CN114369584B - 重组人源岩藻糖基转移酶变异体及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一组重组人源岩藻糖基转移酶变异体，通过对特定位点和片段进行替换、增减、或删除后，改变岩藻糖基转移活性，显著提高转移分子量大于100KD的含有鸟苷二磷酸岩藻糖(GDP‑Fucose)的供体分子。在所述酶突变体的作用下，可以将大分子量的供体分子（例如偶联了抗体分子或者重组蛋白的GDP‑Fucose）转移至受体GlcNAc（N‑乙酰氨基葡萄糖）和LacNac(N‑乙酰乳糖胺)。受体可存在于大分子物质和细胞膜表面。本发明还公开了岩藻糖基转移酶突变体在分子标记和活体细胞标记中的应用。

Description

重组人源岩藻糖基转移酶变异体及应用
技术领域
本发明涉及一种蛋白突变体，属于多肽技术领域。
背景技术
糖基化是碳水化合物与目标分子（通常为蛋白质和脂质）共价连接的过程，蛋白质分子的糖基化是最丰富的翻译后修饰之一，这种修饰具有多种功能，例如，参与蛋白质分子的正确折叠，调节蛋白质的热力学和动力学稳定性，参与分子间相互作用和细胞间粘附，参与免疫识别或者免疫逃逸。与DNA转录或蛋白质翻译不同，蛋白质的糖基化过程没有模板，是一种是酶促反应，供体分子通常是一种活化的核苷酸糖，在糖基转移酶的作用下，对受体位点（羟基或其它官能团）进行特异的糖缀合物的反应。岩藻糖作为糖蛋白中糖链的组成部分，广泛存在于各类细胞表面的质膜上。岩藻糖基转移酶是将L-岩藻糖从GDP-岩藻糖（鸟苷二磷酸岩藻糖）供体底物转移到受体底物的酶。据目前的各种文献报道，岩藻糖基转移酶的主要供体底物都是分子量比较小的GDP-岩藻糖。在岩藻糖基转移酶的作用下，将岩藻糖苷转移至哺乳细胞糖蛋白蛋白N-多糖上。人源的岩藻糖基转移酶一共有11种，分别为FUT1;FUT2; FUT3; FUT4; FUT5; FUT6; FUT7; FUT8; FUT9; FUT10; FUT11。岩藻糖转移酶属于II型一次跨膜蛋白，主要存在于高尔基体内。原核生物的岩藻糖基转移酶，目前经过验证的主要来自幽门螺杆菌（Helicobacter pylori），包括6条序列（Uniprot：http://www.cazy.org/GT10.html）。
细胞表面的分子决定了细胞如何与其它细胞以及周围环境相互作用。肿瘤的治疗性抗体例如抗-CD20, 抗-VEGFR等通过结合T淋巴细胞和NK细胞表面的FcgR，同时结合肿瘤细胞表面的抗原，使得T和NK细胞发挥肿瘤杀伤作用（ADCC）。受其启发，肿瘤免疫疗法近年来有了突变进展——嵌合抗原受体T细胞免疫疗法， Chimeric Antigen Receptor T-CellImmunotherapy （CAR-T），其中Kymriah是第一款被美国批准用于治疗B细胞前体急性淋巴细胞白血病。这是一种治疗肿瘤的新型精准靶向疗法，其用生物技术把辨识癌细胞表面CD19抗原的CAR基因插到T细胞膜表面上，直接识别肿瘤细胞，激活T细胞进行肿瘤杀伤。但CAR-T的技术工艺复杂，价格昂贵。类似CAR-T这样的细胞工程的主要技术挑战是在不干扰细胞内源性功能的情况下赋予被操纵细胞新的特性。作为目前最常见和最稳健的细胞工程方法，首先受到技术复杂性和安全问题的限制，如原代细胞病毒转导效率的再现性不一致、CAR基因的异质表达水平，以及内源性基因被破坏的可能性。因此，使用化学生物学工具直接修饰细胞表面已成为细胞治疗的一种补充和普遍适用的方法。其中包括Bertozzi等人开发的代谢寡糖修饰法（MOE）和细菌转肽酶sortases催化的转肽反应。（Stephan,等.NanoToday 2011, 6, 309−325.；Griffin等. Cell Chem. Biol. 2016, 23, 108−121. ；Hudak等 Chem. Biol. 2014, 21, 16−37. ；Bi, X等. Engineering. Chem. - Eur. J. 2018,24, 8042−8050.））此外，Wu等利用幽门螺杆菌的岩藻糖基转移酶成功地将抗体类大分子蛋白转移到细胞膜表面的多糖上，例如LacNAc和α2,3 sialyl LacNAc。利用这种技术，Wu等构建了两种类型的工程细胞——使用自然杀伤细胞系（NK-92MI）和小鼠原代CD8+OT-1T细胞，通过岩藻糖基转移酶将Her2抗体和PD-L1的抗体分别转移至NK-92MI和CD8+OT-1T细胞，并在小鼠模型中展示了特异性肿瘤靶向性和对抗肿瘤细胞产生的抑制信号（参见Li J,等.ACS Cent Sci. 2018 Dec 26;4(12):1633-1641. ）。因此，利用岩藻糖基转移酶将与供体底物相结合的目的分子标记到携带有受体底物的目的细胞将使得诸如CAR-T这样的细胞治疗的效果得到大幅提升。
糖苷转移酶(glycotransferase)能够在中性条件下，尤其是哺乳细胞无损伤的反应条件下作用，对于细胞学工程是一个无以比拟的长处。但是无论是细菌来源的还是人源的岩藻糖基转移酶对于大分子的供体底物的酶活性并不好。本发明人在研究中发现，相比小分子GDP-Fucose而言，岩藻糖基转移酶对于大分子的供体底物的酶活性降低近千倍，不能满足临床治疗的需求。因此，本发明的目的就是提供一种对于大分子的供体底物转移具有优异酶活性的岩藻糖基转移酶突变体。
发明内容
基于上述目的，本发明首先提供了一种重组人源岩藻糖基转移酶变异体，所述重组人源岩藻糖基转移酶变异体在SEQ ID NO. 1所示的野生型氨基酸序列的第 109 氨基酸至第110氨基酸或者第 170 氨基酸至第171氨基酸的位置插入来源于幽门螺杆菌的alfa-1,3岩藻糖基转移酶序列中较为宽松的序列SEQ ID NO. 7或者SEQ ID NO. 8，此处所述较为宽松的序列是指没有固定的二级结构的非保守性序列。
在一个优选的实施方案中，所述重组人源岩藻糖基转移酶变异体的序列如SEQ IDNO. 3所示。
在另一个优选的实施方案中，所述重组人源岩藻糖基转移酶变异体的序列如SEQID NO. 5所示。
其次，本发明提供了一种上述重组人源岩藻糖基转移酶变异体的多核苷酸，所述多核苷酸的序列如SEQ ID NO. 4所示。
在另一个可选择的实施方案中，所述多核苷酸的序列如SEQ ID NO.6所示。
第三，本发明提供了一种含有上述多核苷酸的表达载体。
第四，本发明提供了一种含有上述表达载体的宿主细胞。
在一个优选的实施方案中，所述宿主细胞为HEK293细胞或者CHO细胞。
第五，本发明提供了一种应用上述的重组人源岩藻糖基转移酶变异体将靶分子标记于目的细胞或者目的蛋白质的方法，所述方法包括：
（1）将供体底物与靶分子相缀合获得连接复合物；
（2）在所述的重组人源岩藻糖基转移酶变异体存在的条件下，使步骤（1）获得的连接复合物与含有GlcNac受体分子的目的细胞或者目的蛋白质一起孵育，获得被标记了靶分子的目的细胞。
在一个优选的实施方案中，所述供体底物的分子量为500D 至150KD的GDP-Fucose-(PEG4)n，所述n为0-10的整数。
在一个更为优选的实施方案中，所述靶分子为IgG，所述n=2。
第六，本发明提供了一种根据上述方法标记的细胞或者蛋白质。
最后，本发明提供了上述的细胞或者蛋白质在制备疾病治疗药物中的应用。
在一个优选的实施方案中，所述疾病为肿瘤、炎症性疾病、代谢类疾病或需要酶替代治疗的罕见病。
本发明对人源的岩藻糖基转移酶的特定位点和片段进行替换、增减、或删除后，改变岩藻糖基转移活性，对于含有鸟苷二磷酸岩藻糖(GDP-Fucose)的抗体作为供体分子时，酶活性提高了数十倍。并且发现，GDP-Fucose与抗体分子之间的linker会影响转移效率，例如，GDP-Fucose与抗体分子之间的linker选用2个PEG4时，相比选用1个PEG4作为linker，FUT-M6的酶活性增加了3.6倍（如图5）。本发明显示利用重组的突变体FUT-M6，FUT-M17可以将分子量500D （例如GDP-Fucose）至 150KD (例如GDP-Fucose-免疫球蛋白)的供体分子，催化转移到含有GlcNac的受体分子上，例如将GDP-Fucose-(PEG4)n-IgG有效地转移至HEK293细胞表面。利用这种方法，不仅可以使得细胞迅速获取新的细胞表面信号分子，通过和效应细胞相互作用，用于激活或者抑制，例如T细胞表面偶联PD-L1的抗体用于拮抗肿瘤细胞传递给T细胞的抑制作用；也可以通过NK细胞表面偶联肿瘤相关抗原（TAAs）的抗体，例如抗Her2，EFGR，VEGFR，CD19等加强NK细胞的靶向性、提高抗肿瘤的效果。此外，还可以通过偶联一种或者数种肿瘤特异识别抗原，改善CAR-T的靶向性，减少CAR-T的脱靶副作用。此外，还可以将代谢相关的酶偶联在血液细胞表面，例如尿酸氧化酶，清除血液和组织中的尿酸，治疗难治性痛风。
附图说明
图1. 重组人源岩藻糖基转移酶表达产物SDS-PAGE鉴定图谱；
图2. 重组人源岩藻糖基转移酶表达产物活性检测图；
图3. 人岩藻糖基转移酶FUT6，FUT10和FUT11针对不同供体底物的Km值检测结果图；
图4. 人岩藻糖基转移酶FUT6及突变体针对不同供体底物的Km值检测结果图；
图5. 人岩藻糖基转移酶FUT6及突变体针对不同供体底物的酶活性比较图；
图6.岩藻糖基转移酶的突变体催化的供体底物标记HEK293的流式细胞术检测图。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的权利要求所限定的保护范围构成任何限制。
实施例1. 重组岩藻糖基转移酶的制备
1.1质粒制备
委托苏州君跻生物科技有限公司合成质粒DNA，并克隆至载体pRM293（在质粒pTT5的基础上进行改造获得pRM293, 具体参见Shi C. Purification and characterizationof a recombinant G-protein-coupled receptor, Saccharomyces cerevisiae Ste2p,transiently expressed in HEK293 EBNA1 cells. Biochemistry. 2005;44(48):15705–15714.）上，分别用于表达FUT6, FUT10, FUT11重组蛋白（氨基酸序列分别见于GenBank:M98825.1或CCDS12152.1，或本申请的SEQ ID NO. 1；GenBank: AJ431184.1或CCDS6088.1和GenBank: BC036037.1或CCDS7333.1, 构建成表达质粒FUT6-pRM293, FUT10-pRM293,FUT11-pRM293。具体操作方法参照《分子克隆实验指南》，质粒先转化DH10B、测序、保菌和菌液培养。按照《Qiagen Mini-prep Kit》和《Qiagen Endofree Maxi-prep Kit》提到的操作方法，进行质粒的制备。
1.2 细胞转染
提取FUT6-pRM293, FUT10-pRM293, FUT11-pRM293质粒DNA，并转染HEK293细胞(National Research Council，Canada)中，详细步骤为：
1.2.1试剂制备
1.2.1.1制备G418溶液：称取250 mg GeneticinTM加入4.5 mL超纯水溶解，超纯水定容至5 mL，0.22 μm滤膜过滤，-20℃保存；
1.2.1.2制备PEI溶液：称取50 mg PEI加入45 mL超纯水溶解，1M NaOH调节pH至7.0，超纯水定容至50 mL，0.22 μm滤膜过滤，-20℃保存；
1.2.1.3制备培养基：在1L FreeStyleTM 293Expression Medium中加入10 mLPluronicdTMF-68和500 μL G418；
1.2.1.4 质粒提前准备在2 mL去内毒素离心管中；
1.2.1.5根据转染需要体积准备好新鲜传代至（1-1.2）×10^6个/mL的细胞悬液。
1.2.2配制转染试剂-质粒复合物
将1μg/mL质粒与33.3μL/mL Opti-MEMTM混合得到A液，
将2μg/mL PEI 与33.3μL/mL Opti-MEMTM混合得到B液，
将B液倒入A液混匀孵育10 min后，加入细胞悬液。
1.2.3 换液转染
在115 rpm，36.8℃，5％CO2培养4 h后，800 g 5 min离心，换成未添加F68和G418的FreeStyleTM293 Expression Medium。
1. 3. 蛋白表达
在115 rpm，36.8℃，5％CO2培养5天后，8500 rpm离心15 min，收集细胞上清。
重组蛋白都带有Fc结构域标签，因此利用Mabselect sure(Protein A, GEhealthcare)进行亲和纯化，纯化方法可见纯化填料说明书；然后再经过凝胶过滤层析（superdex200，GE Healthcare）进行进一步纯化得到纯度较高的蛋白，并去除聚合体。按照《分子克隆实验指南》描述的方法进行SDS-PAGE分析。
人源的岩藻糖基转移酶去除跨膜区和胞浆内段，利用分泌蛋白的信号肽，在哺乳类细胞中融合表达标签进行重组表达，使得岩藻糖基转移酶分泌到细胞外的培养基里, 以便纯化。
信号肽选用人CD33信号肽（编码序列如SEQ ID NO. 2所示）。在CD33的C端和岩藻糖基转移酶的N端之间插入一段241个氨基酸的表达标签，分子量约为25KD。
1. 4 鉴定
FUT6, FUT10, FUT11重组酶在HEK293细胞或者CHO细胞中进行瞬时转染表达。其中FUT6, FUT10, FUT11在相同的条件下表达量最高。收集培养上清，进行纯化，包括亲和层析、疏水相互作用层析以及离子交换层析中的一种或多种。亲和层析为使用琼脂糖凝胶进行线性梯度洗脱，获得含有目的蛋白的洗脱液。洗脱缓冲液为，0.5mM EDTA, 0.1%Tween20, 20mM Tris, pH7.0。纯化后的溶液用30kDa的膜超滤浓缩换液至含有0.0001%Tween 20 pH7.0的磷酸缓冲液中。图1为本发明实施例中纯化后的FUT6,FUT10和FUT11重组蛋白的SDS-PAGE电泳, 上样缓冲液中加入还原剂β-巯基乙醇。
实施例2. 重组岩藻糖基转移酶的活性检测
纯化的FUT6, FUT10, FUT11重组酶进行了酶活性的分析和测量，反应缓冲液中含有40ng重组酶 100 µM超纯GDP-岩藻糖（GDP-Fucose）（Promega Cat.#VA1097）作为供体底物，和40µM胎球蛋白（Promega Cat#V4961）作为受体底物。所有酶反应均在25µL体积的白色96孔板中进行。在室温下静置孵育60分钟。GDP糖基转移酶测定按手册（Promega GDP-Glo™Glycosyltransferase Assay）所述进行。
在PBS缓冲液25µl反应体积中，含有40 ng的重组岩藻糖基转移酶和100 µM GDP-岩藻糖作为供体底物，以及对倍稀释（40 µM）的胎球蛋白作为受体底物，37度孵育30分钟。然后室温下加入 25 µl GDP Detection Reagent ，孵育60分钟，放入GloMax® 96 微孔板发光检测仪 （Cat# E6501），室温下读取，进行酶活性（Km）的检测。在岩藻糖基转移酶的作用下，岩藻糖转移至胎球蛋白上，同时释放出游离的GDP。加入GDP检测试剂，将GDP转化为ATP，并使用荧光素酶/荧光素反应测量新合成的ATP。酶反应产生的荧光与GDP数量相关，从而反应出岩藻糖基转移酶的活性。具体操作如下文所述。
2.1 GDP 生产率测定
PBS缓冲液25 µl反应体积中含有40 ng 的FUT6，FUT10和FUT11重组酶，胎球蛋白作为受体底物从0 – 40 µM对倍稀释，供体底物是100 µM GDP-岩藻糖。37度孵育30分钟。然后室温下加入 25 µl GDP 检测试剂 ，孵育60分钟，放入GloMax® 96 微孔板发光检测仪（Cat# E6501），室温下读取。用公式Y = 1491*X + 379.0（Y是发光检测仪上读取的数据，X是GDP的浓度）计算出GDP的浓度μM，除以60（min）和 FUT的质量 （ng), 得出GDP 生产率。即当供体底物、受体底物和酶的浓度一定的情况下，在以上所述的特定反应条件中，Fucose-GDP上的Fucose被转移到受体底物上，从而释放出GDP，因此检测反应体系中的GDP浓度即可反映出酶的活性。例如当受体底物为7.5 μM，供体底物为100 μM，酶的浓度是40 ng时，在37度孵育30分钟后检测，FUT6, FUT10和FUT11的活性可以用GDP生产效率表示，分别为约140,72，60 pmol/min/μg。1μg FUT6在1分钟内可以催化140 pmol的底物转移，其催化能力大于FUT10和FUT11（参见图2）。
2.2 岩藻糖基转移酶的活性测定
以受体底物胎球蛋白为横坐标，GDP生产率为纵坐标，用非线性回归进行拟合获得Km值。Km又称米氏常数，Km的含义是酶促反应达最大速度（Vm）一半时的底物(S)的浓度，是酶的特征常数之一。不同的酶Km值不同，同一种酶与不同底物反应Km值也不同，Km值可近似的反映酶与底物的亲和力大小：Km值大，表明亲和力小；Km值小，表明亲合力大。
具体步骤为：PBS缓冲液25 µl反应体积中含有40 ng 的FUT6，FUT10和FUT11重组酶，0-40 µM胎球蛋白作为受体底物，供体底物100 µM，分别是GDP-岩藻糖 （GDP-Fucose），GDP-Fucose-PEG4-IgG和GDP-Fucose-(PEG4)n-IgG，其中，GDP-Fucose-PEG4-IgG 为GDP-Fucose 替换为用一个PEG4分子作为接头偶联了IgG的GDP-Fucose，GDP-Fucose-(PEG4)n-IgG为用n个PEG4分子作为接头偶联了IgG的GDP-Fucose。在本发明的一个具体的实施方案中，n分别为1和2。其中，Fucose-PEG4×2-IgG制备方法：TCO-PEG4-NHS（购自Sigma）与抗体IgG在室温下反应30分钟，获得TCO-PEG4-IgG。GDP-Azido-Fucose（购自R&D system），与Methyltetrazine-PEG4-azide或Alkyne-PEG4-NHS Ester (购自Click Chemistry Tools）在30°C反应6小时，获得GDP-Fucose-PEG4-Methyltetrazine和GDP-Fucose-PEG4-NHSEster，分别与TCO-PEG4-IgG和IgG在室温下反应得到GDP-Fucose-PEG4×2-IgG和GDP-Fucose-PEG4-IgG。
FUT6，FUT10和FUT11重组酶，胎球蛋白作为受体底物，100 µM GDP-岩藻糖 （GDP-Fucose），GDP-Fucose-PEG4-IgG和GDP-Fucose-(PEG4)n-IgG分别作为供体底物37度孵育30分钟，然后室温下加入 25 µl GDP 检测试剂 ，孵育60分钟，放入GloMax® 96 微孔板发光检测仪 （Cat# E6501），室温下读取。并用非线性回归拟合Michaelis-Menten方程后得到Km值。当供体底物是GDP-Fucose（分子量约为589.3）时，图3中显示FUT6的酶活性高于FUT10和FUT11，用非线性回归拟合Michaelis-Menten方程后得到Km值。FUT6, FUT10, FUT11重组酶在以上的测试条件下的针对GDP-Fucose的Km值分别为 1.8 uM， 2.3 uM， 2.6 uM（参见图3）。供体底物是GDP-Fucose-PEG4-IgG时，FUT6，FUT10和FUT11的Km值约为1500~2500µM，活力降低近1000倍；供体底物是GDP-Fucose-(PEG4)n-IgG时，此时，GDP-Fucose和IgG之间的接头分子换成2个PEG4，Km值约为200~1000µM，说明FUT重组酶更容易识别小分子的GDP-Fucose (分子量约为589.3)。相比一个PEG4分子作为接头的GDP-Fucose-IgG， 2个PEG4分子作为接头的GDP-Fucose-(PEG4)n-IgG作为供体受体，更容易被FUT重组酶识别。
实施例3. 突变FUT6重组酶的制备和活性检测
目前尚无研究显示岩藻糖基转移酶如何识别供体底物，也没有结构解析的数据。根据以上的试验，证实FUT6不仅可以识别小分子的供体底物，也可以识别大分子供体底物。为了提高FUT6识别大分子供体底物的能力，对FUT6进行了氨基酸序列分析。人源的岩藻糖基转移酶一共有11种，与原核生物的岩藻糖基转移酶同属于糖基转移酶家族10（Glycosyltransferse family 10）, 但是氨基酸一级序列无明显同源性。FUT6与幽门螺杆菌的alfa-1,3岩藻糖基转移酶进行序列对比时发现，FUT6有7处“缺口”(Gap), 即，在SEQID NO. 1所示的野生型氨基酸序列的第 109 氨基酸至第110 氨基酸，第 126 氨基酸至第127 氨基酸，第 138氨基酸至第139 氨基酸，第 150 氨基酸至第151 氨基酸，第 170 氨基酸至第171 氨基酸，第 194 氨基酸至第195 氨基酸，第 299 氨基酸至第300 氨基酸的位置，推测这些缺口使得FUT6在进化过程中结构更加稳定和紧凑，更容易识别小分子底物。因此如果用原核生物的相应序列，例如幽门螺杆菌的alfa-1,3岩藻糖基转移酶相对应的较为宽松的非保守性序列进行修补，可以使得FUT6进行“退化”（devolution），从而识别底物更加宽容。根据这个设想，分别设计了18个突变体。突变的FUT6重组酶分别进行表达和纯化，分别以GDP-Fucose 和GDP-Fucose-(PEG4)n-IgG作为岩藻糖供体，进行酶活力检测。结果显示，在SEQ ID NO. 1所示的野生型氨基酸序列的第 109 氨基酸至第110氨基酸或者第 170氨基酸至第171氨基酸的位置插入宽松型序列，突变体的表达和纯化更容易获得理想的结果，继而带来对大分子供体底物的催化活性的提高。其中，FUT6-M6（简称Mut6，序列如SEQID NO. 3所示，核苷酸编码序列如SEQ ID NO. 4所示）为在SEQ ID NO. 1所示的野生型氨基酸序列的第 109 氨基酸至第110 氨基酸插入序列如SEQ ID NO. 7所示的宽松型序列，FUT6-M17（简称Mut17，序列如SEQ ID NO. 5所示，核苷酸编码序列如SEQ ID NO. 6所示）为在SEQ ID NO. 1所示的野生型氨基酸序列的第 170 氨基酸至第171氨基酸插入序列如SEQID NO. 8所示的宽松型序列。针对小分子的供体GDP-Fucose，Mut6 和 Mut17与野生型的FUT6相比，酶活性下降3~4倍左右；而针对大分子的供体尤其是GDP-Fucose-(PEG4)n-IgG，Mut6 和 Mut17与野生型的FUT6相比，酶活性提高6倍。提高了对大分子供体底物的催化作用（参见图4和图5）。
图4中， PBS缓冲液25 µl反应体积中含有40 ng 的FUT6，FUT6-M6和FUT6-M17重组酶，0-40 µM胎球蛋白作为受体底物，供体底物100 µM，分别是GDP-岩藻糖 （GDP-Fucose），GDP-Fucose-PEG4-IgG和GDP-Fucose-(PEG4)n-IgG。37度孵育30分钟，然后室温下加入 25µl GDP 检测试剂 ，孵育60分钟，放入GloMax® 96 微孔板发光检测仪 （Cat# E6501），室温下读取。并用非线性回归拟合Michaelis-Menten方程后得到Km值。当供体底物是GDP-Fucose（分子量约为589.3D）时，FUT6，FUT6-M6和FUT6-M17的Km值分别为~1.7µM, ~4.5µM和5.9µM；突变体的酶活性下降了3~4倍。当供体底物是GDP-Fucose-PEG4-IgG（分子量约为150KD，比GDP-Fucose大超过200倍）时，FUT6，FUT6-M6和FUT6-M17的Km值约为1300~1700 µM，活力降低近1000倍；供体底物是GDP-Fucose-(PEG4)n-IgG时，此时，GDP-Fucose和IgG之间的接头分子换成2个PEG4，FUT6，FUT6-M6和FUT6-M17的Km值分别为140 µM，34µM 和 47µM。
图5中，FUT6，FUT6-M6和FUT6-M17针对不同的供体底物GDP-Fucose，GDP-Fucose-PEG4-IgG和GDP-Fucose-(PEG4)n-IgG的酶活性比较。突变体FUT6-M6和FUT6-M17识别小分子底物GDP-Fucose的活性低于野生型FUT，而识别大分子底物时，尤其是接头分子为2个PEG4的GDP-Fucose-(PEG4)n-IgG，突变体FUT6-M6和FUT6-M17显示出比野生型FUT更高的活性。
实施例4. 岩藻糖基转移酶的突变体催化的供体底物标记HEK293活细胞
FUT6-M6（序列如SEQ ID NO. 5所示）, FUT6-M17（序列如SEQ ID NO. 6所示），分别在大肠杆菌和哺乳细胞中进行表达纯化，用于活细胞的标记。将HEK293活细胞（~100万）悬浮在100μL含有 20 mM MgSO4（例如CPDA-1）和0.5%FBS的溶液中，pH值调节至5-6， 并依次加入0.1 mg/mL GDP-Fucose-（PEG4）n-IgG和0.04 mg/mL FucTd-HISx6, FUT6-Mut6,FUT6-Mut17，在4度或者室温下，孵育20 – 30分钟后，用CPDA-1（citrate phosphatedextrose adenine）清洗细胞两次。利用流式细胞仪和针对IgG的荧光抗体分析细胞标记的效率，结果显示，在30分钟内，超过90%的细胞被有效地标记了IgG。
在100万HEK293活细胞中加入供体底物GDP-Fucose-(PEG4)n-IgG，并分别加入岩藻糖转移酶FucTd，FUT-M6，FUT-M17，在室温下孵育30分钟后对细胞进行检测。没有进行处理的HEK293细胞（Mock）作为阴性对照，同时转染了hIgG和mIgG的HEK293细胞作为阳性对照（HEK transfected w/ surface-hIgG and surface-mIgG）。用anti-human IgG二抗检测hIgG在细胞表面的呈现，用anti-mouse IgG二抗检测mIgG在细胞表面的呈现。 结果显示在岩藻糖转移酶FucTd，FUT-M6，FUT-M17的作用下，供体底物GDP-Fucose-(PEG4)n-IgG转移至HEK293细胞表面，并能够被anti-hIgG二抗识别（参见图6）。
序列表
<110> 北京睿脉医药科技有限公司
<120> 重组人源岩藻糖基转移酶变异体及应用
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 325
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 1
Arg Val Ser Gln Asp Asp Pro Thr Val Tyr Pro Asn Gly Ser Arg Phe
1 5 10 15
Pro Asp Ser Thr Gly Thr Pro Ala His Ser Ile Pro Leu Ile Leu Leu
20 25 30
Trp Thr Trp Pro Phe Asn Lys Pro Ile Ala Leu Pro Arg Cys Ser Glu
35 40 45
Met Val Pro Gly Thr Ala Asp Cys Asn Ile Thr Ala Asp Arg Lys Val
50 55 60
Tyr Pro Gln Ala Asp Ala Val Ile Val His His Arg Glu Val Met Tyr
65 70 75 80
Asn Pro Ser Ala Gln Leu Pro Arg Ser Pro Arg Arg Gln Gly Gln Arg
85 90 95
Trp Ile Trp Phe Ser Met Glu Ser Pro Ser His Cys Trp Gln Leu Lys
100 105 110
Ala Met Asp Gly Tyr Phe Asn Leu Thr Met Ser Tyr Arg Ser Asp Ser
115 120 125
Asp Ile Phe Thr Pro Tyr Gly Trp Leu Glu Pro Trp Ser Gly Gln Pro
130 135 140
Ala His Pro Pro Leu Asn Leu Ser Ala Lys Thr Glu Leu Val Ala Trp
145 150 155 160
Ala Val Ser Asn Trp Gly Pro Asn Ser Ala Arg Val Arg Tyr Tyr Gln
165 170 175
Ser Leu Gln Ala His Leu Lys Val Asp Val Tyr Gly Arg Ser His Lys
180 185 190
Pro Leu Pro Gln Gly Thr Met Met Glu Thr Leu Ser Arg Tyr Lys Phe
195 200 205
Tyr Leu Ala Phe Glu Asn Ser Leu His Pro Asp Tyr Ile Thr Glu Lys
210 215 220
Leu Trp Arg Asn Ala Leu Glu Ala Trp Ala Val Pro Val Val Leu Gly
225 230 235 240
Pro Ser Arg Ser Asn Tyr Glu Arg Phe Leu Pro Pro Asp Ala Phe Ile
245 250 255
His Val Asp Asp Phe Gln Ser Pro Lys Asp Leu Ala Arg Tyr Leu Gln
260 265 270
Glu Leu Asp Lys Asp His Ala Arg Tyr Leu Ser Tyr Phe Arg Trp Arg
275 280 285
Glu Thr Leu Arg Pro Arg Ser Phe Ser Trp Ala Leu Ala Phe Cys Lys
290 295 300
Ala Cys Trp Lys Leu Gln Glu Glu Ser Arg Tyr Gln Thr Arg Gly Ile
305 310 315 320
Ala Ala Trp Phe Thr
325
<210> 2
<211> 48
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 2
atgccgctgc tgctactgct gcccctgctg tgggcaggtg ccctcgct 48
<210> 3
<211> 335
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Arg Val Ser Gln Asp Asp Pro Thr Val Tyr Pro Asn Gly Ser Arg Phe
1 5 10 15
Pro Asp Ser Thr Gly Thr Pro Ala His Ser Ile Pro Leu Ile Leu Leu
20 25 30
Trp Thr Trp Pro Phe Asn Lys Pro Ile Ala Leu Pro Arg Cys Ser Glu
35 40 45
Met Val Pro Gly Thr Ala Asp Cys Asn Ile Thr Ala Asp Arg Lys Val
50 55 60
Tyr Pro Gln Ala Asp Ala Val Ile Val His His Arg Glu Val Met Tyr
65 70 75 80
Asn Pro Ser Ala Gln Leu Pro Arg Ser Pro Arg Arg Gln Gly Gln Arg
85 90 95
Trp Ile Trp Phe Ser Met Glu Ser Pro Ser His Ala Trp Asn Leu Phe
100 105 110
Asp Tyr Ala Ile Gly Phe Asp Gln Leu Lys Ala Met Asp Gly Tyr Phe
115 120 125
Asn Leu Thr Met Ser Tyr Arg Ser Asp Ser Asp Ile Phe Thr Pro Tyr
130 135 140
Gly Trp Leu Glu Pro Trp Ser Gly Gln Pro Ala His Pro Pro Leu Asn
145 150 155 160
Leu Ser Ala Lys Thr Glu Leu Val Ala Trp Ala Val Ser Asn Trp Gly
165 170 175
Pro Asn Ser Ala Arg Val Arg Tyr Tyr Gln Ser Leu Gln Ala His Leu
180 185 190
Lys Val Asp Val Tyr Gly Arg Ser His Lys Pro Leu Pro Gln Gly Thr
195 200 205
Met Met Glu Thr Leu Ser Arg Tyr Lys Phe Tyr Leu Ala Phe Glu Asn
210 215 220
Ser Leu His Pro Asp Tyr Ile Thr Glu Lys Leu Trp Arg Asn Ala Leu
225 230 235 240
Glu Ala Trp Ala Val Pro Val Val Leu Gly Pro Ser Arg Ser Asn Tyr
245 250 255
Glu Arg Phe Leu Pro Pro Asp Ala Phe Ile His Val Asp Asp Phe Gln
260 265 270
Ser Pro Lys Asp Leu Ala Arg Tyr Leu Gln Glu Leu Asp Lys Asp His
275 280 285
Ala Arg Tyr Leu Ser Tyr Phe Arg Trp Arg Glu Thr Leu Arg Pro Arg
290 295 300
Ser Phe Ser Trp Ala Leu Ala Phe Cys Lys Ala Cys Trp Lys Leu Gln
305 310 315 320
Glu Glu Ser Arg Tyr Gln Thr Arg Gly Ile Ala Ala Trp Phe Thr
325 330 335
<210> 4
<211> 1005
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
cgtgtgagcc aggacgatcc gactgtgtac cccaacggat ctcgtttccc agattctact 60
ggaacccctg ctcactcaat cccactgatc ctcctttgga cctggccctt taacaaacct 120
attgcacttc ctcgctgtag cgagatggtg cctggcactg ctgactgcaa catcaccgcc 180
gatcgcaagg tgtacccaca ggctgatgcc gtgattgtgc atcacaggga agtgatgtat 240
aacccaagcg cgcagctgcc tcgctctcct cggcgtcagg gacagagatg gatctggttt 300
tctatggaga gcccttccca cgcctggaat ttgttcgact atgccattgg tttcgaccaa 360
ctgaaagcca tggacggata cttcaacctc accatgtctt accgctccga tagtgacatc 420
ttcacacctt atggttggct ggagccctgg agcggccagc ccgcccaccc tccgctgaac 480
ctgagcgcta agaccgaatt ggtcgcctgg gcggtttcta attgggggcc taactccgcc 540
cgggtgcgct attaccagag tctgcaggct cacctgaagg tggatgtcta cggccgtagc 600
cataagccac tgccacaggg caccatgatg gagaccttgt caaggtacaa attttacctg 660
gctttcgaga acagtctgca tccagattac attactgaaa agctgtggcg gaacgcactg 720
gaagcatggg cagtaccagt ggtactgggg ccctcccgta gcaactacga gcgctttctg 780
ccacctgatg cttttattca tgtagacgat ttccagtccc ccaaggacct cgcccgctat 840
ctccaagagt tggacaaaga ccacgcccgc tatctgtcct acttccgctg gcgggagaca 900
ctgcgccccc gctccttctc atgggctctg gctttctgca aggcctgctg gaagctgcag 960
gaggaatccc gctaccagac acgcggaatc gctgcctggt tcacc 1005
<210> 5
<211> 329
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Arg Val Ser Gln Asp Asp Pro Thr Val Tyr Pro Asn Gly Ser Arg Phe
1 5 10 15
Pro Asp Ser Thr Gly Thr Pro Ala His Ser Ile Pro Leu Ile Leu Leu
20 25 30
Trp Thr Trp Pro Phe Asn Lys Pro Ile Ala Leu Pro Arg Cys Ser Glu
35 40 45
Met Val Pro Gly Thr Ala Asp Cys Asn Ile Thr Ala Asp Arg Lys Val
50 55 60
Tyr Pro Gln Ala Asp Ala Val Ile Val His His Arg Glu Val Met Tyr
65 70 75 80
Asn Pro Ser Ala Gln Leu Pro Arg Ser Pro Arg Arg Gln Gly Gln Arg
85 90 95
Trp Ile Trp Phe Ser Met Glu Ser Pro Ser His Cys Trp Gln Leu Lys
100 105 110
Ala Met Asp Gly Tyr Phe Asn Leu Thr Met Ser Tyr Arg Ser Asp Ser
115 120 125
Asp Ile Phe Thr Pro Tyr Gly Trp Leu Glu Pro Trp Ser Gly Gln Pro
130 135 140
Ala His Pro Pro Leu Asn Leu Ser Ala Lys Thr Glu Leu Val Ala Trp
145 150 155 160
Ala Val Ser Asn Trp Gly Pro Asn Ser Ala Asn Ala Pro Met Arg Val
165 170 175
Arg Tyr Tyr Gln Ser Leu Gln Ala His Leu Lys Val Asp Val Tyr Gly
180 185 190
Arg Ser His Lys Pro Leu Pro Gln Gly Thr Met Met Glu Thr Leu Ser
195 200 205
Arg Tyr Lys Phe Tyr Leu Ala Phe Glu Asn Ser Leu His Pro Asp Tyr
210 215 220
Ile Thr Glu Lys Leu Trp Arg Asn Ala Leu Glu Ala Trp Ala Val Pro
225 230 235 240
Val Val Leu Gly Pro Ser Arg Ser Asn Tyr Glu Arg Phe Leu Pro Pro
245 250 255
Asp Ala Phe Ile His Val Asp Asp Phe Gln Ser Pro Lys Asp Leu Ala
260 265 270
Arg Tyr Leu Gln Glu Leu Asp Lys Asp His Ala Arg Tyr Leu Ser Tyr
275 280 285
Phe Arg Trp Arg Glu Thr Leu Arg Pro Arg Ser Phe Ser Trp Ala Leu
290 295 300
Ala Phe Cys Lys Ala Cys Trp Lys Leu Gln Glu Glu Ser Arg Tyr Gln
305 310 315 320
Thr Arg Gly Ile Ala Ala Trp Phe Thr
325
<210> 6
<211> 987
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
cgcgtgagtc aggatgaccc tacagtgtac cccaacggta gtcgcttccc ggatagcact 60
ggaacaccgg cccacagcat cccgctgatc ctgctctgga cctggccttt taacaaacct 120
atcgctctgc cccgctgctc cgagatggtc cctggcaccg ctgattgtaa tatcaccgcc 180
gacaggaagg tctaccctca ggctgacgcc gtgatcgtgc atcaccgcga agtcatgtac 240
aatccgtccg cccaactccc tcgctctcct agacggcagg gccaaaggtg gatttggttc 300
agcatggaat ccccctccca ctgttggcaa ctgaaggcca tggacggcta cttcaacttg 360
accatgtcct accgcagcga cagtgacatc ttcactccat atggctggct cgagccctgg 420
tctggtcaac ccgcccaccc tccgcttaac ctgagcgcca agaccgagct ggtcgcctgg 480
gccgtgtcta actggggccc taacagtgct aatgccccga tgcgcgtgag atattaccag 540
agcctgcagg cccatctcaa agtggatgtc tacggccgta gccacaaacc cctgccacag 600
ggtaccatga tggaaaccct gtcccgttac aagttttacc tggcattcga gaactccttg 660
caccctgact acattactga gaagctgtgg cgcaacgccc tggaggcctg ggccgtcccc 720
gtcgtgctgg gcccatcacg cagtaactac gagcgttttc tgcctcccga tgccttcatc 780
cacgtggacg atttccagag ccctaaagac ctggctcgct acctgcagga gctggacaag 840
gaccacgcca gatacctctc ctatttccgg tggcgcgaga ccctgaggcc gcgttccttc 900
tcctgggccc tggccttctg taaggcctgc tggaagctgc aagaagagag ccgctaccaa 960
acgcgtggca ttgcagcctg gttcact 987
<210> 7
<211> 10
<212> PRT
<213> 幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)
<400> 7
Asn Leu Phe Asp Tyr Ala Ile Gly Phe Asp
1 5 10
<210> 8
<211> 4
<212> PRT
<213> 幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)
<400> 8
Asn Ala Pro Met
1

Claims (8)

1. 一种重组人源岩藻糖基转移酶变异体，其特征在于，所述重组人源岩藻糖基转移酶变异体的序列如SEQ ID NO. 3或者SEQ ID NO. 5所示。
2. 一种编码权利要求1所述重组人源岩藻糖基转移酶变异体的多核苷酸，其特征在于，编码序列如SEQ ID NO. 3所示的重组人源岩藻糖基转移酶变异体的多核苷酸的序列如SEQ ID NO. 4所示。
3. 一种编码权利要求1所述重组人源岩藻糖基转移酶变异体的多核苷酸，其特征在于，编码序列如SEQ ID NO. 5所示的重组人源岩藻糖基转移酶变异体的多核苷酸的序列如SEQ ID NO.6所示。
4.一种含有权利要求2或3所述多核苷酸的表达载体。
5.一种含有权利要求4所述表达载体的宿主细胞。
6.根据权利要求5所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞为HEK293细胞或者CHO细胞。
7.一种应用权利要求1所述的重组人源岩藻糖基转移酶变异体将靶分子标记于目的细胞或者目的蛋白质的方法，所述方法为非疾病诊断治疗方法，其特征在于，所述方法包括：
（1）将供体底物与靶分子相缀合获得连接复合物，其中，所述供体底物的分子量为500D至150KD的GDP-Fucose-(PEG4)n，所述n为1-10的整数；
（2）在所述的重组人源岩藻糖基转移酶变异体存在的条件下，使步骤（1）获得的连接复合物与含有GlcNac受体分子的目的细胞或者目的蛋白质一起孵育，获得被标记了靶分子的目的细胞。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述靶分子为IgG，所述n=2。
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