CN117191969A - 一种检测丁丙诺啡中间体vi中的中间体v的方法 - Google Patents
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Abstract
一种检测丁丙诺啡中间体VI中的中间体V的方法，包括:采用高效液相色谱法，将含有中间体V的丁丙诺啡中间体VI样品用稀释剂配制成检测溶液，以苯基键合硅胶为固定相，采用流动相A和流动相B进行梯度洗脱，记录色谱图；其中，所述流动相A为六氟磷酸盐缓冲溶液，所述流动相B为有机相。与现有技术相比，本申请以苯基键合硅胶为固定相，采用六氟磷酸盐缓冲溶液‑有机相为流动相进行梯度洗脱，可以对丁丙诺啡中间体VI中残留中间体V进行有效分离并定量测定，从而有效控制丁丙诺啡产品的质量,该方法分离度高、重复性好、耐用性良好。
Description
技术领域
本文涉及药物分析化学领域，尤其是涉及一种运用高效液相色谱法检测丁丙诺啡中间体VI中残留中间体V的方法。
背景技术
盐酸丁丙诺啡是半合成的阿片生物碱蒂巴因的衍生物，具有阿片受体激动剂和拮抗剂活性，临床上用于镇痛和阿片类依赖的维持治疗。其镇痛作用强于哌替啶，是吗啡的30倍，持续时间长，在临床上已被广泛应用30多年。
盐酸丁丙诺啡，化学名为[5α,7α(S)]-17-(环丙基甲基)-α-(1,1-二甲基乙基)-4,5-环氧-18,19-二氢-3-羟基-6-甲氧基-α-甲基-6,14-亚乙基吗啡喃-7-甲醇盐酸盐；CAS号为53152-21-9；分子式为C29H41NO4.ClH；结构式如下：
中间体VI是新工艺合成丁丙诺啡(WO2017066249A1)的一个关键中间体，中间体V是合成中间体VI的关键中间体，因而中间体V的残留量将直接影响丁丙诺啡成品的质量，所以必须在得到丁丙诺啡中间体VI的粗品时控制其中的中间体V的含量。然而由于中间体V与中间体VI的结构极为相似，其区别只在于结构中的一个桥环上的单键变成双键，目前没有简单易行的分离方法，且国内外也没有公开报道的具体的丁丙诺啡中间体V和丁丙诺啡中间体VI的分离以及丁丙诺啡中间体VI的定量检测方法，故需建立一种有效分离丁丙诺啡中间体V和丁丙诺啡中间体VI以及检测它们含量的色谱方法。
发明内容
有鉴于此，本申请提供了一种检测丁丙诺啡中间体VI中残留的中间体V的方法，采用高效液相色谱法进行检测。该方法可对丁丙诺啡中间体VI中残留的与其结构仅有一个桥环单双键区别的中间体V进行有效分离并定量测定，从而有效控制丁丙诺啡关键中间体的质量，该方法重复性好、分离度高、耐用性良好。
为了实现上述发明目的，本申请提供了一种检测丁丙诺啡中间体VI中的中间体V的方法，所述间体VI和所述中间体V的结构式如下：
所述方法采用高效液相色谱法，对含有所述中间体V的丁丙诺啡中间体VI样品溶液进行检测，以苯基键合硅胶为固定相，采用流动相A和流动相B进行梯度洗脱，记录色谱图；其中，所述流动相A为六氟磷酸盐缓冲溶液，所述流动相B为有机相；以体积百分数计，梯度洗脱程序如下:
| 时间(min) | 流动相A/％ | 流动相B/％ |
| 0 | 85～75 | 15～25 |
| 50 | 75～65 | 25～35 |
| 55 | 45～35 | 55～65 |
| 60 | 45～35 | 55～65 |
| 61 | 85～75 | 15～25 |
| 70 | 85～75 | 15～25 |
。
在一种示例性的实施例中，所述洗脱程序如下:
| 时间(min) | 流动相A/％ | 流动相B/％ |
| 0 | 80 | 20 |
| 50 | 70 | 30 |
| 55 | 40 | 60 |
| 60 | 40 | 60 |
| 61 | 80 | 20 |
| 70 | 80 | 20 |
。
在一种示例性的实施例中，所述流动相A选自六氟磷酸钾缓冲溶液、六氟磷酸钠缓冲溶液中的一种或两种，优选地，为六氟磷酸钾缓冲溶液。
在一种示例性的实施例中，所述流动相B选自甲醇、乙醇和乙腈中的一种或多种，优选地，为乙腈。
在一种示例性的实施例中，所述流动相A的pH值为3.8～5.8，优选为4.4。
在一种示例性的实施例中，所述流动相A的浓度为0.01mol/L～0.05mol/L，优选为0.02mol/L。
在一种示例性的实施例中，所述流动相A的pH调节剂采用选自甲酸、乙酸三氟乙酸和磷酸中的一种或多种，优选地，采用乙酸。
在一种示例性的实施例中，高效液相色谱仪中，所述高效液相色谱的色谱柱为Kromasil100-5Phenyl；其规格优选为4.6×250mm,5μm。
在一种示例性的实施例中，高效液相色谱仪中，所述流动相的流速为0.8mL/min～1.2mL/min，优选为1.0mL/min；
在一种示例性的实施例中，高效液相色谱仪中，所述固定相的柱温为25℃～35℃，优选为30℃。
在一种示例性的实施例中，高效液相色谱仪中，进样量为10μl。
在一种示例性的实施例中，高效液相色谱仪中，检测器为紫外检测器。
在一种示例性的实施例中，高效液相色谱仪中，所述检测器的检测波长为230nm。
在一种示例性的实施例中，所述方法还包括以下步骤：
1)配制溶液
空白溶液：稀释剂；
配制中间体V储备液：将所述中间体V加所述稀释剂溶解，得所述中间体V储备液；
配制中间体VI样品溶液：取丁丙诺啡中间体VI粗品(含有所述中间体V)，加入所述稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，得所述中间体VI样品溶液；
自身对照溶液：取所述中间体VI样品溶液，加入所述稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得所述自身对照溶液；优选地，取所述中间体VI样品溶液1ml至100ml容量瓶中，加入所述稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得所述自身对照溶液；
2)检测
将所述空白溶液、所述中间体V储备液、所述中间体VI样品溶液和所述自身对照溶液分别注入高效液相色谱仪，进行检测，记录色谱图；
3)所述中间体VI的含量测定
采用面积归一化法计算所述中间体VI样品溶液中所述中间体VI的含量，计算公式如下：
4)中间体VI样品中杂质中间体V的含量测定
采用自身对照法计算杂质中间体V的含量，计算公式如下：
在一种示例性的实施例中，任选地，所述中间体V储备液的浓度为0.5mg/mL。
在一种示例性的实施例中，任选地，所述中间体VI样品溶液中，所述中间体VI的浓度为1.0mg/ml。
在一种示例性的实施例中，所述稀释剂选自水、甲醇和乙醇的一种或多种，优选地，为甲醇与水的混合溶液，更优选地，甲醇与水的体积比为1:1。
与现有技术相比，本申请可以对丁丙诺啡中间体VI中残留中间体V进行有效分离并定量测定，并有效控制丁丙诺啡产品的质量,该方法重复性好、分离度高、耐用性良好。
本申请的其它特征和优点将在随后的说明书中阐述，并且，部分地从说明书中变得显而易见，或者通过实施本申请而了解。本申请的其他优点可通过在说明书以及附图中所描述的方案来实现和获得。
附图说明
附图用来提供对本申请技术方案的理解，并且构成说明书的一部分，与本申请的实施例一起用于解释本申请的技术方案，并不构成对本申请技术方案的限制。
图1为实施例1中所述空白溶液HPLC图谱；
图2为实施例1中所述中间体VI样品溶液的HPLC图谱；
图3为实施例1中所述中间体V储备液的HPLC图谱；
图4为实施例1中所述自身对照液的HPLC图谱；
图5为实施例4中所述中间体VI和所述中间体V的线性图；
图6为对比例1中间体VI样品溶液的HPLC图谱；
图7为对比例1的中间体V储备液的HPLC图谱；
图8为对比例2中间体VI样品溶液的HPLC图谱；
图9为对比例2的中间体V储备液的HPLC图谱。
具体实施方式
本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本申请提供了一种检测丁丙诺啡中间体VI中中间体V的方法，所述方法采用高效液相色谱法，将含有中间体V的丁丙诺啡中间体VI样品溶液进行检测，以苯基键合硅胶为固定相，以流动相A和流动相B进行梯度洗脱，记录色谱图；其中，流动相A为六氟磷酸盐缓冲溶液，流动相B为有机相；以体积百分数计，梯度洗脱程序如下:
一种示例性实施例中，所述洗脱程序如下:
| 时间(min) | 流动相A/％ | 流动相B/％ |
| 0 | 80 | 20 |
| 50 | 70 | 30 |
| 55 | 40 | 60 |
| 60 | 40 | 60 |
| 61 | 80 | 20 |
| 70 | 80 | 20 |
。
一种示例性实施例中，所述流动相A选自六氟磷酸钾缓冲溶液、六氟磷酸钠缓冲溶液中的一种或两种，优选地，为六氟磷酸钾缓冲溶液；所述流动相B选自甲醇、乙醇和乙腈中的一种或多种，优选地，为乙腈。
一种示例性的实施例中，所述流动相A的pH值为3.8～5.8，优选为4.4。
一种示例性的实施例中，所述流动相A的浓度为0.01mol/L～0.05mol/L，优选为0.02mol/L。
一种示例性的实施例中，所述流动相A的pH调节剂采用选自甲酸、乙酸、三氟乙酸或者磷酸中的一种或多种，优选地，采用乙酸。
一种示例性的实施例中，所述流动相B选自甲醇、乙醇、乙腈中的一种或多种，优选地，为乙腈。
一种示例性的实施例中，高效液相色谱仪中，所述高效液相色谱柱为Kromasil100-5Phenyl；其规格优选为4.6×250mm,5μm。
一种示例性的实施例中，高效液相色谱仪中，所述流动相的流速为0.8mL/min～1.2mL/min，优选为1.0mL/min。
一种示例性的实施例中，高效液相色谱仪中，所述固定相的柱温为25℃～35℃，优选为30℃。
一种示例性的实施例中，高效液相色谱仪中，进样量为10μl。
一种示例性的实施例中，高效液相色谱仪中，检测器为紫外检测器。
一种示例性的实施例中，高效液相色谱仪中，检测器的检测波长为230nm。一种示例性的实施例中，所述方法还包括以下步骤：
1)配制溶液
稀释剂配制：量取甲醇50ml置于100ml量瓶中，用超纯水稀释至刻度，摇匀，即得；
空白溶液：所述稀释剂；
配制中间体V储备液：将所述中间体V加所述稀释剂溶解，得所述中间体V储备液；
配制中间体VI样品溶液：取丁丙诺啡中间体VI粗品(含有所述中间体V)置于容量瓶中，加入所述稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，得所述中间体VI样品溶液；
配制自身对照溶液：取所述中间体VI样品溶液，加所述稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得所述自身对照溶液；
优选地，取所述中间体VI样品溶液1ml至100ml容量瓶中，加入所述稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得所述自身对照溶液；
2)检测
将所述空白溶液、所述中间体V储备液、所述中间体VI样品溶液和所述自身对照溶液注入高效液相色谱仪，进行检测，记录色谱图；
3)中间体VI含量测定
采用面积归一化法计算所述中间体VI样品溶液中所述中间体VI的含量，计算公式如下：
4)中间体VI样品中杂质中间体V的含量测定
采用自身对照法计算杂质中间体V的含量，计算公式如下：
一种示例性的实施例中，任选地，所述中间体V储备液的浓度为0.5mg/mL。
一种示例性的实施例中，任选地，所述中间体VI样品溶液中，所述中间体VI浓度为1.0mg/ml。
一种示例性的实施例中，所述稀释剂选自水、甲醇、乙醇的一种或多种，优选地，为甲醇与水的混合溶液，更优选地，甲醇与水的体积比为1:1。
为了进一步说明本发明，以下结合实施例对本发明提供的一种运用高效液相色谱法检测丁丙诺啡中间体VI中残留中间体V的方法进行详细描述。
以下实施例中所述中间体V和所述中间体VI均为本公司实验室制得，其中，所述中间体V为纯化后产品，所述中间体VI为粗品，确定含有中间体V。
其它所用的试剂均为市售。
实施例1、系统适用性测试
在采用HPLC方法进行有关物质测试前，都必须进行系统适用性试验，确认检测体系能够满足检测要求：一般是指主峰与相邻杂质的分离度或者某些相邻杂质之间的分离度不小于1.5。
检测条件为：
仪器：Dionex Ultimate 3000液相色谱系统，DAD检测器；
色谱柱：Kromasil 100-5Phenyl(4.6×250mm,5μm)
流动相A：0.02mol/L六氟磷酸钾缓冲溶液(乙酸调pH至4.4)
流动相B：乙腈
检测波长：230nm
流速：1.0mL/min
进样体积：10μl
柱温：30℃
洗脱梯度程序见表1：
表1梯度洗脱程序
稀释剂：50％甲醇水溶液(V/V)
空白溶液：稀释剂
1)配制溶液
稀释剂配制：量取甲醇50ml置于100ml量瓶中，用超纯水稀释至刻度，摇匀，即得所述稀释剂；
空白溶液：稀释剂
配制中间体V储备液：称取中间体V约5mg置于10ml容量瓶中，加所述稀释剂溶解并稀释至刻度，得所述中间体V储备液；
配制中间体VI样品溶液：取丁丙诺啡中间体VI粗品(确定含有中间体V)约20mg置于20ml容量瓶中，加入所述稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，得所述中间体VI样品溶液，也即系统适用溶液；
配制自身对照溶液：取所述中间体VI样品溶液1ml至100ml容量瓶中，加所述稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得所述中间体VI样品溶液；
2)测试
取所述空白溶液，按本实施例色谱条件进行测定，记录色谱图，结果为图1；由图1可知，所述空白溶液基线平稳，无杂峰干扰；
取所述中间体VI样品溶液，按本实施例色谱条件进行测定，记录色谱图，结果见图2，其中，所述中间体VI的保留时间为46.567min，所述中间体V的保留时间为51.267min；
取所述中间体V储备液作为定位溶液，按本实施例色谱条件进行测定，记录色谱图，结果见图3；其中，所述中间体V的保留时间为51.120min；
取所述自身对照溶液，按本实施例所述色谱条件进行测定，记录色谱图，结果见图4；其中，所述中间体VI的保留时间为46.197min，其它杂质包括杂质中间体V因浓度低未出峰；
3)中间体VI含量测定
采用面积归一化法计算所述中间体VI的含量：图2中所述中间体VI的峰面积为115.949，扣除空白以后所有峰的峰面积即为峰1+峰2+除空白峰8的峰面积之和，即为：
0.113+1.124+0.558+1.161+115.949+0.953+0.223+0.337＝120.418；
计算公式如下：
因此，所述中间体VI的含量为96.29％；
4)中间体VI样品中杂质中间体V的含量测定
采用自身对照法计算杂质中间体V的含量，图2中杂质中间体V的峰面积为0.953，图4中自身对照溶液的峰面积为1.544，校正因子为0.58，修约为0.6，因此，所述中间体V的含量为0.37％；
计算公式如下：
结论：由前述测试结果可以看出，系统适用性溶液中，空白溶剂不干扰测定，主成分和杂质能够达到良好的分离，分离度为3.64，符合中国药典的要求，并且利用该方法能很好的进行中间体VI和中间体V含量的定量测定。
实施例2.重复性测试
取实施例1中配制的所述系统适用性溶液作为重复性测试样品溶液，连续进样六次，按面积归一化法计算丁丙诺啡中间体VI的含量，并计算其相对标准偏差，记录丁丙诺啡中间体VI与所述中间体V的分离度，实验结果见下表2。表2重复性实验结果
上述结果表明，本申请方法重复性和分离度均属良好。
实施例3.耐用性测试实验
在现有色谱条件的基础上，微小更改流动相流速、柱温、流动相A的pH，考察本申请检测方法的耐用性。
取实施例1中的所述中间体VI样品溶液，以实施例1的色谱条件为基准，在其基础上进行色谱条件变动，一次只更改一个条件，具体色谱条件变动及测试结果如下表3。
表3耐用性实验结果
结果显示：本申请方法耐用性良好，微小更改流动相流速、柱温、流动相A的pH等，对丁丙诺啡中间体VI与中间体V的检测无影响。
实施例4.线性考察
1)线性溶液的配制
杂质中间体V线性溶液
中间体V线性储备液：精密称取中间体V约5mg(实称5.34mg)置10ml量瓶中，加所述稀释剂溶解并稀释至刻度。
线性1溶液(500％，10.680μg/ml)：精密量取中间体V线性储备液1ml置50ml量瓶中，用稀释剂定容。
线性2溶液(250％，5.340μg/ml)：精密量取线性1溶液5ml置10ml量瓶中，用稀释剂定容。
线性3溶液(100％，2.316μg/ml)：精密量取线性1溶液2ml置10ml量瓶中，用稀释剂定容。
线性4溶液(50％，1.068μg/ml)：精密量取线性1溶液1ml置10ml量瓶中，用稀释剂定容。
线性5溶液(25％，0.534μg/ml)：精密量取线性1溶液1ml置20ml量瓶中，用稀释剂定容。
线性6溶液(10％，0.214μg/ml)：精密量取线性1溶液1ml置50ml量瓶中，用稀释剂定容。
中间体VI线性溶液
中间体VI样品溶液：精密称取中间体VI约20mg(实称21.44mg)置20ml量瓶中，稀释剂溶解并稀释至刻度。
中间体VI线性储备液：精密称取中间体VI样品溶液5ml置10ml量瓶中，稀释剂溶解并稀释至刻度。
线性1溶液(500％，10.720μg/ml)：精密量取中间体VI线性储备液1ml置50ml量瓶中，用稀释剂定容。
线性2溶液(375％，8.040μg/ml)：精密量取线性1溶液7.5ml置10ml量瓶中，用稀释剂定容。
线性3溶液(250％，5.360μg/ml)：精密量取线性1溶液5ml置10ml量瓶中，用稀释剂定容。
线性4溶液(100％，2.144μg/ml)：精密量取线性1溶液2ml置10ml量瓶中，用稀释剂定容。
线性5溶液(50％，1.072μg/ml)：精密量取线性1溶液1ml置10ml量瓶中，用稀释剂定容。
线性6溶液(25％，0.536μg/ml)：精密量取线性1溶液1ml置20ml量瓶中，用稀释剂定容。
2)测试
将上述配制的线性溶液，按本实施例1测定条件，按浓度由低到高进行测定，测试数据如下表4所示，以色谱峰面积-浓度作图，得到标准曲线图，如图5所示。
表4中间体V和中间体VI的线性结果
结果表明：所述中间体V在浓度0.214μg/ml～10.680μg/ml范围内与峰面积之间线性关系良好，线性方程为y＝0.143x-0.0076，相关系数为R2＝0.9996，线性拟合非常好。所述中间体VI在浓度0.536μg/ml～10.720μg/ml范围内与峰面积之间线性关系良好，线性方程为y＝0.245x+0.0031，相关系数为R2＝0.9998，线性拟合非常好，校正因子f＝0.143/0.254＝0.58，修约0.6。
实施例5.检测限和定量限考察
中间体V的定量限和检测限的测定：将中间体V线性储备液逐级稀释，至S/N约为10时溶液的浓度即为定量限浓度，至S/N约为3时溶液的浓度即为检测限浓度，其结果如下表5和表6所示。
表5.中间体V检测限结果
表6.中间体V定量限结果
结果表明：中间体V的检测限为0.064μg/ml，定量限为0.214μg/ml。
中间体VI的定量限和检测限的测定：将中间体VI线性储备液逐级稀释，至S/N约为10时溶液的浓度即为定量限浓度，至S/N约为3时溶液的浓度即为检测限浓度；其结果如下表7和表8所示。
表7.中间体VI检测限结果
表8.中间体VI定量限结果
结果表明：中间体VI的检测限为0.161μg/ml，定量限为0.536μg/ml。
实施例6.溶液稳定性
将所述中间体VI样品溶液和所述自身对照溶液按实施例1色谱条件分别在0h、4h、8h、12h和24h进行测定，记录色谱图，结果见下表9。
表9.稳定性测试结果
结论：室温条件下放置24h，测试样品中中间体V的含量的RSD为2.2％，符合可接受标准，溶液在24h内稳定性良好。
实施例7.精密度
由实验员1和2各配制6份中间体VI样品溶液和1份自身对照溶液，按实施例1色谱条件进行测定，记录色谱图，结果如下表10。
表10.精密度测试结果
从上表数据可以看出，精密度RSD(％)为7.1(限度为15％)，由此说明本方法精密度良好。
对比例1
采用目前常规的检测方式进行检测，步骤如下：
仪器：Dionex Ultimate 3000液相色谱系统，DAD检测器；
色谱柱：Waters Xbridge C18(4.6×250mm,5μm)
流动相A：0.02mol/L磷酸氢二钠缓冲溶液(磷酸调pH4.0)
流动相B：乙腈
检测波长：230nm
流速：1.0mL/min
进样体积：10μl
柱温：30℃
洗脱梯度程序见表11：
表11梯度洗脱程序
稀释剂：50％甲醇水(V/V)
取实施例1中配制的中间体VI样品溶液，按本对比例色谱条件进行测定，记录色谱图，结果见图6；其中，所述中间体VI的保留时间为27.647min，中间体V与中间体VI共同流出。
取实施例1中的中间体V储备液作为定位溶液，按本对比例色谱条件进行测定，记录色谱图，结果见图7；其中，所述中间体V的保留时间为28.653min。
由图6和图7可知，丁丙诺啡中间体VI与中间体V的保留时间一样，中间体VI与中间体V峰型重合，无法分离。
对比例2
采用欧洲药典(10.0版本)中丁丙诺啡及其杂质的检测方式进行检测，步骤如下：
仪器：Dionex Ultimate 3000液相色谱系统，DAD检测器；
色谱柱：Waters SunFire C18(4.6×50mm,3.5μm)
流动相A：称取5.44g磷酸二氢钾，用900ml超纯水溶解，再用5％磷酸水(v/v)溶液调pH4.5，最后用超纯水稀释至1000ml，摇匀，即得。
流动相B：乙腈
检测波长：240nm
流速：1.3ml/min
进样体积：10μl
柱温：30℃
洗脱梯度程序见表12：
表12梯度洗脱程序
稀释剂：甲醇
取实施例1中配制的中间体VI样品溶液，按本对比例色谱条件进行测定，记录色谱图，结果见图8；其中，所述中间体VI的保留时间为7.903min，所述中间体V与中间体VI共同流出。
取实施例1中的中间体V储备液作为定位溶液，按本对比例色谱条件进行测定，记录色谱图，结果见图9；其中所述中间体V的保留时间为7.970min。
由图8-9可以看出，丁丙诺啡中间体VI与中间体V的保留时间一样，中间体VI与中间体V峰型重合，无法分离。
Claims (10)
1.一种检测丁丙诺啡中间体VI中的中间体V的方法，所述中间体VI和所述中间体V的结构式如下：
采用高效液相色谱法，对含有中间体V的丁丙诺啡中间体VI样品溶液进行检测，以苯基键合硅胶为固定相，采用流动相A和流动相B进行梯度洗脱，记录色谱图；其中，所述流动相A为六氟磷酸盐缓冲溶液，所述流动相B为有机相；以体积百分数计，梯度洗脱程序如下:
。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述洗脱程序如下:
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述流动相A选自六氟磷酸钾缓冲溶液和六氟磷酸钠缓冲溶液中的一种或两种，优选地，为六氟磷酸钾缓冲溶液；
所述流动相B选自甲醇、乙醇和乙腈中的一种或多种，优选地，为乙腈。
4.根据权利要求3所述的方法，其中，所述流动相A的浓度为0.01mol/L～0.05mol/L，优选为0.02mol/L。
5.根据权利要求3所述的方法，其中，所述流动相A的pH值为3.8～5.8，优选为4.4。
6.根据权利要求5所述的方法，其中，所述流动相A的pH调节剂采用选自甲酸、乙酸、三氟乙酸和磷酸中的一种或多种，优选地，采用乙酸。
7.根据权利要求1或2所述的方法，其中，高效液相色谱仪中，色谱柱为Kromasil 100-5Phenyl，规格为4.6×250mm,5μm；和/或
所述流动相的流速为0.8mL/min～1.2mL/min，优选为1.0mL/min；和/或
所述固定相的柱温为25℃～35℃，优选为30℃；和/或
进样量为10μl；和/或
检测器为紫外检测器；和/或
检测波长为230nm。
8.根据权利要求1或2所述的方法，所述方法还包括以下步骤：
1)配制溶液
空白溶液：稀释剂；
配制中间体V储备液：将所述中间体V加所述稀释剂溶解，得所述中间体V储备液；
配制中间体VI样品溶液：取丁丙诺啡中间体VI粗品，加入所述稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，得所述中间体VI样品溶液；
自身对照溶液：取所述中间体VI样品溶液，加入所述稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得所述自身对照溶液；优选地，取所述中间体VI样品溶液1ml至100ml容量瓶中，加入所述稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得所述自身对照溶液；
2)检测
将所述空白溶液、所述中间体V储备液、所述中间体VI样品溶液和所述自身对照溶液分别注入高效液相色谱仪，进行检测，记录色谱图；
3)所述中间体VI的含量测定
采用面积归一化法计算所述中间体VI样品溶液中所述中间体VI的含量，计算公式如下：
4)中间体VI样品中所述中间体V的含量测定
采用自身对照法计算所述中间体V的含量，计算公式如下：
9.根据权利要求8所述的方法，其中，所述中间体V储备液的浓度为0.5mg/mL；和/或
所述中间体VI样品溶液中，所述中间体VI浓度为1.0mg/ml。
10.根据权利要求8所述的方法，其中，所述稀释剂选自水、甲醇和乙醇的一种或多种，优选地，为甲醇与水的混合溶液，更优选地，甲醇与水的体积比为1:1。
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