CN116482244A - 一种测定盐酸尼卡地平原料药中有关物质的高效液相色谱方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种测定盐酸尼卡地平原料药中有关物质的高效液相色谱法，该方法采用十八烷基硅烷键合硅胶为填料的色谱柱，以3.5g/L一水合高氯酸钠，含1ml三乙胺水溶液，用高氯酸调节pH至2.0为流动相A：乙腈‑甲醇(70:30)为流动相B，梯度洗脱，可以有效地分离盐酸尼卡地平原料药中的有关物质，包括工艺杂质、强制降解杂质等，本发明方法分析采用梯度洗脱的方法，重现性好，专属性强，灵敏度高，操作简便。
Description
技术领域
本发明属于分析检测技术领域，涉及一种测定盐酸尼卡地平原料药中有关物质的高效液相色谱方法。
背景技术
盐酸尼卡地平，分子式为C26H29N3O6·HCl，是淡黄色粉末或黄色结晶性粉末；无臭，几乎无味。盐酸尼卡地平片：用于高血压和劳力型心绞痛；盐酸尼卡地平缓释胶囊：用于原发性高血压；盐酸尼卡地平注射液：1、用于手术时异常高血压的急救处置；2、用于高血压性急症。
盐酸尼卡地平质量标准在《中国药典》2020版(二部)中有收录，其有关物质检测方法：采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱，等度洗脱方式，但该方法不能将工艺及降解杂质进行有效分离；本发明提供的测定盐酸尼卡地平原料药中有关物质的高效液相色谱方法，能够有效的分离盐酸尼卡地平中杂质，包括降解杂质和工艺杂质，本发明方法分析采用梯度洗脱的方法，重现性好，专属性强，灵敏度高，操作简便。
发明内容
本发明的目的在于提供一种测定盐酸尼卡地平原料药中有关物质的高效液相色谱方法，采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱。
为实现发明目的，本发明采取如下的技术方案：
一种测定盐酸尼卡地平原料药中有关物质的高效液相色谱方法，包括如下步骤：
(1)配制溶液：
a、稀释剂：甲醇；
b、供试品溶液：取盐酸尼卡地平原料药适量，加溶剂稀释，作为供试品溶液；c、对照品溶液：取盐酸尼卡地平原料药适量，加溶剂稀释，作为对照品溶液；d、系统适用性溶液：取盐酸尼卡地平各杂质，加溶剂稀释，作为系统适用性溶液；
(2)检测：
分别取供试品溶液、对照品溶液、系统适用性溶液注入液相色谱仪，记录色谱图，按加校正因子的主成分外标法计算；
色谱条件如下：
色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；
流动相A：一水合高氯酸钠-三乙胺水溶液；
流动相B：乙腈-甲醇(70:30)；
检测波长：239nm；
柱温：41～45℃；
流速：1.0ml/min；
进样量：20μl。
进一步地，所述的步骤(1)中的供试品溶液的浓度为2mg/ml；对照品溶液的浓度为2μg/ml；系统适用性溶液的主成分浓度为2mg/ml，杂质浓度为2μg/ml。
进一步地，所述的步骤(2)中流动相A：3.5g/L一水合高氯酸钠，含1ml三乙胺水溶液，用高氯酸调节调节pH为2.0±0.1。
进一步地，所述的步骤(2)中检测方法的流速为1.0ml/min；检测方法的柱温为43℃。
进一步地，所述的色谱柱规格为ZORBAX SB-C18，4.6×150mm，5μm。
进一步地，所述的步骤(2)中用到的洗脱方式：梯度洗脱；
本发明提供的测定盐酸尼卡地平原料药中有关物质的高效液相色谱方法，能够有效的分离盐酸尼卡地平中杂质，包括降解杂质和工艺杂质，本发明方法分析采用梯度洗脱的方法，重现性好，专属性强，灵敏度高，操作简便。
附图说明
图1实施例1系统适用性溶液的液相色谱图；
图2实施例1供试品溶液的液相色谱图；
图3是尼卡地平线性关系图；
图4是NKZA线性关系图；
图5是NKZB线性关系图；
图6NKZD线性关系图；
图7NKZE线性关系图；
图8NKZF线性关系图；
图9NKZG线性关系图；
图10NKZH线性关系图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和技术效果更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例。结合本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明的描述中，所涉及的各种仪器与材料说明如下：
1、材料
2、主要仪器
Agilent1260高效液相色谱仪；DAD检测器。
实施例1：盐酸尼卡地平原料药有关物质检测
(1)高效液相色谱条件：
色谱柱：Inertsil ODS-3V，5μm，4.6×250mm；
检测波长：200nm；
流速：1.0ml/min；
柱温：33℃；
进样器温度：5℃
进样体积：20μL；
流动相A：3.5g/L一水合高氯酸钠，含1ml三乙胺水溶液，用高氯酸调节调节pH为2.0；
流动相B：乙腈-甲醇(70:30)；
洗脱方式：梯度洗脱。
(2)样品及溶液配制：
稀释剂：甲醇；
空白溶液：稀释剂；
供试品溶液：精密称取盐酸尼卡地平原料药，用溶剂稀释成2mg/ml的溶液；系统适用性溶液：精密称取盐酸尼卡地平对照品、NKZA、NKZB、NKZC、NKZD、NKZD、NKZE、NKZF、NKZG、NKZH，用溶剂稀释成含盐酸尼卡地平2mg/ml、NKZA、NKZB、NKZC、NKZD、NKZD、NKZE、NKZF、NKZG、NKZH各含2μg/ml；
各杂质总表
(3)测定法
分别取空白溶液、供试品溶液、系统适用性溶液，采用上述色谱条件进样，记录色谱图，按加校正因子的主成分外标法计算。
实验结果：系统适用性溶液液相色谱图见图1，供试品溶液液相色谱图见图2。
表1有关物质验证-系统适用性-系统适用性溶液-2
实验结果表明，系统适用性溶液色谱图中，各峰之间的分离度均大于1.0，各杂质的理论塔板数均大于3000。盐酸尼卡地平供试品溶液色谱图中未检出杂质。
实施例2：方法学验证
1、专属性
仪器及色谱条件同实施例1。
考察各峰之间的分离度
取盐酸尼卡地平对照品杂质A、杂质B、杂质C、杂质D、杂质E、杂质F、杂质G、杂质H，各适量，用甲醇溶解并稀释制成混合溶液，取20μl，注入高效液相色谱仪，结果显示各峰之间的分离度符合要求。
6.3.3检测限
LOD溶液：精密移取LOQ-1溶液3ml，置10ml容量瓶中，用溶剂稀释至刻度，摇匀，即可。
精密量取LOD溶液10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图。记录杂质峰及主峰与噪音峰信号的强度比。
表2有关物质验证-检测限
结论：各杂质检测限在0.1217ug/ml～0.2871ug/ml，相对于供试品浓度在0.0061％～0.0144％之间，各杂质和尼卡地平峰的信噪比在6～90之间，符合检测灵敏度要求。
6.3.4定量限
LOQ-1：精密量取对照品贮备液0.4ml及杂质混合贮备液适量，置100ml量瓶，用溶剂稀释并定容至刻度，摇匀。(平行配制6份)
精密量取上述溶液各10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，以信噪比为10:1时的相应浓度确定为定量限浓度。计算6份定量限溶液各杂质峰面积的RSD。
表3有关物质验证-定量限
结论：各杂质定量限浓度在0.4058ug/ml～0.4365ug/ml之间，相对于供试品溶液浓度在0.0203％～0.0478％，各有关物质定量限浓度下6份样品的峰面积RSD最大为13.76％，均不大于15.0％，杂质信噪比最小值为11，符合接受标准，结果良好，符合检测灵敏度要求。
6.3.5线性与范围
线性溶液1(定量限溶液)：精密量取对照品贮备液0.4ml，置100ml量瓶中，加杂质混合贮备液适量l，用溶剂稀释至刻度，摇匀。(盐酸尼卡地平0.4μg/ml,杂质0.4μg/ml)
线性溶液2(50％)：精密量取对照品贮备液1.0ml，置100ml量瓶中，加杂质混合贮备液适量，用溶剂稀释至刻度，摇匀。(盐酸尼卡地平1μg/ml,杂质1μg/ml)
线性溶液3(80％)：精密量取对照品贮备液1.6ml，置100ml量瓶中，加杂质混合贮备液适量，用溶剂稀释至刻度，摇匀。(盐酸尼卡地平1.6μg/ml,杂质1.6μg/ml)
线性溶液4(100％)：精密量取对照品贮备液2ml，置100ml量瓶中，加杂质混合贮备液适量，用溶剂稀释至刻度，摇匀。(盐酸尼卡地平2μg/ml,杂质2μg/ml)
线性溶液5(150％)：精密量取对照品贮备液3ml，置100ml量瓶中，加杂质混合贮备液适量，用溶剂稀释至刻度，摇匀。(盐酸尼卡地平3μg/ml,杂质3μg/ml)
线性溶液6(200％)：精密量取对照品贮备液4ml，置100ml量瓶中，加杂质混合贮备液适量，用溶剂稀释至刻度，摇匀。(盐酸尼卡地平4μg/ml,杂质4μg/ml)
精密量取上述线性溶液1～6各10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，作线性回归方程并计算杂质的校正因子。
表4有关物质验证-线性结果
结果表明：各杂质在定量限至限度2倍范围内峰面积与浓度呈良好线性关系，相关系数r均大于0.995。响应因子(A/C)RSD在1.74％～10.77％。Y轴截距与100％响应值比值在0.15％～8.33％，符合接受标准。
6.3.6校正因子
各杂质校正因子如下表：
表5各杂质校正因子
| 名称 | 线性回归方程斜率 | 拟定校正因子 |
| 盐酸尼卡地平 | 27.287 | / |
| NKZA | 21.995 | 1.24 |
| NKZB | 37.1989 | 0.73 |
| NKZD | 40.236 | 0.68 |
| NKZE | 9.2691 | 2.94 |
| NKZF | 29.835 | 0.91 |
| NKZG | 30.593 | 0.89 |
| NKZH | 5.2379 | 5.21 |
6.3.7精密度
6.3.7.1重复性(试验人员A)
供试品溶液：精密称取盐酸尼卡地平原料药约40mg，置20ml量瓶中，加溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀。
供试品加标溶液：取盐酸尼卡地平原料药约20mg，置10ml量瓶中，加杂质混合贮备液适量，加溶剂溶解稀释至刻度，摇匀。(含盐酸尼卡地平2mg、各杂质2μg/ml，平行配制6份)
精密量取上述对照品溶液和供试品加标溶液各10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，按主成分外标法以对照品中尼卡地平计算6份供试品加标溶液中各杂质含量及相对标准偏差(RSD)。
表6有关物质验证-精密度-重复性试验结果
结果表明：6份供试品加标溶液中，NKZB、NKZH、NKZF、NKZE、NKZG、NKZA、NKZD的平均含量分别为0.12％、0.12％、0.12％、0.10％、0.12％、0.12％、0.11％，RSD分别为0.00％、4.76％、3.36％、4.15％、4.43％、0.00％、3.77％，符合接受标准。
6.3.7.2中间精密度(试验人员B)
供试品溶液：精密称取盐酸尼卡地平原料药约40mg，置20ml量瓶中，加溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀。
中间精密度(供试品加标溶液)：取盐酸尼卡地平原料药约20mg，置10ml量瓶中，加杂质混合贮备液适量，加溶剂溶解稀释至刻度，摇匀。(含盐酸尼卡地平2mg、各杂质2μg/ml，平行配制6份)
精密量取上述系统适用性溶液、对照品溶液、供试品溶液和中间精密度溶液溶液各10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，按主成分外标法加校正因子计算6份中间精密度溶液中各杂质含量及相对标准偏差(RSD)。
表7有关物质验证-精密度-中间精密度试验结果
结果表明：各杂质的6份供试品溶液含量相对标准偏差(RSD)分别为0.00％、3.77％、4.02％、5.00％、4.02％、0.00％、0.00％，均小于10％，符合要求，本法重复性较好。
中间精密度试验结果比较见表8。
表8有关物质验证-精密度-中间精密度试验比较结果
结果表明：不同分析人员、不同仪器、不同时间，各平行配制的6份溶液，供试品溶液中有关物质检出量基本一致(差值小于0.05％)，供试品溶液中间精密度良好。
6.3.8准确度
杂质对照品溶液含主成分和杂质：精密移取对照品贮备液1ml，置50ml量瓶中，加杂质混合贮备液10ml，加溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀。
回收率-定量限：取盐酸尼卡地平原料药约20mg，置10ml量瓶中，加杂质混合贮备液0.4ml，加溶剂溶解稀释至刻度，摇匀。(平行配制3份)
回收率-50％：取盐酸尼卡地平原料药约20mg，置10ml量瓶中，加杂质混合贮备液1ml，加溶剂溶解稀释至刻度，摇匀。(平行配制3份)(2mg/ml,杂质1μg/ml)
回收率-100％：取盐酸尼卡地平原料药约20mg，置10ml量瓶中，加杂质混合贮备液2ml，加溶剂溶解稀释至刻度，摇匀。(平行配制3份)(2mg/ml,杂质2μg/ml)
回收率-150％：取盐酸尼卡地平原料药约20mg，置10ml量瓶中，加杂质混合贮备液3ml，加溶剂溶解稀释至刻度，摇匀。(平行配制3份)(2mg/ml,杂质3μg/ml)
精密量取上述溶液10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，按主成分外标加校正因子计算各浓度下3份回收率溶液的测得量及加入量，计算供试品溶液的杂质原有量，根据加入量、原有量及测得量计算回收率，并计算定量限浓度下3份回收率的均值，其他浓度下9份回收率的均值及相对标准偏差(RSD)。
表9有关物质验证-准确度试验结果
结果表明：已知杂质定量限浓度下平均加样回收率均在70％～120％之间，3份回收率RSD均小于15％，50％、100％、150％浓度下平均加样回收率均在80％～120％之间，9份回收率RSD均小于5％，方法的准确度良好。
6.3.9溶液放置稳定性
将系统适用性溶液放在冷藏条件下和供试品溶液分别放在室温条件下放置，在配制后不同时间，分别精密量取10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图。
对照品溶液各时间点下测得的尼卡地平峰面积相对标准偏差(RSD)，比较各时间点下供试品溶液及供试品加标溶液的杂质含量与0h差值及杂质个数。
精密量取对照品、系统适用性溶液、供试品上述溶液10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图。
表10有关物质验证-耐用性-系统适用性2溶液稳定性
表3有关物质验证-耐用性-供试品溶液稳定性
结果表明：系统适用性溶液冷藏放置14天杂质个数不变，故系统适用性溶液溶液室温放置14天内稳定性良好。
供试品溶液室温放置33小时各杂质含量与0小时各杂质含量的差值均小于0.10％，故供试品溶液室温放置33小时内稳定性良好；供试品溶液2-8℃放置66小时各杂质含量与0小时各杂质含量的差值均小于0.10％，故供试品溶液2-8℃放置66小时内稳定性良好。
Claims (7)
1.一种测定盐酸尼卡地平原料药中有关物质的高效液相色谱方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)配制溶液：
a、稀释剂：甲醇；
b、供试品溶液：取盐酸尼卡地平原料药适量，加溶剂稀释，作为供试品溶液；
c、对照品溶液：取盐酸尼卡地平对照品适量，加溶剂稀释，作为对照品溶液；
d、系统适用性溶液：取盐酸尼卡地平各杂质对照品适量，加溶剂稀释，作为系统适用性溶液；
(2)检测：
分别取供试品溶液、对照品溶液、系统适用性溶液注入液相色谱仪，记录色谱图，按加校正因子的主成分外标法计算；
色谱条件如下：
色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；
流动相A：一水合高氯酸钠-三乙胺水溶液
流动相B：乙腈-甲醇(70:30)；
检测波长：239nm；
柱温：43℃；
流速：1.0ml/min；
进样量：20μl。
2.根据权利要求1所述的一种测定盐酸尼卡地平原料药中有关物质的高效液相色谱方法，其特征在于，所述的步骤(1)中的供试品溶液的浓度为2mg/ml；对照品溶液的浓度为2μg/ml；系统适用性溶液的主成分浓度为2mg/ml，杂质浓度为2μg/ml。
3.根据权利要求1所述的一种测定盐酸尼卡地平原料药中有关物质的高效液相色谱方法，其特征在于，所述的步骤(2)中流动相A：3.5g/L一水合高氯酸钠，含1ml三乙胺水溶液，用高氯酸调节调节pH为2.0±0.1。
4.根据权利要求1所述的一种测定盐酸尼卡地平原料药中有关物质的高效液相色谱方法，其特征在于，所述的步骤(2)中检测方法的流速为1.0ml/min。
5.根据权利要求1所述的一种测定盐酸尼卡地平原料药中有关物质的高效液相色谱方法，其特征在于所述的步骤(2)中检测方法的柱温为43℃。
6.根据权利要求1所述的一种测定盐酸尼卡地平原料药中有关物质的高效液相色谱方法，其特征在于，所述的色谱柱规格为ZORBAX SB-C18，4.6×150mm，5μm。
7.根据权利要求1所述的一种测定盐酸尼卡地平原料药中有关物质的高效液相色谱方法，其特征在于，所述的步骤(2)中用到的洗脱方式：梯度洗脱；
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