CN107843670B

CN107843670B - 一种盐酸丁卡因有关物质的测定方法

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Publication number: CN107843670B
Application number: CN201711280452.XA
Authority: CN
Inventors: 陈沛单; 于自勋; 陈应林; 毛黎静; 吴杰
Original assignee: Jiangsu Jiuxu Pharmaceutical Co ltd
Current assignee: Jiangsu Jiuxu Pharmaceutical Co ltd
Priority date: 2017-12-04
Filing date: 2017-12-04
Publication date: 2020-08-25
Anticipated expiration: 2037-12-04
Also published as: CN107843670A

Abstract

本发明涉及一种盐酸丁卡因有关物质的测定方法，其HPLC检测条件如下：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(4.6mm×150mm，5μm)，以乙腈‑水‑三乙胺为流动相A，以甲醇‑乙腈‑水‑三乙胺为流动相B，进行梯度洗脱。本发明方法操作简便，迅速、精确，用于检测盐酸丁卡因中的有关物质，更能真实地反应本品产品的质量。

Description

一种盐酸丁卡因有关物质的测定方法

技术领域

本发明属于药物分析技术领域，具体涉及盐酸丁卡因原料及制剂有关物质测定方法。

背景技术

盐酸丁卡因是一种常用的局部麻醉药，穿透力强，弥散性好，能透过粘膜，主要用于粘膜麻醉，作用迅速，起效快，但具有一定的毒副作用。盐酸丁卡因分子结构具有基因毒性警示结构，虽然盐酸丁卡因临床应用历史悠久安全性有保证。但其相关杂质也存在基因毒性警示结构，临床上又没有报道其杂质的安全性。基因毒性杂质能直接或间接损伤细胞DNA，产生致突变和致癌作用。基因毒性物质在任何摄入量水平上对DNA都有潜在的破坏性，这种破坏可能导致肿瘤的产生。因此采用一种可靠的方法控盐酸丁卡因的相关杂质尤为必要。

发明内容

本发明所解决的技术问题是提供一种操作简便，迅速、精确的检测方法，用于检测盐酸丁卡因中的有关物质。

本发明采用如下技术方案：

一种盐酸丁卡因有关物质的测定方法，采用高效液相色谱法(HPLC)检测，其检测条件如下：

以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(4.6mm×150mm，5μm)，以乙腈-水-三乙胺体积比(10-30):(90-70):0.2为流动相A(含0.2％的硫酸钠，pH值为2-4)；以甲醇-乙腈-水-三乙胺体积比(5-15):(35-55):(60-30):0.2为流动相B(含0.2％的硫酸钠，pH值为7-8)，进行如下梯度洗脱：

进一步地，以乙腈-水-三乙胺(20:80:0.2，体积比，含0.2％的硫酸钠，pH值为2-4，优选为3.5)为流动相A，以甲醇-乙腈-水-三乙胺(10:45:45:0.2，体积比，含0.2％的硫酸钠，pH值为7-8，优选为7.2)为流动相B。

进一步地，可用冰醋酸调节所述流动相A的pH值；可用磷酸调节所述流动相B的pH值。

进一步地，进样量为5μL；流速为每分钟1.0mL，检测波长为300nm，柱温为30℃。

进一步地，以对氨基苯甲酸和对丁氨基苯甲酸为标准品。

进一步地，以20％乙腈溶液(乙腈:水＝20:80，v/v，下同)为溶剂制备供试品溶液及标准品溶液。

具体操作可参照中国药典2015年版四部通则0512高效液相色谱法。

进一步地，待测样品包括盐酸丁卡因原料或含其制剂；所述制剂包括注射用盐酸丁卡因、盐酸丁卡因胶浆、盐酸丁卡因注射液、盐酸丁卡因片、盐酸丁卡因气雾剂、盐酸丁卡因软膏、盐酸丁卡因糖浆、盐酸丁卡因口服液等。

具体地，所述盐酸丁卡因有关物质的测定方法包括如下步骤：

1)样品制备

供试品溶液的制备：以20％乙腈溶液为溶剂，配制盐酸丁卡因含量约为1mg/mL的供试品溶液；

具体操作如下：取盐酸丁卡因待测样品10mg，置10mL量瓶中，加20％乙腈溶液释至刻度，作为供试品溶液；

标准品溶液I的制备：以20％乙腈溶液为溶剂，取上述供试品溶液适量，配制盐酸丁卡因含量约为2μg/mL的标准品溶液I；

标准品溶液II的制备：以20％乙腈溶液为溶剂，取对氨基苯甲酸标准品与对丁氨基苯甲酸标准品适量，配制约含对氨基苯甲酸0.5μg/mL和含对丁氨基苯甲酸2μg/mL的混合溶液，作为标准品溶液II；

系统适用性溶液的制备：取盐酸丁卡因标准品10mg置10mL量瓶中，加30％的双氧水0.2mL，70℃加热30分钟，加对氨基苯甲酸标准品适量，加20％乙腈溶液稀释至刻度，使每1mL中约含对氨基苯甲酸0.5μg，作为系统适用性溶液；

2)采用上述HPLC检测条件对上述供试品溶液、标准品溶液I、标准品溶液II和系统适用性溶液进行检测，对待测样品的有关物质的定性分析和定量分析；具体如下：

取系统适用性溶液5μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，在相对盐酸丁卡因峰保留时间约0.97处应出现杂质峰，该杂质峰与盐酸丁卡因峰的分离度应符合规定；理论板数按盐酸丁卡因峰计算应不低于2000；再精密量取供试品溶液、对照溶液I和标准品溶液II各5μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图；供试品溶液色谱图中如有杂质峰，与对氨基苯甲酸峰和对丁氨基苯甲酸峰保留时间一致的色谱峰，按外标法以峰面积计算，其他单个杂质峰面积总杂以自身对照法计算。

在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可以相互组合，即得本发明各较佳实施例。

现有盐酸丁卡因有关物质测定方法有中国药典、BP、EP、USP，其中国际主流药典BP、EP、USP测定方法一致。但各国药典测定方法均存在严重缺点和不足之处。

①中国药典采用薄层色谱法只控制对丁氨基苯甲酸杂质。该方法专属性差，且无法控制其他各杂质和无法定量。

②国际主流药典方法比本发明方法检出的杂质个数明显要少。有关物质控方法可能导致产品存在安全隐患。

本发明的创新性主要在于有关物质测定中的色谱条件，更能真实地反应本品产品的质量。

附图说明

图1-图8分别为实施例2强制破坏试验结果图。

图9-图10分别为实施例1对氨基苯甲酸线性关系图、对丁氨基苯甲酸线性关系图。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购买得到的常规产品。

若无特殊指明以下均为HPLC检测，具体条件如下：

以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(4.6mm×150mm，5μm)，以乙腈-水-三乙胺(20:80:0.2，体积比，含0.2％的硫酸钠，用冰醋酸调节pH值至3.5)为流动相A，以甲醇-乙腈-水-三乙胺(10:45:45:0.2，体积比，含0.2％的硫酸钠，用磷酸调节pH值至7.2)为流动相B，进行如下梯度洗脱：

进样量为5μL；流速为每分钟1.0mL，检测波长为300nm，柱温为30℃。

实施例1相关验证

检测限、定量限：

盐酸丁卡因检测限溶液的制备：精密称取对盐酸丁卡因标准品27.02mg，置50ml量瓶中，加20％的乙腈溶液溶解并稀释至刻度，精密量取0.4ml，置50ml量瓶中，加20％的乙腈溶液稀释至刻度，精密量取0.5ml，置10ml量瓶中，加20％的乙腈溶液稀释至刻度，精密量取3ml，置10ml量瓶中，加20％的乙腈溶液稀释至刻度后，信噪比为3.4。

对氨基苯甲酸定量限、检测限溶液的制备：精密称取对氨基苯甲酸标准品25.70mg(纯度99.8％)，置100ml量瓶中，加20％的乙腈溶液溶解并稀释至刻度，精密量取0.1ml，置50ml量瓶中，加20％的乙腈溶液稀释至刻度，精密量取2ml，置10ml量瓶中，加20％的乙腈溶液稀释至刻度后，信噪比为11.9，精密量取3ml，置10ml量瓶中，加20％的乙腈溶液稀释至刻度后信噪比为3.1。

对丁氨基苯甲酸定量限、检测限溶液的制备：精密称取对丁氨基苯甲酸标准品12.68mg，置50ml量瓶中，加乙腈溶解并稀释至刻度，精密量取0.4ml，置50ml量瓶中，加20％的乙腈溶液稀释至刻度，精密量取0.5ml，置10ml量瓶中，加20％的乙腈溶液稀释至刻度后信噪比为12.5，精密量取3ml，置10ml量瓶中，加20％的乙腈溶液稀释至刻度后信噪比为3.5。

LOQ对氨基苯甲酸＝0.51ng(约相当于0.01％的对氨基苯甲酸)、LOQ对丁氨基苯甲酸＝0.51ng(约相当于0.01％的对丁氨基苯甲酸)；LOD对氨基苯甲酸＝0.15ng(约相当于0.003％的对氨基苯甲酸)、LOD对丁氨基苯甲酸＝0.15ng(约相当于0.003％的对丁氨基苯甲酸)、LOD盐酸丁卡因＝0.16ng(约相当于0.003％的未知单杂)。

准确度：对氨基苯甲酸对照储备液：精密称取对氨基苯甲酸标准品25.70mg(纯度99.8％)，置100ml量瓶中，加20％的乙腈溶液溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取1ml，置于100ml量瓶中，加20％的乙腈稀释至刻度，摇匀，即得。C_对＝2.565μg/ml

对丁氨基苯甲酸对照储备液：精密称取对丁氨基苯甲酸标准品12.68mg，置50ml量瓶中，加乙腈溶解并稀释至刻度，精密量取5ml，置100ml量瓶中，加20％的乙腈溶液稀释至刻度，摇匀，即得。C_对＝12.68μg/ml

标准品溶液的制备：分别精密量取对氨基苯甲酸对照储备液2ml和对丁氨基苯甲酸对照储备液1.6ml，置同一10ml量瓶中，加20％的乙腈稀释至刻度，摇匀，即得。

样品溶液的制备：精密量盐酸丁卡因注射液1ml置10ml量瓶中，加20％的乙腈稀释至刻度，摇匀，即得。

准确度溶液的制备：

I精密量取盐酸丁卡因注射液5ml，置50ml量瓶中，分别精密加入对氨基苯甲酸对照储备液2ml和对丁氨基苯甲酸对照储备液0.4ml，加20％的乙腈稀释至刻度，摇匀，即得。同法制备3份。

II精密量取盐酸丁卡因注射液1ml，置10ml量瓶中，精密加入对氨基苯甲酸对照储备液2ml和对丁氨基苯甲酸对照储备液1ml，加20％的乙腈稀释至刻度，摇匀，即得。同法制备3份。

III精密量取盐酸丁卡因注射液1ml，置10ml量瓶中，精密加入对氨基苯甲酸对照储备液3ml和对丁氨基苯甲酸对照储备液1.8ml，加20％的乙腈稀释至刻度，摇匀，即得。同法制备3份。

测定法：分别精密吸取标准品溶液、样品溶液、准确度溶液各5μl注入液相色谱仪记录色谱图，结果以回收率计，结果见下表。

标准品溶液重复性结果

样品名称	A<sub>1</sub>	A<sub>2</sub>	A<sub>3</sub>	A<sub>4</sub>	A<sub>5</sub>	A<sub>平均</sub>	RSD％
								对氨基苯甲酸	7.71	7.68	7.72	7.71	7.69	7.70	0.22
对丁氨基苯甲酸	57.42	57.34	57.10	57.17	57.04	57.21	0.29

对氨基苯甲酸准确度测定结果

对丁氨基苯甲酸准确度测定结果

P对氨基苯甲酸＝99.7％，RSD对氨基苯甲酸＝0.60％(n＝9)，范围：LOQ(标示量20％)～标示量150％；P对丁氨基苯甲酸＝102.1％，RSD对丁氨基苯甲酸＝3.2％(n＝9)，范围：LOQ(标示量5％)～标示量150％。

线性范围：

对氨基苯甲酸对照储备液：精密称取对氨基苯甲酸标准品25.70mg(纯度99.8％)，置100ml量瓶中，加20％的乙腈溶液溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取0.6ml，置100ml量瓶中，加20％的乙腈溶液稀释至刻度，摇匀，即得。C＝1.539μg/ml

对丁氨基苯甲酸对照储备液：精密称取对丁氨基苯甲酸标准品12.68mg，置50ml量瓶中，加乙腈溶解并稀释至刻度，精密量取2.4ml，置100ml量瓶中，加20％的乙腈稀释至刻度，摇匀即得。C＝6.0864μg/ml

线性溶液的制备：分别精密量取对氨基苯甲酸对照储备液1.3ml和对丁氨基苯甲酸对照储备液0.3ml，置20ml量瓶中，加20％的乙腈稀释至刻度，摇匀，作为线性溶液I；另分别精密量取对氨基苯甲酸对照储备液和对丁氨基苯甲酸对照储备液各1ml、2ml、3ml、4ml、5ml，分别置于10ml量瓶中，加20％的乙腈稀释至刻度，分别作为线性溶液Ⅱ、III、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ。

测定法：分别精密吸取线性溶液Ⅳ5μl注入液相色谱仪，连续进样5次，作为系统适用性，分别精密吸取线性溶液各5μl注入液相色谱仪，连续进样2次，记录色谱图，以样品浓度C(μg/ml)为横坐标，峰面积(A)为纵坐标绘制标准曲线。结果见下表和图9(对氨基苯甲酸线性关系图)、图10(对丁氨基苯甲酸线性关系图)。

系统适用性(标准品重复性)

样品名称	A<sub>1</sub>	A<sub>2</sub>	A<sub>3</sub>	A<sub>4</sub>	A<sub>5</sub>	A<sub>平均</sub>	RSD(％)
								对氨基苯甲酸	5.94	5.98	6.06	6.11	6.05	6.03	1.2
对丁氨基苯甲酸	50.82	50.72	50.92	50.65	50.90	50.80	0.23

对氨基苯甲酸、对丁氨基苯甲酸线性范围结果

对氨基苯甲酸的含量在0.01％～0.077％(LOQ～150％限度)的范围内呈良好的线性关系，线性方程：Y＝12.97X+0.010R²＝0.999。对丁氨基苯甲酸的含量在0.01％～0.32％(LOQ～150％限度)的范围内呈良好的线性关系，线性方程：Y＝27.67X+0.086R²＝1。

实施例2强制破坏试验

按以下方法配制供试品溶液，然后分别按本发明方法及国际药典(USP、EP、BP)方法进行HPLC检测，结果见图1-图8。结果表明，国际药典方法未破坏的供试品溶液可检出2个杂质；氧破坏可检出5个杂质，主峰与相邻峰未完全分离。

1、未破坏：取盐酸丁卡因10mg，置10ml量瓶中，加20％乙腈稀释至刻度。

按国际药典方法检测结果见图1，按本发明方法检测结果见图3。

2、酸破坏：取盐酸丁卡因10mg，置10ml量瓶中，加0.5mol/L盐酸0.5ml，于100℃加热30分钟，加0.5mol/L氢氧化钠0.5ml中和，加20％乙腈稀释至刻度。

按本发明方法检测结果见图7。

3、碱破坏：取盐酸丁卡因10mg，置10ml量瓶中，加0.5mol/L氢氧化钠0.5ml，静置20分钟，加0.5mol/L盐酸0.5ml中和，加20％乙腈稀释至刻度。

按本发明方法检测结果见图5。

4、氧破坏：取盐酸丁卡因10mg，加双氧水0.2ml，于100℃加热30分钟，加20％乙腈稀释至刻度。

按国际药典方法检测结果见图2，按本发明方法检测结果见图8。

5、光破坏：取盐酸丁卡因10mg，置10ml量瓶中，加20％乙腈稀释至刻度，于4500±500LX照射10天。

按本发明方法检测结果见图4。

6、热破坏：取盐酸丁卡因10mg，置10ml量瓶中，加20％乙腈稀释至刻度，于100℃加热3小时。

按本发明方法检测结果见图6。

实施例3方法比较

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims

1.一种盐酸丁卡因有关物质的测定方法，其特征在于，采用高效液相色谱法检测，其检测条件如下：

以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以乙腈-水-三乙胺体积比10-30:90-70:0.2为流动相A，所述流动相A的pH值为2-4且其中含0.2％的硫酸钠；以甲醇-乙腈-水-三乙胺体积比5-15:35-55:60-30:0.2为流动相B，所述流动相B的pH值为7-8且其中含0.2％的硫酸钠；进行如下梯度洗脱：100％的流动相A运行3分钟后，在接下来的17分钟时间内由100％流动相A过渡至100％的流动相B，100％的流动相B保持10分钟。

2.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于，所用高效液相色谱法检测条件如下：以乙腈-水-三乙胺体积比20:80:0.2为流动相A，以甲醇-乙腈-水-三乙胺体积比10:45:45:0.2为流动相B。

3.根据权利要求1或2所述的测定方法，其特征在于，所述流动相A的pH值为3.5；和/或，所述流动相B的pH值为7.2。

4.根据权利要求1或2所述的测定方法，其特征在于，用冰醋酸调节所述流动相A的pH值；和/或，用磷酸调节所述流动相B的pH值。

5.根据权利要求1或2所述的测定方法，其特征在于，所用高效液相色谱法检测条件如下：进样量为5μL；流速为每分钟1.0mL，检测波长为300nm，柱温为30℃。

6.根据权利要求1或2所述的测定方法，其特征在于，所用高效液相色谱法以对氨基苯甲酸和对丁氨基苯甲酸为标准品。

7.根据权利要求1或2所述的测定方法，其特征在于，以20％乙腈溶液为溶剂制备供试品溶液及标准品溶液。

8.根据权利要求1或2所述的测定方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)样品制备

2)采用所述高效液相色谱法检测条件对上述供试品溶液、标准品溶液I、标准品溶液II和系统适用性溶液进行检测，对待测样品的有关物质的定性分析和定量分析。

9.根据权利要求8所述的测定方法，其特征在于，步骤2)具体如下：取系统适用性溶液5μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，在相对盐酸丁卡因峰保留时间约0.97处应出现杂质峰，该杂质峰与盐酸丁卡因峰的分离度应符合规定；理论板数按盐酸丁卡因峰计算应不低于2000；再精密量取供试品溶液、标准品I和标准品溶液II各5μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图；供试品溶液色谱图中如有杂质峰，与对氨基苯甲酸峰和对丁氨基苯甲酸峰保留时间一致的色谱峰，按外标法以峰面积计算，其他单个杂质峰面积总杂以自身对照法计算。

10.根据权利要求1或2所述的测定方法，其特征在于，待测样品包括盐酸丁卡因原料或含其制剂；所述制剂包括注射用盐酸丁卡因、盐酸丁卡因胶浆、盐酸丁卡因注射液、盐酸丁卡因片、盐酸丁卡因气雾剂、盐酸丁卡因软膏、盐酸丁卡因糖浆、盐酸丁卡因口服液。