CN117949561A - 一种利用hplc测定对甲苯胺中杂质含量的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种利用HPLC测定对甲苯胺中杂质含量的方法，属于医药分析技术领域。该方法包括以下步骤：1)配制对照品溶液和供试品溶液；2)设置高效液相检测条件；采用以十八烷基键合硅胶为填充剂的色谱柱；流动相为流动相A和流动相B的混合溶液，用流动相进行梯度洗脱；其中，流动相A为1％磷酸氢二钾溶液与磷酸的混合溶液，流动相B为乙腈；3)分别吸取供试品溶液和对照品溶液，注入液相色谱仪，记录色谱图，观察并计算对甲苯胺中杂质的含量。本发明能够快速、有效、准确可靠的分离检测出对甲苯胺中的杂质，有利于提高对甲苯胺的产品质量，提高患者用药安全性。

Description

一种利用HPLC测定对甲苯胺中杂质含量的方法

技术领域

本发明属于医药分析技术领域，具体涉及一种利用HPLC测定对甲苯胺中杂质含量的方法。

背景技术

对甲苯胺主要作为染料中间体，亦可作为药品中间体。根据对甲苯胺工艺路线，在制备中间体过程中会产生工艺副产物杂质邻硝基甲苯、间硝基甲苯、对硝基甲苯和间甲苯胺，而目前尚未有利用HPLC分离检测对甲苯胺中的邻硝基甲苯、间硝基甲苯、对硝基甲苯和间甲苯胺的方法，因此，提供一种快速、有效、准确可靠的利用HPLC分离检测对甲苯胺中杂质含量的方法迫在眉睫，对于原料制剂的生成和贮存具有重要意义，且可提高患者的用药安全性。

发明内容

针对现有技术存在的上述问题，本发明所要解决的技术问题在于提供一种利用HPLC测定对甲苯胺中杂质含量的方法，能够快速、有效、准确可靠的分离检测对甲苯胺中杂质含量，提高患者的用药安全性。

为了解决上述问题，本发明所采用的技术方案如下：

一种利用HPLC测定对甲苯胺中杂质含量的方法，具体步骤如下：

1)配制对照品溶液和供试品溶液；

2)设置高效液相检测条件；采用以十八烷基键合硅胶为填充剂的色谱柱；流动相为流动相A和流动相B的混合溶液，用流动相进行梯度洗脱；其中，流动相A为1％磷酸氢二钾溶液与磷酸的混合溶液，流动相B为乙腈；

3)分别吸取供试品溶液和对照品溶液，注入液相色谱仪，记录色谱图，观察并计算对甲苯胺中杂质的含量。

进一步的，步骤1)中，供试品溶液的制备方法为：精密称取对甲苯胺置容量瓶中，加入溶剂稀释定容成每1mL含对甲苯胺0.5mg的溶液；对照品溶液的制备方法为：精密量取供试品溶液置容量瓶中，加溶剂稀释定容成每1mL含对甲苯胺5μg的溶液；其中，所述溶剂为流动相A与流动相B的体积比为65:35的混合溶液。

进一步的，步骤2)中，色谱柱长250mm，内径4.6mm，填料粒径5μm。

进一步的，步骤2)中，色谱柱的柱温为40℃。

进一步的，步骤2)中，1％磷酸氢二钾溶液与磷酸的体积比为1000:2。

进一步的，步骤2)中，流动相A与流动相B的体积比65:35。

进一步的，步骤2)中，按如下方法用流动相进行梯度洗脱：先将流动相A与流动相B以65:35的体积比洗脱30min，然后以40:60的体积比洗脱至45min，洗脱完毕；其中，梯度洗脱的流速为1.0mL/min。

进一步的，步骤2)中，流动相在检测运行时的流速为1.0mL/min。

进一步的，步骤3)中，供试品溶液和对照品溶液的进样量为10μL。

进一步的，步骤3)中，液相色谱仪的检测波长为210nm。

有益效果：相比于现有技术，本发明的优点为：

(1)本发明在210nm检测波长下，对于杂质峰，邻硝基甲苯峰面积小于等于对照溶液的主峰面积的0.2倍，间硝基甲苯峰面积小于等于对照溶液的主峰面积的0.2倍，对硝基甲苯峰面积小于等于对照溶液的主峰面积的0.2倍，间甲苯胺峰面积小于等于对照溶液的主峰面积的0.2倍，单个杂质峰面积小于等于对照溶液的主峰面积的0.2倍，各杂质峰面积的和小于等于对照溶液主峰面积。对甲苯胺与各杂质之间能很好分离，溶剂峰不干扰主成分及杂质的检测。

(2)本发明在各条件下破坏样品经峰纯度检测，光谱纯度均大于990，各条件下破坏产生的杂质均能与主峰很好地分离，有关物质检测专属性良好；同时对色谱条件参数发生微小变化时对对甲苯胺有关物质杂质分离与检查结果没有影响，耐用性良好。

(3)本发明使用HPLC能够快速、有效、准确和可靠的分离检测出对甲苯胺中的有关物质，有利于提高对甲苯胺的产品质量，提高患者用药安全性。

附图说明

图1为本发明测定对甲苯胺中杂质含量的系统适用性溶液图谱；

图2为本发明的破坏性试验中对甲苯胺-未破坏图谱；

图3为本发明的破坏性试验中对甲苯胺-酸破坏图谱；

图4为本发明的破坏性试验中对甲苯胺-碱破坏图谱；

图5为本发明的破坏性试验中对甲苯胺-光破坏图谱；

图6为本发明的破坏性试验中对甲苯胺-热解破坏图谱；

图7为本发明的破坏性试验中对甲苯胺-高温坏图谱；

图8为本发明的破坏性试验中对甲苯胺-氧化破坏图谱；

图9为本发明对甲苯胺-对照品溶液稳定性中0H对甲苯胺-对照品溶液稳定性图谱；

图10为本发明对甲苯胺-对照品溶液稳定性中34H对甲苯胺-对照品溶液稳定性图谱；

图11为本发明对甲苯胺-供试品溶液稳定性中0H对甲苯胺-供试品溶液稳定性图谱；

图12为本发明对甲苯胺-供试品溶液稳定性中34H对甲苯胺-供试品溶液稳定性图谱；

图13为本发明对甲苯胺-耐用性中对甲苯胺-耐用性-正常条件色谱图；

图14为本发明对甲苯胺-耐用性中对甲苯胺-耐用性-不同流速(0.95mL/min)色谱图；

图15为本发明对甲苯胺-耐用性中对甲苯胺-耐用性-不同流速(1.05mL/min)色谱图；

图16为本发明对甲苯胺-耐用性中对甲苯胺-耐用性-不同柱温(38℃)色谱图；

图17为本发明对甲苯胺-耐用性中对甲苯胺-耐用性-不同柱温(42℃)色谱图；

图18为本发明对甲苯胺-耐用性中对甲苯胺-耐用性-不同初始比例(水相:乙腈＝66:34)色谱图；

图19为本发明对甲苯胺-耐用性中对甲苯胺-耐用性-不同初始比例(水相:乙腈＝64:36)色谱图；

图20为本发明对甲苯胺-耐用性中对甲苯胺-耐用性-不同pH(3.70)色谱图；

图21为本发明对甲苯胺-耐用性中对甲苯胺-耐用性-不同pH(3.80)色谱图；

图22为本发明对甲苯胺-耐用性中对甲苯胺-耐用性-不同色谱柱(LC-303)色谱图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进一步进行描述。

以下实施例所采用的高效液相检测条件如下：

色谱柱：250mm×4.6mm×5μm(Shim-pack Scepter HD-C18)；

流速：1.0mL/min；

柱温：40℃；

流动相：流动相A(1％磷酸氢二钾溶液与磷酸的混合溶液)和流动相B(乙腈)；1％磷酸氢二钾溶液与磷酸的体积比为1000:2；流动相A与B的体积比为65:35；

检测波长：210nm；

进样量：10μL。

以下实施例所用面积归一化法的计算方法为：100％-主峰含量。

实施例1

1、利用HPLC测定对甲苯胺(SM1)中杂质含量的方法：

(1)配制对照品溶液和供试品溶液：精密称取对甲苯胺置容量瓶中，加入溶剂稀释定容成每1mL含对甲苯胺0.5mg的溶液，作为供试品溶液；精密量取供试品溶液置容量瓶中，加溶剂稀释定容成每1mL含对甲苯胺5μg的溶液，作为对照品溶液；其中，所述溶剂为流动相A与流动相B的体积比为65:35的混合溶液；对照品溶液为自身对照。

(2)设置高效液相检测条件；采用以十八烷基键合硅胶为填充剂的色谱柱；流动相为流动相A和流动相B的混合溶液，用流动相进行梯度洗脱；其中，流动相A为1％磷酸氢二钾溶液与磷酸的混合溶液，流动相B为乙腈；按如下方法用流动相进行梯度洗脱：先将流动相A与流动相B以65:35的体积比洗脱30min，然后以40:60的体积比洗脱至45min，洗脱完毕；其中，梯度洗脱的流速为1.0mL/min。柱温为40℃；检测波长为210nm。

(3)分别吸取供试品溶液和对照品溶液10μL，注入液相色谱仪，记录色谱图，观察并计算对甲苯胺中杂质的含量。

2、本发明检测对甲苯胺有关物质的结果

根据对甲苯胺工艺路线，在制备中间体过程中会产生工艺副产物杂质邻硝基甲苯、间硝基甲苯、对硝基甲苯和间甲苯胺，通过HPLC法同时检测对甲苯胺及其杂质邻硝基甲苯、间硝基甲苯、对硝基甲苯、间甲苯胺的含量。

本发明根据ICH Q3D及《化学药物杂质研究的指导原则》，将邻硝基甲苯、间硝基甲苯、对硝基甲苯及最大单杂限度初步拟定为0.2％，间甲苯胺限度初步拟定为0.5％。取三批样品进行有关物质检样，其中，SM1-1为邻硝基甲苯，SM1-2为间硝基甲苯，SM1-3为对硝基甲苯，SM1-5为间甲苯胺，结果如下表1所示。

表1本发明方法检测对甲苯胺有关物质结果

表1为本发明方法检测对甲苯胺有关物质结果，由表可知，本发明采用梯度洗脱的方式，各杂质分离效果好，杂质可有效检出。

实施例2

对实施例1检测方法进行方法验证，分别从系统适用性、破坏性试验、定量限、检测限、线性关系、精密度、准确度、溶液稳定性等几个方面进行验证。

1、系统适用性：

取对甲苯胺各杂质对照品及对甲苯胺对照品适量，精密称定，加流动相溶解并稀释制成每1mL含各杂质约0.5mg的各杂质贮备液。移取各杂质贮备液适量，加流动相分别制成每1mL含邻硝基甲苯、间硝基甲苯、对硝基甲苯均为1μg，间甲苯胺为2.5μg，对甲苯胺为1μg的各杂质定位溶液。

精密称定供试品适量于合适的量瓶中，再加入各杂质贮备液适量于同一量瓶中，用流动相溶解稀释制成每1mL约含对甲苯胺0.5mg、邻硝基甲苯、间硝基甲苯、对硝基甲苯均为1μg，间甲苯胺为2.5μg的混合溶液，作为系统适用性溶液。

分别取空白溶液、各杂质定位溶液及系统适用性溶液各10μL注入高效液相色谱仪，检测波长为210nm，记录色谱图，考察各成分的分离情况。结果如下表2所示。

表2系统适用性结果

	单样	混合样	分离度
				空白溶剂	——	——	——
对甲苯胺	5.924	6.820	3.3
				间甲苯胺	7.808	7.897	2.4
邻硝基甲苯	25.311	25.340	34.8
				对硝基甲苯	25.987	25.974	2.0
间硝基甲苯	26.656	26.730	2.3

表2为系统适用性结果，图1为本发明测定对甲苯胺中杂质含量的系统适用性溶液图谱，由图1和表2可知，在210nm波长下对甲苯胺、各已知杂质及其他杂质之间均能有效分离，且溶剂峰不干扰已知杂质及未知杂质的测定。

2、破坏性试验

未破坏溶液：取本品约10mg，置于20mL容量瓶中，用流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，作为破坏前溶液。

酸破坏溶液：取本品约10mg，置于20mL容量瓶中，加1mol/L的盐酸溶液1mL，室温破坏4h，加1mol/L的氢氧化钠溶液1mL中和，用流动相溶解稀释至刻度，摇匀，作为酸破坏溶液。

碱破坏溶液：取本品约10mg，置于20mL容量瓶中，加1mol/L的氢氧化钠溶液1mL，室温破坏4h，加1mol/L的盐酸溶液1mL中和，用流动相溶解稀释至刻度，摇匀，作为碱破坏溶液。

氧化破坏溶液：取本品约10mg，置于20mL容量瓶中，加3％的双氧水1mL，室温破坏2h，用流动相溶解稀释至刻度，摇匀，作为氧化破坏溶液。

热解破坏溶液：取本品约10mg，置于20mL容量瓶中，加适量流动相溶解，60℃水浴破坏2h，冷却至室温，再用流动相溶解稀释至刻度，摇匀，作为热解破坏溶液。

高温破坏溶液：取本品约10mg，置于20mL容量瓶中，60℃水浴破坏2h，冷却至室温，用流动相溶解稀释至刻度，摇匀，作为高温破坏溶液。

光照破坏溶液：取未破坏溶液置于光照箱内(4500Lux，100uv)光照4h，作为光照破坏溶液。

酸碱空白：取1mol/L盐酸1mL置20mL量瓶，加1mol/L氢氧化钠1mL中和，加流动相稀释至刻度，摇匀，作为酸碱空白溶液。

氧化空白：取3％双氧水1mL置20mL量瓶，加流动相稀释至刻度，摇匀，作为氧化空白溶液。

取上述溶液各10μL注入色谱仪，记录色谱图，用面积归一化法计算各杂质峰的量。如图2～8所示。

图2～8为本发明的破坏性试验中测试色谱图，由图可知，在各破坏条件产生的降解产物与主峰能完全分离，降解产物不干扰各已知杂质的测定。

3、峰纯度

对各种破坏条件下的供试品溶液，采用二极管阵列测定，进行了峰纯度测定，峰纯度结果如下表3所示。

表3峰纯度结果

表3为峰纯度结果，由表可知，各条件下破坏样品经峰纯度检测，峰纯度均不小于990，峰纯度较高。

4、物料平衡考察

物料平衡考察结果如下表4所示：

表4物料平衡考察结果

表4为物料平衡考察结果，由表可知，通过样品物料平衡数据分析，本品主峰破坏减少量与其含量下降基本一致，各相同浓度的样品经不同条件破坏后检出的总峰面积基本相似，说明本色谱条件能将降解杂质均有效地检出。

5、破坏降解杂质研究

破坏降解杂质研究结果如下表5所示：

表5强制降解考察结果

名称

RT(min)

未破坏

酸

碱

氧化

高温

热解

光照

未知杂质1

1.76

0.018

/

/

/

/

/

0.005

未知杂质2

1.87

/

/

0.724

/

/

/

/

未知杂质3

2.20

/

0.007

0.021

/

/

/

/

未知杂质4

2.88

/

/

/

0.030

/

/

/

未知杂质5

3.75

/

/

/

0.033

/

/

/

未知杂质6

5.26

0.020

0.020

0.017

0.016

0.019

0.019

0.020

未知杂质7

6.64

/

/

/

0.191

/

/

/

SM1-5

7.53

0.199

0.225

0.190

0.198

0.208

0.204

0.193

未知杂质8

10.14

0.010

0.012

0.010

0.014

0.013

0.014

0.010

SM1-3

25.83

/

/

/

0.095

/

/

/

未知杂质9

27.10

/

/

/

0.021

/

/

/

表5为强制降解考察结果，由表可知，本品经酸、高温、热解、光照破坏各杂质均未见明显变化；经碱破坏降解出未知杂质2(0.724％)，总杂由0.247％增长至0.966％；经氧化破坏降解出SM1-3(0.0095％)及未知杂质7(0.191％)，总杂由0.247％增长至0.598％。各条件下破坏样品经峰纯度检测，峰纯度均不小于990，破坏前后物料基本平衡。

6、定量限和检测限

取对甲苯胺各杂质对照品及对甲苯胺对照品适量，精密称定，加流动相溶解并稀释制成每1mL含SM1-1、SM1-2、SM1-3均为1μg，SM1-5为2.5μg，对甲苯胺为1μg的混合溶液。

用稀释法测其定量限(信号值/噪声值≥10)、检测限(信号值/噪声值≥3)，结果如下表6所示。

表6定量限检测限试验结果

表6为定量限检测线试验结果，由表可知，定量限与检测限符合有关物质检查要求。

7、线性和范围

取对甲苯胺各杂质对照品及对甲苯胺对照品适量，精密称定，加流动相溶解并稀释制成每1mL含SM1-1、SM1-2、SM1-3均为10μg，SM1-5为25μg，对甲苯胺为10μg的混合溶液，作为线性贮备液。取上述溶液分别用流动相按下表7稀释制成各浓度的线性溶液。

表7线性溶液配制方法

精密量取上述溶液各10μL分别注入高效液相色谱仪，每份样品进2针，记录色谱图，测定峰面积，以峰面积A为纵坐标、浓度C为横坐标作线性回归。结果如下表8～12所示。

表8SM1线性测定结果

表9SM1-5线性测定结果

表10SM1-1线性测定结果

表11SM1-3线性测定结果

表12SM1-2线性测定结果

表8～12为线性溶液测试结果，由表可知，对甲苯胺在0.0205～2.0514μg/mL范围内，SM1-5在0.0111～5.5700μg/mL范围内，SM1-1在0.0257～2.5739μg/mL范围内，SM1-3在0.0213～2.1343μg/mL范围内，SM1-2在0.0259～2.5920μg/mL范围内，峰面积与测定浓度呈良好线性关系。

根据上述线性回归方程结果测得斜率K，代入相对校正因子计算公式，计算校正因子，计算公式如下：

其中，K_主成分为对甲苯胺标准曲线斜率；K_杂质为杂质标准曲线斜率。

计算结果如下表13所示：

表13校正因子测定结果

杂质名称	相对校正因子
		SM1-5	0.57
SM1-1	0.98
		SM1-3	1.29
SM1-2	0.83

表13为校正因子测定结果，由表可知，所有已知杂质的相对校正因子均在0.2～5范围内，可按加校正因子的自身对照法计算杂质含量。

8、进样密度

取各杂质及对甲苯胺对照品适量，用流动相溶解稀释制成每1mL含SM1-1、SM1-2、SM1-3均为1μg，SM1-5为2.5μg，对甲苯胺为1μg的混合溶液，取10μL注入液相色谱仪，连续进样6次，记录峰面积。结果如下表14所示。

表14进样精密度试验结果

表14为进样精密度试验结果，由表可知，6次进样精密度样品目标峰面积RSD％≤2.0％，进样精密度良好。

9、溶液稳定性

1)杂质溶液稳定性

取各杂质及对甲苯胺对照品适量，用流动相溶解稀释制成每1mL含SM1-1、SM1-2、SM1-3均为1μg，SM1-5为2.5μg，对甲苯胺为1μg的混合溶液，分别于0、2、4、8、12、18、26、34小时进样，考察其日内稳定性。结果如下表15所示。

表15杂质溶液稳定性

表15为杂质溶液稳定性，图9和图10为本发明对甲苯胺-对照品溶液稳定性图谱，由表15、图9～10可知，各杂质在溶剂中于34h内稳定(RSD％≤2.0％)。

2)供试品溶液稳定性

称取对甲苯胺适量，加流动相溶解并稀释制成每1mL约含0.5mg的溶液，作为供试品溶液，分别于配制后的0、2、4、8、12、18、26、34h进样(按面积归一化法计算)，考察其杂质变化情况。结果如下表16所示。

表16供试品溶液稳定性

表16为供试品溶液稳定性，图11和图12为本发明对甲苯胺-供试品溶液稳定性图谱，由表16和图11～12可知，供试品在溶剂中34h与0h偏差≤限度的10.0％，供试品34h内稳定性良好。

10、重复性

取对甲苯胺适量，按照本申请方法，重复测定6次。检查结果如下表17所示。

表17重复性结果

表17为重复性结果，由表可知，6个重复性样品检验结果各杂质绝对偏差≤绝对偏差限度，重复性良好。

11、加样回收率

取各杂质，加流动相溶解稀释制成每1mL含SM1-1、SM1-2、SM1-3均为10μg，SM1-5为25μg的混合溶液，作为回收率贮备液。

精密称取对甲苯胺适量，精密吸取上述混合贮备液按下表配制成含有对甲苯胺约0.5mg/mL，含各杂质为限度浓度的50％、100％和200％的溶液，每种浓度配制3份。

按下表18配制回收率溶液：

表18回收率溶液配制方法

吸取上述样品各10μL进样，记录各已知杂质峰面积，计算各已知杂质回收率。回收率的计算方式为：

原始量＝称样量×杂质含量(以重复性数据计)；

测得加入量＝测得总量-已知量；

回收率＝〔测得加入量/加入量〕×100％。

结果如下表19～22所示。

表19SM1-5加样回收率实验结果

表20SM1-1加样回收率实验结果

表21SM1-3加样回收率实验结果

表22SM1-2加样回收率实验结果

表19～22为加样回收率试实验结果，由表可知，目标杂质每个回收率及平均回收率均在92％～105％范围内，回收率良好。

12、耐用性

将本申请测定方法色谱条件分别作微小变动(柱温、流速、流动相初始比例、pH值及色谱柱)，考察在不同条件下分离度及本品杂质含量测定情况，按下表23所示条件进行实验。

表23耐用性实验条件

具体试验内容及结果如下表24、25所示。

表24耐用性试验分离度结果

表25耐用性试验检样结果

表24为耐用性试验分离度结果，表25为耐用性试验检样结果，图13～22为本发明对甲苯胺-耐用性测试色谱图，由表24、25和图13～22可知，本发明方法色谱条件参数发生微小变化时对对甲苯胺有关物质杂质分离与检查结果没有影响，耐用性良好。

13、中间精密度

取对甲苯胺样品，由同一操作人员，于不同时间对同一批号样品进行有关物质检查；由不同操作人员，于不同时间对同一批号样品进行有关物质检查；由同一操作人员，于不同仪器、不同时间对同一批号样品进行有关物质检查，检查结果如下表26所示。

表26中间精密度试验结果

表26为中间精密度试验结果，由表可知，由不同人员、不同仪器、在不同时间测定本品有关物质，测定结果几乎没有变化，中间精密度良好。

Claims (10)

1.一种利用HPLC测定对甲苯胺中杂质含量的方法，其特征在于，具体步骤如下：

1)配制对照品溶液和供试品溶液；

2)设置高效液相检测条件；采用以十八烷基键合硅胶为填充剂的色谱柱；流动相为流动相A和流动相B的混合溶液，用流动相进行梯度洗脱；其中，流动相A为1％磷酸氢二钾溶液与磷酸的混合溶液，流动相B为乙腈；

3)分别吸取供试品溶液和对照品溶液，注入液相色谱仪，记录色谱图，观察并计算对甲苯胺中杂质的含量。

2.根据权利要求1所述的利用HPLC测定对甲苯胺中杂质含量的方法，其特征在于，步骤1)中，供试品溶液的制备方法为：精密称取对甲苯胺置容量瓶中，加入溶剂稀释定容成每1mL含对甲苯胺0.5mg的溶液；对照品溶液的制备方法为：精密量取供试品溶液置容量瓶中，加溶剂稀释定容成每1mL含对甲苯胺5μg的溶液；其中，所述溶剂为流动相A与流动相B的体积比为65:35的混合溶液。

3.根据权利要求1所述的利用HPLC测定对甲苯胺中杂质含量的方法，其特征在于，步骤2)中，色谱柱长250mm，内径4.6mm，填料粒径5μm。

4.根据权利要求1所述的利用HPLC测定对甲苯胺中杂质含量的方法，其特征在于，步骤2)中，色谱柱的柱温为40℃。

5.根据权利要求1所述的利用HPLC测定对甲苯胺中杂质含量的方法，其特征在于，步骤2)中，1％磷酸氢二钾溶液与磷酸的体积比为1000:2。

6.根据权利要求1所述的利用HPLC测定对甲苯胺中杂质含量的方法，其特征在于，步骤2)中，流动相A与流动相B的体积比65:35。

7.根据权利要求1所述的利用HPLC测定对甲苯胺中杂质含量的方法，其特征在于，步骤2)中，按如下方法用流动相进行梯度洗脱：先将流动相A与流动相B以65:35的体积比洗脱30min，然后以40:60的体积比洗脱至45min，洗脱完毕；其中，梯度洗脱的流速为1.0mL/min。

8.根据权利要求1所述的利用HPLC测定对甲苯胺中杂质含量的方法，其特征在于，步骤2)中，流动相在检测运行时的流速为1.0mL/min。

9.根据权利要求1所述的利用HPLC测定对甲苯胺中杂质含量的方法，其特征在于，步骤3)中，供试品溶液和对照品溶液的进样量为10μL。

10.根据权利要求1所述的利用HPLC测定对甲苯胺中杂质含量的方法，其特征在于，步骤3)中，液相色谱仪的检测波长为210nm。