CN111929372A - 一种盐酸普萘洛尔基因毒性杂质hplc检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种盐酸普萘洛尔基因毒性杂质HPLC检测方法，其方法为将1‑萘酚和萘缩水甘油醚与稀释剂定容配制成混合对照品母液；将盐酸普萘洛尔与稀释剂定容配制成样品溶液；将混合对照品母液和样品溶液采用高效液相色谱仪器进行检测，得到盐酸普萘洛尔基因毒性杂质1‑萘酚和萘缩水甘油醚的定性定量检测结果，高效液相色谱的条件为：C18色谱柱；以磷酸水溶液为流动相A，以乙腈为流动相B，进行梯度洗脱，柱温为20‑30℃，检测波长为215‑220nm；专属性、溶液稳定性、灵敏度、线性、准确度、精密度、耐用性表现较好，色谱条件适宜，分离效果较佳，能够满足定性定量检测要求，利于对API中基因毒性杂质1‑萘酚和萘缩水甘油醚进行质量控制，以便监控药品质量。

Description

一种盐酸普萘洛尔基因毒性杂质HPLC检测方法

技术领域

本发明涉及一种盐酸普萘洛尔基因毒性杂质HPLC检测方法，属于盐酸普萘洛尔检测方法技术领域。

背景技术

盐酸普萘洛尔为为β-受体阻断药，阻断心肌的β受体，减慢心率,抑制心脏收缩力与传导、循环血量减少、心肌耗氧量降低，临床主要用于治疗多种原因所致的心律失常，也可用于心绞痛高血压嗜铬细胞瘤等。盐酸普萘洛尔片一致性评价需对API质量研究，对API起始原料中基因毒性杂质1-萘酚

和萘缩水甘油醚

进行质量控制，这两种基因毒性杂质ICHM7分类为2类杂质，查阅各国药典盐酸普萘洛尔质量标准，只有中国药典规定了1-萘酚不得过300ppm，JP17，USP41，EP9.0均未规定1-萘酚和萘缩水甘油醚限度。

盐酸普萘洛尔API在水中溶解性较好，基因毒性杂质在水中溶解性较差，1-萘酚为无色或黄色、有苯酚气味、晶体或粉末状，受光变玫瑰色，萘缩水甘油醚是无色至浅黄色液体，目前还没有一种有效的分析方法用于检测盐酸普萘洛尔中的1-萘酚和萘缩水甘油醚基因毒性杂质含量，不利于盐酸普萘洛尔片的质量控制。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的缺陷，提供一种盐酸普萘洛尔基因毒性杂质HPLC检测方法，用于定性定量检测盐酸普萘洛尔药品中1-萘酚、萘缩水甘油醚，以便对盐酸普萘洛尔药品中的基因毒性杂质进行质量控制。

本发明是通过如下的技术方案予以实现的：

一种盐酸普萘洛尔基因毒性杂质HPLC检测方法，其方法如下：

将1-萘酚和萘缩水甘油醚与稀释剂定容配制成混合对照品母液；将盐酸普萘洛尔与稀释剂定容配制成样品溶液；将混合对照品母液和样品溶液采用高效液相色谱仪器进行检测，得到盐酸普萘洛尔基因毒性杂质1-萘酚和萘缩水甘油醚的定性定量检测结果，高效液相色谱的条件为：C18色谱柱；以磷酸水溶液为流动相A，以乙腈为流动相B，进行梯度洗脱，柱温为20-30℃，检测波长为215-220nm；

所述稀释剂由体积比为1:1的乙腈和水组成，所述混合对照品母液中1-萘酚和萘缩水甘油醚的浓度均为2.5-3.125μg/ml，所述样品溶液中盐酸普萘洛尔的浓度为40-50mg/ml，并以超声溶解；高效液相色谱的条件中流速1.0ml/min，进样量为10-40μl，所述流动相A磷酸水溶液中的磷酸体积百分比为0.1％；

所述高效液相色谱仪器采用106安捷伦VWD、107安捷伦DAD、112安捷伦VWD、或QC104岛津VWD型号仪器；

上述一种盐酸普萘洛尔基因毒性杂质HPLC检测方法，优选地，所述色谱柱采用Waters Atlantis T3色谱柱，所述梯度洗脱程序为:时间0min：流动相B为40％，时间15min流动相B为40％，时间30min流动相B为50％，时间31min流动相B为80％，时间36min流动相B为80％，时间37min流动相B为40％，时间45min流动相B为40％，所述柱温优选25℃，所述检测波长优选220nm。

上述一种盐酸普萘洛尔基因毒性杂质HPLC检测方法，优选地，所述色谱柱采用InertsilODS-3色谱柱，所述梯度洗脱程序为:时间0min：流动相B为35％，时间25min流动相B为35％，时间40min流动相B为45％，时间41min流动相B为70％，时间46min流动相B为70％，时间47min流动相B为35％，时间55min流动相B为35％，所述柱温优选20℃，所述检测波长优选215nm。

上述一种盐酸普萘洛尔基因毒性杂质HPLC检测方法，优选地，所述色谱柱采用InertsilODS-3色谱柱，所述梯度洗脱程序为:时间0min：流动相B为35％，时间25min流动相B为35％，时间40min流动相B为26％，时间40min流动相B为45％，时间41min流动相B为80％，时间50min流动相B为80％，时间51min流动相B为35％，时间60min流动相B为35％，所述柱温优选25℃，所述检测波长优选215nm；

将盐酸普萘洛尔、混合对照品母液与稀释剂配制成盐酸普萘洛尔浓度为40-50mg/ml、1-萘酚和萘缩水甘油醚的浓度均为0.25-0.3125μg/ml的系统适用性溶液，将混合对照品母液与稀释剂配制成1-萘酚和萘缩水甘油醚的浓度均为0.25-0.3125μg/ml的混合对照品限度溶液，用于HPLC检测方法验证。

本发明的有益效果为：

盐酸普萘洛尔药品中1-萘酚、萘缩水甘油醚的毒性杂质HPLC检测方法，专属性、溶液稳定性、灵敏度、线性、准确度、精密度、耐用性表现较好，色谱条件适宜，该方法在不同仪器上杂质分离效果较佳，能够满足定性定量检测要求，利于对API中基因毒性杂质1-萘酚和萘缩水甘油醚进行质量控制，以便监控药品质量。

附图说明

图1为实施例2的系统适用性溶液色谱图。

图2为实施例3的系统适用性溶液色谱图。

图3为系统适用性试验的系统适用性溶液色谱图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明的具体实施方式作进一步说明。

实施例1-5中：

(1)试剂选用：乙腈：默克、批号：SBK5734；磷酸：国药、批号：20170929。

(2)样品选用：盐酸普萘洛尔(API)云阳提供(批号180101，170201，170202)；1-萘酚：阿拉丁、批号：K1717022；萘缩水甘油醚：LGC、批号：43050702、含量99.6％；杂质A：LGC、批号：43010801；杂质B：LGC、批号：79125；杂质C：LGC、批号：66021。

实施例1-4中：

溶液配制：1-萘酚和缩水甘油醚ICHM7分类为2类杂质，盐酸普萘洛尔每日最大服用剂量为240mg，根据TTC法计算杂质限度，1.5μg/day÷240mg/day＝6.25ppm，查阅各国药典盐酸普萘洛尔质量标准，只有中国药典规定了1-萘酚不得过300ppm，JP17，USP41，EP9.0均未规定1-萘酚和萘缩水甘油醚限度，按照现行法规要求以及从严控制策略，拟定1-萘酚和缩水甘油醚限度为6.25ppm，为使杂质在API中限度6.25ppm以内可控，采用API浓度为50mg/ml，杂质限度浓度0.3125μg/ml进行分析方法的开发。

稀释剂：稀释剂由体积比为1:1的乙腈和水组成；

混合对照品母液：分别精密称取1-萘酚和萘缩水甘油醚25mg置于两个100ml量瓶中，稀释剂溶解并定容至刻度，得0.25mg/ml对照品溶液，量取对照品溶液各1.25ml至于100ml量瓶中，稀释剂溶解并定容至刻度，得混合对照品母液，混合对照品母液中1-萘酚和萘缩水甘油醚的浓度均为3.125μg/ml；

系统适用性溶液：称取盐酸普萘洛尔500mg置于10ml量瓶中，加入上述混合对照品母液1ml，再加入8ml稀释剂超声使之完全溶解后稀释液定容至刻度，即得，系统适用性溶液中盐酸普萘洛尔浓度为50mg/ml、1-萘酚和萘缩水甘油醚的浓度均为0.3125μg/ml；

混合对照品限度溶液：精密移取上述混合对照品母液1ml置于10ml量瓶中，稀释剂定容至刻度，即得，混合对照品限度溶液中1-萘酚和萘缩水甘油醚的浓度均为0.3125μg/ml；

样品溶液：称取盐酸普萘洛尔500mg置于10ml量瓶中，加入稀释剂超声溶解并定容至刻度，即得，样品溶液中样品溶液中盐酸普萘洛尔的浓度为50mg/ml。

实施例1:

将上述系统适用性溶液采用106安捷伦VWD高效液相色谱仪器进行检测，高效液相色谱的条件为：C18色谱柱；以磷酸水溶液为流动相A，流动相A磷酸水溶液中的磷酸体积百分比为0.1％，以乙腈为流动相B，进行梯度洗脱，流速1.0ml/min，进样量为40μl，柱温30℃；

所述色谱柱采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂Waters Atlantis T3(4.6×150mm，3μm)色谱柱，所述梯度洗脱程序为:时间0min：流动相B为40％，时间18min流动相B为40％，时间25min流动相B为50％，时间35min流动相B为50％，时间36min流动相B为80％，时间45min流动相B为80％，时间46min流动相B为40％，时间55min流动相B为40％，对不同检测波长下的1-萘酚和萘缩水甘油醚的色谱响应结果如下表1：

表1不同波长下1-萘酚和萘缩水甘油醚的响应

波长(nm)	1-萘酚峰面积	萘缩水甘油醚峰面积
			280	33.54	N/A
295	43.26	N/A
			220	295.37	183.6
230	271.48	123.726

由上表1可知，1-萘酚和萘缩水甘油醚在220nm处响应更佳，确认基线噪音有无干扰。

实施例2:

将上述系统适用性溶液采用107安捷伦DAD高效液相色谱仪器进行检测，高效液相色谱的条件为：C18色谱柱；以磷酸水溶液为流动相A，流动相A磷酸水溶液中的磷酸体积百分比为0.1％，以乙腈为流动相B，进行梯度洗脱，流速1.0ml/min，进样量为10μl；

所述色谱柱采用Waters Atlantis T3色谱柱，所述梯度洗脱程序为:时间0min：流动相B为40％，时间15min流动相B为40％，时间30min流动相B为50％，时间31min流动相B为80％，时间36min流动相B为80％，时间37min流动相B为40％，时间45min流动相B为40％；对不同柱温下的1-萘酚和萘缩水甘油醚的色谱分离度结果如下表2：

表2不同柱温下1-萘酚和萘缩水甘油醚的分离度

由上表2可知，1-萘酚和萘缩水甘油醚在柱温25℃分离度最佳，与前后杂质分离度均能达到1.5以上，柱温系统适用性溶液30℃的色谱图参见附图1，系统适用性溶液1-萘酚在12.039min出峰分离较佳，分离度为2.779；萘缩水甘油醚25.879min出峰，峰前有杂质干扰其分离度为1.432。

实施例3：

在二极管阵列检测器检测器(DAD)上对1-萘酚和萘缩水甘油醚进行全波长扫描得到UV光谱图，1-萘酚和萘缩水甘油醚有相似的吸收波长，均在215nm处有最大吸收，确定杂质的检测波长为215nm。

将上述系统适用性溶液采用QC104岛津VWD高效液相色谱仪器进行检测，高效液相色谱的条件为：C18色谱柱；以磷酸水溶液为流动相A，流动相A磷酸水溶液中的磷酸体积百分比为0.1％，以乙腈为流动相B，进行梯度洗脱，流速1.0ml/min，进样量为40μl，柱温20℃；

所述色谱柱采用Inertsil ODS-3(4.6×150mm，3μm)色谱柱，所述梯度洗脱程序为:时间0min：流动相B为35％，时间25min流动相B为35％，时间40min流动相B为45％，时间41min流动相B为70％，时间46min流动相B为70％，时间47min流动相B为35％，时间55min流动相B为35％；检测得到系统适用性溶液HPLC色谱图参见附图1，由附图1可知：1-萘酚在17.683min出峰分离较佳，分离度为3.387；萘缩水甘油醚在35.768min出峰分离较佳，分离度为2.362，该方法较佳。

实施例4：

将系统适用性溶液采用不同高效液相色谱仪器进行检测，其他色谱条件与实施例3一致进行不同液相对于岛津液相开发的分析方法进行对比研究，其结果见下表3：

表3同一样品同一方法在不同仪器上系统适用性溶液分离结果

由上表3可知，该方法在不同仪器上杂质分离效果较佳，最小分离度为1.96。该方法能够满足检测要求。

实施例5：

稀释剂：稀释剂由体积比为1:1的乙腈和水组成；

混合对照品母液：称取1-萘酚、萘缩水甘油醚约25mg，精密称定，分别置于100ml量瓶中，加稀释液溶解并定容至刻度；各取1.0ml上述溶液置于同一100ml量瓶中，稀释液定容至刻度，制成1-萘酚、萘缩水甘油醚浓度为2.5μg/mL的混合对照品母液。

混合对照品限度溶液：精密移取混合对照品母液1ml置于10ml量瓶中，稀释液定容至刻度，得1-萘酚和萘缩水甘油醚的浓度均为0.25μg/mL限度溶液。

系统适用性溶液：称取盐酸普萘洛尔对照品约400mg，置于10ml量瓶中，加入混合对照品母液1ml，稀释液超声溶解制成每1ml中含盐酸普萘洛尔约40mg、杂质1-萘酚和萘缩水甘油醚约0.25μg混合溶液，作为系统适用性溶液；精密量取40μl，注入QC104岛津VWD高效液相色谱仪，记录色谱图，1-萘酚、缩水甘油醚前后杂质分离度大于1.5。

样品溶液：称取盐酸普萘洛尔400mg置于10ml量瓶中，加入稀释剂超声溶解并定容至刻度，即得，样品溶液中样品溶液中盐酸普萘洛尔的浓度为40mg/ml。

按照计算公式：

A样：供试品溶液中杂质峰面积；A对：对照品溶液中杂质峰面积；M对：杂质对照品的称样量(mg)；Cs：杂质对照品的含量(％)；M样：样品称样量(mg)；V样：供试品溶液稀释体积(ml)；V对：对照品溶液稀释体积(ml)；质控要求：1-萘酚和萘缩水甘油醚含量均不得过6.25ppm。

按照色谱条件：以磷酸水溶液为流动相A，流动相A磷酸水溶液中的磷酸体积百分比为0.1％，以乙腈为流动相B，进行梯度洗脱，流速1.0ml/min，进样量为40μl，柱温25℃，所述色谱柱采用Inertsil ODS-3(4.6×150mm，3μm)色谱柱，所述梯度洗脱程序为:时间0min：流动相B为35％，时间25min流动相B为35％，时间40min流动相B为26％，时间40min流动相B为45％，时间41min流动相B为80％，时间50min流动相B为80％，时间51min流动相B为35％，时间60min流动相B为35％，按照外标法检测不同批号的样品，得到含量结果如下:4：

表4 3批样品检测结果

批号	1-萘酚含量(ppm)	萘缩水甘油醚含量(ppm)
			180101	6.06	0
170201	3.24	0
			170202	3.97	0

结果显示，3批样品(批号：20180101、20170201、20170202)1-萘酚和萘缩水甘油醚含量均不超过6.25ppm。

综上，根据基毒杂质限度浓度0.3125μg/ml，-萘酚和萘缩水甘油醚最佳信噪比分别为170和161，故可以降低样品浓度以及对照品浓度，拟配制盐酸普萘洛尔样品浓度为40mg/ml，混合对照品即杂质限度浓度为0.25ug/ml进行如下方法学验证；

(1)专属性试验：

①已知杂质干扰研究：盐酸普萘洛尔EP中明确了3个已知杂质A、杂质B、杂质C，以稀释剂为溶剂配制呈浓度0.1mg/ml,已知杂质对1-萘酚和萘缩水甘油醚检测的方法专属性进行考察，按照实施例4的色谱条件，1-萘酚和萘缩水甘油醚分别在18.754min和36.947min出峰，单标杂质A在7.541min出峰，杂质B是一对差向异构体两个峰分别在10.819min和11.737min出峰，杂质C未检出，其为弱极性化合物，拟增加有机相比例将其洗脱，故修改梯度条件，40min前梯度不变，杂质1-萘酚和萘缩水甘油醚、杂质A、杂质B保留时间不变，40min后增大有机相比例，使得杂质C能够被洗脱；

所述梯度洗脱程序为:时间0min：流动相B为35％，时间25min流动相B为35％，时间40min流动相B为26％，时间40min流动相B为45％，时间41min流动相B为80％，时间50min流动相B为80％，时间51min流动相B为35％，时间60min流动相B为35％；该条件下杂质C出峰时间为46.679min，综上杂质A、杂质B和杂质C均不干扰1-萘酚和萘缩水甘油醚的检测；

②破坏实验:取盐酸普萘洛尔适量，分别进行酸(0.5mol/L盐酸溶液)、碱(0.5mol/L氢氧化钠溶液)、氧化(30％H2O2溶液)、高温(105℃)和光照(照度4500Lux，近紫外能量90μw/cm2)破坏，考察降解产物是否干扰1-萘酚和萘缩水甘油醚的检测。

1、未破坏：取本品约50mg，精密称定，置5ml量瓶中，加稀释液溶解并定容至刻度，作为未破坏供试品溶液；

2、酸破坏：取本品约50mg，精密称定，置5ml量瓶中，加入0.5mol/L盐酸溶液2ml，放置2小时后，加入0.5mol/L氢氧化钠溶液2ml中和，加稀释液溶解并定容至刻度，作为酸破坏样品；

3、碱破坏：取本品约50mg，精密称定，置5ml量瓶中，加入0.5mol/L氢氧化钠溶液2ml，放置2小时后，加入0.5mol/L盐酸2ml中和，加稀释液溶解并定容至刻度，作为碱破坏样品；

4、氧化破坏：取本品约50mg，精密称定，置5ml量瓶中，加30％H2O2溶液2ml，放置2小时后，加稀释液溶解并定容至刻度，作为氧化破坏样品；

5、高温固体破坏：取高温(105℃)24小时后样品约50mg，精密称定，置5ml量瓶中，加稀释液溶解并定容至刻度，作为高温固体破坏样品；

6、光照固体破坏：取光照(照度4500Lux，近紫外能量90μw/cm2)破坏24h样品约50mg，精密称定，置5ml量瓶中，加稀释液2.5ml溶解并定容至刻度，作为光照固体破坏样品；

将上述破坏样品按照实施例5的方法进行检测，检测结果显示盐酸普萘洛尔在酸、碱、氧化、高温和光照条件均有不同程度的降解，降解杂质未干扰1-萘酚和萘缩水甘油醚的检测，且另有杂质干扰1-萘酚的检测；酸、碱、高温和光照条件降解产物均未干扰1-萘酚和萘缩水甘油醚的检测；

(2)溶液稳定性

①对照品溶液：取1-萘酚和萘缩水甘油醚各25mg，精密称定，置100ml量瓶中，用稀释液溶解并定容至刻度，摇匀，即得浓度为0.25mg/ml的对照品溶液；精密移取上述溶液1ml置100ml量瓶中，用稀释液定容至刻度，摇匀即得浓度为2.5μg/ml；再移取上述溶液1ml置10ml量瓶中，用稀释液定容至刻度，摇匀即得。分别于0、2、4、6、10、14、24、48、72小时测定，考察对照品溶液在室温条件下的稳定性；

②样品溶液：取盐酸普萘洛尔约400mg，精密称定，置10ml量瓶中，用稀释液溶解并定容至刻度，摇匀，即得。分别于0、4、6、14、36、48、72小时测定，按照实施例5的色谱条件考察样品溶液在室温条件下的稳定性，其结果见下表5：

表5-1溶液稳定性试验结果

由上表5结果显示：对照品溶液和供试品溶液在72小时内稳定。

(3)线性、范围、检测限和定量限

精密称取1-萘酚和萘缩水甘油醚各适量，用稀释液溶解并稀释制成每1ml中约含2.5μg混合对照品母液。分别精密量取混合对照品母液①0.5ml置25ml，②0.8ml置20ml，③0.8ml置10ml，④1.0ml置10ml，⑤2.0ml置10ml，⑥4.0ml置10ml中，加稀释液稀释定容至刻度，摇匀。其中以限度浓度的20％作为定量限(S/N大于10)，定量限溶液稀释3倍后作为检测限(S/N大于3)。精密量取上述溶液各40μl,按照实施例5的色谱条件，分别注入液相色谱仪中，记录色谱图，量取峰面积。以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标进行线性回归，以杂质限度浓度(0.25μg/ml)为100％的相对浓度，试验结果见下表6：

表6标准曲线测定结果

结果表明，1-萘酚在0.0512～1.0240μg/ml范围内，浓度与峰面积呈线性关系，线性方程为A＝607.7362C-0.7741，相关系数为0.9999；萘缩水甘油醚在0.0540～1.0797μg/ml范围内，浓度与峰面积呈线性关系，线性方程为A＝480.5113C-2.2479,相关系数为0.9999。

定量定量限检测结果见下表7和表8：

表7定量限检测结果

表8检测限检测结果

待测物	峰面积	检测限度(μg/ml)	S/N
				1-萘酚	10.644	0.0171	6.9
萘缩水甘油醚	8.653	0.018	5.9

由表7和表8显示：1-萘酚：定量限浓度为0.0512μg/ml，检测限浓度为0.0170μg/m；萘缩水甘油醚：定量限浓度为0.0540μg/ml，检测限浓度为0.0180μg/ml。满足定量要求。

(4)进样精密度

取上述(3)中线性④限度浓度连续进样6针，考察杂质溶液的进样精密度。

结果见表9：

表9进样精密度试验

序号	1-萘酚峰面积	萘缩水甘油醚峰面积
			1	153.807	127.543
2	152.614	128.53
			3	152.934	128.388
4	152.907	129.415
			5	152.916	126.215
6	154.027	128.143
			mean	153.201	128.039
RSD(％)	0.37	0.84

结果显示，在该方法条件下，各杂质的进样精密度良好，RSD均小于1.0％。

(5)准确度和重复性

精密称取盐酸普萘洛尔样品(批号：170201)400mg，置10ml量瓶中，分别加入1-萘酚、萘缩水甘油醚浓度均为2.5μg/ml的杂质混合母液0.2ml、0.5ml、1.0ml、1.5ml，用稀释液稀释溶解并定容至刻度，摇匀，即得杂质浓度为20％、50％、100％、150％四个水平(100％水平6份，其他三个水平3份)的回收率样品溶液。精密量取各回收率样品溶液40μl，注入液相色谱仪，按照实施例5的色谱条件，记录色谱图，根据线性回归方程和供试品溶液的峰面积，计算回收率；100％水平6份样品溶液计算重复性，1-萘酚和萘缩水甘油醚的准确度试验数据分别见表10和表11：

表10 1-萘酚准确度试验数据(n＝12)

表11萘缩水甘油醚准确度试验数据(n＝12)

表10和表11结果表明，盐酸普萘洛尔中1-萘酚和萘缩水甘油醚回收率在90％～108％之间，符合验证要求，表明该方法具有良好的准确度。

1-萘酚和萘缩水甘油醚的重复性试验数据分别见表12和表13：

表12 1-萘酚重复性试验数据(n＝6)

表13萘缩水甘油醚重复性试验数据(n＝6)

表12和表13结果表明，1-萘酚和萘缩水甘油醚重复性检测结果RSD分别为为0.6％和2.5％，表明该方法重复性良好。

(6)中间精密度试验

取盐酸普萘洛尔样品(批号：170201)6份，分别加入1-萘酚、萘缩水甘油醚浓度均为2.5μg/ml的杂质混合母液，制成每1ml含1-萘酚和萘缩水甘油醚为0.25μg、盐酸普萘洛尔为40mg的溶液。按照实施例5的色谱条件，由不同分析人员在不同仪器设备上，不同时间进行检测，考察不同仪器、不同人员及不同时间检测的差异，结果见下表14：

表14 1-萘酚和萘缩水甘油醚中间精密度试验

表14结果显示，由不同人员在不同时间，采用高效液相色谱法加标测定盐酸普萘洛尔中1-萘酚和萘缩水甘油醚的含量分别为9.68ppm和6.68ppm，RSD分别为1.0％和2.5％(n＝12)，中间精密度良好。

(7)方法耐用性：

在实施例5的色谱条件下，微调流动相柱温、流速、流动相B起始比例、流动相磷酸浓度、及更换不同色谱柱，检测系统适用性溶液和成品，考察方法的耐用性，试验结果详见下表15：

表15方法耐用性测定结果

通过本次试验发现，略微改变柱温、流动相起始比例、流速、流动相和色谱柱等色谱条件均能满足1-萘酚和萘缩水甘油醚检测要求，说明在色谱条件有微小变化时本方法的耐用性较好。

(8)系统适用性试验：采用实施例5的系统适用性溶液配制方法，按照实施例5进行检测，其结果参见附图2，1-萘酚和萘缩水甘油醚前后杂质分离度不得低于1.5。

综上，本发明盐酸普萘洛尔基因毒性杂质HPLC检测方法的方法学验证结果见下表16：

表16基因毒性杂质方法学验证结果

由此可见，本发明提供了一种用于检测盐酸普萘洛尔药品中1-萘酚、萘缩水甘油醚的毒性杂质HPLC检测方法，专属性、溶液稳定性、灵敏度、线性、准确度、精密度、耐用性表现较好，色谱条件适宜，该方法在不同仪器上杂质分离效果较佳，能够满足检测要求，利于对API中基因毒性杂质1-萘酚和萘缩水甘油醚进行质量控制，以便监控药品质量。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求书的保护范围为准。

Claims (10)

1.一种盐酸普萘洛尔基因毒性杂质HPLC检测方法，其特征在于，其方法如下：

将1-萘酚和萘缩水甘油醚与稀释剂定容配制成混合对照品母液；将盐酸普萘洛尔与稀释剂定容配制成样品溶液；将混合对照品母液和样品溶液采用高效液相色谱仪器进行检测，得到盐酸普萘洛尔基因毒性杂质1-萘酚和萘缩水甘油醚的定性定量检测结果，高效液相色谱的条件为：C18色谱柱；以磷酸水溶液为流动相A，以乙腈为流动相B，进行梯度洗脱，柱温为20-30℃，检测波长为215-220nm。

2.根据权利要求1所述的一种盐酸普萘洛尔基因毒性杂质HPLC检测方法，其特征在于，所述稀释剂由体积比为1:1的乙腈和水组成，所述混合对照品母液中1-萘酚和萘缩水甘油醚的浓度均为2.5-3.125μg/ml，所述样品溶液中盐酸普萘洛尔的浓度为40-50mg/ml，并以超声溶解。

3.根据权利要求1所述的一种盐酸普萘洛尔基因毒性杂质HPLC检测方法，其特征在于，高效液相色谱的条件中流速1.0ml/min，进样量为10-40μl，所述流动相A磷酸水溶液中的磷酸体积百分比为0.1％。

4.根据权利要求1所述的一种盐酸普萘洛尔基因毒性杂质HPLC检测方法，其特征在于，将盐酸普萘洛尔、混合对照品母液与稀释剂配制成盐酸普萘洛尔浓度为40-50mg/ml、1-萘酚和萘缩水甘油醚的浓度均为0.25-0.3125μg/ml的系统适用性溶液，将混合对照品母液与稀释剂配制成1-萘酚和萘缩水甘油醚的浓度均为0.25-0.3125μg/ml的混合对照品限度溶液，用于HPLC检测方法验证。

5.根据权利要求1所述的一种盐酸普萘洛尔基因毒性杂质HPLC检测方法，其特征在于，所述高效液相色谱仪器采用106安捷伦VWD、107安捷伦DAD、112安捷伦VWD、或QC104岛津VWD型号仪器。

6.根据权利要求1～5任意一项所述的一种盐酸普萘洛尔基因毒性杂质HPLC检测方法，其特征在于，所述色谱柱采用Waters Atlantis T3色谱柱，所述梯度洗脱程序为:时间0min：流动相B为40％，时间15min流动相B为40％，时间30min流动相B为50％，时间31min流动相B为80％，时间36min流动相B为80％，时间37min流动相B为40％，时间45min流动相B为40％。

7.根据权利要求6所述的一种盐酸普萘洛尔基因毒性杂质HPLC检测方法，其特征在于，所述柱温优选25℃，所述检测波长优选220nm。

8.根据权利要求1～5任意一项所述的一种盐酸普萘洛尔基因毒性杂质HPLC检测方法，其特征在于，所述色谱柱采用InertsilODS-3色谱柱，所述梯度洗脱程序为:时间0min：流动相B为35％，时间25min流动相B为35％，时间40min流动相B为45％，时间41min流动相B为70％，时间46min流动相B为70％，时间47min流动相B为35％，时间55min流动相B为35％。

9.根据权利要求8所述的一种盐酸普萘洛尔基因毒性杂质HPLC检测方法，其特征在于，所述柱温优选20℃，所述检测波长优选215nm。

10.根据权利要求1～5任意一项所述的一种盐酸普萘洛尔基因毒性杂质HPLC检测方法，其特征在于，所述色谱柱采用InertsilODS-3色谱柱，所述梯度洗脱程序为:时间0min：流动相B为35％，时间25min流动相B为35％，时间40min流动相B为26％，时间40min流动相B为45％，时间41min流动相B为80％，时间50min流动相B为80％，时间51min流动相B为35％，时间60min流动相B为35％，所述柱温优选25℃，所述检测波长优选215nm。

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