CN117554526A - 一种测定s-1-氨基-3-氯-2-丙醇盐酸盐及其对映异构体的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种柱前衍生化HPLC法分析S‑1‑氨基‑3‑氯‑2‑丙醇盐酸盐及其对映异构体的方法，属于药品分析检测技术领域。该方法采用苯基键合硅胶为填充剂(Agilent ZORBAX SB‑Phenyl，4.6mm×250mm，5μm)进行分析检测。该方法能够简单、准确、高效的分析检测S‑1‑氨基‑3‑氯‑2‑丙醇盐酸盐及其对映异构体，有效控制其质量。
Description
技术领域
本发明涉及一种柱前衍生化HPLC法分析S-1-氨基-3-氯-2-丙醇盐酸盐及其对映异构体的方法，属于药品分析检测技术领域。
背景技术
(S)-1-氨基-3-氯-2-丙醇盐酸盐在常温常压下为白色固体，熔点大于131℃，属于氨基醇类衍生物，可作为医药化学和有机合成中间体，是药物分子利奈唑胺的合成中间体。
目前暂无(S)-1-氨基-3-氯-2-丙醇盐酸盐及其对映异构体分离的文献报道，且目标化合物属于一对手性异构体，常规的反相分离较困难，通过正相手性柱分离可能性较大，但目标化合物又无紫外吸收，所以通过常规的分离手段难于对目标化合物进行分离，故通过柱前衍生化，在色谱分离之前将样品与一定的化学试剂发生化学反应，将样品中的目标化合物制备成适当的衍生物，通过后者的分析检测可以对目标化合物进行定性和定量分析。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种柱前衍生化HPLC法分析S-1-氨基-3-氯-2-丙醇盐酸盐及其对映异构体的方法。该方法采用苯基键合硅胶为填充剂(AgilentZORBAX SB-Phenyl，4.6mm×250mm，5μm)进行分析检测。该方法能够简单、准确、高效的分析检测S-1-氨基-3-氯-2-丙醇盐酸盐及其对映异构体，有效控制其质量。
本发明所述一种柱前衍生化HPLC法分析S-1-氨基-3-氯-2-丙醇盐酸盐(标记为SM2)及其对映异构体的方法，包括如下步骤：采用苯基键合硅胶为填充剂(Agilent ZORBAXSB-Phenyl，4.6mm×250mm，5μm或效能相当的色谱柱)并使用水-甲醇混合溶剂为流动相进行分析检测。
进一步地，在上述技术方案中，具体包括以下步骤：A、衍生化溶液制备；B、HPLC分析；C、按面积归一化法计算对映异构体含量。
A、衍生化溶液制备方法：
(1)取Nα-(2,4-二硝基-5-氟苯基)-L-丙氨酰胺适量，精密称定，用丙酮溶解并稀释制成每1mL约含10mg溶液，摇匀，作为衍生化试剂；
(2)精密量取1mol/L碳酸氢钠溶液1mL，置10mL量瓶中，加衍生化试剂3mL，于40℃水浴锅中加热120min，再加2mol/L盐酸溶液1mL，用稀释剂[甲醇/水＝50/50(v/v)]稀释至刻度，摇匀，作为空白溶剂；
(3)取本品适量，精密称定，加水溶解并用稀释剂稀释制成每1mL约含4mg的溶液，作为供试品贮备液；精密量取该贮备液1mL，置10mL量瓶中，加1mol/L碳酸氢钠溶液1mL，衍生化试剂(Nα-(2,4-二硝基-5-氟苯基)-L-丙氨酰胺)3mL，于40℃水浴锅中加热120min，再加2mol/L盐酸溶液1mL，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。
B、HPLC分析方法
(1)选用色谱柱，以水为流动相A；以甲醇为流动相B；按下表进行线性梯度洗脱；
| 时间(分钟) | 流动相A(％) | 流动相B(％) |
| 0 | 95 | 5 |
| 45 | 68 | 32 |
| 115 | 68 | 32 |
| 116 | 20 | 80 |
| 121 | 20 | 80 |
| 123 | 95 | 5 |
| 130 | 95 | 5 |
(2)设置流动相流速为1.0mL/min；
(3)设置液相色谱柱温箱温度为30℃；检测波长340nm；进样量为10μL。
C、获得结果：按照上述HPLC检测的色谱条件进样分析，按面积归一化法计算对映异构体含量。
说明书附图
图1为实施例1中空白溶剂色谱图；
图2为实施例1中供试品溶液色谱图。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明作进一步描述。
实施例中所用的仪器、试剂、溶液和检测时的色谱条件描述如下：
1.仪器
Waters Acquity Arc液相色谱仪，包括真空脱气机、四元梯度泵、全自动进样器、柱温箱、UV检测器和Thermo变色龙色谱工作站。
梅特勒XPR205/A型十万分之一电子天平。
2.试剂
(S)-1-氨基-3-氯-2-丙醇盐酸盐(99.0％)、(R)-1-氨基-3-氯-2-丙醇盐酸盐(97％)、Nα-(2,4-二硝基-5-氟苯基)-L-丙氨酰胺(98％)、碳酸氢钠(分析纯)、盐酸(分析纯)、丙酮(分析纯)、甲醇(色谱级)。
3.溶液的制备
衍生化试剂：取Nα-(2,4-二硝基-5-氟苯基)-L-丙氨酰胺适量，精密称定，用丙酮溶解并稀释制成每1mL约含10mg的溶液，摇匀。
空白溶剂：精密量取1mol/L碳酸氢钠溶液1mL，置10mL量瓶中，加衍生化试剂3mL，于40℃水浴锅中加热120min，再加2mol/L盐酸溶液1mL，用稀释剂[甲醇/水＝50/50(v/v)]稀释至刻度，摇匀。
供试品溶液取本品适量，精密称定，加水溶解并用稀释剂稀释制成每1mL约含4mg溶液，作为供试品贮备液；精密量取该贮备液1mL，置10mL量瓶中，加1mol/L碳酸氢钠溶液1mL，衍生化试剂3mL，于40℃水浴锅中加热120min，再加2mol/L盐酸溶液1mL，用稀释剂稀释至刻度，摇匀。
对照品一级贮备液取对映异构体对照品适量，精密称定，加水溶解并用稀释剂稀释制成每1mL约含4mg的溶液，作为对照品贮备液；精密量取该贮备液1.0mL，置10mL量瓶中，加1mol/L碳酸氢钠溶液1mL，衍生化试剂3mL，于40℃水浴锅中加热120min，再加2mol/L盐酸溶液1mL，用稀释剂稀释至刻度，摇匀；精密量取该衍生化溶液1.0mL，置20mL量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，作为对照品一级贮备液。
系统适用性溶液精密量取供试品贮备液1mL，置10mL量瓶中，加1mol/L碳酸氢钠溶液1mL，衍生化试剂3mL，于40℃水浴锅中加热120min，再加2mol/L盐酸溶液1mL，对照品一级贮备液1mL，用稀释剂稀释至刻度，摇匀。
4.HPLC-UV条件
色谱柱：Agilent ZORBAX SB-Phenyl，4.6mm×250mm，5μm柱；以水为流动相A；以甲醇为流动相B；按下表进行线性梯度洗脱；检测波长为340nm；柱温为30℃；流速为每分钟1.0mL，进样体积10μl。
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实施例1衍生化等度方法
S-1-氨基-3-氯-2-丙醇盐酸盐及其对映异构体HPLC-UV检测方法
色谱柱：Agilent ZORBAX SB-Phenyl，4.6mm×250mm，5μm柱；以乙腈：水＝20：80进行等度洗脱；检测波长为340nm；柱温为30℃；流速为每分钟1.0mL，进样体积10μl。
实验结果：供试品溶液色谱图中，与空白溶剂色谱图相比，保留时间72.615min处有一明显色谱峰，峰面积为347.376，标记为S-1-氨基-3-氯-2-丙醇盐酸盐(SM2)峰。该方法能有效检出SM2，因此在该方法基础上进行优化。
实施例2衍生化梯度与反应比
色谱柱采用：Agilent ZORBAX SB-Phenyl，4.6mm×250mm，5μm柱；以水为流动相A；以甲醇为流动相B；按下表进行线性梯度洗脱；检测波长为340nm；柱温为30℃；流速为每分钟1.0mL，进样体积10μl。
| 时间(分钟) | 流动相A(％) | 流动相B(％) |
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| 121 | 20 | 80 |
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分别精密量取供试品溶液1.0mL，置10mL量瓶中，加1mol/L碳酸氢钠溶液1mL，分别加衍生化试剂3mL、3.75mL、4.5mL、5.25mL，分别于40℃水浴锅中加热120min，再分别加2mol/L盐酸溶液1mL，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，得1:4～1:7衍生化反应比的衍生化供试品溶液。
实验结果：实际SM2相对峰面积与理论SM2相对峰面积进行比较，当衍生化反应比为1:4时，实际SM2相对峰面积与理论值差值最小，因此衍生化反应比确定为1:4，如下表所示。
实施例3衍生化反应时间
分别精密量取供试品溶液1.0mL，置10mL量瓶中，分别加1mol/L碳酸氢钠溶液1mL，衍生化试剂3mL，分别于40℃水浴锅中加热90min、100min、110min、120min，再分别加2mol/L盐酸溶液1mL，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，得40℃水浴加热90min～120min的衍生化供试品溶液。
实验结果：实际SM2相对峰面积与理论SM2相对峰面积进行比较，当衍生化反应时间为120min时，实际SM2相对峰面积与理论值差值最小，因此衍生化反应时间确定为120min，如下表所示。
专属性及系统适用性
稀释剂：水:甲醇(50:50)。
1mol/L碳酸氢钠溶液：取碳酸氢钠4.2g，精密称定，加水50mL溶解。
2mol/L盐酸溶液：量取盐酸9mL，加水50mL溶解，混匀。
衍生化试剂：精密称取Nα-(2,4-二硝基-5-氟苯基)-L-丙氨酰胺500.23mg，置50mL量瓶中，用丙酮溶解并稀释至刻度，摇匀。
空白溶剂：精密量取1mol/L碳酸氢钠溶液1.0mL，置10mL量瓶中，加衍生化试剂3mL，于40℃水浴锅中加热120min，再加2mol/L盐酸溶液1mL，用稀释剂稀释至刻度，摇匀。
供试品贮备液：精密称取本品40.20mg，置10mL量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀。
对映异构体对照品贮备液：精密称取对映异构体对照品40.26mg、40.10mg，置不同10mL量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀。标记为对映异构体对照品贮备液1、对映异构体对照品贮备液2。
衍生化对映异构体溶液：精密量取对映异构体对照品贮备液1、对映异构体对照品贮备液2各1.0mL，置不同10mL量瓶中，分别加1mol/L碳酸氢钠溶液1mL，衍生化试剂3mL，于40℃水浴锅中加热120min，再加2mol/L盐酸溶液1mL，用稀释剂稀释至刻度，摇匀。标记为衍生化对映异构体溶液1、衍生化对映异构体溶液2。
衍生化对映异构体对照品贮备液：精密量取衍生化对映异构体溶液1、衍生化对映异构体溶液2各2.5mL，置50mL量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，作为衍生化对映异构体对照品贮备液。标记为衍生化对映异构体对照品贮备液1、衍生化对映异构体对照品贮备液2。
系统适用性溶液：取“溶液稳定性”项下0h加标供试品溶液。
对照品溶液：精密量取衍生化对映异构体对照品贮备液1、衍生化对映异构体对照品贮备液2各1.0mL，置10mL量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。标记为对照品溶液1、对照品溶液2。
测定法：精密量取上述空白溶剂、系统适用性溶液、对照品溶液，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。
试验结果见下表：
系统适用性结果表—分离度、理论塔板数、不对称度
| 名称 | 与主峰的分离度 | 理论塔板数 | 不对称度 |
| SM2对映异构体 | 2.08 | 31298 | 1.00 |
系统适用性结果表—峰面积
试验结论：空白溶剂中，SM2峰处略干扰，干扰峰面积为0.111，在检测限及定量限验证项下中，定量限溶液峰面积平均值为0.221，空白溶剂干扰峰面积小于定量限溶液峰面积，符合要求；系统适用性溶液中，SM2对映异构体峰与主峰之间的分离度为2.08，大于1.5，理论塔板数为31298，大于2000，不对称度为1.00，小于2.0；5针对照品溶液峰面积RSD为0.67％，小于2.0％，对照品溶液1与对照品溶液2的f值之比为0.99。该方法专属性及系统适用性良好。
检测限与定量限
检测限和定量限计算溶液：精密量取衍生化对映异构体对照品储备液适量，用稀释液稀释成每1mL含对映异构体2μg的低浓度溶液。
精密量取空白溶液及低浓度溶液各10μl，注入高效液相色谱仪，记录色谱图。按≥10倍信噪比(S/N)计算定量限，按≥3倍信噪比(S/N)计算检测限；
对映异构体及SM2定量限浓度溶液连续进样6针，峰面积的RSD≤10.0％，信噪比均应大于≥10；检测限浓度溶液连续进样3针，信噪比均应大于≥3，并报告定量限浓度与限度浓度的比值。
检测限和定量限计算溶液：取“专属性及系统适用性”项下对照品溶液1。
供试品贮备液：取“专属性及系统适用性”项下供试品贮备液。
衍生化供试品溶液：精密量取供试品贮备液1.0mL，置10mL量瓶中，分别加1mol/L碳酸氢钠溶液1mL，衍生化试剂3mL，于40℃水浴锅中加热120min，再加2mol/L盐酸溶液1mL，用稀释剂稀释至刻度，摇匀。
衍生化对映异构体溶液：取“专属性及系统适用性”项下衍生化对映异构体溶液。
定量限贮备液：精密量取衍生化供试品溶液、衍生化对映异构体溶液各1.0mL，置同一20mL量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀。
定量限溶液：精密量取定量限贮备液0.15mL置10mL量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，作为定量限溶液。
检测限溶液：精密量取定量限溶液5.0mL置10mL量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，作为检测限溶液。
测定法：精密量取检测限溶液及定量限溶液，分别注入液相色谱仪，记录色谱图，其中，检测限溶液连续进样3针，定量限溶液连续进样6针。
试验结果见下表：
定量限与检测限浓度计算结果表
经上述计算，将定量限溶液配制为每1mL约含SM2对映异构体和SM2各0.3μg的溶液，SM2对映异构体和SM2浓度为限度浓度的15％。
检测限结果表
| SM2对映异构体 | SM2 | |
| 检测限溶液1S/N | 11.1 | 9.9 |
| 检测限溶液2S/N | 11.0 | 11.0 |
| 检测限溶液3S/N | 10.4 | 10.7 |
定量限结果表
| SM2对映异构体 | SM2 | |
| 定量限1S/N | 21.0 | 20.9 |
| 定量限2S/N | 20.9 | 20.5 |
| 定量限3S/N | 21.2 | 21.3 |
| 定量限4S/N | 20.9 | 21.2 |
| 定量限5S/N | 21.4 | 21.4 |
| 定量限6S/N | 21.1 | 21.0 |
| 定量限溶液1峰面积 | 0.216 | 0.221 |
| 定量限溶液2峰面积 | 0.221 | 0.225 |
| 定量限溶液3峰面积 | 0.228 | 0.239 |
| 定量限溶液4峰面积 | 0.214 | 0.234 |
| 定量限溶液5峰面积 | 0.230 | 0.246 |
| 定量限溶液6峰面积 | 0.215 | 0.232 |
| 平均值 | 0.221 | 0.233 |
| RSD(％) | 3.14％ | 3.92％ |
| 理论定量限浓度(μg/mL) | 0.300 | 0.300 |
| 实际定量限浓度(μg/mL) | 0.293 | 0.302 |
| 相当于限度浓度的百分比(％) | 14.6％ | 15.1％ |
结论：3针检测限溶液SM2对映异构体与SM2信噪比S/N均大于3，6针定量限溶液SM2对映异构体与SM2信噪比S/N均大于10，峰面积RSD均小于10.0％，定量限浓度分别为限度浓度的14.6％和15.1％，均低于限度浓度的30％。
线性
SM2对照品贮备液：精密称取SM2对照品40.29mg，置10mL量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀。
衍生化SM2对照品溶液：精密量取SM2对照品贮备液1.0mL，置10mL量瓶中，加1mol/L碳酸氢钠溶液1mL，衍生化试剂3mL，于40℃水浴锅中加热120min，再加2mol/L盐酸溶液1mL，用稀释剂稀释至刻度，摇匀。
对映异构体对照品贮备液：精密称取对映异构体对照品40.14mg，置10mL量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀。
衍生化对映异构体溶液：精密量取对映异构体对照品贮备液1.0mL，置10mL量瓶中，加1mol/L碳酸氢钠溶液1mL，衍生化试剂3mL，于40℃水浴锅中加热120min，再加2mol/L盐酸溶液1mL，用稀释剂稀释至刻度，摇匀。
线性贮备液：精密量取衍生化SM2对照品溶液和衍生化对映异构体溶液各1.0mL，置同一20mL量瓶中，加稀释剂稀释至刻度，摇匀。
分别精密量取线性贮备液的系列贮备液，分别置于置于10mL量瓶中，加稀释剂稀释至刻度，摇匀，配成衍生化SM2对照品溶液和衍生化对映异构体分别约为0.3、1.0、0.6、2.0、3.0、4.0μg/mL的溶液。
以峰面积对浓度作线性图，SM2对映异构体与SM2线性相关系数r均大于0.990，y轴截距与100％响应值之比均小于25％，SM2与SM2对映异构体线性回归方程斜率K比值为1.05(介于0.9～1.1之间)，表明可以采用面积归一化法。
溶液稳定性
溶液配制：供试品储备液：同“专属性及系统适用性”项下供试品储备液。
衍生化对映异构体对照品储备液：同“专属性及系统适用性”项下衍生化对映异构体对照品储备液。
加标供试品溶液：量取供试品储备液1mL，置10mL量瓶中，加1mol/L碳酸氢钠溶液1mL，衍生化试剂3mL，于40℃水浴锅中加热120min，再加2mol/L盐酸溶液1mL，衍生化对映异构体对照品储备液1mL，用稀释液稀释至刻度，摇匀，作为加标供试品溶液。
测定法：对加标供试品溶液进行24小时的溶液稳定性考察，分别不同时间点进样，记录色谱图。
试验结果见下表：
溶液稳定性结果表(室温)
结论：加标供试品溶液在室温下放置24h，各峰面积与0h峰面积比较，比值均在90％～110％范围内，表明该溶液在24h内稳定。
重复性
溶液配制：供试品储备液：同“专属性及系统适用性”项下供试品储备液。
衍生化对映异构体对照品储备液：同“专属性及系统适用性”项下衍生化对映异构体对照品储备液。
对照品溶液：同“专属性及系统适用性”项下对照品溶液，平行配制2份。
衍生化供试品溶液：同“专属性及系统适用性”项下衍生化供试品溶液。平行配制2份。
加标供试品溶液：同“溶液稳定性”项下加标供试品溶液。平行配制6份。
测定法：精密量取对照品溶液、供试品溶液和加标供试品，注入气相色谱仪，记录色谱图。
试验结果见下表：
重复性结果表
结论：6份加标供试品溶液中，SM2对映异构体回收率均在80％～120％之间，RSD小于10％。该方法重复性良好。
中间精密度
在同一实验室，不同的日期，不同的仪器，由不同的分析人员再进行重复性试验。
设分析人员的代码为A和B，仪器的代码为I和II。
第一天：A，I，第二天：B，II。
照重复性项下实验过程操作。
试验结果见下表：
中间精密度结果表
与重复性结果对比表
结论：中间精密度6份加标供试品溶液中，各溶剂的回收率均在80％～120％之间，RSD均小于10％，与重复性共12份加标供试品溶液，各溶剂的回收率均在80％～120％之间，共12份回收率的RSD均小于15％。该分析方法中间精密度良好。
准确度
溶液配制：衍生化对映异构体对照品储备液：同“专属性及系统适用性”项下衍生化对映异构体对照品储备液。
供试品储备液：同“专属性及系统适用性”项下供试品储备液。
对照品溶液：同“专属性及系统适用性”项下对照品溶液，平行配制2份。
衍生化供试品溶液：同“专属性及系统适用性”项下衍生化供试品溶液，平行配制2份。
定量限浓度溶液：量取供试品储备液1mL，置10mL量瓶中，加1mol/L碳酸氢钠溶液1mL，衍生化试剂3mL，于40℃水浴锅中加热120min，再加2mol/L盐酸溶液1mL，对照品溶液1.5mL，用稀释液稀释至刻度，摇匀，平行配制3份。
100％限度浓度溶液：量取供试品储备液1mL，置10mL量瓶中，加1mol/L碳酸氢钠溶液1mL，衍生化试剂3mL，于40℃水浴锅中加热120min，再加2mol/L盐酸溶液1mL，衍生化对映异构体对照品储备液1mL，用稀释液稀释至刻度，摇匀，平行配制3份。
150％限度浓度溶液：量取供试品储备液1mL，置10mL量瓶中，加1mol/L碳酸氢钠溶液1mL，衍生化试剂3mL，于40℃水浴锅中加热120min，再加2mol/L盐酸溶液1mL，衍生化对映异构体对照品储备液1.5mL，用稀释液稀释至刻度，摇匀，平行配制3份。
测定法：取上述对照品溶液、衍生化供试品溶液，定量限浓度溶液、100％限度浓度溶液和150％限度浓度溶液，注入气相色谱仪，记录色谱图。
试验结果见下表：
准确度结果表
结论：在定量限、100％限度、150％限度浓度加标供试品溶液中，SM2对映异构体回收率均在80％～120％之间，9份加标供试品溶液的回收率RSD小于10％。该分析方法准确度良好。
耐用性
耐用性考察因素及变动范围见下表：
耐用性考察因素及变动范围表
供试品贮备液：取“重复性”项下供试品贮备液。
衍生化对映异构体对照品贮备液：取“重复性”项下衍生化对映异构体对照品贮备液1。
系统适用性溶液：精密量取供试品贮备液1.0mL，置10mL量瓶中，加1mol/L碳酸氢钠溶液1mL，衍生化试剂3mL，于40℃水浴锅中加热120min，再加2mol/L盐酸溶液1mL，衍生化对映异构体对照品贮备液1mL，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，作为加标供试品溶液。测定法：取系统适用性溶液注入液相色谱仪，记录色谱图。
试验结果见下表：
耐用性结果统计表
结论：将柱温、检测波长、流速、流动相初始比例进行微小调整后，对映异构体与主峰之间的分离度均大于1.5，对映异构体峰理论塔板数均大于2000，不对称度均小于2.0。
样品检测
按经过验证后的色谱条件，进行样品检测，检测结果见下表：
样品检测结果
| 批号 | 20210201 | 20211210 |
| 对映异构体(％) | 0.09％ | 0.09％ |
验证结果表明：本方法专属性及系统适用性良好；检测灵敏度符合要求，线性良好；溶液在24h内稳定；准确度良好；在同一实验室不同的日期，不同的仪器，由不同的分析人员测定结果的精密度良好；改变柱温28℃～32℃、检测波长338nm～342nm、流速0.95～1.05mL/min，流动相初始比例94:6～96:4，系统适用性符合要求，耐用性良好；综上所述，本方法可用于S-1-氨基-3-氯-2-丙醇盐酸盐及其对映异构体的测定。
Claims (5)
1.一种测定S-1-氨基-3-氯-2-丙醇盐酸盐及其对映异构体的方法，其特征在于，包括如下步骤：采用苯基键合硅胶为填充剂并使用水-甲醇混合溶剂为流动相进行分析检测。
2.根据权利要求1所述S-1-氨基-3-氯-2-丙醇盐酸盐及其对映异构体的方法，其特征在于：色谱柱选自Agilent ZORBAX SB-Phenyl，4.6mm×250mm，5μm或效能相当的色谱柱。
3.根据权利要求1所述S-1-氨基-3-氯-2-丙醇盐酸盐及其对映异构体的方法，其特征在于，具体包括如下步骤：A、衍生化溶液制备；B、HPLC分析；C、按面积归一化法计算对映异构体含量。
4.根据权利要求3所述S-1-氨基-3-氯-2-丙醇盐酸盐及其对映异构体的方法，其特征在于，衍生化溶液制备过程为：
(1)取Nα-(2,4-二硝基-5-氟苯基)-L-丙氨酰胺适量，精密称定，用丙酮溶解并稀释制成每1mL含10mg溶液，摇匀，作为衍生化试剂；
(2)精密量取1mol/L碳酸氢钠溶液1mL，置10mL量瓶中，加衍生化试剂3mL，于40℃水浴锅中加热120min，再加2mol/L盐酸溶液1mL，用稀释剂[甲醇/水＝50/50(v/v)]稀释至刻度，摇匀，作为空白溶剂；
(3)取本品适量，精密称定，加水溶解并用稀释剂稀释制成每1mL约含4mg的溶液，作为供试品贮备液；精密量取该贮备液1mL，置10mL量瓶中，加1mol/L碳酸氢钠溶液1mL，衍生化试剂(Nα-(2,4-二硝基-5-氟苯基)-L-丙氨酰胺)3mL，于40℃水浴锅中加热120min，再加2mol/L盐酸溶液1mL，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。
5.根据权利要求3所述S-1-氨基-3-氯-2-丙醇盐酸盐及其对映异构体的方法，其特征在于，HPLC分析过程为：
(1)选用色谱柱，以水为流动相A；以甲醇为流动相B；按下表进行线性梯度洗脱；
(2)设置流动相流速为1.0mL/min；
(3)设置液相色谱柱温箱温度为30℃；检测波长340nm；进样量为10μL。
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