CN105505959A - 一种胸膜肺炎放线杆菌的ApNGT基因及其应用 - Google Patents

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宋其涛
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Abstract

本专利涉及对胸膜肺炎放线杆菌的ApNGT基因（NCBI:ACCESSION？A3N2T3）的第1405和1406位核苷酸的特异性突变和应用，所述核苷酸为：SEQ？ID？NO:1所示的核苷酸和/或SEQ？ID？NO:2所示的核苷酸。ApNGT是来源于是胸膜肺炎放线杆菌的一种糖基化转移酶，可识别多肽或蛋白中的N-X-S/T序列，并将Glucose？(Glc)从活化的供体UDP-Glc转移到Asn残基上。我们突变的ApNGT在大肠杆菌中表达后，在多肽水平上糖基化效率与野生型的ApNGT相比提高了160多倍，这为多肽类和蛋白类生物制品糖基化修饰提供了极大便利。突变后ApNGT稳定性良好，可作为一种工具酶易于商品化生产，具有广泛的应用前景。

Description

一种胸膜肺炎放线杆菌的ApNGT基因及其应用
技术领域
本发明属于分子生物学中糖工程领域，涉及胸膜肺炎放线杆菌的ApNGT基因的第1405和1406位核苷酸的特异性突变，多肽及蛋白快速简易葡萄糖基化的酶合成方法。
背景技术
胸膜肺炎放线杆菌在1957年首次报道,早称为副溶血嗜血杆菌，1964年被正式宣布为猪胸膜肺炎的病原体，1983年重新分类后，DNA的研究显示它与林氏放线杆菌更密切相关。属于巴氏杆菌科，放线菌属，是一种革兰氏阴性多形态小球杆菌，兼性厌氧，有荚膜，鞭毛和菌毛，不能形成芽孢，是一种呼吸道寄生菌，主要存在于患病动物的肺部和扁桃体，病猪和带菌猪是本病的主要传染源。
糖蛋白在生命活动中扮演着重要的角色,如细胞信号识别、神经调控、细胞间的信息传达及免疫调节等,因此引起了人们的广泛关注。糖肽是位于糖蛋白核心结构区域的由糖基与氨基酸或多肽链以共价键相连而形成的缀合物。含有糖肽的物质与糖蛋白相比,具有多种相似的重要生物功能,同时又没有糖蛋白巨大的分子量和复杂的结构,因此成为研究糖蛋白的重要模型。而且糖肽类药物研究非常广泛，糖肽类药物主要用于治疗癌症、代谢紊乱相关的重大疾病，这些疾病相关的药物拥有全球非常重要的市场。蛋白糖基化修饰一共有5种类型，按重要性排序分别是N－O－P－C－和G－糖基化，这些糖基化修饰均通过连接寡糖基团到蛋白表面，但其修饰位点不同，其中以N-糖基化最为普遍，其通过将聚糖连接到天冬氨酸或精氨酸侧链的氮原子上对蛋白进行修饰，是目前研究的最为透彻的糖基化过程。
一直以来，大部分药物糖蛋白依赖于直接从生物体中提取，但因为数量有限成本高昂存在病毒感染等问题，无法广泛运用于临床。因此，目前的研究主要集中在开发糖蛋白表达载体，经过适当的糖基化改造，用于药用蛋白质的生产。ApNGT就属于N-糖基化修饰的一种重要的转移酶。
发明内容
本发明公开了一种胸膜肺炎放线杆菌的ApNGT基因，其特征在于，所述ApNGT突变基因的突变位点在于所述ApNGT基因从5′端起第1405个核苷酸，突变结果为C到G,第1406个核苷酸，突变结果为A到C，所述的ApNGT基因序列见SEQNO:1。其编码的氨基酸突变位点第620个氨基酸，突变结果是由Glutamine到Alanine，序列见SEQNO:2。
本发明所述胸膜肺炎放线杆菌的ApNGT基因，其中的引物SEQNO:3CATTTCCATTTTGCATTGGGGGCATCAAACGGTATTAC为特异扩增胸膜肺炎放线杆菌的ApNGT基因的上游引物；SEQNO:4GCCCCCAATGCAAAATGGAAATGCACTTTCACTTTG为胸膜肺炎放线杆菌的ApNGT基因的下游引物。
本发明所述胸膜肺炎放线杆菌的ApNGT基因，其中1）包含N-X-S/T序列的多肽进行糖基化修饰，反应为体系30ul，包含pH=8.0Tris-HCl(50mM),MgCl2(5mM),UDP-Glc(10mM),NaCl(10mM),ApNGT(0.3mg/ml),Peptide(1mM),用ddH2O补齐，37℃水浴条件下反应45分钟，采用MALDI-TOF定性和HPLC定量；
2）在包含N-X-S/T序列的蛋白hmw1ct(NCBI:Accession:WP_014550671.1GI:504363569,AtaC1866–2428)进行糖基化修饰，反应体系为200ul，包含pH=8.0Tris-HCl(50mM),MgCl2(5mM),UDP-Glc(5mM),NaCl(100mM),ApNGT(0.3mg/ml),Protein(1mg/ml),37℃反应一个小时，使用MALDI-TOF定性。
本发明进一步公开了胸膜肺炎放线杆菌ApNGT基因在制备提高糖基化多肽的效率方面的应用。实验结果表明：本发明提供的胸膜肺炎放线杆菌ApNGT基因（改造型酶），可以大量提高糖基化多肽的效率，可以实现体外多肽糖基化，通过绿色环保，简易的操作可以大量获得糖基化多肽，突破了现有化学方法合成糖肽步骤繁多，成本高昂，选择性差的屏障。同时突变的ApNGT在大肠杆菌中表达后，在多肽水平上糖基化效率与野生型的ApNGT相比提高了160多倍，这为多肽类和蛋白类生物制品糖基化修饰提供了极大便利。突变后ApNGT稳定性良好，可作为一种工具酶易于商品化生产，具有广泛的应用前景。
本发明所述SEQNO:1的原始基因序列atggaaaacgaaaataaaccgaatgtagctaattttgaagcggcggttgcggctaaagattatgaaaaagcttgctccgaattacttttaattttgagtcagttagatagtaactttggtggtattcatgagattgagtttgaatatccggcgcagcttcaggatttagagcaagaaaaaatcgtttatttttgtacgcgtatggcaacggcgattactacgttgttttccgatcctgtcttagaaatctccgatttaggcgttcagagatttttggtttatcaacgttggttagcgttaatctttgccagttcaccgtttgtgaatgcggatcatatattacaaacatataacagagagccgaatcgtaagaatagtttagagattcatttagattcttcaaaatcgtcattaattaaattctgtatcctgtatttaccggaatctaacgtaaatttgaatctggatgtaatgtggaatatttcacctgaattatgcgcttctttatgttttgctttgcaatcgcctcgttttgtcggtacatcaactgcgtttaataaacgagcgaccattttgcaatggtttccacgacatttggatcaacttaaaaacctgaataatattcctagtgccatttcgcatgacgtatatatgcattgtagttatgatacgtcagtaaataaacatgatgtgaaaagggcgttaaatcatgttattcgtcgccatatcgaaagtgaatacggttggaaagatcgtgatgtcgctcatatcggttatcgtaataataaaccggttatggtcgtattactggaacatttccattcggcccattctatttaccgtacgcattccacatctatgattgcggcacgtgaacatttctatttaatcggtttaggtagtccgtcggttgatcaagcgggtcaagaggtttttgatgagttccacttggttgccggcgataatatgaagcagaagttagaatttatccgctcagtttgtgagagcaacggtgccgcaatattttatatgccgagtatcggtatggatatgacgacgattttcgcaagtaatacgcgccttgctccgatacaagcgatagcattggggcatccggcaacaacacattcggacttcattgaatatgtgattgtggaagacgattatgtcggctcggaagagtgctttagcgaaacgttattacgtttaccaaaagatgcgctgccttacgtcccgtcagcattagcgcctgaaaaagtggactatttattacgtgaaaatccggaagtggtaaatatcggtatagcttcaaccacgatgaagctaaatccgtatttcttagaagcgttaaaagcgattcgtgatcgtgccaaagtgaaagtgcatttccattttgcattggggcaatcaaacggtattactcacccgtatgtagaacgctttattaaatcttatttaggtgattcggccactgcgcaccctcattctccttatcatcaatatctccgtattttgcataattgcgatatgatggtaaacccgttcccattcgggaatacgaacggaattatcgatatggtcactttaggcttagttggtgtgtgtaagacaggagccgaagttcatgagcatattgatgaagnggctgtttaaacgtttaggcttacccgagtggctgatagcaaatacggtagatgaatatgttgaacgggcggttcgcttagcggaaaatcatcaggagcgtttagagttacgtcgatatattattgaaaataacggattgaacacattgtttaccggggatcctagaccgatgggacaagtatttttagaaaaattaaatgcgttcctaaaagaaaattaa
SEQNO:2的原始氨基酸序列MENENKPNVANFEAAVAAKDYEKACSELLLILSQLDSNFGGIHEIEFEYPAQLQDLEQEKIVYFCTRMATAITTLFSDPVLEISDLGVQRFLVYQRWLALIFASSPFVNADHILQTYNREPNRKNSLEIHLDSSKSSLIKFCILYLPESNVNLNLDVMWNISPELCASLCFALQSPRFVGTSTAFNKRATILQWFPRHLDQLKNLNNIPSAISHDVYMHCSYDTSVNKHDVKRALNHVIRRHIESEYGWKDRDVAHIGYRNNKPVMVVLLEHFHSAHSIYRTHSTSMIAAREHFYLIGLGSPSVDQAGQEVFDEFHLVAGDNMKQKLEFIRSVCESNGAAIFYMPSIGMDMTTIFASNTRLAPIQAIALGHPATTHSDFIEYVIVEDDYVGSEECFSETLLRLPKDALPYVPSALAPEKVDYLLRENPEVVNIGIASTTMKLNPYFLEALKAIRDRAKVKVHFHFALGQSNGITHPYVERFIKSYLGDSATAHPHSPYHQYLRILHNCDMMVNPFPFGNTNGIIDMVTLGLVGVCKTGAEVHEHIDEGLFKRLGLPEWLIANTVDEYVERAVRLAENHQERLELRRYIIENNGLNTLFTGDPRPMGQVFLEKLNAFLKEN
本发明公开的胸膜肺炎放线杆菌的ApNGT基因的优点在于：
1.多肽葡萄糖基化效率提升了100多倍。
我们已经通过MALDI-TOF检测氨基酸序列为GGFNLTYTIER的多肽底物可以被野生型和改造型NGT糖基化，因而实验设计了带荧光标签的该多肽，具体为FITC-GGFNLTYTIER，通过对两个酶的动力学参数的测定，从数据中我们可以得到改造型酶Q469A多肽葡萄糖基化效率提升160倍左右。
大量获得葡萄糖基化的多肽和糖蛋白的简易程序。
现阶段的糖肽合成主要靠化学合成方法，主要有直线型合成法，汇聚式合成法，直线-汇聚混合法，自然连接合成法等等，这些方法合成成本高，需要非常多的功能团保护和去保护，保护和去保护的方法需要有很高的选择性和专一性。而且糖苷键的形成还应具有较好的立体选择性，并且在后续合成中要保持其构型不变，难度非常大，产率低。本发明提供可以简易大量获得葡萄糖基化的多肽，只要多肽中的氨基酸序列含有N-X-S/T（其中X可为任意氨基酸，除脯氨酸外），而且可使用其他种类的酶进一步在葡萄糖基化的多肽的葡萄糖上加以修饰，获得糖链糖基化的多肽，乃至糖蛋白。
改造型酶糖基化蛋白识别位点比野生型更广泛。
本发明采用受体蛋白hmw1ct，在体系下反应一个小时后，进行MALDI-TOF质谱检测，发现改造型酶可以糖基化该蛋白8个位点，野生型酶糖基化该蛋白7个位点，相比之下，改造型酶具有更广泛的识别N-X-S/T（其中X可为任意氨基酸，除脯氨酸外）序列。
说明书附图：
图1为含未突变ApNGT基因的pET-15b质粒提取的琼脂糖凝胶电泳结果；
图2为PCR产物琼脂糖凝胶电泳结果；
图3为突变ApNGT基因测序后和未突变ApNGT基因比对；
图4为突变ApNGT基因的pET-15b质粒提取的琼脂糖凝胶电泳结果；
图5为突变的ApNGT蛋白SDS-PAGE考马斯亮蓝染色结果；
图6为未突变的ApNGT蛋白SDS-PAGE考马斯亮蓝染色结果；
图7（a）为HPLC测定改造型酶糖基化多肽产率；
图7（b）为HPLC测定野生型酶糖基化多肽产率；
图8（a）为改造型酶糖基化多肽MALDI-TOF检测结果；图8（b）为野生型酶糖基化多肽MALDI-TOF检测结果；
图9（a）未糖基化蛋白MALDI-TOF质谱检测结果；
图9（b）改造型酶糖基化蛋白MALDI-TOF质谱检测结果；
图9（c）野生型酶糖基化蛋白MALDI-TOF质谱检测结果。
具体实施方式
一.下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。下面结合附图对本发明提供的一种胸膜肺炎放线杆菌的ApNGT基因及具体应用的详细说明
二.本发明所用到的菌种及质粒来源如下：
（一）、将带有未突变的胸膜肺炎放线杆菌的ApNGT基因的pET-15b质粒从大肠杆菌中提取后，利用8‰琼脂糖凝胶电泳检测提取的质粒，用紫外观测结果（详细结果见附图1）
（二）、通过FastMutagenesisSystem完成突变
1.聚合酶链式反应(PCR)
将引物依照标注的浓度用ddH2O稀释，利用FastMutagenesisSystem已知，参考TransGenBiotech公司的说明书.并且适度优化）进行突变。反应体系25μL，具体如下：
表1FastMutagenesisSystem反应体系的组成
打开PCR仪，设置各个阶段的温度和时间如下：
表2PCR各个阶段的温度与时间
2.PCR产物的验证
利用8‰琼脂糖凝胶电泳检测提取的质粒，在紫外灯下观测电泳结果（详见附图2）。根据突变的产物条带亮度，选取产率较高的样品，进行后续反应。
3.消化
向选中的突变产物中加入0.8μLDMT酶，用移液枪吹打混匀。将混合物于37℃恒温消化1h。
（三）突变后的胸膜肺炎放线杆菌的ApNGT基因导入DMT感受态细胞中，然后过夜培养该菌种，第二天取突变的菌液，递交给金唯智生物科技有限公司进行测序。测序使用的引物为T7和T7-Term。测序结果与NCBI数据库提供的胸膜肺炎放线杆菌的ApNGT基因比对，得到的突变位点，结果详见附图3所示。
（四）突变后的胸膜肺炎放线杆菌的ApNGT基因的表达与纯化
1.使用质粒提取试剂盒将含有突变后的胸膜肺炎放线杆菌的ApNGT基因的质粒的提取后，利用8‰琼脂糖凝胶电泳检测所提取的质粒，在紫外灯下观测电泳结果，详见附图4。切胶回收质粒，将其导入BL21(DE3)感受态细胞中，依次进行涂布，37℃恒温培养12小时。
2.挑取单菌落活化于含50μg/mL的氨苄青霉素的4mLLB液体培养基中，37℃，200r/min培养6h后，重新接种扩大培养（37℃，200r/min培养约4h），待菌液OD600值达到0.6，加入0.1mmol/LIPTG，诱导蛋白的表达（16℃，160r/min）。诱导20h后，8000r/min离心10min收集菌体，PBS预洗1次后，按照每克湿菌体加入10mLPBS(pH8.0)柱平衡缓冲液（PBS）的量充分悬浮菌体，在冰浴条件下超声破碎菌体(160W，工作2s，间歇4s，10-20min)，然后4℃、12000r/min离心30min。收集上清，将上清液用0.22μm水膜过滤后，与预装好的且经PBS预洗过的Ni-NTA填料在4℃混合孵育10min，让液体经重力流经填料，弃流穿液，再依次用10mmol/L，30mmol/L，50mmol/L咪唑溶液梯度洗脱镍柱，去掉杂蛋白。最后用250mmol/L的咪唑溶液洗脱镍柱，并收集洗脱的溶液即目的蛋白溶液。
3.使用12%SDS-PAGE检测蛋白质，详见附图5，收集较浓的蛋白溶液混合后，使用30K的超滤膜超滤后进行BCA定量。
4.未突变的胸膜肺炎放线杆菌的ApNGT基因的表达与纯化操作如上，详见附图6。
（五）ApNGT的具体应用
（1）多肽反应为体系30ul，包含pH=8.0Tris-HCl(50mM),MgCl2(5mM),
UDP-Glc(10mM),NaCl(10mM),ApNGT(0.3mg/ml),Peptide(1mM),用ddH2O补齐，37℃水浴条件下反应45分钟，用甘氨酸终止液终止反应。
（a）HPLC定量采用C18反向色谱柱流速0.8mL/min，
时间色普乙腈（1‰三氟乙酸）超纯水（1‰三氟乙酸）
0min8%92%
10min8%92%
25min28%72%
35min42%58%
35.01min80%20%
举例多肽GGFNLTYTIER，详见附图7。
（b）MALDI-TOF定性基质20mg/mlDHB。举例详见附图8；我们可以得到，改造型酶可以大量提高糖基化多肽的效率，本发明可以实现体外多肽糖基化，通过绿色环保，简易的操作可以大量获得糖基化多肽，突破了现有化学方法合成糖肽步骤繁多，成本高昂，选择性差的屏障。
（2）蛋白反应为体系200ul，包含pH=8.0Tris-HCl(50mM),MgCl2(5mM),UDP-Glc(5mM),NaCl(100mM),ApNGT(0.3mg/ml),Protein(1mg/ml),37℃反应一个小时，使用MALDI-TOF定性。基质为10mg/ml的SA，举例详见附图9。
由检测结果可以得到野生型酶可以糖基化该蛋白7个位点，改造型可以糖基化该蛋白8个位点，改造型糖基化位点比野生型提高一个。改造型酶糖基化该蛋白更为彻底，蛋白原料已经完全糖基化，这使蛋白糖基化均一成为可能。同时，使用识别葡萄糖的糖基转移酶，进一步进行糖链修饰，与市场蛋白PEG化相比较，此方法具有针对性，准确性。而且，基于改造型酶识别位点多，糖基化效率高的优势，可以通过同位素标记葡萄糖进行蛋白或多肽同位素标记，为药物代谢实时检测提供了全新的方法。除此之外，蛋白糖基化之后，可以增强蛋白的稳定性，可以抑制具有选择性位点的蛋白酶的水解作用，从而达到选择性保护蛋白质某个肽段的目的。
以上所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。
SEQUENCELISTING
<110>南开大学
<120>一种胸膜肺炎放线杆菌的ApNGT基因及其应用
<160>4
<170>PatentInversion3.5
<210>1
<211>1864
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(1643)..(1643)
<223>nisa,c,g,ort
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SerValAsnLysHisAspValLysArgAlaLeuAsnHisValIleArg
225230235240
ArgHisIleGluSerGluTyrGlyTrpLysAspArgAspValAlaHis
245250255
IleGlyTyrArgAsnAsnLysProValMetValValLeuLeuGluHis
260265270
PheHisSerAlaHisSerIleTyrArgThrHisSerThrSerMetIle
275280285
AlaAlaArgGluHisPheTyrLeuIleGlyLeuGlySerProSerVal
290295300
AspGlnAlaGlyGlnGluValPheAspGluPheHisLeuValAlaGly
305310315320
AspAsnMetLysGlnLysLeuGluPheIleArgSerValCysGluSer
325330335
AsnGlyAlaAlaIlePheTyrMetProSerIleGlyMetAspMetThr
340345350
ThrIlePheAlaSerAsnThrArgLeuAlaProIleGlnAlaIleAla
355360365
LeuGlyHisProAlaThrThrHisSerAspPheIleGluTyrValIle
370375380
ValGluAspAspTyrValGlySerGluGluCysPheSerGluThrLeu
385390395400
LeuArgLeuProLysAspAlaLeuProTyrValProSerAlaLeuAla
405410415
ProGluLysValAspTyrLeuLeuArgGluAsnProGluValValAsn
420425430
IleGlyIleAlaSerThrThrMetLysLeuAsnProTyrPheLeuGlu
435440445
AlaLeuLysAlaIleArgAspArgAlaLysValLysValHisPheHis
450455460
PheAlaLeuGlyGlnSerAsnGlyIleThrHisProTyrValGluArg
465470475480
PheIleLysSerTyrLeuGlyAspSerAlaThrAlaHisProHisSer
485490495
ProTyrHisGlnTyrLeuArgIleLeuHisAsnCysAspMetMetVal
500505510
AsnProPheProPheGlyAsnThrAsnGlyIleIleAspMetValThr
515520525
LeuGlyLeuValGlyValCysLysThrGlyAlaGluValHisGluHis
530535540
IleAspGluGlyLeuPheLysArgLeuGlyLeuProGluTrpLeuIle
545550555560
AlaAsnThrValAspGluTyrValGluArgAlaValArgLeuAlaGlu
565570575
AsnHisGlnGluArgLeuGluLeuArgArgTyrIleIleGluAsnAsn
580585590
GlyLeuAsnThrLeuPheThrGlyAspProArgProMetGlyGlnVal
595600605
PheLeuGluLysLeuAsnAlaPheLeuLysGluAsn
610615620
<210>3
<211>38
<212>DNA
<213>人工序列
<400>3
catttccattttgcattgggggcatcaaacggtattac38
<210>4
<211>36
<212>DNA
<213>人工序列
<400>4
gcccccaatgcaaaatggaaatgcactttcactttg36

Claims (5)

1.一种胸膜肺炎放线杆菌的ApNGT基因，具有SEQNO:1所示的ApNGT基因序列。
2.一种胸膜肺炎放线杆菌的ApNGT基因，其编码的620个氨基酸序列见SEQNO2。
3.权利要求1所述胸膜肺炎放线杆菌的ApNGT基因，其中的引物SEQNO:3CATTTCCATTTTGCATTGGGGGCATCAAACGGTATTAC为特异扩增胸膜肺炎放线杆菌的ApNGT基因的上游引物；SEQNO:4GCCCCCAATGCAAAATGGAAATGCACTTTCACTTTG为胸膜肺炎放线杆菌的ApNGT基因的下游引物。
4.权利要求1所述胸膜肺炎放线杆菌的ApNGT基因，其中1）包含N-X-S/T序列的多肽进行糖基化修饰，反应为体系30ul，包含pH=8.0Tris-HCl(50mM),MgCl2(5mM),UDP-Glc(10mM),NaCl(10mM),ApNGT(0.3mg/ml),Peptide(1mM),用ddH2O补齐，37℃水浴条件下反应45分钟，采用MALDI-TOF定性和HPLC定量；
2）在包含N-X-S/T序列的蛋白hmw1ct(NCBI:Accession:WP_014550671.1GI:504363569,AtaC1866–2428)进行糖基化修饰，反应体系为200ul，包含pH=8.0Tris-HCl(50mM),MgCl2(5mM),UDP-Glc(5mM),NaCl(100mM),ApNGT(0.3mg/ml),Protein(1mg/ml),37℃反应一个小时，使用MALDI-TOF定性。
5.权利要求1所述的胸膜肺炎放线杆菌ApNGT基因在制备提高糖基化多肽效率方面的应用。
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