CN116448935A - 同时检测并分离五种高浓度奥硝唑注射液杂质的高效液相色谱法 - Google Patents
同时检测并分离五种高浓度奥硝唑注射液杂质的高效液相色谱法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于药物的检测本发明属于药物的检测技术领域，具体涉及同时检测并分离五种高浓度奥硝唑注射液杂质的高效液相色谱法。本发明所述的同时检测并分离五种高浓度奥硝唑注射液杂质的高效液相色谱法：包括检测条件如下：流速：0.9mL/min‑1.1mL/min；柱温：28℃‑32℃；进样量：7μL‑20μL；色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；理论塔板数大于5000；流速：1.0mL/min；检测波长：318nm；流动相：以甲醇为流动相A，以磷酸二氢钾溶液为流动相B，进行梯度洗脱。本发明提供的同时检测并分离五种高浓度奥硝唑注射液杂质的高效液相色谱法，专属性强、灵敏度高、精密度好。
Description
技术领域
本发明属于药物的检测技术领域，具体涉及同时检测并分离五种高浓度奥硝唑注射液杂质的高效液相色谱法。
背景技术
奥硝唑作为第三代硝基咪唑类药物，具有更好的抗厌氧菌活性。目前，中国药典收载有奥硝唑注射液（奥硝唑的灭菌水溶液）的质量标准。
目前，对于奥硝唑原料药或者注射液中的杂质，有奥硝唑杂质A（2-甲基-5-硝基咪唑），奥硝唑杂质B（1-（2,3-二羟基丙基）-2-甲基-5-硝基咪唑），奥硝唑杂质C（1-(2-甲基-5-硝基-1-咪唑基)-丙酮），奥硝唑杂质D（1-(2，3-环氧基丙基)-2-甲基-5-硝基咪唑），奥硝唑杂质E（1-(2-甲基-4-硝基咪唑基)-3-(2-甲基-5-硝基咪唑基)-2-丙醇），但是对于杂质含量微小的情况下同时检测其含量，限度较大。并且在奥硝唑注射液的制备及存放过程中受温度以及光照条件的影响，其杂质含量明显升高，以现有的技术难以实现其同时检测并实现良好分离的目的。
CN102539564A公开了一种奥硝唑注射液杂质的检测方法及含量测定方法，公开一种HPLC法对以下三种杂质的检测，其杂质为1-氯-3-(2-甲基-5-硝基-1H-咪唑-1-基)丙-2-醇、2-甲基-5-硝基咪唑、1-(3-氯-丙烯基)-2-甲基-5-硝基咪唑、1-丙酮基-2-甲基-5-硝基咪唑，采用的固定相为以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，流动相：乙腈-水体积比为（15-25）:（75-85）或甲醇-水体积比为（15-25）:（75-85），流速为0.8-1.2mL/min，柱温为30-40℃，检测波长为305-315nm，理论板数按奥硝唑峰计算应不低于2500；实现简便、快速、精确控制产品质量的目的。此方法等同于中国药典方法，其中此专利中只检测了几种杂质，难以同时检测多种杂质。
CN112213407A公开了一种左奥硝唑有关物质的检测方法，采用四种对照品，分别是2-甲基-5-硝基咪唑，1-(2,3-环氧丙基)-2-甲基-5-硝基咪唑，1-(2,3-二羟丙基)-2-甲基-5-硝基咪唑，s-(-)-1-(3-氯-2-羟基丙基)-2-甲基-4-硝基咪唑，1-丙酮基-2-甲基-5-硝基咪唑，以甲醇为流动相A，以水为流动相B，进行梯度洗脱，增加了对新的杂质的检测，意义重大。此方法同时用于检测提到的物种杂质，分离度低，准确率低。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有技术存在的以上问题，提供一种同时检测并分离五种高浓度奥硝唑注射液杂质的高效液相色谱法，专属性强、灵敏度高、精密度好，且具有良好的线性和准确度，有效检测并分离奥硝唑注射液中的五种已知杂质及其它未知杂质，并且大幅度提高了杂质的检出能力。
本发明所述的同时检测并分离五种高浓度奥硝唑注射液杂质的高效液相色谱法，包括以下步骤：
（1）系统适用性溶液的配制：精密称取奥硝唑原料，置于量瓶中，精密加入奥硝唑杂质A、B、C、D、E贮备液及甲醇溶液溶解，并用甲醇溶液稀释至刻度，摇匀；
（2）供试品溶液的配制：精密量取奥硝唑注射液置于量瓶中，用甲醇溶液稀释至刻度；
（3）对照溶液的配制：精密量取供试品溶液，置于量瓶中，用甲醇溶液稀释至刻度，摇匀。
（4）测定方法：分别精密量取甲醇溶液、系统适用性溶液、供试品溶液、对照溶液，分别注入液相色谱仪，记录色谱图；采用峰面积自身对照法计算未知杂质的含量。
选择检测条件如下：
流速：0.9mL/min-1.1mL/min；
柱温：28℃-32℃；
进样量：7μL-20μL；
色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；
理论塔板数大于5000；
流速：1.0mL/min；
检测波长：318nm；
流动相：以甲醇为流动相A，以0.005-0.1mol/L磷酸二氢钾溶液为流动相B，进行梯度洗脱，洗脱程序如表1所示。
表1 洗脱程序
色谱柱为Wondasil C18-WR型号，规格为4.6×250mm。
系统适用性溶液的配制：精密称取奥硝唑原料100mg，置于20mL量瓶中，精密加入奥硝唑杂质A、奥硝唑杂质B、奥硝唑杂质C、奥硝唑杂质D、奥硝唑杂质E贮备液各1mL及20wt.%甲醇溶液溶解，并用20wt.%甲醇溶液稀释至刻度，摇匀，得到含奥硝唑杂质A、奥硝唑杂质B、奥硝唑杂质C、奥硝唑杂质D、奥硝唑杂质E均为5μg/mL，奥硝唑为5mg/mL的溶液。
供试品溶液的配制：精密量取奥硝唑注射液3mL置于100mL量瓶中，用20wt.%甲醇溶液稀释至刻度，奥硝唑浓度为5mg/mL。
对照溶液的配制：精密量取供试品溶液1mL，置于50mL量瓶中，用20wt.%甲醇溶液稀释至刻度，摇匀，再精密量取1mL，置于20mL量瓶中，用20wt.%甲醇溶液稀释至刻度，摇匀，奥硝唑浓度为5μg/mL。
奥硝唑的主峰与杂质峰的分离度≥1.5，杂质之间的分离度≥1.2。
供试品溶液的色谱图中经校正后的奥硝唑杂质A、奥硝唑杂质C、奥硝唑杂质E的峰面积，均不大于对照溶液的奥硝唑主峰面积的0.10%，奥硝唑杂质B、奥硝唑杂质D的峰面积均不大于对照溶液的奥硝唑主峰面积的0.10%。
奥硝唑杂质A校正因子0.80、杂质C校正因子0.85、杂质E校正因子0.77。
与现有技术相比，本发明具有的有益效果是：
（1）采用本发明的高效液相色谱法，可以同时检测并分离五种高浓度奥硝唑注射液杂质，分离度好。
（2）采用本发明的高效液相色谱法，专属性强、灵敏度高、精密度好，且具有良好的线性和准确度，可有效检测并分离奥硝唑注射液中的杂质，杂质检出能力强。
附图说明
图1为采用中国药典的方法检测未被高温破坏的样品色谱图。
图2为采用中国药典的方法检测持续破坏10天的样品的色谱图。
图3为原料厂家方法检测持续破坏10天的样品的色谱图。
图4为本发明的方法开发中对照试验1的色谱图。
图5为本发明的方法开发中对照试验2的色谱图。
图6为本发明的方法开发中对照试验3的色谱图。
图7为本发明的方法开发中试验4的高温破坏的样品的色谱图。
图8为本发明的方法开发中试验4的强光4500LX破坏的样品的色谱图。
图9为本发明方法检测系统适用性图谱。
图10为本发明方法检测奥硝唑注射液图谱。
图11为中国药典方法检测系统适用性图谱。
图12为中国药典方法检测奥硝唑注射液图谱。
图13为专利CN112213407A方法检测系统适用性图谱。
图14为专利CN112213407A方法检测奥硝唑注射液图谱。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明。
通过以下部分来具体说明本发明方案的实施与现有技术的对照，以及对本发明方法的方法学论证和本发明方法的实践应用。
以下所用的试验仪器与药品规格为：
高效液相色谱仪：岛津SHIMADZU，SPD-20A/SPD-M20A和LC-2030C plus；电子天平：岛津SHIMADZU，AUW120D；电子天平：METTLER TOLEDO，XPR2/A；光照试验仪：北京天星科仪科技有限公司，LS-4000UVL。
奥硝唑对照品：中国食品药品检定研究院，批号100608-202003，含量99.9%；奥硝唑杂质A对照品：中国食品药品检定研究院，批号100512-202005，含量100%；奥硝唑杂质B：TLC，批号1950-036A2，含量97.8%；奥硝唑杂质C，深圳卓越，批号20200115，含量98.63%；奥硝唑杂质D：中国食品药品检定研究院，批号101346-201501，含量98.5%；奥硝唑杂质E，TLC，批号3560-014A4，含量98.0%；奥硝唑注射液：山东海雅医药科技有限公司，批号2106291、2106301、2107011；参比制剂：Laboratoires SERB，批号2700。
本发明的同时检测并分离五种高浓度奥硝唑注射液杂质的高效液相色谱法，包括以下步骤：
（1）系统适用性溶液的配制：精密称取奥硝唑原料100mg，置于20mL量瓶中，精密加入奥硝唑杂质A、奥硝唑杂质B、奥硝唑杂质C、奥硝唑杂质D、奥硝唑杂质E贮备液各1mL及20wt.%甲醇溶液溶解，并用20wt.%甲醇溶液稀释至刻度，摇匀，得到含奥硝唑杂质A、奥硝唑杂质B、奥硝唑杂质C、奥硝唑杂质D、奥硝唑杂质E均为5μg/mL，奥硝唑为5mg/mL的溶液。
（2）供试品溶液的配制：精密量取奥硝唑注射液3mL置于100mL量瓶中，用20wt.%甲醇溶液稀释至刻度，奥硝唑浓度为5mg/mL。
（3）对照溶液的配制：精密量取供试品溶液1mL，置于50mL量瓶中，用20wt.%甲醇溶液稀释至刻度，摇匀，再精密量取1mL，置于20mL量瓶中，用20wt.%甲醇溶液稀释至刻度，摇匀，奥硝唑浓度为5μg/mL。
（4）测定方法：分别精密量取甲醇溶液、系统适用性溶液、供试品溶液、对照溶液，分别注入液相色谱仪，记录色谱图；采用峰面积自身对照法计算未知杂质的含量；
选择检测条件如下：
流速：0.9mL/min-1.1mL/min；
柱温：28℃-32℃；
进样量：7μL-20μL；
色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，为Wondasil C18-WR型号，规格为4.6×250mm，5μm；
理论塔板数大于5000；
流速：1.0mL/min；
检测波长：318nm；
流动相：以甲醇为流动相A，以0.005-0.1mol/L磷酸二氢钾溶液为流动相B，进行梯度洗脱。
实施例1
采用上述的方法，对奥硝唑注射液在80℃蒸馏加热8h，室温放置16h，如此5个循环破坏后的样品，进行检测，其中流动相B的浓度为0.01mol/L磷酸二氢钾溶液，流速为1.0mL/min，柱温为30℃，进样量为20μL，按照表2所示的洗脱程序进行梯度洗脱。其色谱图如图7所示，由图7可以看出，各个杂质峰分离好。满足奥硝唑的主峰与杂质峰的分离度≥1.5，杂质之间的分离度≥1.2的要求。
表2 洗脱程序
实施例2
与实施例1完全相同的条件与步骤，不同的是将对奥硝唑注射液的处理为：强光4500LX持续破坏50天的，然后进行检测，其检测的色谱图如图8所示，由图8可以看出，各个杂质峰分离好。同样满足奥硝唑的主峰与杂质峰的分离度≥1.5，杂质之间的分离度≥1.2的要求。
实施例3
所述的同时检测并分离五种高浓度奥硝唑注射液杂质的高效液相色谱法，包括以下步骤：
（1）系统适用性溶液的配制：精密称取奥硝唑原料100mg，置于20mL量瓶中，精密加入奥硝唑杂质A、奥硝唑杂质B、奥硝唑杂质C、奥硝唑杂质D、奥硝唑杂质E贮备液各1mL及20wt.%甲醇溶液溶解，并用20wt.%甲醇溶液稀释至刻度，摇匀，得到含奥硝唑杂质A、奥硝唑杂质B、奥硝唑杂质C、奥硝唑杂质D、奥硝唑杂质E均为5μg/mL，奥硝唑为5mg/mL的溶液。
（2）供试品溶液的配制：精密量取奥硝唑注射液3mL置于100mL量瓶中，用20wt.%甲醇溶液稀释至刻度，奥硝唑浓度为5mg/mL。
（3）对照溶液的配制：取奥硝唑杂质A、奥硝唑杂质B、奥硝唑杂质C、奥硝唑杂质D、奥硝唑杂质E和奥硝唑对照品各约5mg，分别置50mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为奥硝唑杂质A、奥硝唑杂质B、奥硝唑杂质C、奥硝唑杂质D、奥硝唑杂质E和奥硝唑对照品贮备液。
（4）测定方法：分别精密量取甲醇溶液、系统适用性溶液、供试品溶液、对照溶液，分别注入液相色谱仪，记录色谱图；采用峰面积自身对照法计算未知杂质的含量；
选择检测条件如下：
流速：1.0mL/min；
柱温：30℃；
进样量：20μL；
色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，为Wondasil C18-WR型号，规格为4.6×250mm，5μm；
理论塔板数大于5000；
流速：1.0mL/min；
检测波长：318nm；
流动相：以甲醇为流动相A，以0.01mol/L磷酸二氢钾溶液为流动相B，按照表1进行梯度洗脱。
检测出的谱图如图9所示，系统适用性溶液中杂质之间的最小分离度为1.813，如图10所示，同一奥硝唑注射液供试品中检出杂质的峰面积之和为199748。
实施例4
采用实施例1的同时检测并分离五种高浓度奥硝唑注射液杂质的高效液相色谱法，对三批样品及参比制剂的奥硝唑注射液及其杂质的检测，对奥硝唑注射液连续3批样品及参比制剂有关物质进行测定，检测结果如下。
自制样品2106291批：奥硝唑杂质A小于对照溶液主峰面积0.05倍、奥硝唑杂质B小于对照溶液主峰面积0.05倍、奥硝唑杂质C未检出、奥硝唑杂质D为0.010%、奥硝唑杂质E为0.0039%、其他最大单杂为0.025%，均小于0.10%，总杂为0.056%，小于0.4%，符合要求。
自制样品2106301批：奥硝唑杂质A小于对照溶液主峰面积0.05倍、奥硝唑杂质B小于对照溶液主峰面积0.05倍、奥硝唑杂质C未检出、奥硝唑杂质D为0.010%、奥硝唑杂质E为0.0039%、其他最大单杂为0.025%，均小于0.10%，总杂为0.056%，小于0.4%，符合要求。
自制样品2107011批：奥硝唑杂质A小于对照溶液主峰面积0.05倍、奥硝唑杂质B小于对照溶液主峰面积0.05倍、奥硝唑杂质C未检出、奥硝唑杂质D为0.010%、奥硝唑杂质E为0.0038%、其他最大单杂为0.025%，均小于0.10%，总杂为0.055%，小于0.4%，符合要求。
参比制剂2700：奥硝唑杂质A未检出、奥硝唑杂质B小于对照溶液主峰面积0.05倍、奥硝唑杂质C未检出、奥硝唑杂质D未检出、奥硝唑杂质E为0.029%、其他最大单杂为0.029%，均小于0.10%，总杂为0.096%，小于0.4%，符合要求。
结论：分别对自制样品进行考察，检出的已知杂质种类基本一致，检出的含量略有差异。自制样品与参比制剂相比，均满足限度要求。
进一步对以上方法进行探索、方法学验证。
1、本发明的方法的探索
1.1、供试品溶液浓度的选择
中国药典方法的供试品溶液浓度为0.1mg/mL，原料厂家方法的供试品溶液浓度为0.5mg/mL，经分析，中国药典的杂质供试品溶液浓度与含量测定的供试品溶液浓度相同，其杂质的供试品溶液浓度过小，在此浓度下杂质不能被有效检测到。将供试品溶液浓度加大到5mg/mL进行方法筛选试验。
1.2、不同方法对高温考察样品检测情况
中国药典方法：
采用中国药典奥硝唑注射液的检测方法（流动相：甲醇:水（20:80））进行奥硝唑注射液及其杂质的检测，对高温60℃持续破坏10天的样品检测发现图谱中6.5min~10min之前出现鼓包如图2所示，但未高温破坏的样品无此情况出现，如图1所示，表明使用此方法供试品中的杂质不能完全分离，因此中国药典方法不适用高温破坏后的奥硝唑注射液。
原料厂家方法：
进行奥硝唑原料厂家的梯度方法对奥硝唑注射液经高温60℃持续破坏10天的样品的检测情况，具体试验结果如下。
奥硝唑原料方法：色谱条件：以甲醇-水-冰醋酸（20:80:0.1）为流动相，检测波长为317nm，其色谱图如图3所示，显示在保留时间2-8min之间杂质峰聚集，难以分离。
1.3、方法开发
通过试验发现，流动相用梯度洗脱的方式，对高温考察样品杂质的分离检测效果较等度法稍好些，但通过试验不同的梯度程序发现，基线的波动无法消除。采用高温降解样品，通过调整流动相，继续试验。对照试验1-3检测时采用的色谱柱同为PHenomenex LunaC18，4.6×250mm，5μm，流速同为1mL/min；柱温：30℃、进样量20μL。
对照试验1：色谱条件以流动相A为：甲醇；流动相B为：0.01mol/L的磷酸二氢钾，进行梯度洗脱，洗脱程序如表3所示。
表3 洗脱程序
试验样品是在高温60℃连续降解10天的奥硝唑注射液（配制后再高温放置9天），然后进行高效液相色谱检测，色谱图如图4所示。结果可以看出，在保留时间28-32min之间杂质峰较为密集，无法有效分离。
对照试验2：采用试验1的方法，色谱条件以流动相A为：甲醇；流动相B为：0.01mol/L的磷酸二氢钾，按照如表4所示的洗脱程序进行梯度洗脱，试验样品与试验1相同，然后进行高效液相色谱检测，色谱图如图5所示。由如图5可以看出，虽然各杂质峰之间的分离度大为改观，但是各个杂质之间仍旧不能完全分离。
表4 洗脱程序
对照试验3：采用试验1的方法，色谱条件以流动相A为：甲醇；流动相B为：0.01mol/L磷酸二氢钾。按照如表5所示的洗脱程序进行梯度洗脱，试验样品为高温60℃降解20天奥硝唑注射液（配制后再放置7天），然后进行高效液相色谱检测，色谱图如图6所示。由如图6可以看出，虽然主峰与主峰之后的杂质峰分离效果大为改观，但是结果仍不理想。
表5 洗脱程序
由以上可以看出，采用对照实验1-3采用不同的色谱柱，与其他洗脱条件时，均不能满足奥硝唑的主峰与杂质峰的分离度≥1.5，杂质之间的分离度≥1.2的要求。
1.4、与现有方法对同一奥硝唑注射液杂质检出能力的比较
溶液配制
（1）对照品贮备液：取奥硝唑杂质A、奥硝唑杂质B、奥硝唑杂质C、奥硝唑杂质D、奥硝唑杂质E和奥硝唑对照品各约5mg，分别置50mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为奥硝唑杂质A、奥硝唑杂质B、奥硝唑杂质C、奥硝唑杂质D、奥硝唑杂质E和奥硝唑对照品贮备液。
（2）系统适用性溶液：精密称取奥硝唑原料100mg，置20mL量瓶中，精密加入奥硝唑杂质A、奥硝唑杂质B、奥硝唑杂质C、奥硝唑杂质D、奥硝唑杂质E贮备液各1mL及20wt.%甲醇溶液溶解，并用20wt.%甲醇溶液稀释至刻度，摇匀，得到含奥硝唑杂质A、奥硝唑杂质B、奥硝唑杂质C、奥硝唑杂质D、奥硝唑杂质E均为5μg/mL，奥硝唑为5mg/mL的溶液。
（3）供试品溶液：精密量取奥硝唑注射液3mL置100mL量瓶中，用20wt.%甲醇溶液稀释至刻度，奥硝唑浓度为5mg/mL。
分别采用如下方法进行检测：
（1）本发明方法
检测图谱见附图9-10。系统适用性溶液中杂质之间的最小分离度为1.813，同一奥硝唑注射液供试品中检出杂质的峰面积之和为199748。
（2）中国药典方法
检测图谱见附图11-12。系统适用性溶液中杂质之间的最小分离度为1.399。同一奥硝唑注射液供试品中检出杂质的峰面积之和为63062。
（3）公开专利CN112213407A方法
检测图谱见附图13-14。系统适用性溶液中杂质之间的最小分离度为0.888。同一奥硝唑注射液供试品中检出杂质的峰面积之和为101031。
由现有方法对同一浓度系统适用性溶液的检测情况看出，本发明方法检测结果杂质之间的分离度为1.813，大于1.5，满足色谱检测要求；而中国药典方法检测结果杂质之间的分离度为1.399，基本符合要求；公开专利CN112213407A方法检测结果杂质之间的分离度为0.888，小于1.2，不符合要求。对同一奥硝唑注射液供试品中检出杂质的峰面积结果可以看出，本发明方法明显大于已公开方法。即本发明方法具有明显的分离度和检出能力优势。
2、方法学验证
对本发明奥硝唑注射液有关物质分析方法进行验证，主要内容包括：专属性、系统适用性、检测限、定量限、线性、校正因子、精密度、准确度及耐用性等方面的验证。
2.1系统适用性和专属性
分别精密吸取空白溶剂、各杂质定位溶液、系统适用性溶液、空白辅料溶液、供试品溶液和对照溶液各20μL注入高效液相色谱仪，进行检测。
要求：系统适用性溶液中主峰及各杂质峰的理论塔板数大于5000，主峰与杂质峰的分离度≥1.5，奥硝唑杂质A、奥硝唑杂质B、奥硝唑杂质C、奥硝唑杂质D、奥硝唑杂质E杂质峰间的分离度≥1.2。空白溶剂、空白辅料不干扰主峰及杂质峰的测定。
结果：系统适用性溶液中主峰及各杂质峰的理论塔板数最小为20646，大于5000；主峰与杂质峰的分离度为7.352，大于1.5；杂质峰间的分离度最小为2.007，大于1.2。空白溶剂、空白辅料不干扰主峰及杂质峰的测定。
2.2奥硝唑注射液破坏性试验
进行奥硝唑注射液在不同条件下的破坏降解试验，通过破坏后主峰与杂质峰的分离情况、破坏前后质量守恒情况、色谱系统的适用性，考察所建立的色谱条件对奥硝唑注射液有关物质检测的适用性。
检测时供试品浓度为5mg/mL，进样量为20μL，在该进样量情况下，奥硝唑主峰超载，无法判断供试品溶液在破坏前后的质量守恒情况及主峰纯度。因此对破坏后的供试品溶液先以正常20μL进样量检测，考察破坏后主峰与杂质峰的分离情况及杂质情况，分离满足要求后再减少进样量，以不超载的7μL（相当于供试品浓度为1.75mg/mL）进样检测，考察破坏前后的质量守恒情况及主峰纯度。
要求：各破坏条件下，空白破坏溶液不影响主峰和杂质峰的检测，主峰与杂质峰间的分离度大于1.5，主峰纯度合格，各条件破坏前后质量守恒。
奥硝唑注射液的破坏性条件：
未破坏样品：
供试品溶液：取奥硝唑注射液3mL置100mL量瓶中，用20wt.%甲醇定容至刻度，摇匀，即得。
空白溶剂为20wt.%甲醇溶液。
酸破坏：
供试品溶液：取奥硝唑注射液3mL置100mL量瓶中，加入4mL1mol/LHCl溶液，混匀，在室温下放置1h进行强降解，降解后的样品，加入4mL1mol/LNaOH溶液调节至中性，加20wt.%甲醇溶液稀释至刻度，摇匀，即得。
酸空白：取4mL1mol/LHCl溶液置100mL量瓶中，加入4mL1mol/LNaOH溶液，混匀，加入20wt.%甲醇溶液稀释至刻度，摇匀，即得。
碱破坏：
供试品溶液：取奥硝唑注射液3mL置100mL量瓶中，加入0.1mL1mol/LNaOH溶液，混匀，在室温下放置1h进行强降解，降解后的样品，加入0.1mL1mol/LHCl溶液调节至中性，加20wt.%甲醇溶液稀释至刻度，摇匀，即得。
碱空白：取0.1mL1mol/LNaOH溶液置100mL量瓶中，加入0.1mL1mol/LHCl溶液，混匀，加入20wt.%甲醇溶液稀释至刻度，摇匀，即得。
氧化破坏：
供试品溶液：取奥硝唑注射液3mL置100mL量瓶中，加入5mL30%双氧水，混匀，在室温下放置1h进行强降解，降解后的样品，用20wt.%甲醇溶液定容至刻度，摇匀，即得。
氧化空白：取5mL30%双氧水置100mL量瓶中，用20wt.%甲醇溶液稀释至刻度，摇匀，即得。
强光破坏：
供试品溶液：取经4500lux±500lux光照强度下放置6天进行强降解的奥硝唑注射液3mL置100mL量瓶中，用20wt.%甲醇溶液定容至刻度，摇匀，即得。
高温破坏：
供试品溶液：取经80℃加热48h进行强降解的奥硝唑注射液3mL置100mL量瓶中，用20wt.%甲醇定容至刻度，摇匀，即得。
结果：
质量守恒值计算与评价：未破坏样品奥硝唑杂质A/V系数（总峰面积与样品量比值）与各破坏后样品的奥硝唑杂质A/V系数的比值即为质量守恒值。质量守恒值：未破坏样品为1、酸破坏为0.99、碱破坏为0.99、氧化破坏为1.01、强光破坏为0.97、高温破坏为0.99，均位于0.9～1.1之间，即质量守恒。
峰纯度：纯度相似度大于等于阈值，表明样品纯度合格。未破坏样品为1.000000、酸破坏为0.999999、碱破坏为0.999999、氧化破坏为1.000000、强光破坏为1.000000、高温破坏为0.999999。
结论：各破坏条件下，空白破坏溶液不影响主峰和杂质峰的检测，主峰与杂质峰间的分离度最小为6.730，大于1.5，主峰纯度合格，各条件破坏前后质量守恒，表明该色谱条件下专属性好。
2.3定量限和检测限
取奥硝唑杂质A、奥硝唑杂质B、奥硝唑杂质C、奥硝唑杂质D、奥硝唑杂质E对照品，分别用甲醇制成每1mL中含杂质对照品为0.1mg的贮备液，精密量取上述贮备液适量，用20wt.%甲醇溶液稀释至一定浓度，取此溶液注入液相色谱仪，进行检测。
以各物质主峰信噪比约为3:1作为检测限。
以各物质主峰信噪比约为10:1作为定量限。取定量限溶液分别连续进样6次，计算检测结果的重复性。
要求：各杂质6次重复性结果的主峰保留时间的相对标准偏差应不大于1%、峰面积的相对标准偏差应不大于10%。
检测限结果：经检测，拟定奥硝唑注射液有关物质测定浓度为5mg/mL，在该浓度下，奥硝唑杂质A的定量限浓度为0.003864μg/mL，奥硝唑杂质B的定量限浓度为0.004997μg/mL，奥硝唑杂质C的定量限浓度为0.006057μg/mL，奥硝唑杂质D的定量限浓度为0.007888μg/mL，奥硝唑杂质E的定量限浓度为0.007560μg/mL，表明奥硝唑注射液色谱条件检测灵敏度高，适合进行有关物质测定。
定量限结果：（1）拟定奥硝唑有关物质测定浓度为5mg/mL，奥硝唑杂质A的定量限浓度为0.012880μg/mL，奥硝唑杂质B的定量限浓度为0.016656μg/mL，奥硝唑杂质C的定量限浓度为0.020192μg/mL，奥硝唑杂质D的定量限浓度为0.026295μg/mL，奥硝唑杂质E的定量限浓度为0.025201μg/mL，方法灵敏度高。
（2）各成分定量限溶液连续进样6针，保留时间RSD小于1%，峰面积RSD均小于10%，满足定量要求，精密度良好。
2.4线性考察和范围
考察奥硝唑注射液有关物质测定线性，即在0.25μg/mL~10μg/mL杂质峰面积与浓度之间的关系，具体如下：
取奥硝唑杂质A、奥硝唑杂质B、奥硝唑杂质C、奥硝唑杂质D、奥硝唑杂质E和奥硝唑对照品各约5mg，精密称定，分别置50mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，制成每1mL中含杂质和奥硝唑对照品为0.1mg的贮备液，分别精密量取上述贮备液1mL置10mL量瓶中，用20wt.%甲醇溶液稀释制成每1mL中含奥硝唑杂质A、奥硝唑杂质B、奥硝唑杂质C、奥硝唑杂质D、奥硝唑杂质E和奥硝唑对照品为10μg的混合对照品溶液（10μg/mL），精密量取混合对照品溶液，逐级稀释，制成每1mL中含杂质分别为10μg、8μg、5μg、3μg、1μg、0.5μg、0.25μg的线性溶液。
精密量取上述各线性溶液注入液相色谱仪，记录数据。以浓度（C）为横坐标（X轴），以峰面积（A）为纵坐标（Y轴），进行线性回归分析。
要求：各杂质和奥硝唑浓度与峰面积线性关系良好，线性回归方程的相关系数r≥0.999。
结果：奥硝唑在0.252397~10.09589μg/mL浓度范围内，线性方程为y=51758x-700.49，r=0.9999，具有良好的线性关系；奥硝唑杂质A在0.257600~10.30400μg/mL浓度范围内，线性方程为y=65714x+8.0159，r=0.9999，具有良好的线性关系；奥硝唑杂质B在0.277605～11.10421μg/mL浓度范围内，线性方程为y=56649x+256.55，r=0.9999，具有良好的线性关系；奥硝唑杂质C在0.252394～10.09577μg/mL浓度范围内，线性方程为y=62410x-1031.4，r=0.9999，具有良好的线性关系；奥硝唑杂质D在0.262946～10.51783μg/mL浓度范围内，线性方程为y=53870x-1151，r=0.9999，具有良好的线性关系；奥硝唑杂质E在0.252007～10.08028μg/mL浓度范围内，线性方程为y=67806x-71.462，r=0.9999，具有良好的线性关系。
2.5相对校正因子
2.5.1相对校正因子的计算
根据线性考察结果项下绘制的主成分奥硝唑浓度和杂质浓度对其峰面积的回归曲线，以主成分奥硝唑回归曲线斜率与杂质回归曲线斜率的比计算校正因子。
2.5.2校正因子的确认
奥硝唑原料项下有关物质方法验证，确认的校正因子标示为：奥硝唑杂质A校正因子0.80、奥硝唑杂质B校正因子0.91、奥硝唑杂质C校正因子0.85、奥硝唑杂质D校正因子0.96、奥硝唑杂质E校正因子0.77、奥硝唑杂质B和奥硝唑杂质D的校正因子位于0.9～1.1之间。
要求：测得校正因子与标示校正因子的相对偏差应≤2.0%。
结果：奥硝唑杂质A测得校正因子为0.79、与标示校正因子0.80的相对偏差为0.63%，小于2.0%。
奥硝唑杂质B测得校正因子为0.91、位于0.9～1.1之间，符合要求。
奥硝唑杂质C测得校正因子为0.83、与标示校正因子0.85的相对偏差为1.20%，小于2.0%。
奥硝唑杂质D测得校正因子为0.96、位于0.9～1.1之间，符合要求。
奥硝唑杂质E测得校正因子为0.76、与标示校正因子0.77的相对偏差为0.66%，小于2.0%。
结论：本次验证测得奥硝唑杂质A、奥硝唑杂质C、奥硝唑杂质E的校正因子与标示校正因子的相对偏差均小于2.0%，奥硝唑杂质B、奥硝唑杂质D的校正因子均位于0.9～1.1之间，符合对校正因子的验证要求。根据ICH和化学药物杂质研究指导原则的相关要求，当校正因子在0.9～1.1，即默认其相对校正因子为1.0，对杂质可以直接采用不加校正因子的主成分自身对照法进行定量计算。因此奥硝唑杂质A校正因子为0.80，奥硝唑杂质B校正因子为1.0，奥硝唑杂质C校正因子为0.85，奥硝唑杂质D校正因子为1.0，奥硝唑杂质E校正因子为0.77合理。
2.6准确度
为了考察奥硝唑注射液有关物质测定方法的准确度，进行回收率测定。采用杂质定量加入法，对样品中定量加入限度浓度的50%、100%、150%的杂质进行回收率试验，具体如下：
杂质对照品贮备液：取奥硝唑杂质A、奥硝唑杂质B、奥硝唑杂质C、奥硝唑杂质D、奥硝唑杂质E对照品各约5mg，精密称定，分别置50mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，制成每1mL中含杂质对照品为0.1mg的贮备液。
样品贮备液（浓溶液）：精密移取奥硝唑注射液9mL置30mL量瓶中，加20wt.%甲醇溶液稀释至刻度，摇匀。
未加杂质供试品溶液：精密量取样品贮备液（浓溶液）2mL置20mL量瓶中，加20wt.%甲醇溶液稀释至刻度，摇匀，即得未加杂质供试品溶液（与制剂供试品同浓度）。
对照溶液：精密量取未加杂质供试品溶液1mL置20mL量瓶中，用20wt.%甲醇溶液稀释至刻度，摇匀，再精密量取1mL置50mL量瓶中，用20wt.%甲醇溶液稀释至刻度，摇匀，即得。
杂质对照品溶液：精密量取奥硝唑杂质A、奥硝唑杂质B、奥硝唑杂质C、奥硝唑杂质D、奥硝唑杂质E对照品贮备液各1mL置同一20mL量瓶中，加20wt.%甲醇溶液稀释至刻度，摇匀，即得。
回收率（杂质添加）溶液：精密量取样品浓溶液2mL置20mL量瓶中，同法制备9份，每3份为一组，取对照品奥硝唑杂质A、奥硝唑杂质B、奥硝唑杂质C、奥硝唑杂质D、奥硝唑杂质E贮备液进行添加，第1组添加0.5mL，第2组添加1.0mL，第3组添加1.5mL，用20wt.%甲醇溶液稀释至刻度，摇匀，分别得到含各杂质量相当于50%、100%、150%限度浓度的杂质添加溶液。
分别精密量取上述溶液各20μL注入高效液相色谱仪进行检测。分别按外标法和自身对照法计算回收率。
要求：各杂质外标法回收率在90%～108%范围内，RSD≤10%；自身对照法与外标法回收率的差值的绝对值应≤15%。
结果：奥硝唑杂质A不同浓度外标法回收率为99.92%~101.85%、RSD为0.54%；自身对照法回收率为104.80%~106.82%，RSD为0.54%；自身对照法与外标法回收率的差值的绝对值为4.88%~4.94%。
奥硝唑杂质B不同浓度外标法回收率为101.04%~103.27%、RSD为0.80%；自身对照法回收率为114.43%~116.96%，RSD为0.80%；自身对照法与外标法回收率的差值的绝对值为13.39%~13.69%。
奥硝唑杂质C不同浓度外标法回收率为100.62%~101.91%、RSD为0.43%；自身对照法回收率为105.34%~106.69%，RSD为0.43%；自身对照法与外标法回收率的差值的绝对值为4.72%~4.78%。
奥硝唑杂质D不同浓度外标法回收率为92.58%~98.90%、RSD为2.18%；自身对照法回收率为99.59%~106.39%，RSD为2.18%；自身对照法与外标法回收率的差值的绝对值为7.01%~7.49%。
奥硝唑杂质E不同浓度外标法回收率为99.08%~100.81%、RSD为0.57%；自身对照法回收率为104.49%~106.31%，RSD为0.57%；自身对照法与外标法回收率的差值的绝对值为5.41%~5.50%。
各杂质外标法回收率在90%～108%范围内，RSD＜10%；自身对照法与外标法回收率的差值的绝对值＜15%，说明此方法准确度较高。
2.7精密度试验
2.7.1重复性试验
平行配制6份奥硝唑注射液供试品溶液，进行有关物质测定，验证有关物质测定方法的重复性，同时考察系统适用性。
分别精密吸取系统适用性溶液、供试品溶液和对照溶液各20μL注入高效液相色谱仪，进行检测。
要求：系统适用性符合要求，有关物质含量的重复性RSD≤10%。
结果：6次测定奥硝唑杂质A、奥硝唑杂质B、奥硝唑杂质C均未检出，奥硝唑杂质D的RSD值为1.32%，奥硝唑杂质E的RSD值为2.04%，其他最大单杂的RSD值为0.60%，总杂质的RSD值为0.57%。RSD均小于10%，表明本法重复性良好。
2.7.2中间精密度试验
取奥硝唑注射液，分别于不同时间、不同试验员、不同仪器进行检测，平行配制6份样品，进行有关物质测定，同时考察系统适用性，与重复性试验的6份样品检测结果做统计分析。
分别精密吸取系统适用性溶液、供试品溶液和对照溶液各20μL注入高效液相色谱仪，进行检测。
要求：系统适用性符合要求，12份样品有关物质含量的中间精密度RSD≤15%。
结果：12次测定奥硝唑杂质A、奥硝唑杂质B、奥硝唑杂质C均未检出，奥硝唑杂质D的RSD值为12.58%，奥硝唑杂质E的RSD值为2.86%，其他最大单杂的RSD值为1.28%，总杂质的RSD值为1.42%。
结论：由重复性试验和中间精密度试验所得12组数据可知：奥硝唑杂质A、奥硝唑杂质B、奥硝唑杂质C均未检出，奥硝唑杂质D、奥硝唑杂质E的RSD均＜15%，总杂质和其他单杂均无明显变化，表明有关物质方法精密度良好。
2.8耐用性
考察色谱条件进行微小变化，对测定结果的影响程度，对色谱条件中的柱温、流速、色谱柱品牌进行试验。
考察色谱条件发生微小变化，对奥硝唑注射液有关物质检测结果的影响程度，具体方法如下：在不同柱温、不同流速、不同色谱柱条件下，分别检测奥硝唑注射液的有关物质，考察对样品测定结果的影响程度。
2.8.1注射液有关物质耐用性-不同柱温
奥硝唑注射液有关物质检测方法柱温拟定为30℃，考察柱温发生微小变化，对系统适用性及供试品有关物质测定的影响。
调整柱温为28℃、32℃，分别精密量取空白溶剂、系统适用性溶液、对照溶液和供试品溶液分别注入液相色谱仪，记录色谱图。考察不同柱温对系统适用性溶液中各杂质分离度的影响以及对样品测定结果的影响。
要求：系统适用性符合要求，不同柱温有关物质含量的RSD≤10%。
结果：不同柱温条件下，空白溶剂不干扰主峰及杂质峰的测定，系统适用性溶液中主峰及各杂质峰的理论塔板数大于5000，主峰与杂质峰的分离度均大于1.5，奥硝唑杂质A、奥硝唑杂质B、奥硝唑杂质C、奥硝唑杂质D、奥硝唑杂质E峰间的分离度均大于1.2，符合要求；供试品溶液中奥硝唑杂质A、奥硝唑杂质B、奥硝唑杂质C均未检出，奥硝唑杂质D、奥硝唑杂质E、其他最大单杂和总杂质的含量RSD均小于10%，基本无明显变化，表明该方法耐用性良好。
2.8.2注射液有关物质耐用性-不同流速
奥硝唑注射液有关物质测定流速拟定为1.0mL/min，考察流速发生微小变化，对系统适用性及供试品有关物质测定的影响。
调整流速为0.9mL/min、1.1mL/min，分别精密量取空白溶剂、系统适用性溶液、对照溶液和供试品溶液分别注入液相色谱仪。考察不同流速对系统适用性溶液中各杂质分离度的影响以及对样品测定结果的影响。
要求：系统适用性符合要求，不同流速有关物质含量的RSD≤10%。
结果：不同流速条件下，空白溶剂不干扰主峰及杂质峰的测定，系统适用性溶液中主峰及各杂质峰的理论塔板数大于5000，主峰与杂质峰的分离度≥1.5，奥硝唑杂质A、奥硝唑杂质B、奥硝唑杂质C、奥硝唑杂质D、奥硝唑杂质E杂质峰间的分离度均大于1.2，符合要求；供试品溶液中奥硝唑杂质A、奥硝唑杂质B、奥硝唑杂质C均未检出，奥硝唑杂质D、奥硝唑杂质E、其他最大单杂和总杂质的含量RSD均小于10%，基本无明显变化，表明该方法耐用性良好。
2.8.3注射液有关物质耐用性-不同色谱柱
比较不同色谱柱对奥硝唑有关物质测定结果的影响，采用不同色谱柱分别进行了系统适用性考察和供试品有关物质检查。采用的色谱柱信息如下：
色谱柱1：岛津Wondasil C18-WR 4.6×250mm
色谱柱2：pHenomenex Luna C18 250×4.6mm
色谱柱3：thermo BDS Hypersil C18 250×4.6mm
色谱柱4：岛津Shim-pack Giss C18 4.6×250mm
精密量取空白辅料溶液、系统适用性溶液、对照溶液和供试品溶液分别注入液相色谱仪。考察不同色谱柱对系统适用性溶液中各杂质分离度的影响以及对样品测定结果的影响。
要求：系统适用性符合要求，不同色谱柱有关物质含量的RSD≤10%。
结果：色谱柱2供试品溶液中奥硝唑杂质B与最大单杂峰位置重合，导致供试品图谱中出现双头峰；色谱柱3主峰出峰时间过快，保留时间为31.8mim，常规条件为39.6min，导致主峰与相邻峰的分离度不好，且最大单杂峰拖尾严重，拖尾因子为2.216；色谱柱4中主峰出峰时间过慢，保留时间52.0min，主峰与主峰之后的小杂质峰分离度不好；色谱柱1的杂质检出情况及分离效果均优于其它色谱柱，且能满足分析方法全过程的验证要求，因此本法需指定色谱柱型号，指定色谱柱1岛津Wondasil C18-WR 4.6×250mm为本法检测用色谱柱。
验证结论：该方法专属性强、灵敏度高、精密度好，且具有良好的线性和准确度，可有效检测奥硝唑注射液的有关物质；检测溶液需临用现制或者采用低温进样器检测，样品溶液在冷藏（2～8℃）条件下12小时内溶液稳定；耐用性试验显示奥硝唑注射液色谱条件中的柱温、流速进行微小变动，对有关物质测定无影响，但需要指定色谱柱岛津WondasilC18-WR 4.6×250mm进行检测。
Claims (7)
1.一种同时检测并分离五种高浓度奥硝唑注射液杂质的高效液相色谱法，其特征在于：包括以下步骤：
（1）系统适用性溶液的配制：精密称取奥硝唑原料，置于量瓶中，精密加入奥硝唑杂质A、奥硝唑杂质B、奥硝唑杂质C、奥硝唑杂质D、奥硝唑杂质E贮备液及甲醇溶液溶解，并用甲醇溶液稀释至刻度，摇匀；
（2）供试品溶液的配制：精密量取奥硝唑注射液置于量瓶中，用甲醇溶液稀释至刻度；
（3）对照溶液的配制：精密量取供试品溶液，置于量瓶中；
（4）测定方法：分别精密量取甲醇溶液、系统适用性溶液、供试品溶液、对照溶液，分别注入液相色谱仪，记录色谱图；采用峰面积自身对照法计算未知杂质的含量；
选择检测条件如下：
流速：0.9mL/min-1.1mL/min；
柱温：28℃-32℃；
进样量：7μL-20μL；
色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；
理论塔板数大于5000；
流速：1.0mL/min；
检测波长：318nm；
流动相：以甲醇为流动相A，以0.005-0.1mol/L磷酸二氢钾溶液为流动相B，进行梯度洗脱，洗脱程序为：
。
2.根据权利要求1所述的同时检测并分离五种高浓度奥硝唑注射液杂质的高效液相色谱法，其特征在于：色谱柱为Wondasil C18-WR型号，规格为4.6×250mm。
3.根据权利要求1所述的同时检测并分离五种高浓度奥硝唑注射液杂质的高效液相色谱法，其特征在于：系统适用性溶液的配制：精密称取奥硝唑原料100mg，置于20mL量瓶中，精密加入奥硝唑杂质A、奥硝唑杂质B、奥硝唑杂质C、奥硝唑杂质D、奥硝唑杂质E贮备液各1mL及20wt.%甲醇溶液溶解，并用20wt.%甲醇溶液稀释至刻度，摇匀，得到含奥硝唑杂质A、奥硝唑杂质B、奥硝唑杂质C、奥硝唑杂质D、奥硝唑杂质E均为5μg/mL，奥硝唑为5mg/mL的溶液。
4.根据权利要求1所述的同时检测并分离五种高浓度奥硝唑注射液杂质的高效液相色谱法，其特征在于：供试品溶液的配制：精密量取奥硝唑注射液3mL置于100mL量瓶中，用20wt.%甲醇溶液稀释至刻度，奥硝唑浓度为5mg/mL。
5.根据权利要求1所述的同时检测并分离五种高浓度奥硝唑注射液杂质的高效液相色谱法，其特征在于：对照溶液的配制：精密量取供试品溶液1mL，置于50mL量瓶中，用20wt.%甲醇溶液稀释至刻度，摇匀，再精密量取1mL，置于20mL量瓶中，用20wt.%甲醇溶液稀释至刻度，摇匀，奥硝唑浓度为5μg/mL。
6.根据权利要求1所述的同时检测并分离五种高浓度奥硝唑注射液杂质的高效液相色谱法，其特征在于：奥硝唑的主峰与杂质峰的分离度≥1.5，杂质之间的分离度≥1.2。
7.根据权利要求1所述的同时检测并分离五种高浓度奥硝唑注射液杂质的高效液相色谱法，其特征在于：供试品溶液的色谱图中经校正后的奥硝唑杂质A、奥硝唑杂质C、奥硝唑杂质E的峰面积，均不大于对照溶液的奥硝唑主峰面积的0.10%，奥硝唑杂质B、奥硝唑杂质D的峰面积均不大于对照溶液的奥硝唑主峰面积的0.10%。
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