 | 样品-4 | 样品-5 | 样品-6 | RSD |
| 硫脲 | 未检出 | 未检出 | 未检出 | 未检出 | 未检出 | 未检出 | -- |
(3.6)准确度
为了确定该色谱方法的测定结果与真实值(加入量)的差异，从而确认该方法是否可以获得准确的测试结果，进行该实验验证。
取硫脲对照品适量，精密称定，用稀释溶剂溶解并稀释制成每1mL约含硫脲3.4μg的准确度储备液(1000％)。
取盐酸普拉克索原料20.0mg，置于20mL量瓶中，再精密加入准确度储备液1.0mL，再加稀释溶剂稀释至刻度，摇匀，作为50％准确度溶液。平行制备3份。
取盐酸普拉克索原料20.0mg，置于20mL量瓶中，再精密加入准确度储备液2.0mL，再加稀释溶剂稀释至刻度，摇匀，作为100％准确度溶液。平行制备3份。
取盐酸普拉克索原料20.0mg，置于20mL量瓶中，再精密加入准确度储备液3.0mL，再加稀释溶剂稀释至刻度，摇匀，作为150％准确度溶液。平行制备3份。
测试结果见下表5。
表5硫脲准确度测试结果
从上表结果可以看出，硫脲的回收率范围在100.04-102.68％之间，在50％-150％之间，回收率RSD％为0.9％,故本方法能准确测定硫脲的含量。
(3.7)溶液稳定性
取硫脲100％准确度溶液，分别在不同的时间点精密量取上述溶液各20μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，以目标物不同的时间点的峰面积的RSD(％)评定溶液的稳定性，实验结果见下表6。
表6硫脲溶液稳定性结果
100％准确度溶液在室温下放置21h，峰面积偏差小于2.0％，说明在室温下放置21h是稳定的；
从上述实验结果看，本发明检测方法满足下表7的要求，能够用于盐酸普拉克索原料中硫脲的检测。
表7
实施例2
采用本发明盐酸普拉克索中杂质硫脲的检测方法进行样品检测：
1、色谱条件
高效液相色谱仪：Agilent 1100；
色谱柱：Waters X-Bridge RP-18 150×3.0mm×3.5μm；
色谱柱固定相：C18；
流动相：流动相A为水：乙腈(体积比)＝95:5，流动相B为0.1体积％三氟乙酸水溶液(用三乙胺调节pH至5.0)：乙腈(体积比)＝90:10；
色谱柱温度：35℃；
梯度洗脱程序：
| 时间(min) | 流动相A(体积％) | 流动相B(体积％) |
| 0 | 100 | 0 |
| 3 | 100 | 0 |
| 4 | 0 | 100 |
| 15 | 0 | 100 |
| 16 | 100 | 0 |
| 22 | 100 | 0 |
检测器波长：244nm；
流速：0.7mL/min；
进样体积：20.0μL。
2、样品检测
取3批从印度Macleods Pharmaceuticals Ltd.购买的盐酸普拉克索原料，每批取20mg，精密称定，分别置于20mL量瓶中，再加稀释溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀，进样测试，测试结果见下表8。
表8样品检测结果
| 批号 | 名称 | 结果 |
| E/8500/A18003 | 盐酸普拉克索 | 硫脲未检出 |
| E/8500/A18004 | 盐酸普拉克索 | 硫脲未检出 |
| E/8500/A18005 | 盐酸普拉克索 | 硫脲未检出 |
对比例1
按照实施例1的方法检测硫脲对照品，不同的是：流动相B为0.1体积％三氟乙酸水溶液：乙腈(体积比)＝90:10。所得色谱峰峰形不佳，影响定量。
对比例2
按照实施例1的方法检测硫脲对照品，不同的是：流动相为水：乙腈(体积比)＝95:5，直接将该流动相进入色谱柱。所得色谱峰峰形太差，无法用于定量。
以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。
Claims (9)
1.一种利用HPLC外标法测定盐酸普拉克索原料中硫脲含量的方法，其特征是：采用高效液相色谱仪对盐酸普拉克索原料进行检测，采用外标法进行定量分析，色谱条件如下：
色谱柱：Waters X-Bridge RP-18；
流动相A：体积分数5%的乙腈水溶液；
流动相B：体积比90:10的0.1体积%的三氟乙酸水溶液与乙腈的混合液，三氟乙酸水溶液用三乙胺调节pH至5.0；
流动相采用梯度洗脱，洗脱程序为：0-3min，流动相A 的体积分数为100%；3-4min，流动相A的体积分数从100%变为0%；4-15min，流动相A的体积分数为0%；15-16min，流动相A的体积分数从0%变为100%；16-22min，流动相A 的体积分数为100%。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征是：检测波长为240-250nm。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征是：色谱柱柱温为32-37℃。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征是：流动相流速为0.5-1.0mL/min，进样体积为15-20μL。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征是：Waters X-Bridge RP-18色谱柱的尺寸为150mm×3.0mm×3.5μm。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征是：检测时，取硫脲对照品，精密称定，用流动相A稀释制成不同浓度的硫脲对照品溶液，将对照品溶液分别进行高效液相色谱检测，得到标准曲线；然后将待测的盐酸普拉克索原料样品用流动相A配成供试品溶液，进行高效液相色谱检测。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征是：供试品溶液中盐酸普拉克索原料的浓度为1mg/ml。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征是：根据标准曲线绘制的线性方程为y=187.0 x-0.235，线性范围为0.0053µg/mL~0.678µg/mL。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征是：硫脲的检测限为1.3ppm，定量限为5.3ppm。
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