CN105602923B - 一种n-糖酰胺酶d的异源表达及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物工程领域，公开一种N‑糖酰胺酶D的异源表达及其应用。N‑糖酰胺酶D在酶解糖蛋白上的N‑链寡糖中的应用，所述N‑糖酰胺酶D的氨基酸序列如SEQ NO.1所示。本发明通过酶活性测定和底物特异性的分析，发现所述N‑糖酰胺酶D能作用于糖蛋白和糖肽，并最大限度酶切不同类型的N‑糖链结构，无自身糖基化污染，兼具了PNGase F和PNGase A两者优点的同时摒弃了它们的缺点。本发明利用基因工程手段克隆表达了重组N‑糖酰胺酶D，实现了N‑糖酰胺酶D的大量表达，获得了N‑糖酰胺酶D。

Description

一种N-糖酰胺酶D的异源表达及其应用

技术领域

本发明属于生物工程领域，具体涉及一种N-糖酰胺酶D的异源表达，生化特性优化及其应用。

背景技术

糖组学研究是继基因组学和蛋白质组学之后的一个新的生物学研究热点，其中糖蛋白质聚糖是糖组学研究的重中之重。N-糖酰胺酶(PNGase)是N-连接糖基化研究中主要的工具酶，它能够将N-糖链完整地从其所连接的蛋白分子上释放下来，能够最大程度的保持糖链和蛋白结构的完整性，并在蛋白的糖基化位点上留下标记，为相关的后续研究提供最大化的信息。因此N-糖酰胺酶被广泛用于N-连接糖链结构信息的研究，糖链结构与功能关系的研究，糖链对糖蛋白功能的影响以及蛋白质结构分析等方面。

目前应用最广泛的商业化N-糖酰胺酶主要有两种：分别是从甜杏仁提取的N-糖酰胺酶A(PNGase A)和大肠杆菌表达的重组N-糖酰胺酶F(PNGase F)，其反应过程如下图所示：

但是这两种酶在使用中都有各自不可克服的缺点：PNGase F不能酶切来源于植物或昆虫等核心结构上含有α1,3-岩藻糖的糖蛋白；PNGase A作为一种糖蛋白，在高浓度条件下，会发生一定程度的自身去糖基化作用，在糖链分析中可能有影响实验结果的风险性，同时PNGase A由于自身空间结构复杂，尚未有文献报道可以使用E.coli等原核表达系统对其进行重组表达。

综上所述，现有的PNGase F和PNGase A两种酶各有优缺点，其并不能完全满足糖组学研究的需要，因此对N-糖酰胺酶进行进一步开发和研究十分有必要。

发明内容

本发明的主要目的在于提供N-糖酰胺酶D在酶解糖蛋白上的N-链寡糖中的应用。

本发明的另一目的在于提供一种N-糖酰胺酶D，实现N-糖酰胺酶D的异源表达，相比于现有的商业N-糖酰胺酶，N-糖酰胺酶D具有更好的实用性。

本发明的另一目的在于提供一种N-糖酰胺酶D的制备方法。

本发明的目的可以通过以下技术方案实现：

N-糖酰胺酶D在酶解糖蛋白上的N-链寡糖中的应用。所述糖蛋白的来源包括动物、植物和微生物。

上述N-糖酰胺酶D的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

一种用于酶解糖蛋白上N-链寡糖的N-糖酰胺酶D，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

用于表达上所述N-糖酰胺酶D的重组表达载体、转基因细胞系和转基因重组菌。

所述的重组表达载体，采用以下方法制备：将如SEQ ID NO.2所示N-糖酰胺酶D编码基因双酶切后连接至pRSF载体的Nde I和Kpn I之间；得到大肠重组表达载体pRSF-DjPNGase。

所述的转基因重组菌是将上述的重组表达载体导入大肠杆菌中，筛选得到表达N-糖酰胺酶D的转基因重组菌；所述的大肠杆菌优选为大肠杆菌BL21(DE3)。

一种制备N-糖酰胺酶D的方法，培养含有N-糖酰胺酶D编码基因的转基因细胞系或培养上述重组表达载体转化的转基因重组菌，诱导其表达，收获表达产物，得到粗酶，然后进行纯化得到纯酶形式的目的蛋白。

上述的N-糖酰胺酶D在酶解核心结构上含有α1,3-岩藻糖的糖蛋白中的应用。

一种酶解糖蛋白制备N-链寡糖的方法，是用上述的N-糖酰胺酶D将糖链从所连接的蛋白质分子上释放下来，得到游离态N-链寡糖。

一种制备去糖基化蛋白的方法，是用上述的N-糖酰胺酶D将糖链从所连接的蛋白质分子上释放下来，得到去糖基化蛋白。

上述N-糖酰胺酶D的异源表达，为如SEQ ID NO.2所示N-糖酰胺酶D的编码基因在大肠杆菌中异源可溶性表达。

上述的N-糖酰胺酶D在酶解多种标准糖蛋白上的N-链寡糖中的应用。所述标准糖蛋白为核糖核酸酶(RNaseB)、乳铁蛋白(Lactoferrin)和辣根过氧化物酶(HRP)。

本发明涉及从一种粳稻(Dyella japonica)中克隆的N-糖酰胺酶D基因。所述编码序列如SEQ NO.2所示。本发明还涉及包含所述N-糖酰胺酶D编码序列的重组表达载体，N-糖酰胺酶D编码基因的核苷酸序列双酶切后连接至pRSF载体的Nde I和Kpn I之间；得到大肠重组表达载体pRSF-DjPNGase。本发明还制备包含N-糖酰胺酶D编码基因的转基因重组菌，将重组好的表达载体pRSF-DjPNGase转化到大肠杆菌BL21(DE3)，构成表达pRSF-DjPNGase的转基因重组菌。

将转基因重组菌通过正常的振荡培养，用IPTG诱导大肠杆菌表达目的蛋白，通过超声裂解细胞，收获表达产物，表达产物利用Ni-NTA琼脂糖凝胶进行亲和纯化。对得到的纯化形式的N-糖酰胺酶D的活性使用不同类型标准糖蛋白：核糖核酸酶(RNaseB)、乳铁蛋白(Lactoferrin)和辣根过氧化物酶(HRP)进行测试。

本发明还将N-糖酰胺酶D运用到释放多种植物糖蛋白N-链寡糖中，利用酸沉淀植物蛋白后加入N-糖酰胺酶D，得到多种不同类型的N-链寡糖，其结果如图1所示。

本发明通过利用已经非常成熟的基因工程技术，通过基因搜索，克隆，重组表达和生化特性研究等获得了一种优质N-糖酰胺酶D。其能作用于糖蛋白和糖肽，并最大限度酶切不同类型的N-糖链结构，无自身糖基化污染，兼具了PNGase F和PNGase A两者优点的同时摒弃了它们的缺点。本发明的酶具有酶切含有1，3-核心岩藻糖的结构，PNGase F却不能。本发明的酶可以在大肠杆菌中表达，不是糖蛋白，PNGase A却不能。

本发明的有益效果：

本技术方案可以通过生物工程技术得到一种优质的N-糖酰胺酶D，其兼具了PNGase F和PNGase A两者优点的同时摒弃了它们的缺点，将为植物、昆虫糖组学N-糖链研究提供更经济实用的新工具，也为动物细菌等生物的糖组学研究提供更多的选择。

附图说明

图1为N-糖酰胺酶D酶切植物糖蛋白所得N-链寡糖结构图及N-链寡糖色谱图

图2为N-糖酰胺酶D的Western blot图

图3为N-糖酰胺酶D底物特异性分析

具体实施方式

结合以下具体实施例，对本发明作进一步详细说明，本发明的保护内容不局限于以下实例。

实验材料和试剂

1、菌株和载体：

常规菌种Dyella japonica购自德国微生物菌种保藏中心(DSMZ)，保藏号：DSM-16301。大肠杆菌Top10、BL21(DE3)级表达载体pRSF购自Novagen公司。

2、酶类及其他生化试剂：

限制性内切酶、DNA Marker、Protein Marker购自TaKaRa公司；AxyPrep质粒提取试剂盒为Axygen公司产品。其他常规试剂为上海生工或南京寿德公司。

3、本发明中所使用的生物化学技术均为本领域中的常规技术:

在以下实施例中，除非特殊说明，所有实验操作均按照以下实验手册或文献中的部分进行，包括：[美]J.沙姆布鲁克等，分子克隆实验指南；赵永芳等，生物化学技术原理及其应用(第二版)；朱检等，生物化学实验[M]，本发明中所有相关的酶或酶活性均指N-糖酰胺酶D。

实施例1 N-糖酰胺酶D基因的获得

将N-糖酰胺酶D基因(SEQ ID NO.2)送至南京金斯瑞公司进行合成。具体方法为采用基于PAS(PCR-based Accurate Synthesis)的方法合成N-糖酰胺酶D的基因，设计全长拼接引物，在引物的两端各设计了保护性碱基，通过克隆位点Nde I和Kpn I连入表达载体pRSF，转入大肠杆菌Top10，过夜培养，挑取阳性克隆子测序。将测序结果与设计的预期序列进行比对，100％匹配，得到重组载体pRSF-DjPNGase。

实施例2 N-糖酰胺酶D编码基因在BL(DE21)中的表达

将实施例1中得到的带有重组质粒的大肠杆菌Top10细胞中的质粒抽提出来，转化到制备好的感受态细胞BL21(DE3)中。挑取重组大肠杆菌菌株BL21(DE3)到5ml含卡纳抗生素的LB液体培养基中37℃，250rpm振荡过夜培养。按1％接种量(v/v)转接到新鲜LB(400ml)培养液中，37℃，200rpm振荡培养至OD₆₀₀≈0.6-0.8，加入诱导剂IPTG至终浓度1.0mM，18℃，200rpm振荡过夜培养。

实施例3 N-糖酰胺酶D的纯化

将实施例2中表达的N-糖酰胺酶D的菌液4℃，4500rpm离心20min收集菌体，向菌体沉淀中加入10ml裂解缓冲液(pH7.5 50mM氯化钠；50mM Tris-HCl；1％Triton)，100μlPMSF，使菌体重悬于裂解液中，进行超声波破碎仪中破碎细胞20min。将破碎后的细胞裂解液4℃，14000rpm离心20min收集上清。

由于设计的重组表达载体pRSF-DjPNGase表达产物N端带有6个连续的组氨酸，可以通过亲和层析柱(Ni-NTA琼脂糖凝胶)亲和纯化。首先用平衡液平衡柱子(pH8.0 100mM氯化钠50mM Tris-HCl)，将粗酶液负载上柱；采用10倍体积冲洗液(pH 8.0 100mM氯化钠50mMTris-HCl)进行洗脱除去杂蛋白，然后用一定量的洗脱液(pH 8.0 50mM氯化钠50mM Tris-HCl 300mM咪唑)收集目的蛋白，每管大约1ml。保存含有目的蛋白样品管，用于后续实验。将诱导前，诱导后，上清以及纯化后的蛋白做Western blot蛋白电泳。如图2所示。

实施例4将实施例3中得到的纯酶进行底物特异性分析

本实施例将实施例3中得到的纯酶进行底物特异性分析，选取不同类型标准糖蛋白，分别为核糖核酸酶(RNaseB)、乳铁蛋白(Lactoferrin)和辣根过氧化物酶(HRP)。反应体系如下：

Na<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub>缓冲液(200mM)	10μl
		底物(10μg/μL)	10μl
纯化的酶液	10μl
		H<sub>2</sub>O	10μl
总体积	40μl

不加酶的反应作为空白对照，将样品置于37℃，过夜反应。

由于释放的N-链寡糖不能直接通过荧光或者紫外检测到，因而使用含有紫外或荧光基团的衍生试剂如2-AB(2-氨基苯甲酰胺)进行修饰，使之能够用高灵敏度的分析检测仪器如高效液相色谱(HPLC)分析。本实施例中通过2-AB标记酶解释放的N-链寡糖并使用HPLC进行荧光检测，达到分析N-糖酰胺酶D的底物特异性的目的。本实施例中使用的HPLC是岛津LC-30A型超高效液相色谱(Shimadzu，Tokyo，Japan)。该系统配备有SIL-30AC自动进样器、LC-30AD四元低压梯度泵、DGU-20A5R真空脱气机和RF-20Axs荧光检测器。

将反应结束的样品95℃加热终止反应，然后将样品旋干，将标准的2-AB试剂加到已干燥的样品中,65℃标记2小时后，加入乙腈，使其终浓度达到80％后上样。

液相色谱分离条件

色谱柱：反相HILIC色谱柱AcquityBEH Glycan Column(2.1×150mm,1.7μm particle size；Waters,Ireland)

流动相A：50mM甲酸铵(pH 4.5)缓冲液；流动相B：乙腈；

流速：0.5mL/min；

进液量：40μL；

激发、检测波长：Ex 330nm，Em 420nm；

柱温：60℃

洗脱方式：梯度洗脱，初始梯度比例95％(B相)如图3为不同糖蛋白酶解后N-链寡糖的检测。实验证明，N-糖酰胺酶D可以酶切不同类型的糖蛋白，酶解释放所有类型的N-链寡糖包含PNGase F酶所不能酶切的包含核心α1-3岩藻糖的结构。在功能上其完全可以替代PNGase F用于酶切N-链寡糖的分析。

实施例5 N-糖酰胺酶D的应用

将实施例3中纯化得到的酶应用于酶解植物糖蛋白。首先将从本地苏果超市购买的10种植物(芹菜、黄豆、绿豆、香蕉、土豆、木瓜、芦笋、梨、洋葱和胡萝卜)每种称取10g后切碎榨汁。将得到的汁液取1mL后加入等体积的40％TCA溶液，14,000rpm,4℃,离心30分钟，将得到的沉淀水洗3-5次，使其PH变为中性，加入实施例3中纯化得到的酶，反应体系如下：

Na<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub>缓冲液(200mM)	40μl
		底物	蛋白沉淀
纯化的酶液	20μl
		H<sub>2</sub>O	100μl
总体积	160μl

样品置于37℃，过夜反应。将反应结束的样品95℃加热终止反应，离心取上清，然后将样品旋干，将标准的2-AB试剂加到已干燥的样品中,65℃标记2小时后，加入乙腈，使其终浓度达到80％后上样。其液相色谱分离条件如实施例4中所示，所得N-链寡糖色谱图如图1所示。通过实验证明N-糖酰胺酶D可以直接作用于植物糖蛋白，酶解释放不同类型的N-链寡糖，包含含有核心α1-3岩藻糖的结构。其不仅能作用于不同类型的标准糖蛋白，也能作用于不同的植物样品，为研究植物中的N-链寡糖提供了有利工具。

Claims (9)

1.N-糖酰胺酶D在酶解糖蛋白上的N-链寡糖中的应用；所述N-糖酰胺酶D的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.一种用于酶解糖蛋白上N-链寡糖的N-糖酰胺酶D，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

3.用于表达权利要求2所述N-糖酰胺酶D的重组表达载体、转基因细胞系和转基因重组菌。

4.根据权利要求3所述的重组表达载体，其特征在于：所述重组表达载体的制备方法为：将如SEQ ID NO.2所示N-糖酰胺酶D编码基因双酶切后连接至pRSF载体的Nde I和Kpn I之间；得到大肠重组表达载体pRSF-DjPNGase。

5.根据权利要求3所述的转基因重组菌，其特征在于：所述的转基因重组菌是将权利要求3或4所述的重组表达载体导入大肠杆菌中，筛选得到表达N-糖酰胺酶D的转基因重组菌；所述的大肠杆菌为大肠杆菌BL21(DE3)。

6.一种制备如权利要求2所述N-糖酰胺酶D的方法，其特征在于：培养如权利要求3所述的含有N-糖酰胺酶D编码基因的转基因细胞系或培养如权利要求5所述的转基因重组菌，诱导其表达，收获表达产物，得到粗酶，然后进行纯化得到纯酶形式的目的蛋白。

7.权利要求2所述的N-糖酰胺酶D在酶解核心结构上含有α1,3-岩藻糖的糖蛋白中的应用。

8.一种酶解糖蛋白制备N-链寡糖的方法，其特征在于是用权利要求2所述的N-糖酰胺酶D将糖链从所连接的蛋白质分子上释放下来，得到游离态N-链寡糖。

9.一种制备去糖基化蛋白的方法，其特征在于是用权利要求2所述的N-糖酰胺酶D将糖链从所连接的蛋白质分子上释放下来，得到去糖基化蛋白。