CN117310022B - 一种分离和检测乌美溴铵中间体奎宁环二苯甲醇有关物质的方法 - Google Patents
一种分离和检测乌美溴铵中间体奎宁环二苯甲醇有关物质的方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供一种分离和检测乌美溴铵中间体奎宁环二苯甲醇有关物质的方法。本发明采用高效液相色谱法，色谱条件包括：色谱柱为Agilent InfinityLabPoroshell 120EC‑C18(4.6mm×250mm，4μm)色谱柱；以磷酸盐缓冲液为流动相A，磷酸盐缓冲液浓度为0.018mol/L～0.022mol/L，pH为3.0～4.0；以乙腈为流动相B；梯度洗脱。本发明方法能够同时对10种已知杂质进行有效检测，对各已知杂质的分离效果好，可准确和灵敏的定量检测各杂质，更好的监控中间体奎宁环二苯甲醇的质量。
Description
技术领域
本发明涉及药物分析技术领域，特别是涉及一种分离和检测乌美溴铵中间体奎宁环二苯甲醇有关物质的方法。
背景技术
乌美溴铵为长效抗胆碱药，由葛兰素史克公司研发，用于治疗成人慢性阻塞性肺疾病(COPD)患者。奎宁环二苯甲醇为合成乌美溴铵的中间体，化学名称为二苯基(奎宁环-4-基)甲醇，分子式为C20H23NO，分子量为293.41，奎宁环二苯甲醇的结构式如式Ⅰ所示。
药物中的杂质含量决定着药物的品质，中间体作为合成原料药的关键物料，其有关物质是影响原料药质量的重要因素，想要得到高质量的原料药，需要从中间体入手，因而提高中间体中杂质的检测水平至关重要。
根据奎宁环二苯甲醇的合成路线及可能的降解途径分析，确定了奎宁环二苯甲醇原料药中可能含有10种杂质，即杂质I-3、杂质I-5、杂质I-6、杂质I-7、杂质I-8、杂质I-9、杂质I-10、杂质I-11、杂质I-12和杂质I-13，结构式如下：
目前，现有技术中未发现一种可同时对以上10种已知杂质进行有效检测的方法。欧洲药典、英国药典、美国药典、中国药典和日本药典中均未收载奎宁环二苯甲醇和乌美溴铵的质量标准。
因此，研究一种分离和检测奎宁环二苯甲醇有关物质的方法，对奎宁环二苯甲醇的质量控制非常重要。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明提供一种分离和检测乌美溴铵中间体奎宁环二苯甲醇有关物质的方法。本发明方法能够同时对10种已知杂质进行有效检测，对各已知杂质的分离效果好，可准确和灵敏的定量检测各杂质，更好的监控中间体奎宁环二苯甲醇的质量。
为实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：
一种分离和检测乌美溴铵中间体奎宁环二苯甲醇有关物质的方法，采用高效液相色谱法，色谱条件包括：
色谱柱为Agilent InfinityLabPoroshell 120EC-C18(4.6mm×250mm，4μm)色谱柱；
以磷酸盐缓冲液为流动相A，磷酸盐缓冲液浓度为0.018mol/L～0.022mol/L，pH为3.0～4.0；以乙腈为流动相B；
梯度洗脱：在0分钟，流动相A的体积占比为84％-86％，流动相B的体积占比为14％-16％；0到40分钟，流动相A的体积占比线性减少至50％，流动相B的体积占比线性增加至50％；40分钟到60分钟，流动相A的体积占比线性减少至20％，流动相B的体积占比线性增加至80％；60分钟到61分钟，流动相A的体积占比线性增加至84％-86％，流动相B的体积占比线性减少至14％-16％；61分钟到70分钟，流动相A的体积占比为84％-86％，流动相B的体积占比为14％-16％。
根据本发明优选的，流动相A磷酸盐缓冲液配制方式为：将无水磷酸二氢钠溶于水中，用磷酸调节pH值，即得。
根据本发明优选的，色谱条件包括：色谱柱柱温为20℃～30℃，优选25℃；流动相流速为0.9ml/min～1.3ml/min，优选1.0ml/min；检测器为紫外检测器，检测波长为210nm。
根据本发明优选的，采用乙腈的磷酸盐缓冲液作为溶剂配制供试品溶液；乙腈的磷酸盐缓冲液中，乙腈和磷酸盐缓冲液的体积比为30:70；磷酸盐缓冲液浓度为0.018mol/L～0.022mol/L，pH为3.0～4.0；磷酸盐缓冲液配制方式为：将无水磷酸二氢钠溶于水中，用磷酸调节pH值，即得；供试品溶液中奎宁环二苯甲醇的浓度为0.3mg/ml；供试品溶液用溶剂稀释100倍，作为对照溶液；精密量取供试品溶液与对照溶液，分别注入高效液相色谱仪，记录色谱图；进样体积为20μl。
根据本发明优选的，按照对照品外标法或加校正因子的主成分自身对照法计算各已知杂质的含量，按照加校正因子的主成分自身对照法计算未知杂质的含量。本发明对比了各杂质按外标法计算的杂质含量和加校正因子的主成分自身对照法计算的杂质含量的测定结果，两种杂质含量计算结果之间无明显差异，表明使用加校正因子的主成分自身对照法可准确定量各已知杂质的含量，在杂质对照品难获得的情况下，可通过加校正因子的主成分自身对照法定量各已知杂质的含量，节约了成本。
根据本发明优选的，在液相色谱图中，主成分和各已知杂质的出峰顺序为杂质I-3、杂质I-6、杂质I-7、杂质I-13、奎宁环二苯甲醇、杂质I-12、杂质I-8、杂质I-9、杂质I-10、杂质I-11与杂质I-5。
根据本发明优选的，在液相色谱图中，杂质I-3、杂质I-6、杂质I-7、杂质I-13、杂质I-12、杂质I-8、杂质I-9、杂质I-10、杂质I-11与杂质I-5的相对保留时间分别为0.47、0.89、0.94、0.98、1.11、1.76、1.78、1.90、2.09和3.17。可通过相对保留时间对各已知杂质进行定性。
根据本发明优选的，杂质I-3、杂质I-6、杂质I-7、杂质I-13、杂质I-12、杂质I-8、杂质I-9、杂质I-10、杂质I-11和杂质I-5的校正因子分别为1.7、1.0、1.9、1.3、1.3、0.5、0.5、0.6、0.6和0.4。
本发明通过专属性试验验证了采用本发明提供的检测方法，溶剂、主成分、主成分中的未知杂质等均不干扰各已知杂质的检测，此方法专属性较好。
本发明验证了本发明提供的检测方法的定量限和检测限，以及线性范围试验，证实本方法适用性强，灵敏度高；重复性试验证明本方法精密度高；回收率试验证实本方法准确度高。且能一次性的分离杂质I-3、杂质I-6、杂质I-7、杂质I-13、杂质I-12、杂质I-8、杂质I-9、杂质I-10、杂质I-11和杂质I-5，共10种已知杂质，检验工作效率显著提高。
本发明的有益效果是：
1、本发明提供的检测方法有效解决了极性相似的奎宁环二苯甲醇、杂质I-7和杂质I-13完全重合，难分离的问题。筛选了不同类型的色谱柱，包括高碳载量的色谱柱、不同规格的色谱柱和核壳类型的色谱柱等；本发明采用核壳色谱柱，具有低背压，高柱效，在普通液相上达到超高压液相的效果，以及使用该色谱柱进行了梯度程序、柱温和pH的优化，将奎宁环二苯甲醇与杂质I-7和杂质I-13达到有效的分离，可准确的对上述2个杂质进行定量分析，更好的控制了奎宁环二苯甲醇的质量。
2、杂质I-8、杂质I-9和杂质I-10为3个位置异构体，较难分离。本发明在检测其他杂质的同时，通过对梯度程序、柱温和pH的优化，解决了杂质I-8、杂质I-9和杂质I-10的分离问题，实现了在不使用手性色谱柱的条件下，使用C18色谱柱即可对3个位置异构体的分离，节约了成本，提高了检验工作效率。
3、本发明通过优化溶剂的组成，解决了由于溶剂效应，杂质I-3峰形差的问题，改善峰形后，可更加准确和灵敏的监控杂质I-3的含量，检验效率显著提高。
4、本发明方法专属性和适用性强，检测灵敏度高，线性关系良好，精密度和准确度高，检测方法的耐用性较好，检测效率高。色谱条件存在一定程度波动时，不影响杂质的准确检出和定量，可有效控制产品的质量。
5、本发明检测方法中，使用到了核壳色谱柱，对比了其他C18色谱柱，见对比例4，发现主峰与杂质I-13分离度变差，杂质I-11、杂质I-8和杂质I-9完全重合。可见，本发明中的色谱柱对于奎宁环二苯甲醇中各杂质分离的重要性。
6、本发明检测方法中柱温需要适宜，对比了其他柱温，见对比例6，发现杂质I-7和杂质I-13重合，并且与主峰之间的分离较差，杂质I-8和杂质I-9之间的分离较差。可见，柱温如不适宜，杂质之间分离度变差，表明本发明中的柱温对于奎宁环二苯甲醇中各杂质分离的重要性。
7、本发明检测方法中磷酸盐缓冲液的pH值需要适宜，对比了磷酸盐缓冲液的其他pH值，见对比例5，发现由于磷酸盐缓冲液的pH值的影响，杂质I-3的峰形变差，杂质I-7和杂质I-13完全重合，杂质I-8和杂质I-9之间的分离较差。可见，如pH值不适宜，主峰与相邻杂质之间分离度变差，表明本发明中的pH对于奎宁环二苯甲醇中各杂质分离的重要性。
8、本发明检测方法中流动相的流速需要适宜，对比了其他流速，见对比例7，发现杂质I-7和杂质I-13重合，与主峰分离度较差，杂质I-8和杂质I-9之间的分离较差，杂质I-10和杂质I-11的几乎重合。可见，如流速不适宜，杂质之间的分离变差，表明本发明中的流速对于奎宁环二苯甲醇中各杂质分离的重要性。
9、本发明检测方法中流动相A为磷酸盐缓冲液，对比了磷酸水溶液，见对比例8，发现由于无缓冲盐的缓冲能力，发现杂质I-7、杂质I-13和主峰完全重合，杂质I-6与主峰之间的分离较差，杂质I-8与杂质I-9之间的分离变差。可见，简单的磷酸溶液不适用于奎宁环二苯甲醇有关物质的检测，证明了流动相中增加磷酸盐缓冲液的必要性。
附图说明
图1是专属性试验中空白溶液的色谱图；
图2是专属性试验中对照品溶液的色谱图；
图3是专属性试验中加标供试品溶液的色谱图；
图4是专属性试验中供试品溶液的色谱图；
图5是流速为0.9ml/min时系统适用性溶液的色谱图；
图6是流速为1.3ml/min时系统适用性溶液的色谱图；
图7是柱温为20℃时系统适用性溶液的色谱图；
图8是柱温为30℃时系统适用性溶液的色谱图；
图9是磷酸盐缓冲液-乙腈体积比为86:14时系统适用性溶液的色谱图；
图10是磷酸盐缓冲液-乙腈体积比84:16时系统适用性溶液的色谱图；
图11是磷酸盐缓冲液浓度为18mmol/L时系统适用性溶液的色谱图；
图12是磷酸盐缓冲液浓度为22mmol/L时系统适用性溶液的色谱图；
图13是磷酸盐缓冲液pH为3.0时系统适用性溶液的色谱图；
图14是磷酸盐缓冲液pH为4.0时系统适用性溶液的色谱图；
图15是对比例1的色谱图。
图16是对比例2的色谱图。
图17是对比例3的色谱图。
图18是对比例4的色谱图。
图19是对比例5中磷酸盐缓冲液pH2.8的色谱图。
图20是对比例5中磷酸盐缓冲液pH4.2的色谱图。
图21是对比例6中柱温18℃的色谱图。
图22是对比例6中柱温35℃的色谱图。
图23是对比例7中流速0.8ml/min的色谱图。
图24是对比例7中流速1.4ml/min的色谱图。
图25是对比例8的色谱图。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
实施例中所用原料如无特殊说明，均为常规产品；所用方法如无特殊说明，均为现有技术。
实施例1，一种高效液相色谱法分离和检测奎宁环二苯甲醇有关物质的方法
试验仪器：Waters高效液相色谱仪，型号为Acquity Arc。检测器采用2489紫外检测器。
色谱条件：
色谱柱用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(Agilent InfinityLabPoroshell120EC-C18，4.6mm×250mm，4μm)；以20mmol/L磷酸盐缓冲溶液(取无水磷酸二氢钠2.4g，加水1000ml使溶解，用磷酸调节pH值至3.5)为流动相A，以乙腈为流动相B，流动相流速为每分钟1.0ml，按下列方式进行梯度洗脱；柱温为25℃；检测波长为210nm；进样体积为20μl。
在0分钟，流动相A的体积占比为85％，流动相B的体积占比为15％；0到40分钟，流动相A的体积占比线性减少至50％，流动相B的体积占比线性增加至50％；40分钟到60分钟，流动相A的体积占比线性减少至20％，流动相B的体积占比线性增加至80％；60分钟到61分钟，流动相A的体积占比线性增加至85％，流动相B的体积占比线性减少至15％；61分钟到70分钟，流动相A的体积占比为85％，流动相B的体积占比为15％。
样品配制：
溶剂：流动相A-乙腈(70:30)。
供试品溶液：取奎宁环二苯甲醇约30mg，置100ml量瓶中，加溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀。
对照溶液：精密量取供试品溶液1ml，置100ml量瓶中，用溶剂稀释至刻度，摇匀。
测定法：精密量取供试品溶液与对照溶液，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。
研究结果显示，按照该方法进行杂质分离时，如图4所示，各杂质之间分离度较好。此方法适用于奎宁环二苯甲醇有关物质的检测，可有效控制本品质量。
实施例2，对实施例1中的检测方法进行验证试验
2.1，专属性试验
溶剂：流动相A-乙腈(70:30)。
杂质I-3、I-6、I-7、I-12对照品贮备液：分别取杂质I-3、I-6、I-7、I-12对照品约12mg，精密称定，置20ml量瓶中，加乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀。
杂质I-5对照品贮备液：取杂质I-5对照品约18mg，精密称定，置20ml量瓶中，加乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀。
杂质I-8、I-9对照品贮备液：分别取杂质I-8、I-9对照品约6mg，精密称定，置10ml量瓶中，加溶剂3ml、乙腈3ml超声使溶解，用乙腈稀释至刻度，摇匀。
杂质I-10对照品贮备液：取杂质I-10对照品约6mg，精密称定，置10ml量瓶中，加乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀。
杂质I-11对照品贮备液：取杂质I-11对照品约24mg，精密称定，置20ml量瓶中，加乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀。
杂质I-13对照品贮备液：取杂质I-13对照品约12mg，精密称定，置20ml量瓶中，加溶剂5ml、乙腈5ml使溶解，用乙腈稀释至刻度，摇匀。
混合对照品贮备液：精密量取杂质I-3对照品贮备液、杂质I-7对照品贮备液、杂质I-8对照品贮备液、杂质I-9对照品贮备液、杂质I-10对照品贮备液和杂质I-12对照品贮备液各2ml，杂质I-5对照品贮备液、杂质I-6对照品贮备液、杂质I-11对照品贮备液和杂质I-13对照品贮备液各10ml，置同一100ml量瓶中，用溶剂稀释至刻度，摇匀。
加标供试品溶液：取奎宁环二苯甲醇约30mg，精密称定，置100ml量瓶中，精密量取混合对照品贮备液5ml，置同一100ml量瓶中，加溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀。
供试品溶液：取奎宁环二苯甲醇约30mg，精密称定，置100ml量瓶中，加溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀。
对照品溶液：精密量取混合对照品贮备液5ml，置100ml量瓶中，用溶剂稀释至刻度，摇匀。
杂质I-3、I-7、I-8、I-9、I-10、I-12定位溶液：分别精密量取杂质I-3、I-7、I-8、I-9、I-10、I-12对照品贮备液1ml，置50ml量瓶中，用溶剂稀释至刻度，摇匀，精密量取1ml，置20ml量瓶中，用溶剂稀释至刻度，摇匀。
杂质I-5、I-6、I-11、I-13定位溶液：分别精密量取杂质I-5、I-6、I-11、I-13对照品贮备液5ml，置50ml量瓶中，用溶剂稀释至刻度，摇匀，精密量取1ml，置20ml量瓶中，用溶剂稀释至刻度，摇匀。
精密量取溶剂(空白溶液)、供试品溶液、对照品溶液、加标供试品溶液和各已知杂质定位溶液，分别注入液相色谱仪，色谱条件同实施例1，记录色谱图。结果见图1～图4。
试验结果表明，溶剂、主成分均不干扰各已知杂质的检测，结果表明该方法专属性良好。
2.2，定量限与检测限试验
定量限溶液：精密量取各杂质单体定位溶液各适量，加溶剂定量稀释制成各自的信噪比为10左右的溶液。
检测限溶液：精密量取各杂质单体定位溶液各适量，加溶剂定量稀释制成各自的信噪比为3左右的溶液。
精密量取定量限溶液或检测限溶液，注入液相色谱仪，色谱条件同实施例1，记录色谱图。
表1定量限和检测限试验结果
2.3，线性与范围试验
溶剂：流动相A-乙腈(70:30)。
取“专属性试验”项下制备的杂质I-3对照品贮备液、杂质I-7对照品贮备液、杂质I-8对照品贮备液、杂质I-9对照品贮备液、杂质I-10对照品贮备液和杂质I-12对照品贮备液。
奎宁环二苯甲醇对照品贮备液：取奎宁环二苯甲醇对照品约60mg，精密称定，置100ml量瓶中，加溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀。
混合对照品贮备液①：精密量取杂质I-3对照品贮备液、杂质I-7对照品贮备液、杂质I-8对照品贮备液、杂质I-9对照品贮备液、杂质I-10对照品贮备液、杂质I-12对照品贮备液和奎宁环二苯甲醇对照品贮备液各1ml，置同一50ml量瓶中，用溶剂稀释至刻度，摇匀。
混合对照品贮备液②：取奎宁环二苯甲醇对照品、杂质I-5对照品、杂质I-6对照品、杂质I-11对照品和杂质I-13对照品各约18mg，精密称定，置同一20ml量瓶中，加溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取10ml，置同一100ml量瓶中，用溶剂稀释至刻度，摇匀。
线性溶液1：
精密量取混合对照品贮备液①1ml、2ml、3ml、5ml、10ml、15ml，分别置6个不同的100ml量瓶中，用溶剂稀释至刻度，摇匀，分别作为线性试验的第2～7个点。以定量限溶液作为线性的第1个点。
线性溶液2：
精密量取混合对照品贮备液②2ml、3ml、5ml、10ml、15ml、20ml，分别置6个不同的100ml量瓶中，用溶剂稀释至刻度，摇匀，分别作为线性试验的第2～7个点。以定量限溶液作为线性的第1个点。
精密量取定量限溶液、各线性溶液，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。以浓度C(μg/ml)为横坐标，峰面积A为纵坐标，进行线性回归。
表2杂质I-3线性与范围试验结果
表3杂质I-7线性与范围试验结果
表4奎宁环二苯甲醇线性与范围试验结果1
表5杂质I-12线性与范围试验结果
表6杂质I-8线性与范围试验结果
表7杂质I-9线性与范围试验结果
表8杂质I-10线性与范围试验结果
表9杂质I-6线性与范围试验结果
表10杂质I-13线性与范围试验结果
表11奎宁环二苯甲醇线性与范围试验结果2
表12杂质I-11线性与范围试验结果
表13杂质I-5线性与范围试验结果
验证结果：第一组线性试验中，杂质I-3在0.1031μg/ml～1.5470μg/ml范围内、杂质I-7在0.1201μg/ml～1.8012μg/ml内、杂质I-12在0.1082μg/ml～1.6227μg/ml内、杂质I-8在0.0191μg/ml～1.7923μg/ml内、杂质I-9在0.0202μg/ml～1.8951μg/ml内、杂质I-10在0.0360μg/ml～1.8003μg/ml内和奎宁环二苯甲醇在0.0335μg/ml～1.7959μg/ml内峰面积A与浓度C呈良好的线性关系，且Y轴截距绝对值/100％响应值均小于25％。
第二组线性试验中，杂质I-6在0.0588μg/ml～19.5900μg/ml范围内、杂质I-13在0.0495μg/ml～16.5083μg/ml范围内、杂质I-11在0.0362μg/ml～18.0774μg/ml范围内、杂质I-5在0.0175μg/ml～17.4700μg/ml、奎宁环二苯甲醇在0.0335μg/ml～18.1679μg/ml范围内峰面积A与浓度C呈良好的线性关系，且Y轴截距绝对值/100％响应值均小于25％。
2.4，溶液稳定性试验
溶剂：流动相A-乙腈(70:30)。
按照“专属性试验”项下方法制备混合对照品贮备液。
对照品溶液：精密量取混合对照品贮备液5ml，置100ml量瓶中，用溶剂稀释至刻度，摇匀。
供试品溶液：取奎宁环二苯甲醇约30mg，精密称定，置100ml量瓶中，加溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀。
对照溶液：精密量取供试品溶液1ml，置100ml量瓶中，用溶剂稀释至刻度，摇匀。
加标供试品溶液：取奎宁环二苯甲醇约30mg，精密称定，置100ml量瓶中，精密量取混合对照品贮备液5ml，置同一100ml量瓶中，加溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀。
取对照品溶液、对照溶液、供试品溶液与加标供试品溶液于室温条件下放置，分别于制备后的第0h、6h、12h、24h末进样分析，记录色谱图，计算各个时间点各成分的峰面积与0h峰面积的比值。
表14对照品溶液稳定性试验与0h峰面积比值结果(％)
备注：N/A代表不适用
表15对照溶液稳定性试验结果
| 时间/h | 对照溶液主峰峰面积 | 与0h峰面积比值结果(％) |
| 0 | 209568 | N/A |
| 6 | 209783 | 100.1 |
| 12 | 210317 | 100.4 |
| 24 | 213299 | 101.8 |
表16供试品溶液稳定性试验结果
备注：N/A代表不适用
表17加标供试品溶液稳定性试验结果
备注：N/A代表不适用
验证结果：室温条件下，对照品溶液、供试品溶液、加标供试品溶液放置24小时，杂质变化符合要求。说明对照品溶液、供试品溶液、加标供试品溶液室温放置24小时内稳定。
2.5，重复性试验
溶剂：流动相A-乙腈(70:30)。
按照“专属性试验”项下方法制备混合对照品贮备液。
对照品溶液：精密量取混合对照品贮备液5ml，置100ml量瓶中，用溶剂稀释至刻度，摇匀。
加标供试品溶液：取奎宁环二苯甲醇约30mg，精密称定，置100ml量瓶中，精密量取混合对照品贮备液5ml，置同一100ml量瓶中，加溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀。平行制备6份。
对照溶液：精密量取加标供试品溶液1ml，置100ml量瓶中，用溶剂稀释至刻度，摇匀。
精密量取溶剂、对照品溶液、加标供试品溶液与对照溶液，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。分别按照杂质对照品外标法和加校正因子的主成分自身对照法计算各已知杂质的含量。
表18重复性试验结果1
表19重复性试验结果2
验证结果：平行制备6份加标供试品溶液，按外标法计算各已知杂质的含量，各杂质的RSD值均不大于3％。按加校正因子的主成分自身对照法计算各已知杂质的含量，各杂质的RSD值均不大于3％，总杂含量的RSD值为0.9％，小于4％。
2.6，准确度试验
按照“专属性试验”项下方法制备混合对照品贮备液。
对照品溶液：精密量取混合对照品贮备液5ml，置100ml量瓶中，用溶剂稀释至刻度，摇匀。
供试品溶液：取奎宁环二苯甲醇约30mg，精密称定，置100ml量瓶中，加溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀。
回收率溶液1：取奎宁环二苯甲醇约30mg，精密称定，置100ml量瓶中，精密量取混合对照品贮备液2.5ml，置同一100ml量瓶中，加溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀。平行制备3份。
回收率溶液2：取奎宁环二苯甲醇约30mg，精密称定，置100ml量瓶中，精密量取混合对照品贮备液5ml，置同一100ml量瓶中，加溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀。平行制备3份。
回收率溶液3：取奎宁环二苯甲醇约30mg，精密称定，置100ml量瓶中，精密量取混合对照品贮备液7.5ml，置同一100ml量瓶中，加溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀。平行制备3份。
精密量取溶剂、对照品溶液、供试品溶液与3个浓度的回收率溶液，分别注入液相色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积分别计算各杂质的检出量并计算回收率。
计算公式：
表20准确度试验结果
| 名称 | 回收率(％) | 名称 | 回收率(％) | 名称 | 回收率(％) |
| 杂质I-3 | 97.4 | 杂质I-9 | 101.2 | 杂质I-13 | 100.4 |
| 杂质I-7 | 101.7 | 杂质I-11 | 100.0 | 杂质I-8 | 100.3 |
| 杂质I-12 | 99.1 | 杂质I-6 | 100.2 | 杂质I-10 | 102.1 |
| 杂质I-5 | 98.7 | / | / | / | / |
验证结果：3个浓度范围内，杂质I-3、杂质I-7、杂质I-12、杂质I-9、杂质I-8和杂质I-10的平均回收率分别为97.4％、101.7％、99.1％、101.2％、100.3％和102.1％，均在90％～108％之间。3个浓度范围内，杂质I-5、杂质I-6、杂质I-11和杂质I-13的平均回收率分别为98.7％、100.2％、100.0％和100.4％，均在92％～105％之间。以上结果表明该方法准确度较高。
对比例1，奎宁环二苯甲醇有关物质的HPLC分离检测。
试验仪器：Waters高效液相色谱仪，型号为Acquity Arc。检测器采用2489紫外检测器。
色谱条件：
色谱柱：YMC-Pack pro C18 RS，4.6mm×150mm，3μm；
流动相：以10mmol/L磷酸盐缓冲溶液(取无水磷酸二氢钠1.2g，加水1000ml使溶解，用磷酸调节pH值至2.8)为流动相A，以乙腈为流动相B；按下列方式进行梯度洗脱：
在0分钟，流动相A体积占比为85％，流动相B体积占比为15％；0到40分钟，流动相A体积占比线性减少至50％，流动相B体积占比线性增加至50％；40分钟到60分钟，流动相A体积占比线性减少至20％，流动相B体积占比线性增加至80％；60分钟到61分钟，流动相A体积占比线性增加至85％，流动相B体积占比线性减少至15％；61分钟到70分钟，流动相A体积占比为85％，流动相B体积占比为15％。
波长：210nm；柱温：40℃；流速：1.0ml/min；进样体积：20μl。
样品配制：
溶剂：乙腈-水(30:70)。
杂质I-3、I-5、I-6、I-7、I-10、I-11、I-12、I-13对照品贮备液：分别取杂质I-3、I-5、I-6、I-7、I-10、I-11、I-12、I-13对照品约6mg，置10ml量瓶中，加乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀。
杂质I-8对照品贮备液：取杂质I-8对照品约6mg，置10ml量瓶中，加水3ml使溶解，用乙腈稀释至刻度，摇匀。
杂质I-9对照品贮备液：取杂质I-9对照品约6mg，置20ml量瓶中，加水5ml使溶解，用乙腈稀释至刻度，摇匀。
混合对照品贮备液：精密量取杂质I-3、杂质I-5、杂质I-6、杂质I-7、杂质I-8、杂质I-10、杂质I-11、杂质I-12、杂质I-13对照品贮备液各1ml、杂质I-9对照品贮备液2ml，置同一20ml量瓶中，用溶剂稀释至刻度，摇匀。
加标供试品溶液：取奎宁环二苯甲醇约6mg，置20ml量瓶中，精密量取混合对照品贮备液1ml，置同一20ml量瓶中，加溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀。
测定法：精密量取加标供试品溶液，注入液相色谱仪，记录色谱图。
研究结果显示，按照该方法进行杂质分离时，如图15所示，加标供试品溶液色谱图中杂质I-3峰形较差，存在溶剂效应；杂质I-7、杂质I-13和主峰重合。可见，此方法不适用于奎宁环二苯甲醇有关物质的检测。
对比例2，奎宁环二苯甲醇有关物质的HPLC分离检测。
试验仪器：Waters高效液相色谱仪，型号为Acquity Arc。检测器采用2489紫外检测器。
色谱条件：
色谱柱：Agilent InfinityLabPoroshell 120EC-C18，4.6mm×250mm，4μm；
流动相：20mmol/L磷酸盐缓冲溶液(取无水磷酸二氢钠2.4g，加水1000ml使溶解，用磷酸调节pH值至2.8)为流动相A，以乙腈为流动相B；按下列方式进行梯度洗脱：
在0分钟到10分钟，流动相A体积占比为85％，流动相B体积占比为15％；10到50分钟，流动相A体积占比线性减少至30％，流动相B体积占比线性增加至70％；50到55分钟，流动相A体积占为30％，流动相B体积占为70％；55分钟到56分钟，流动相A体积占比线性增加至85％，流动相B体积占比线性减少至15％；56分钟到65分钟，流动相A体积占比为85％，流动相B体积占比为15％。
波长：210nm；柱温：30℃；流速：1.0ml/min；进样体积：20μl。
样品配制：
溶剂：乙腈-水(30:70)。
加标供试品溶液：取奎宁环二苯甲醇约6mg，置20ml量瓶中，精密量取混合对照品贮备液(制备方法同对比例1)1ml，置同一20ml量瓶中，加溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀。
测定法：精密量取加标供试品溶液，注入液相色谱仪，记录色谱图。
研究结果显示，按照该方法进行杂质分离时，如图16所示，由于溶剂效应，杂质I-3峰形较差；杂质I-13和主峰之间的分离较差，杂质I-8和杂质I-9之间的分离较差。可见，此方法不适用于奎宁环二苯甲醇有关物质的检测，无法控制本品质量。
对比例3，奎宁环二苯甲醇有关物质的HPLC分离检测。
试验仪器：Waters高效液相色谱仪，型号为Acquity Arc。检测器采用2489紫外检测器。
色谱条件：
色谱柱：Agilent InfinityLabPoroshell 120EC-C18，4.6mm×250mm，4μm；
其余色谱条件同对比例2。
样品配制：
溶剂：20mmol/L磷酸盐缓冲溶液(取无水磷酸二氢钠2.4g，加水1000ml使溶解，用磷酸调节pH值至2.8)-乙腈(30:70)。
加标供试品溶液：取奎宁环二苯甲醇约6mg，置20ml量瓶中，精密量取混合对照品贮备液(制备方法同对比例1)1ml，置同一20ml量瓶中，加溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀。
测定法：精密量取加标供试品溶液，注入液相色谱仪，记录色谱图。
研究结果显示，按照该方法进行杂质分离时，如图17所示，相比对比例2，由于溶剂的改变，杂质I-3峰形得到改善；但杂质I-8和杂质I-9之间的分离较差。可见，此方法不适用于奎宁环二苯甲醇有关物质的检测，无法控制本品质量。
对比例4，使用本发明实施例1的色谱条件(色谱柱除外)，用于奎宁环二苯甲醇有关物质的HPLC分离检测。
试验仪器：Waters高效液相色谱仪，型号为Acquity Arc。检测器采用2489紫外检测器。
色谱条件：
色谱柱：Waters XBridge C18，4.6mm×250mm，5μm；
其余色谱条件同实施例1。
样品配制：
溶剂：流动相A-乙腈(70:30)。
加标供试品溶液：取奎宁环二苯甲醇约6mg，置20ml量瓶中，精密量取混合对照品贮备液(制备方法同对比例1)1ml，置同一20ml量瓶中，加溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀。
测定法：精密量取加标供试品溶液，注入液相色谱仪，记录色谱图。
研究结果显示，使用本发明的色谱条件，更换不同厂家色谱柱时，如图18所示，发现主峰与杂质I-13之间的分离变差，杂质I-11、杂质I-8和杂质I-9完全重合。可见，本发明中的色谱柱对于奎宁环二苯甲醇中各杂质分离的重要性。
对比例5，使用本发明实施例1的色谱条件(磷酸盐缓冲液的pH除外)，用于奎宁环二苯甲醇有关物质的HPLC分离检测。
试验仪器：Waters高效液相色谱仪，型号为Acquity Arc。检测器采用2489紫外检测器。
色谱条件：
流动相1：20mmol/L磷酸盐缓冲溶液(取无水磷酸二氢钠2.4g，加水1000ml使溶解，用磷酸调节pH值至2.8)为流动相A，以乙腈为流动相B。
流动相2：20mmol/L磷酸盐缓冲溶液(取无水磷酸二氢钠2.4g，加水1000ml使溶解，用磷酸调节pH值至4.2)为流动相A，以乙腈为流动相B。
其余色谱条件同实施例1。
样品配制：
溶剂：流动相A-乙腈(70:30)。
加标供试品溶液：取奎宁环二苯甲醇约6mg，置20ml量瓶中，精密量取混合对照品贮备液(制备方法同对比例1)1ml，置同一20ml量瓶中，加溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀。
测定法：精密量取加标供试品溶液，注入液相色谱仪，记录色谱图。
研究结果显示，除磷酸盐缓冲液的pH值外，使用本发明的色谱条件时，如图19和图20所示，发现由于磷酸盐缓冲液的pH值的影响，杂质I-3的峰形变差，杂质I-7和杂质I-13完全重合，杂质I-8和杂质I-9之间的分离较差。可见，超出本发明的pH值保护范围后，主峰与相邻杂质之间分离度变差，表明本发明中流动相A的pH值对于奎宁环二苯甲醇杂质分离的重要性。
对比例6，使用本发明实施例1的色谱条件(柱温除外)，用于奎宁环二苯甲醇有关物质的HPLC分离检测。
试验仪器：Waters高效液相色谱仪，型号为Acquity Arc。检测器采用2489紫外检测器。
色谱条件：
柱温1：18℃；柱温2：35℃。
其余色谱条件同实施例1。
样品配制：
溶剂：流动相A-乙腈(70:30)。
加标供试品溶液：取奎宁环二苯甲醇约6mg，置20ml量瓶中，精密量取混合对照品贮备液(制备方法同对比例1)1ml，置同一20ml量瓶中，加溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀。
测定法：精密量取加标供试品溶液，注入液相色谱仪，记录色谱图。
研究结果显示，除柱温外，使用本发明的色谱条件时，如图21和图22所示，发现杂质I-7和杂质I-13重合，并且与主峰之间的分离较差，杂质I-8和杂质I-9之间的分离较差。可见，超出本发明的柱温保护范围后，部分杂质之间的分离变差，表明本发明中的柱温对于奎宁环二苯甲醇中各杂质分离的重要性。
对比例7，使用本发明实施例1的色谱条件(流速除外)，用于奎宁环二苯甲醇有关物质的HPLC分离检测。
试验仪器：Waters高效液相色谱仪，型号为Acquity Arc。检测器采用2489紫外检测器。
色谱条件：
流速1：0.8ml/min；流速2：1.4ml/min。
其余色谱条件同实施例1。
样品配制：
溶剂：流动相A-乙腈(70:30)。
加标供试品溶液：取奎宁环二苯甲醇约6mg，置20ml量瓶中，精密量取混合对照品贮备液(制备方法同对比例1)1ml，置同一20ml量瓶中，加溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀。
测定法：精密量取加标供试品溶液，注入液相色谱仪，记录色谱图。
研究结果显示，除流速外，使用本发明的色谱条件时，如图23和图24所示，发现杂质I-7和杂质I-13重合，与主峰之间的分离较差，杂质I-8和杂质I-9之间的分离较差。可见，超出本发明的流速保护范围后，部分杂质之间分离变差，表明本发明中的流速对于奎宁环二苯甲醇杂质分离的重要性。
对比例8，使用本发明实施例1的色谱条件(流动相除外)，以0.1％磷酸水溶液为流动相A，以乙腈为流动相B，用于检测奎宁环二苯甲醇有关物质的试验。
试验仪器：Waters高效液相色谱仪，型号为Acquity Arc。检测器采用2489紫外检测器。
色谱条件：
色谱柱：Agilent InfinityLabPoroshell 120EC-C18，4.6mm×250mm，4μm；
流动相：以0.1％磷酸水溶液为流动相A，以乙腈为流动相B。
其余色谱条件同实施例1。
样品配制：
溶剂：流动相A-乙腈(70:30)。
加标供试品溶液：取奎宁环二苯甲醇约6mg，置20ml量瓶中，精密量取混合对照品贮备液(制备方法同对比例1)1ml，置同一20ml量瓶中，加溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀。
测定法：精密量取加标供试品溶液，注入液相色谱仪，记录色谱图。
研究结果显示，使用本发明的色谱条件，以0.1％磷酸溶液为流动相A，以乙腈为流动相B时，如图25所示，发现杂质I-7、杂质I-13和主峰完全重合，杂质I-6与主峰之间的分离较差，杂质I-8与杂质I-9之间的分离变差。可见，简单的磷酸溶液不适用于奎宁环二苯甲醇有关物质的检测，证明了流动相中增加磷酸盐缓冲液的必要性。
试验例1：本发明提供的不同色谱条件下检测试验
溶剂：流动相A-乙腈(70:30)
加标供试品溶液：取奎宁环二苯甲醇约30mg，精密称定，置100ml量瓶中，精密量取混合对照品贮备液(制备方法同对比例1)5ml，置同一100ml量瓶中，加溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀。
对照溶液：精密量取加标供试品溶液1ml，置100ml量瓶中，用溶剂稀释至刻度，摇匀。
分别考察流动相中磷酸盐缓冲液不同浓度、磷酸盐缓冲液不同pH、磷酸盐缓冲液与乙腈不同比例(梯度洗脱程序中起始或最终占比)、不同流速、不同色谱柱柱温条件下的试验结果，即变化上述条件，其它色谱条件同实施例1，对比如下：
试验中提供了磷酸盐缓冲液浓度在18mmol/L、20mmol/L、22mmol/L，磷酸盐缓冲液与乙腈体积比为86:14、85:15、84:16，流动相流速在每分钟0.9ml、1.0ml、1.3ml，柱温在20℃、25℃、30℃，磷酸盐缓冲液pH在3.0、3.5、4.0各条件分别对杂质含量的影响，对色谱条件的耐用性进行考察。即，在标准色谱条件(实施例1中的色谱条件)下变化上述条件。流速为每分钟0.9ml时加标供试品溶液的色谱图见图5，流速为每分钟1.3ml时加标供试品溶液的色谱图见图6，柱温为20℃时加标供试品溶液的色谱图见图7，柱温为30℃时加标供试品溶液的色谱图见图8，磷酸盐缓冲液与乙腈比例为86:14时加标供试品溶液的色谱图见图9，磷酸盐缓冲液与乙腈比例为84:16时加标供试品溶液的色谱图见图10，磷酸盐缓冲液浓度为18mmol/L时加标供试品溶液的色谱图见图11，磷酸盐缓冲液浓度为22mmol/L时加标供试品溶液的色谱图见图12，磷酸盐缓冲液pH为3.0时加标供试品溶液的色谱图见图13，磷酸盐缓冲液pH为4.0时加标供试品溶液的色谱图见图14。杂质含量测试结果如下表所示。
表21不同变化条件对各杂质含量测定结果影响的耐用性试验结果
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以上试验结果可见，在本发明提供的以上色谱条件范围内，各杂质之间分离良好，该方法的耐用性较好，在该范围内的条件的波动不会影响各杂质的定性检出和定量检测结果。
综上所述，本发明建立了一个同时分离和定量检测奎宁环二苯甲醇中有关物质的检测方法。本发明采用高效液相色谱法，样品处理过程操作简单、无需对照品、成本低、准确高效；灵敏度高；专属性较好；使用的试剂为乙腈，容易获得，有较广阔的应用前景。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (8)
1.一种分离和检测乌美溴铵中间体奎宁环二苯甲醇有关物质的方法，其特征在于，采用高效液相色谱法，色谱条件包括：
色谱柱为Agilent InfinityLabPoroshell 120EC-C18，4.6mm×250mm，4μm；
以磷酸盐缓冲液为流动相A，磷酸盐缓冲液浓度为0.018mol/L～0.022mol/L，pH为3.0～4.0；以乙腈为流动相B；
梯度洗脱：在0分钟，流动相A的体积占比为84％-86％，流动相B的体积占比为14％-16％；0到40分钟，流动相A的体积占比线性减少至50％，流动相B的体积占比线性增加至50％；40分钟到60分钟，流动相A的体积占比线性减少至20％，流动相B的体积占比线性增加至80％；60分钟到61分钟，流动相A的体积占比线性增加至84％-86％，流动相B的体积占比线性减少至14％-16％；61分钟到70分钟，流动相A的体积占比为84％-86％，流动相B的体积占比为14％-16％；
色谱柱柱温为20℃～30℃；流动相流速为0.9ml/min～1.3ml/min；采用乙腈的磷酸盐缓冲液作为溶剂配制供试品溶液；乙腈的磷酸盐缓冲液中，乙腈和磷酸盐缓冲液的体积比为30:70；磷酸盐缓冲液浓度为0.018mol/L～0.022mol/L，pH为3.0～4.0；
乌美溴铵中间体奎宁环二苯甲醇有关物质结构如下：
2.根据权利要求1所述分离和检测乌美溴铵中间体奎宁环二苯甲醇有关物质的方法，其特征在于，流动相A磷酸盐缓冲液配制方式为：将无水磷酸二氢钠溶于水中，用磷酸调节pH值，即得。
3.根据权利要求1所述分离和检测乌美溴铵中间体奎宁环二苯甲醇有关物质的方法，其特征在于，色谱条件包括：色谱柱柱温为25℃；流动相流速为1.0ml/min；检测器为紫外检测器，检测波长为210nm。
4.根据权利要求1所述分离和检测乌美溴铵中间体奎宁环二苯甲醇有关物质的方法，其特征在于，磷酸盐缓冲液配制方式为：将无水磷酸二氢钠溶于水中，用磷酸调节pH值，即得；供试品溶液中奎宁环二苯甲醇的浓度为0.3mg/ml；供试品溶液用溶剂稀释100倍，作为对照溶液；精密量取供试品溶液与对照溶液，分别注入高效液相色谱仪，记录色谱图；进样体积为20μl。
5.根据权利要求1所述分离和检测乌美溴铵中间体奎宁环二苯甲醇有关物质的方法，其特征在于，按照对照品外标法或加校正因子的主成分自身对照法计算各已知杂质的含量，按照加校正因子的主成分自身对照法计算未知杂质的含量。
6.根据权利要求1所述分离和检测乌美溴铵中间体奎宁环二苯甲醇有关物质的方法，其特征在于，在液相色谱图中，主成分和各已知杂质的出峰顺序为杂质I-3、杂质I-6、杂质I-7、杂质I-13、奎宁环二苯甲醇、杂质I-12、杂质I-8、杂质I-9、杂质I-10、杂质I-11与杂质I-5。
7.根据权利要求1所述分离和检测乌美溴铵中间体奎宁环二苯甲醇有关物质的方法，其特征在于，在液相色谱图中，杂质I-3、杂质I-6、杂质I-7、杂质I-13、杂质I-12、杂质I-8、杂质I-9、杂质I-10、杂质I-11与杂质I-5的相对保留时间分别为0.47、0.89、0.94、0.98、1.11、1.76、1.78、1.90、2.09和3.17。
8.根据权利要求1所述分离和检测乌美溴铵中间体奎宁环二苯甲醇有关物质的方法，其特征在于，杂质I-3、杂质I-6、杂质I-7、杂质I-13、杂质I-12、杂质I-8、杂质I-9、杂质I-10、杂质I-11和杂质I-5的校正因子分别为1.7、1.0、1.9、1.3、1.3、0.5、0.5、0.6、0.6和0.4。
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