CN117871727A - 一种利奈唑胺葡萄糖注射液中枸橼酸根含量的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本申请涉及分析化学技术领域，具体公开了一种利奈唑胺葡萄糖注射液中枸橼酸根含量的检测方法。该检测方法包括以下步骤：配制浓度为0.2‑0.5mg/mL的样品溶液；然后将所述样品溶液注入液相色谱仪中，采用十八烷基硅烷键合硅胶填料的色谱柱及流动相梯度洗脱方法进行分离检测。本申请提供的利奈唑胺葡萄糖注射液中枸橼酸根含量的检测方法能够快速、准确检测利奈唑胺葡萄糖注射液中枸橼酸根含量，将上述方法用于利奈唑胺葡萄糖注射液的生产中，能够实现利奈唑胺葡萄糖注射液质量的有效把控。
Description
技术领域
本申请涉及分析化学的技术领域，具体涉及一种利奈唑胺葡萄糖注射液中枸橼酸根含量的检测方法。
背景技术
枸橼酸又称为柠檬酸，是一种重要的有机弱酸，是注射液中常用的调节pH的辅料。但由于枸橼酸根离子能够与血液中的钙离子形成一种易溶于水、但难以解离的可溶性络合物枸橼酸钙，从而对人体钙的代谢产生影响，导致低钙血症、引起抽和心肌收缩抑制等现象；因此在药物制剂生产时，需要严格控制枸橼酸根的含量。
《中国药典》2020版四部中规定了枸橼酸根的测试方法包括如下两种：一是比色法，该方法下样品需要进行约1小时的显色处理后，用紫外-分光光度法测试吸光度，计算枸橼酸离子的含量，但是上述方法在样品处理中需要使用危化品醋酸酐，因此安全性较差，难以推广使用；二是高效液相色谱法，即采用高效液相色谱仪在流动相的洗脱下实现枸橼酸根的分离与检测；然而当采用上述高效液相色谱检测条件对利奈唑胺葡萄糖注射液中枸橼酸根含量检测时，发现有其他杂质干扰枸橼酸离子的测定，导致枸橼酸离子的峰与其他杂质峰之间的分离度较差，且难以达到基线分离，利奈唑胺葡萄糖注射液中枸橼酸根含量检测准确性不佳。
因此，为了保证利奈唑胺葡萄糖注射液的使用安全性，急需提供一种专属性强、灵敏度高、分离度好的利奈唑胺葡萄糖注射液中枸橼酸根含量的检测方法，来实现利奈唑胺葡萄糖注射液质量的有效把控。
发明内容
为了快速、准确检测利奈唑胺葡萄糖注射液中枸橼酸根含量，本申请提供一种利奈唑胺葡萄糖注射液中枸橼酸根含量的检测方法。
本申请提供的利奈唑胺葡萄糖注射液中枸橼酸根含量的检测方法，采用如下的技术方案：
一种利奈唑胺葡萄糖注射液中枸橼酸根含量的检测方法，所述检测方法包括以下步骤：配制样品溶液、将所述样品溶液注入液相色谱仪中，采用十八烷基硅烷键合硅胶填料的色谱柱及流动相梯度洗脱方法进行分离检测；
所述样品溶液的浓度为0.2-0.5mg/mL；
所述流动相梯度洗脱方法为：0-10.00min，流动相A为100％，流动相B为0％；10.00-10.01min，流动相A由100％减少至20％，流动相B由0％增加至80％；10.01-20.00min，流动相A为20％，流动相B为80％；20.00-20.01min，流动相A由20％增加至100％，流动相B由80％减少至0％；20.01-30.00min，流动相A为100％，流动相B为0％。
本申请提供一种利奈唑胺葡萄糖注射液中枸橼酸根含量的检测方法，该检测方法通过调整样品溶液的浓度，并采用十八烷基硅烷键合硅胶填料的色谱柱以及特定的流动相梯度洗脱方法，能够快速、准确地同时检测利奈唑胺葡萄糖注射液中枸橼酸根及相关杂质的含量，并且检测的专属性强、灵敏度高、分离度好；将上述检测方法用于利奈唑胺葡萄糖注射液生产中，能够实现注射液质量的有效把控。
本申请中，发明人为了实现利奈唑胺葡萄糖注射液中枸橼酸根含量的检测，首先采用中国药典(ChP2020)通则3108枸橼根离子测定法进行检测，发现获得的检测谱图中枸橼酸根峰与其他杂质峰之间的分离度较差、基线处难以分离。基于此，发明人对上述方法进行改进，通过大量实验探究，重新确定了利奈唑胺葡萄糖注射液中枸橼酸根含量检测方法中的流动相类型以及洗脱方法，从而实现了利奈唑胺葡萄糖注射液中利奈唑胺、枸橼酸及相关杂质的有效分离以及枸橼酸含量的准确测定。
可选地，所述流动相A为0.1％磷酸水溶液，流动相B为0.1％磷酸甲醇溶液。
本申请中，利奈唑胺葡萄糖注射液中的相关杂质包括杂质A、杂质B、杂质C、杂质D、杂质E、杂质F和5-羟甲基糠醛中的一种或多种。
可选地，所述分离检测过程中，柱温为33-37℃。
可选地，所述分离检测过程中，流动相流速为0.8-1.2mL/min。
可选地，所述分离检测过程中，检测波长为200-220nm。
可选地，所述分离检测过程中，进样量为18-23μL。
可选地，所述配制样品溶液采用的稀释溶剂为水。
可选地，所述流动相A为0.1％磷酸水溶液，流动相B为0.1％磷酸甲醇溶液。
可选地，所述十八烷基硅烷键合硅胶填料的色谱柱为AtlantisTM dC18色谱柱，规格为150mm×4.6mm，5μm。
综上所述，本申请具有以下有益效果：
1.本申请提供了一种利奈唑胺葡萄糖注射液中枸橼酸根含量的检测方法，该检测方法采用十八烷基硅烷键合硅胶填料的色谱柱以及流动相梯度洗脱方法进行分离检测，上述方法能够快速、准确地检测利奈唑胺葡萄糖注射液中枸橼酸根含量，并且检测的专属性强、灵敏度高、分离度好。
2.本申请提供的利奈唑胺葡萄糖注射液中枸橼酸根含量的检测方法获得的检测谱图的各峰的对称性好、峰高适宜、出峰位置居中、各物质的出峰位置相差较远，分离效果明显。
3.本申请提供的利奈唑胺葡萄糖注射液中枸橼酸根含量的检测方法解决了相关技术检测方法中存在的基线分离困难、各峰之间的分离度差等问题，利用上述检测方法检测利奈唑胺葡萄糖注射液中的枸橼酸根含量，能够实现利奈唑胺葡萄糖注射液质量的有效把控。
附图说明
图1是实施例1提供的检测方法检测混合对照品溶液获得的检测谱图。
图2是实施例1提供的检测方法检测供试品溶液获得的检测谱图。
图3是枸橼酸根的线性关系图。
图4是对比例1提供的检测方法检测供试品溶液获得的检测谱图。
图5是对比例2提供的检测方法检测供试品溶液获得的检测谱图。
图6是对比例3提供的检测方法检测供试品溶液获得的检测谱图。
图7是对比例4提供的检测方法检测供试品溶液获得的检测谱图。
具体实施方式
本申请提供了一种利奈唑胺葡萄糖注射液中枸橼酸根含量的检测方法，具体包括以下步骤：
(1)配制样品溶液；所述样品溶液的浓度为0.2-0.5mg/mL；
(2)将所述样品溶液注入液相色谱仪中，采用AtlantisTM dC18色谱柱(规格为150mm×4.6mm，5μm)及流动相梯度洗脱方法进行分离检测；所述分离检测过程中，检测波长为200-220nm，柱温为33-37℃，流动相流速为0.8-1.2mL/min，进样量为18-23μL；
所述流动相梯度洗脱方法为：0-10.00min，流动相A(0.1％磷酸水溶液)为100％，流动相B(0.1％磷酸甲醇溶液)为0％；10.00-10.01min，流动相A(0.1％磷酸水溶液)由100％减少至20％，流动相B(0.1％磷酸甲醇溶液)由0％增加至80％；10.01-20.00min，流动相A(0.1％磷酸水溶液)为20％，流动相B(0.1％磷酸甲醇溶液)为80％；20.00-20.01min，流动相A(0.1％磷酸水溶液)由20％增加至100％，流动相B(0.1％磷酸甲醇溶液)由80％减少至0％；20.01-30.00min，流动相A(0.1％磷酸水溶液)为100％，流动相B(0.1％磷酸甲醇溶液)为0％。
本申请采用的原料来源如下表1所示，其余原料、试剂、溶剂等均可通过商购获得。
表1本申请中的原料来源
注：枸橼酸对照品使用前取适量，于105℃干燥2h。
以下结合实施例、性能检测试验及对本申请作进一步详细说明。
制备例1
溶液配制
杂质A贮备液：取杂质A对照品约2mg，精密称定，置10mL量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀；再精密量取1mL，置10mL量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀。
杂质C、D、E、利奈唑胺贮备液配制过程同杂质A贮备液配制过程。
杂质B贮备液：取杂质B对照品约2mg，精密称定，置10mL量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀；再精密量取2.5mL，置10mL量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀。
杂质F贮备液：取杂质F对照品约2mg，精密称定，置10mL量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀。
1.HMF贮备液：取5-HMF对照品约10mg，精密称定，置50mL量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀。
杂质A定位溶液：精密量取杂质A贮备液2mL，置10mL量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀。
按杂质A定位溶液配制方法，同法配制杂质C、D、E、利奈唑胺定位溶液。
杂质B定位溶液：精密量取杂质B贮备液2mL，置10mL量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀。
杂质F定位溶液：精密量取杂质F贮备液2mL，置10mL量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀。
5-HMF定位溶液：精密量取杂质5-HMF贮备液1mL，置20mL量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀。
枸橼酸定位溶液：取枸橼酸对照品约20mg，精密称定，置10mL量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀。
混合对照品溶液：取利奈唑胺对照品约10mg，精密称定，置50mL量瓶中，加杂质A、杂质B、杂质C、杂质D、杂质E、杂质F贮备液各1mL，5-HMF贮备液0.25mL、枸橼酸定位溶液5mL，用水溶解并稀释至刻度，摇匀。
空白辅料溶液：精密量取空白辅料10mL，置100mL量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀。
对照品溶液：取枸橼酸对照品约20mg，精密称定，置100mL量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀。
供试品溶液：精密量取利奈唑胺葡萄糖注射液10mL，置100mL量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀。
实施例1
实施例1提供一种利奈唑胺葡萄糖注射液中枸橼酸根含量的检测方法，具体包括以下步骤：(1)配制样品溶液：如制备例1。
(2)精密量取空白溶液(水)、空白辅料溶液、各定位溶液、混合对照品溶液、供试品溶液、对照品溶液各20μL，注入液相色谱仪中，采用AtlantisTM dC18色谱柱(规格为150mm×4.6mm，5μm)及流动相梯度洗脱方法进行分离检测；所述分离检测过程中，检测波长为210nm，柱温为35℃，流动相流速为1mL/min，进样量为20μL；
所述流动相梯度洗脱方法为：0-10.00min，0.1％磷酸水溶液为100％，0.1％磷酸甲醇溶液为0％；10.00-10.01min，0.1％磷酸水溶液由100％减少至20％，0.1％磷酸甲醇溶液由0％增加至80％；10.01-20.00min，0.1％磷酸水溶液为20％，0.1％磷酸甲醇溶液为80％；20.00-20.01min，0.1％磷酸水溶液由20％增加至100％，0.1％磷酸甲醇溶液由80％减少至0％；20.01-30.00min，0.1％磷酸水溶液为100％，0.1％磷酸甲醇溶液为0％。
用上述检测方法对混合对照品溶液进行检测，获得的液相色谱检测结果(即对照品溶液中各杂质的洗脱顺序与各峰之间的分离度)如下表2所示。检测谱图如图1所示。
表2相关杂质的洗脱顺序及液相色谱检测结果
根据上述检测结果可知，利奈唑胺、枸橼酸及其他相关杂质均能被洗脱出来，并且空白溶液、空白辅料溶液均不干扰枸橼酸根离子含量测定。枸橼酸根离子峰与相邻峰的分离度为21.74(大于1.5)，枸橼酸与相邻杂质的分离度好，说明本申请提供的利奈唑胺葡萄糖注射液中枸橼酸根含量的检测方法能够快速、准确地检测利奈唑胺葡萄糖注射液中枸橼酸根含量。
此外，将对照品溶液连续进样5次，其峰面积RSD为0.06％(小于2.0％)，说明上述方法的系统适用性符合要求。因此，说明本申请提供的利奈唑胺葡萄糖注射液中枸橼酸根含量的检测方法的专属性良好。
(二)将利奈唑胺葡萄糖注射液配制成浓度为0.2mg/mL的供试品溶液，然后采用实施例1的检测条件进行检测，获得的检测谱图如图2所示，图2的峰表如下表3所示。可以看出，枸橼酸离子峰的拖尾因子仅为1.17(拖尾因子在0.95-1.40之间，视为合格)。因此，说明实施例1提供的检测条件能够实现利奈唑胺葡萄糖注射液中枸橼酸根含量的准确检测。
表3对比例4获得的检测谱图对应峰表
仪器精密度
精密量取对照品溶液20μL，注入液相色谱仪；按照实施例1中的液相色谱检测条件进行检测，连续进样6次，计算保留时间及峰面积的RSD值，检测结果如表所示。
表4仪器精密度检测结果
| 名称 | 保留时间(min) | 峰面积 |
| 对照品溶液1-1 | 5.503 | 251035 |
| 对照品溶液1-2 | 5.483 | 253956 |
| 对照品溶液1-3 | 5.471 | 253730 |
| 对照品溶液1-4 | 5.486 | 254975 |
| 对照品溶液1-5 | 5.446 | 255440 |
| 对照品溶液1-6 | 5.434 | 255301 |
| RSD(％) | 0.48 | 0.65 |
根据表4的检测结果可知，将对照品溶液连续进样6次，保留时间RSD为0.48％，小于1.0％，峰面积RSD为0.65％，小于2.0％，因此，说明本申请提供的利奈唑胺葡萄糖注射液中枸橼酸根含量的检测方法的仪器精密度良好。
线性范围
考察枸橼酸根含量浓度约100μg/mL～400μg/mL范围内的线性，要求以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标进行线性回归，相关系数r≥0.998。具体如下：
(1)配制线性储备液：精密称定枸橼酸对照品40mg，置100mL量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀。
(2)分别精密量取线性贮备液，按下表5进行配制，加水稀释制成线性溶液1～5。
表5线性溶液的配制浓度
(3)精密量取上述线性溶液各20μL，注入液相色谱仪中；然后分别按照实施例1的液相色谱检测条件进行检测，记录色谱图；并以浓度为横坐标(X)、峰面积为纵坐标(Y)进行线性回归。枸橼酸根的线性关系如下表6所示，线性关系图如图3所示。
表6枸橼酸根的线性关系
根据表6及图3的结果可知，枸橼酸根离子浓度在103.873μg/mL～415.490μg/mL范围内，浓度与峰面积呈良好的线性关系，因此，说明本申请提供的利奈唑胺葡萄糖注射液中枸橼酸根含量的检测方法的线性良好。
精密度
同一实验室，不同日期、不同人员1与2、不同仪器，按如下进行测定。要求重复性：人员1或人员2配制6份供试品溶液中枸橼酸根含量RSD≤1％；要求中间精密度：由不同人员、在不同日期，采用不同仪器测定，共12份供试品溶液中枸橼酸根含量RSD≤2％。
1.重复性
(1)实验人员1配制溶液：
空白辅料溶液：精密量取空白辅料10mL，置100mL量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀。
对照品溶液：取枸橼酸对照品约20mg，精密称定，置100mL量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀。
供试品溶液：精密量取本品10mL，置100mL量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀。平行配制6份。
(2)精密量取空白辅料溶液、对照品溶液、供试品溶液，注入液相色谱仪，然后按照实施例1的液相色谱检测条件进行检测，记录色谱图；结果如下表7所示。
表7重复性检测结果
根据表7的检测结果可知，实验人员1配制的6份供试品溶液的枸橼酸根平均浓度为1.86mg/mL，RSD为0.28％，小于1％，因此，说明本申请提供的利奈唑胺葡萄糖注射液中枸橼酸根含量的检测方法的重复性良好。
2.中间精密度
实验人员2按照“重复性”项下进行试验，并与重复性试验结果一并计算RSD，即中间精密度。结果如下表8所示。
表8中间精密度结果
根据表8的检测结果可知，由不同人员，在不同时间，使用不同仪器和同品牌的不同批次色谱柱测定，共12份供试品溶液的枸橼酸根平均浓度为1.88mg/mL，RSD为0.90％，小于2％，因此，说明本申请提供的利奈唑胺葡萄糖注射液中枸橼酸根含量的检测方法的中间精密度良好。
对比例1
对比例1提供一种利奈唑胺葡萄糖注射液中枸橼酸根含量的检测方法。
对比例1采用的方法标准是中国药典ChP2020通则3108枸橼酸离子测定法第三法。
对比例1的高效液相色谱条件为：采用AtlantisTM dC18色谱柱(规格为150mm×4.6mm，5μm)及流动相洗脱方法进行分离检测；流动相A为18.2mmol/L磷酸盐缓冲液，流动相B为0.1％异丙醇溶液(pH2.0～2.5)，流动相A与流动相B的体积比为95∶5；分离检测过程中，检测波长为210nm，柱温为40℃，流动相流速为1mL/min，进样量为20μL。
精密称取经减压干燥至恒重的枸橼酸钠0.735g，置100mL量瓶中，用超纯水溶解并稀释至刻度。精密量取5.0mL、10.0mL、15.0mL，分别置25mL量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，即得相应的5.0mmol/L、10.0mmol/L、15.0mmol/L枸橼酸离子对照品溶液。分别精密量取20μL，注入液相色谱仪，按照对比例1提供的检测条件进行检测；并以对照品溶液的枸橼酸离子浓度对其相应的峰面积作直线回归，求直线回归方程；另精密量取供试品溶液(浓度为20mg/mL)1mL，置15mL离心管中，精密加1.5％磺基水杨酸4mL，混匀，室温静置2小时以上，以每分钟3000转离心10分钟，取上清液，注入液相色谱仪，按照对比例1的检测条件进行检测。
对比例1获得的检测谱图如图4所示，图4的峰表如下表9所示。可以看出，枸橼酸离子峰(2)与其他杂质峰(1)之间的分离度仅为0.24，基线处未完全分离，且枸橼酸离子峰的拖尾因子较大，达到1.67，因此，说明对比例1的检测条件并不能实现利奈唑胺葡萄糖注射液中枸橼酸根含量的准确检测。
表9对比例1获得的检测谱图对应峰表
对比例2
对比例2提供一种利奈唑胺葡萄糖注射液中枸橼酸根含量的检测方法。
按照对比例1的方法进行对比例2，不同之处在于：色谱柱为YMC-Triart C18色谱柱(规格为150mm×4.6mm，5μm)。
对比例2获得的检测谱图如图5所示，图5的峰表如下表10所示。可以看出，枸橼酸离子峰的拖尾因子较大，达到1.92(拖尾因子在0.95-1.40之间，视为合格)。因此，说明对比例2的该检测条件并不能实现利奈唑胺葡萄糖注射液中枸橼酸根含量的准确检测。
表10对比例2获得的检测谱图对应峰表
对比例3
对比例3提供一种利奈唑胺葡萄糖注射液中枸橼酸根含量的检测方法。
按照实施例1的方法进行对比例3，不同之处在于：供试品溶液的浓度为2mg/mL。
利用上述方法对利奈唑胺葡萄糖注射液进行检测，获得的检测谱图如图6所示，图6的峰表如下表11所示。可以看出，枸橼酸离子峰的拖尾因子较大，达到1.94(拖尾因子在0.95-1.40之间，视为合格)。因此，说明对比例3的该检测条件并不能实现利奈唑胺葡萄糖注射液中枸橼酸根含量的准确检测。
表11对比例3获得的检测谱图对应峰表
对比例4
对比例4提供一种利奈唑胺葡萄糖注射液中枸橼酸根含量的检测方法。
按照实施例1的方法进行对比例4，不同之处在于：流动相梯度洗脱程序。
对比例4的流动相梯度洗脱程序为：0-8.00min，0.1％磷酸水溶液为100％，0.1％磷酸甲醇溶液为0％；8-20.00min，0.1％磷酸水溶液由100％减少至20％，0.1％磷酸甲醇溶液由0％增加至80％；20.00-20.01min，0.1％磷酸水溶液由20％增加至100％，0.1％磷酸甲醇溶液由80％减少至0％；20.01-30.00min，0.1％磷酸水溶液为100％，0.1％磷酸甲醇溶液为0％。
利用上述方法对利奈唑胺葡萄糖注射液进行检测，检测谱图如图7所示，图7的峰表如下表12所示。可以看出，枸橼酸离子峰的拖尾因子较大，达到1.47(拖尾因子在0.95-1.40之间，视为合格)。因此，说明对比例4的该检测条件并不能实现利奈唑胺葡萄糖注射液中枸橼酸根含量的准确检测。
表12对比例4获得的检测谱图对应峰表
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (8)
1.一种利奈唑胺葡萄糖注射液中枸橼酸根含量的检测方法，其特征在于，所述检测方法包括以下步骤：配制样品溶液、将所述样品溶液注入液相色谱仪中，采用十八烷基硅烷键合硅胶填料的色谱柱及流动相梯度洗脱方法进行分离检测；
所述样品溶液的浓度为0.2-0.5mg/mL；
所述流动相梯度洗脱方法为：0-10.00min，流动相A为100%，流动相B为0%；10.00-10.01min，流动相A由100%减少至20%，流动相B由0%增加至80%；10.01-20.00min，流动相A为20%，流动相B为80%；20.00-20.01min，流动相A由20%增加至100%，流动相B由80%减少至0%；20.01-30.00min，流动相A为100%，流动相B为0%。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述流动相A为0.1%磷酸水溶液，流动相B为0.1%磷酸甲醇溶液。
3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述分离检测过程中，柱温为33-37℃。
4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述分离检测过程中，流动相流速为0.8-1.2mL/min。
5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述分离检测过程中，检测波长为200-220nm。
6.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述分离检测过程中，进样量为18-23μL。
7.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述配制样品溶液采用的稀释溶剂为水。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的检测方法，其特征在于，所述十八烷基硅烷键合硅胶填料的色谱柱为AtlantisTM dC18色谱柱，规格为150mm×4.6mm，5μm。
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