CN114200031A - 利伐沙班中间体ⅲ中杂质(s)-1-氨基-3-氯-2-丙醇盐酸盐的检测方法 - Google Patents

利伐沙班中间体ⅲ中杂质(s)-1-氨基-3-氯-2-丙醇盐酸盐的检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了利伐沙班中间体Ⅲ中杂质(S)‑1‑氨基‑3‑氯‑2‑丙醇盐酸盐的检测方法。本发明采用高效液相色谱法，对样品进行柱前在线衍生化，以OPA(邻苯二甲醛)为衍生化试剂，硼酸盐为缓冲液，十八烷基硅烷键合硅胶为填料的色谱柱，采用一定比例的磷酸氢二钾水溶液及乙腈为流动相等度洗脱。本方法能够有效分离和测定利伐沙班中间体Ⅲ及其基因毒性杂质(S)‑1‑氨基‑3‑氯‑2‑丙醇盐酸盐，方法简便可行，重现性好。

Description

利伐沙班中间体Ⅲ中杂质(S)-1-氨基-3-氯-2-丙醇盐酸盐的 检测方法
技术领域
本发明属于药物分析技术领域，涉及利伐沙班中间体Ⅲ中杂质(S)-1-氨基-3-氯-2-丙醇盐酸盐的检测方法，具体涉及4-(4-((5S)-5-(氨基甲基)-2-氧代-1,3-噁烷基-3-基)苯基)吗啉-3-酮盐酸盐中基因毒性杂质(S)-1-氨基-3-氯-2-丙醇盐酸盐的检测方法。
背景技术
利伐沙班由拜耳(Bayer)和杨森(Janssen)联合开发，首先于2008年9月15日获加拿大卫生部批准上市，然后于2008年9月30日获欧洲药物管理局(EMA)批准上市，又于2011年7月1日获美国食品药品监督管理局(FDA)批准上市。利伐沙班是一种选择性凝血因子Xa抑制剂。它既能够抑制单独的凝血因子Xa，也能抑制结合在凝血酶原复合物上面的凝血因子Xa。利伐沙班对血小板聚集没有直接效果，但是对由凝血酶引起的血小板聚集有间接作用。通过抑制凝血因子Xa，利伐沙班降低凝血酶的生成。
4-(4-((5S)-5-(氨基甲基)-2-氧代-1,3-噁烷基-3-基)苯基)吗啉-3-酮盐酸盐作为合成利伐沙班的关键中间体(以下简称利伐沙班中间体III)，其杂质控制是保证利伐沙班安全性和有效性的重要因素之一，因此确定利伐沙班中间体Ⅲ中基因毒性杂质(S)-1-氨基-3-氯-2-丙醇盐酸盐的检测方法具有重要意义。
(S)-1-氨基-3-氯-2-丙醇盐酸盐是在制备利伐沙班中间体Ⅲ过程中的降解产物，且降解产物无紫外吸收，因此如何准确测定基因毒性杂质(S)-1-氨基-3-氯-2-丙醇盐酸盐成为一个亟待解决的问题。
利伐沙班中间体Ⅲ及(S)-1-氨基-3-氯-2-丙醇盐酸盐的结构式分别为：
Figure BDA0002690304650000011
在现行版各国药典和文献中均未收载(S)-1-氨基-3-氯-2-丙醇盐酸盐相关的检测方法。为了有效分析药品质量，保证用药安全，需开发利伐沙班中间体Ⅲ中基因毒性杂质(S)-1-氨基-3-氯-2-丙醇盐酸盐的检测方法，该方法需有较高的灵敏度，且(S)-1-氨基-3-氯-2-丙醇盐酸盐与相邻峰之间应能完全分离。
发明内容
有鉴于此，根据利伐沙班中间体Ⅲ及(S)-1-氨基-3-氯-2-丙醇盐酸盐的结构特征，本发明的目的在于提供一种利伐沙班中间体Ⅲ中基因毒性杂质(S)-1-氨基-3-氯-2-丙醇盐酸盐的检测方法。该方法首次将柱前在线衍生化的方法运用于利伐沙班中间体Ⅲ的检测中，以OPA作为衍生化试剂，硼酸盐作为缓冲液，采用高效液相色谱法，以十八烷基硅烷键合硅胶为填料的色谱柱，以磷酸氢二钾水溶液:乙腈为流动相，能对(S)-1-氨基-3-氯-2-丙醇盐酸盐的残留浓度进行有效测定和控制，该方法专属性强，灵敏度高，方便快速、准确度高，对保证利伐沙班的安全性和可靠性，具有重要意义。
本发明的目的可通过以下技术方案实现：
一种4-(4-((5S)-5-(氨基甲基)-2-氧代-1,3-噁烷基-3-基)苯基)吗啉-3-酮盐酸盐中基因毒性杂质(S)-1-氨基-3-氯-2-丙醇盐酸盐的检测方法，包括在进样前以邻苯二甲醛为衍生化试剂，硼酸盐为缓冲液，对供试品溶液或对照品溶液进行柱前在线衍生化；再采用高效液相色谱法检测衍生化物。
作为本发明的一种优选，所述邻苯二甲醛浓度为1～20mg/ml，优选10mg/ml；硼酸盐的pH值为8～11，优选10.2，所述的柱前在线衍生化方法为：吸取硼酸盐及待检测样品适量，混合液在清洗口充分混合，等待0.5～1min，吸取OPA与混合液在清洗口充分混合，等待0.5～1min，进样。
作为本发明的进一步优选，硼酸盐缓冲液取样量为0μl～8.0μl，优选4μl；邻苯二甲醛溶液取样量为2.0μl～8.0μl，优选4.0μl；待测样品或对照溶液的取样量为10～20μl，优选15μl。
作为本发明的一种优选，所述的高效液相色谱法的检测条件为：检测器：高效液相色谱仪-紫外可见光检测器；色谱柱的固定相为十八烷基硅烷键合硅胶；柱温为25℃～45℃，优选35℃；流动相为磷酸氢二钾水溶液：乙腈，流速为0.6ml/min～1.6ml/min，优选1.4ml/min。
作为本发明的进一步优选，所述的磷酸氢二钾水溶液的浓度为0.005mol/L～0.015mol/L、pH值为4.0～9.0，其中浓度优选0.01mol/L、pH优选6.5。
作为本发明的更进一步优选，所述的流动相中磷酸氢二钾水溶液与乙腈的比例为70:30～90:10，优选83:17。
作为本发明的进一步优选，所述的检测方法，包含以下步骤：
1)称取(S)-1-氨基-3-氯-2-丙醇盐酸盐适量，制备对照品溶液；
2)称取待检测的4-(4-((5S)-5-(氨基甲基)-2-氧代-1,3-噁烷基-3-基)苯基)吗啉-3-酮盐酸盐适量，制备供试品溶液；
3)取待检测的对照品溶液和供试品溶液，以邻苯二甲醛为衍生化试剂，硼酸盐为缓冲液，进行柱前在线衍生化；
4)采用高效液相色谱法分别对所述的对照品溶液、供试品溶液进行检测；检测条件为：
检测器：高效液相色谱仪-紫外可见光检测器；色谱柱的固定相为十八烷基硅烷键合硅胶；柱温为25℃～45℃，流动相为磷酸氢二钾水溶液：乙腈＝70:30～90:10，流速为0.6ml/min～1.6ml/min，等度洗脱，其中，所述的磷酸氢二钾水溶液的浓度为0.005mol/L～0.015mol/L、pH值为4.0～9.0。
作为本发明的进一步优选，所述的高效液相色谱法的柱温为35℃；流动相为磷酸氢二钾水溶液：乙腈＝83:17，流速为1.4ml/min。
结果计算：供试品溶液中如有(S)-1-氨基-3-氯-2-丙醇盐酸盐，按外标法以峰面积计算。
本发明的有益效果在于：
(1)本发明首次将柱前在线衍生化的方式运用于利伐沙班中间体Ⅲ的检测中，以OPA作为衍生化试剂，硼酸盐作为缓冲液，样品前处理方式操作简单，检测具有高灵敏、快速有效、准确度高等特点，容易控制；
(2)本发明提供的一种利伐沙班中间体Ⅲ中基因毒性杂质(S)-1-氨基-3-氯-2-丙醇盐酸盐的检测方法，实现了杂质的有效控制，确保了产品的质量，并最终确定了产品的安全有效。
附图说明
图1为空白溶剂的高效液相色谱图；
图2为重复性试验中灵敏度溶液的高效液相色谱图；
图3为重复性试验中系统适用性溶液的高效液相色谱图；
图4为重复性试验中对照品溶液的高效液相色谱图；
图5为重复性试验中供试品溶液的高效液相色谱图；
图6为重复性试验中加标供试品溶液的高效液相色谱图；
图7为色谱条件参数变化表
图8为色谱条件改变试验结果表
具体实施方式
所举实施例是为了更好地对本发明的内容进行说明，但不是本发明的内容仅限于所举实施例。所以熟悉本领域的技术人员根据上述发明内容对实施方案进行非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。
本发明具体的实施方式中使用的利伐沙班中间体Ⅲ、对照品、设备、衍生化试剂均为已知产品，利伐沙班中间体Ⅲ为本公司制备品，对照品、设备、衍生化试剂通过购买市售产品获得。
主要设备来源如下：
1260型高效液相色谱仪，购自安捷伦公司；
OPA衍生化试剂，购自安捷伦公司；
硼酸盐，购自安捷伦公司；
ZORBAX Extend-C18色谱柱(4.6*150mm，5μm)，购自安捷伦公司；
供试品及杂质对照品的主要来源如下：
利伐沙班中间体Ⅲ的批号为181101，来源于南京恒生制药有限公司；
(S)-1-氨基-3-氯-2-丙醇盐酸盐的批号为R19090580，含量为95.2％，来源于Accela。
Figure BDA0002690304650000041
实施例1本发明的检测分析方法的方法学研究
本实施例中试验条件如下：
仪器：Agilent 1260液相色谱仪
色谱柱：ZORBAX Extend-C18色谱柱(4.6*150mm，5μm)
检测器检测波长：336nm
柱温：35℃
流动相：0.01mol/L磷酸氢二钾水溶液(pH6.5)：乙腈(83：17)
运行时间：40min
流动相流速：1.4ml/min
样品预处理方式为：吸取硼酸盐4.0μl、样品15.0μl，在清洗口，19.0μl混合液混合5次，等待0.5min，吸取OPA 4.0μl，23.0μl上一步所得混合液在清洗口混合10次，等待0.5min，进样。
溶液配制：
以20％乙腈作为稀释液，即为空白溶剂。
取(S)-1-氨基-3-氯-2-丙醇盐酸盐适量，加稀释液稀释成每1ml中含(S)-1-氨基-3-氯-2-丙醇盐酸盐约5μg的溶液作为对照品贮备液。
精密量取对照品贮备液2ml，置50ml量瓶中，稀释液稀释定容，制成每1ml含(S)-1-氨基-3-氯-2-丙醇盐酸盐约0.2μg的对照品溶液。
配制方法同对照品溶液，同法配制重复对照品溶液。
精密量取对照品溶液3ml，置10ml量瓶中，稀释液稀释定容，制成每1ml含(S)-1-氨基-3-氯-2-丙醇盐酸盐约0.06μg的灵敏度溶液。
取利伐沙班中间体Ⅲ适量，置50ml量瓶中，再精密加入对照品贮备液2ml，稀释液稀释溶解定容，制成每1ml含利伐沙班中间体Ⅲ约2mg、(S)-1-氨基-3-氯-2-丙醇盐酸盐约0.2μg的系统适用性溶液。
取利伐沙班中间体Ⅲ适量，加稀释液稀释成每1ml中含利伐沙班中间体Ⅲ约2mg的供试品溶液。
1、系统适用性试验
按溶液配制方法制备空白溶剂、灵敏度溶液、系统适用性溶液、对照品溶液及重复对照品溶液，按上述色谱条件进样检测，记录色谱图，测定结果见表1。
表1系统适用性试验结果表
Figure BDA0002690304650000051
结论：灵敏度溶液中，(S)-1-氨基-3-氯-2-丙醇盐酸盐信噪比大于10；系统适用性溶液中，(S)-1-氨基-3-氯-2-丙醇盐酸盐峰与相邻杂质峰的分离度大于1.5；对照品溶液峰面积RSD均小于10.0％，保留时间RSD均小于1.0％；重复对照品溶液响应值回收率为99.5％，系统适用性试验结果均符合要求。
2、专属性试验
按溶液配制方法制备空白溶剂及对照品溶液，按上述色谱条件进样检测，记录色谱图，测定结果见表2。
表2专属性试验结果表
名称 (S)-1-氨基-3-氯-2-丙醇盐酸盐出峰时间min
对照品溶液 13.706
空白溶剂 未出峰
结论：空白溶剂对检测无干扰。
3、定量限与检测限试验
按溶液配制方法制备灵敏度溶液即为定量限溶液。
精密量取定量限溶液3ml，置10ml量瓶中，加稀释液稀释定容，作为检测限溶液。
取定量限溶液及检测限溶液，按上述色谱条件进样检测，记录色谱图，测定结果见表3、表4。
表3检测限试验结果表
Figure BDA0002690304650000061
表4定量限试验结果表
Figure BDA0002690304650000062
结论：检测限溶液相当于供试品浓度的百分比为0.00043％，连续进样3次S/N均不小于3.0，符合要求；定量限溶液相当于供试品浓度的百分比为0.0014％，6份定量限溶液S/N均大于10.0，峰面积RSD为7.1％，符合要求。
4、线性试验
按溶液配制方法制备对照品贮备液即为线性贮备液。
分别精密量取线性贮备液0.6ml、1ml、1.6ml、2ml、1.2ml、1.5ml，置于50ml、50ml、50ml、50ml、25ml、25ml量瓶中，加稀释液稀释定容，摇匀，作为30％、50％、80％、100％、120％、150％线性溶液。按上述色谱条件进样检测，记录色谱图，测定结果见表5。
表5线性试验结果表
Figure BDA0002690304650000063
Figure BDA0002690304650000071
结论：在0.05737μg/ml～0.2893μg/m浓度范围内，(S)-1-氨基-3-氯-2-丙醇盐酸盐回归方程为y＝26.036x+0.1023，相关系数r为0.9921(n＝6)，响应值为1.9％，响应因子的RSD为5.1％，均符合线性试验要求。
5、重复性试验
按溶液配制方法制备的系统适用性溶液即为重复性溶液，平行配制6份。按上述色谱条件进样检测，记录色谱图，测定结果见表6。
表6重复性试验结果表
Figure BDA0002690304650000072
结论：6份重复性溶液中(S)-1-氨基-3-氯-2-丙醇盐酸盐回收率在98.3％～106.3％之间，回收率的RSD为3.6％，符合重复性试验要求。
6、中间精密度试验
按溶液配制方法制备的系统适用性溶液即为中间精密度溶液，平行配制6份。按上述色谱条件进样检测，记录色谱图，测定结果见表7。
表7中间精密度试验结果表
Figure BDA0002690304650000073
Figure BDA0002690304650000081
结论：6份中间精密度溶液中(S)-1-氨基-3-氯-2-丙醇盐酸盐回收率在91.2％～105.7％之间，回收率的RSD为7.3％；结合重复性试验结果，12份精密度溶液中(S)-1-氨基-3-氯-2-丙醇盐酸盐回收率在91.2％～106.3％之间，回收率的RSD为5.7％，符合精密度试验要求。
7、准确度试验
按溶液配制方法制备的对照品贮备液即为准确度贮备液。
称取利伐沙班中间体Ⅲ约200mg共9份，精密称定，分别置50ml量瓶中，分别精密加入准确度贮备液0.6ml、2ml、3ml各3份，加稀释液稀释定容，摇匀，作为准确度溶液。按上述色谱条件进样检测，记录色谱图，测定结果见表8。
表8准确度试验结果表
Figure BDA0002690304650000082
结论：准确度溶液中30％水平、100％水平、150％水平的加标供试品溶液回收率为99.2％～118.8％，RSD为6.1％，符合准确度试验要求。
8、溶液稳定性试验
按溶液配制方法制备对照品溶液及系统适用性溶液(即为加标供试品溶液)。按上述色谱条件进样检测，记录色谱图，测定结果见表9。
表9溶液稳定性试验结果表
Figure BDA0002690304650000083
Figure BDA0002690304650000091
对照品溶液中(S)-1-氨基-3-氯-2-丙醇盐酸盐峰面积RSD为3.4％，说明对照品溶液18小时内稳定；加标供试品溶液中(S)-1-氨基-3-氯-2-丙醇盐酸盐峰面积RSD为2.6％，说明加标供试品溶液48小时内稳定。
9、色谱条件改变试验
按溶液配制方法制备空白溶剂、灵敏度溶液、系统适用性溶液、对照品溶液、重复对照品溶液及供试品溶液。按图7色谱条件参数变化表进样检测，记录色谱图，测定结果见图8谱条件改变试验结果表。
结论：(1)改变色谱条件后，系统适用性均符合要求；(2)在各条件下的供试品溶液，(S)-1-氨基-3-氯-2-丙醇盐酸盐均未检出，符合要求。以上数据证明色谱条件改变，所有结果均符合要求。
综上所述，本发明提供了一种利伐沙班中间体Ⅲ中基因毒性杂质(S)-1-氨基-3-氯-2-丙醇盐酸盐的检测方法，首次将柱前在线衍生化的方法运用于利伐沙班中间体Ⅲ的检测中，该方法系统适用性、专属性、定量限及检测限、线性、精密度、准确度及耐用性等均良好，为监控利伐沙班中间体Ⅲ中基因毒性杂质(S)-1-氨基-3-氯-2-丙醇盐酸盐，提供了一种行之有效的检测方法，进一步保证了产品质量和患者的用药安全。
同时，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本方案予以说明，本领域的普通技术人员应当理解，对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范当中。

Claims (8)

1.一种4-(4-((5S)-5-(氨基甲基)-2-氧代-1,3-噁烷基-3-基)苯基)吗啉-3-酮盐酸盐中基因毒性杂质(S)-1-氨基-3-氯-2-丙醇盐酸盐的检测方法，其特征在于，包括在进样前以邻苯二甲醛为衍生化试剂，硼酸盐为缓冲液，对供试品溶液或对照品溶液进行柱前在线衍生化；再采用高效液相色谱法检测衍生化物。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述邻苯二甲醛浓度为1～20mg/ml，优选10mg/ml；硼酸盐的pH值为8～11，优选10.2，所述的柱前在线衍生化方法为：吸取硼酸盐及待检测样品适量，混合液在清洗口充分混合，等待0.5～1min，吸取OPA与混合液在清洗口充分混合，等待0.5～1min，进样。
3.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，硼酸盐缓冲液取样量为0μl～8.0μl，优选4μl；邻苯二甲醛溶液取样量为2.0μl～8.0μl，优选4.0μl；待测样品或对照溶液的取样量为10～20μl，优选15μl。
4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述的高效液相色谱法的检测条件为：检测器：高效液相色谱仪-紫外可见光检测器；色谱柱的固定相为十八烷基硅烷键合硅胶；柱温为25℃～45℃，优选35℃；流动相为磷酸氢二钾水溶液：乙腈，流速为0.6ml/min～1.6ml/min，优选1.4ml/min。
5.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，所述的磷酸氢二钾水溶液的浓度为0.005mol/L～0.015mol/L、pH值为4.0～9.0，其中浓度优选0.01mol/L、pH优选6.5。
6.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，所述的流动相中磷酸氢二钾水溶液与乙腈的比例为70:30～90:10，优选83:17。
7.根据权利要求1～6中任一项所述的检测方法，其特征在于，包含以下步骤：
1)称取(S)-1-氨基-3-氯-2-丙醇盐酸盐适量，制备对照品溶液；
2)称取待检测的4-(4-((5S)-5-(氨基甲基)-2-氧代-1,3-噁烷基-3-基)苯基)吗啉-3-酮盐酸盐适量，制备供试品溶液；
3)取待检测的对照品溶液和供试品溶液，以邻苯二甲醛为衍生化试剂，硼酸盐为缓冲液，进行柱前在线衍生化；
4)采用高效液相色谱法分别对所述的对照品溶液、供试品溶液进行检测；检测条件为：检测器：高效液相色谱仪-紫外可见光检测器；色谱柱的固定相为十八烷基硅烷键合硅胶；柱温为25℃～45℃，流动相为磷酸氢二钾水溶液：乙腈＝70:30～90:10，流速为0.6ml/min～1.6ml/min，等度洗脱，其中，所述的磷酸氢二钾水溶液的浓度为0.005mol/L～0.015mol/L、pH值为4.0～9.0。
8.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于所述的高效液相色谱法的柱温为35℃；流动相为磷酸氢二钾水溶液：乙腈＝83:17，流速为1.4ml/min。
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