CN113943718B - 一种糖基转移酶及其在Tn抗原的标记、成像和检测中的应用 - Google Patents

一种糖基转移酶及其在Tn抗原的标记、成像和检测中的应用 Download PDF

Info

Publication number
CN113943718B
CN113943718B CN202111180580.3A CN202111180580A CN113943718B CN 113943718 B CN113943718 B CN 113943718B CN 202111180580 A CN202111180580 A CN 202111180580A CN 113943718 B CN113943718 B CN 113943718B
Authority
CN
China
Prior art keywords
antigen
protein
b3gnt6
glycosyltransferase
alkyne
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202111180580.3A
Other languages
English (en)
Other versions
CN113943718A (zh
Inventor
陈兴
宋其涛
王競
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Peking University
Original Assignee
Peking University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Peking University filed Critical Peking University
Priority to CN202111180580.3A priority Critical patent/CN113943718B/zh
Publication of CN113943718A publication Critical patent/CN113943718A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN113943718B publication Critical patent/CN113943718B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1048—Glycosyltransferases (2.4)
    • C12N9/1051—Hexosyltransferases (2.4.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y204/00—Glycosyltransferases (2.4)
    • C12Y204/01—Hexosyltransferases (2.4.1)
    • C12Y204/01147—Acetylgalactosaminyl-O-glycosyl-glycoprotein beta-1,3-N-acetylglucosaminyltransferase (2.4.1.147)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/531—Production of immunochemical test materials
    • G01N33/532—Production of labelled immunochemicals
    • G01N33/533—Production of labelled immunochemicals with fluorescent label
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57407—Specifically defined cancers
    • G01N33/57415—Specifically defined cancers of breast
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57484—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites
    • G01N33/57492—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites involving compounds localized on the membrane of tumor or cancer cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
    • G01N33/582—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with fluorescent label
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/40—Fusion polypeptide containing a tag for immunodetection, or an epitope for immunisation
    • C07K2319/43—Fusion polypeptide containing a tag for immunodetection, or an epitope for immunisation containing a FLAG-tag
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/10—Plasmid DNA
    • C12N2800/106—Plasmid DNA for vertebrates
    • C12N2800/107—Plasmid DNA for vertebrates for mammalian
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/91—Transferases (2.)
    • G01N2333/91091—Glycosyltransferases (2.4)
    • G01N2333/91097—Hexosyltransferases (general) (2.4.1)
    • G01N2333/91102—Hexosyltransferases (general) (2.4.1) with definite EC number (2.4.1.-)

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种糖基转移酶及其在Tn抗原的标记、成像和检测中的应用。具体地公开了蛋白质B3GNT6(43‑384)作为糖基转移酶在制备Tn抗原标记试剂或试剂盒中的应用。本发明首次克隆并表达了糖基转移酶B3GNT6的截短体，构建了糖基转移酶B3GNT6(43‑384)，该酶能够特异性识别Tn抗原，高效地利用核酸形式的非天然糖，通过酶促反应和生物正交反应将非天然糖携带的生物正交基团以共价键的形式转移到Tn抗原上，可以快速、特异地实现对癌症细胞表面的Tn抗原标记和成像。本发明发展了一种高效的化学酶法标记策略，可以实现对癌症细胞表面Tn抗原的标记和检测，对癌症的早期诊断和靶向治疗具有重要的意义。

Description

一种糖基转移酶及其在Tn抗原的标记、成像和检测中的应用
技术领域
本发明属于生物医学领域，具体涉及一种糖基转移酶及其在Tn抗原的标记、成像和检测中的应用
背景技术
癌症是全世界最为关心的公共健康问题，也是对人类健康威胁最大的疾病之一。尽管传统的手术、化疗药、放射等疗法取得了巨大的成功，但是癌症仍然是难以预防和完全治愈的，尽早发现并及时治疗是最为有效的办法。
肿瘤相关糖类抗原(Tumor-associated carbohydrate antigens，TACAs)，也被称作肿瘤相关碳水化合物抗原，指并非某一种肿瘤所特有,在其他肿瘤细胞上也存在的糖类抗原分子，是肿瘤细胞表面高丰度的多糖标志物，可用于区别肿瘤细胞和正常细胞。临床上除了我们熟知的甲胎蛋白，癌胚抗原，还利用TACA作为血液中的肿瘤标志物筛查，例如Cancer Antigen19-9(简称CA199)用于检测胰腺癌、结肠癌和胃癌，Cancer Antigen 12-5(简称CA125，MUC16)用于检测卵巢癌，Cancer Antigen 15-3(简称CA153，MUC1)用于检测转移性乳腺癌。此外，有一种聚糖抗原(黏蛋白型O-聚糖抗原)，是单个乙酰胺基半乳糖胺(GalNAc)连接到苏氨酸(Thr)或者丝氨酸(Ser)残基上，又称Tn antigen(简称Tn抗原)，在癌症组织中广泛表达，已有研究表明约有90％的实体乳腺癌肿瘤高表达Tn抗原。Tn抗原的高表达使肿瘤细胞的抗原性和黏附能力发生改变，促进肿瘤细胞的恶性增生与转移，其作为靶点为肿瘤的研究和治疗提供了新的方向。
现有的Tn抗原检测手段局限于传统的凝集素方法和抗体法。凝集素虽然被广泛使用，但是由于凝集素与糖的结合力仅仅是μM级别，当使用高浓度、长时间孵育的凝集素方法进行蛋白富集时，难免会产生非特异性吸附。而且，有报道凝集素的产品批次间的差异大、且选择性差，其对糖链的识别并不是一一对应关系，通常都是一种凝集素识别一类糖链，因此导致对其他种类的糖型存在交叉识别的缺陷。抗体法也存在低亲和力的缺点，而且使用成本高昂，市场上没有稳定性良好的糖基化抗体。因此，现有Tn抗原检测方法的缺陷很大成程度上限制了Tn抗原在癌症检测体系中的应用。实现Tn抗原的特异、高效、快速地检测，对肿瘤的筛查、诊断与抗肿瘤药物或疫苗的开发具有重要的意义，不仅可以推动人类对于癌症发生、发展的认知，更具有广泛的临床应用前景。研究和开发一种高效、稳定、快速、特异性强的方法实现对Tn抗原的检测是亟需解决的问题，对临床上癌症相关的糖抗原的标记具有极大的推动作用。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何基于化学酶法技术方便、快速、特异地实现对Tn抗原的标记、检测和成像。所要解决的技术问题不限于如所描述的技术主题，本领域技术人员通过以下描述可以清楚地理解本文未提及的其它技术主题。
为解决上述技术问题，本发明首先提供了蛋白质，名称为B3GNT6(43-384)，所述蛋白质B3GNT6(43-384)可为下述任一种：
A1)氨基酸序列是SEQ ID No.1的蛋白质；
A2)将SEQ ID No.1所示的氨基酸序列经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与A1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有相同功能的蛋白质；
A3)在A1)或A2)的N端和/或C端连接标签或信号肽得到的具有相同功能的融合蛋白质。
所述蛋白质B3GNT6(43-384)为一种截短的B3GNT6蛋白，与B3GNT6蛋白相比，N末端截短了42个氨基酸；截短的B3GNT6蛋白可作为糖基转移酶，能够特异性识别Tn抗原。
所述蛋白质B3GNT6(43-384)可为人源的。
与所述蛋白质B3GNT6(43-384)同源不同家族蛋白及不同源的同功能蛋白均在本发明的保护范围内。
本文中，术语“蛋白质B3GNT6(43-384)”、“糖基转移酶B3GNT6(43-384)”、“B3GNT6(43-384)”、“B3GNT6(43-384)截短体”可以互换使用。
为了使A1)中的蛋白质便于纯化或检测，可在由序列表中SEQ ID No.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接标签蛋白。
所述标签蛋白包括但不限于：GST(谷胱甘肽巯基转移酶)标签蛋白、His6标签蛋白(His-tag)、MBP(麦芽糖结合蛋白)标签蛋白、Flag标签蛋白、SUMO标签蛋白、HA标签蛋白、Myc标签蛋白、eGFP(增强型绿色荧光蛋白)、eCFP(增强型青色荧光蛋白)、eYFP(增强型黄绿色荧光蛋白)、mCherry(单体红色荧光蛋白)或AviTag标签蛋白。
本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化或点突变的方法，对本发明的编码蛋白质B3GNT6(43-384)的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明分离得到的蛋白质B3GNT6(43-384)的核苷酸序列75％或75％以上同一性的核苷酸，只要编码蛋白质B3GNT6(43-384)且具有蛋白质B3GNT6(43-384)功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。
上述75％或75％以上同一性，可为80％、85％、90％或95％以上的同一性。
本文中，同一性是指氨基酸序列或核苷酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如NCBI主页网站的BLAST网页。例如，可在高级BLAST2.1中，通过使用blastp作为程序，将Expect值设置为10，将所有Filter设置为OFF，使用BLOSUM62作为Matrix，将Gap existence cost，Per residue gap cost和Lambda ratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索一对氨基酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。
本文中，所述80％以上的同一性可为至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。
本发明还提供了核酸分子，所述核酸分子可为下述任一种：
B1)编码所述蛋白质B3GNT6(43-384)的核酸分子；
B2)编码序列是SEQ ID No.2所示的cDNA分子；
B3)核苷酸序列是SEQ ID No.2所示的DNA分子；
SEQ ID No.2所示的DNA分子编码氨基酸序列是SEQ ID No.1的蛋白质B3GNT6(43-384)。
本文所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA。
本发明还提供了生物材料，所述生物材料可为下述E1)至E4)中的任一种：
E1)含有B1)或B2)或B3)所述核酸分子的表达盒；
E2)含有B1)或B2)或B3)所述核酸分子的重组载体、或含有E1)所述表达盒的重组载体；
E3)含有B1)或B2)或B3)所述核酸分子的重组微生物、或含有E1)所述表达盒的重组微生物、或含有E2)所述重组载体的重组微生物；
E4)含有B1)或B2)或B3)所述核酸分子的细胞、或含有E1)所述表达盒的细胞、或含有E2)所述重组载体的细胞；
本文所述载体是本领域技术人员公知的，包括但不限于：质粒、噬菌体(如λ噬菌体或M13丝状噬菌体等)、黏粒(即柯斯质粒)、人工染色体(如酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)、P1人工染色体(PAC)或Ti质粒人工染色体(TAC)等)、病毒载体(如逆转录病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒或疱疹病毒(如单纯疱疹病毒)等)，具体可为载体pFlag-CMV-3。
本文所述微生物可为酵母、细菌、藻或真菌。其中，细菌可来自埃希氏菌属(Escherichia),欧文氏菌(Erwinia),根癌农杆菌属(Agrobacterium)、黄杆菌属(Flavobacterium),产碱菌属(Alcaligenes),假单胞菌属(Pseudomonas),芽胞杆菌属(Bacillus)等。
本文所述细胞可为动物细胞，具体可为哺乳动物细胞HEK293F。
所述重组载体具体可为重组载体pFlag-CMV-3-B3GNT6(43-384)，重组载体pFlag-CMV-3-B3GNT6(43-384)是将pFlag-CMV-3载体的Hind III和Not I识别位点间的片段(小片段)替换为核苷酸序列是序列表中SEQ ID NO.2的DNA片段，保持pFlag-CMV-3载体的其他序列不变，得到的重组表达载体。所述重组载体pFlag-CMV-3-B3GNT6(43-384)表达带有Flag标签的蛋白质B3GNT6(43-384)(融合蛋白Flag-B3GNT6(43-384))。
本发明还提供了所述蛋白质B3GNT6(43-384)和/或所述核酸分子的下述任一种应用：
C1)所述蛋白质B3GNT6(43-384)和/或所述核酸分子在制备Tn抗原标记试剂或试剂盒中的应用；
C2)所述蛋白质B3GNT6(43-384)和/或所述核酸分子在制备检测Tn抗原的产品中的应用；
C3)所述蛋白质B3GNT6(43-384)和/或所述核酸分子在制备诊断或辅助诊断癌症的产品中的应用；
C4)所述蛋白质B3GNT6(43-384)和/或所述核酸分子在制备癌症的预后判断或疗效观察的产品中的应用；
C5)所述蛋白质B3GNT6(43-384)和/或所述核酸分子在制备用于Tn抗原成像的试剂中的应用；
C6)所述蛋白质B3GNT6(43-384)和/或所述核酸分子在临床免疫学检验技术中的应用；
C7)所述蛋白质B3GNT6(43-384)和/或所述核酸分子在标记免疫技术中的应用。
上述应用中，所述Tn抗原可为癌症细胞(癌细胞)表面Tn抗原。
进一步地，C3)中所述在制备诊断或辅助诊断癌症的产品中的应用可为在制备诊断或辅助诊断早期癌症的产品中的应用。
上述应用中，所述产品可为酶联免疫试剂盒或免疫组化试剂盒。
本发明还提供了一种Tn抗原检测试剂盒，所述试剂盒包括所述蛋白质B3GNT6(43-384)。
所述Tn抗原检测试剂盒可为酶联免疫试剂盒或免疫组化试剂盒。
进一步地，所述试剂盒还包括糖基转移酶供体底物叠氮糖、含炔烃的检测试剂和点击化学反应催化剂。
进一步地，所述试剂盒还包括酶促反应催化剂，所述酶促反应催化剂可为含金属离子的化合物。所述金属离子可为锰离子、钴离子和/或锌离子。
具体地，在本发明的一个实施方案中，所述酶促反应催化剂为MnCl2。
进一步地，所述试剂盒还包括铜离子配体(催化剂稳定剂)。所述铜离子配体可为BTTAA、BTTES、TBTA或THPTA。
具体地，在本发明的一个实施方案中，所述铜离子配体为BTTAA。
上述试剂盒中，所述糖基转移酶供体底物叠氮糖可为UDP-GlcNAz。
上述试剂盒中，所述含炔烃的检测试剂(即含有炔烃的标记分子)可为炔基修饰的小分子标记物，所述小分子标记物可为染料或半抗原。
具体地，在本发明的一个实施方案中，所述含炔烃的检测试剂为Alkyne-Cy5。
上述试剂盒中，所述点击反应催化剂可为亚铜离子(Cu+)化合物，如溴化亚铜或碘化亚铜但不限于此。
具体地，在本发明的一个实施方案中，所述点击反应催化剂为硫酸铜(CuSO4)和抗坏血酸钠(VcNa)。
进一步地，所述试剂盒还包括溶剂，所述溶剂可为水、四氢呋喃、DMSO、乙腈、或四氢呋喃与水的混合物、或DMSO与水的混合物、或上述化合物的混合物。
本发明还提供了所述试剂盒在癌症筛查中的应用。
本发明还提供了一种Tn抗原的标记方法，所述方法包括如下步骤：
(1)采用所述蛋白质B3GNT6(43-384)作为糖基转移酶，以糖基转移酶供体底物叠氮糖为酶促反应底物，对含有Tn抗原的样本进行酶促反应处理。
(2)步骤(1)处理后的样本与含炔烃的检测试剂在点击反应催化剂的作用下进行点击反应，得到被所述含炔烃的检测试剂标记的Tn抗原。
上述方法中，所述糖基转移酶供体底物叠氮糖可为UDP-GlcNAz。
上述方法中，所述酶促反应可以金属离子作为催化剂，所述金属离子可为锰离子、钴离子和/或锌离子；和/或，所述酶促反应的最适pH值可为7-8。
进一步地，所述酶促反应的最适pH值可为7.5。
上述方法中，所述含炔烃的检测试剂(即含有炔烃的标记分子)可为下述任一种：
D1)炔基修饰的小分子标记物；
D2)炔基修饰的染料；
D3)炔基修饰的半抗原；
D4)Alkyne-Cy5。
进一步地，所述点击反应可为铜离子催化的点击反应(铜催化的叠氮-炔基环加成反应)但不限于此。
进一步地，所述点击反应催化剂可为亚铜离子(Cu+)化合物，如溴化亚铜、碘化亚铜等。
在本发明的一个实施方案中，所述点击反应催化剂为硫酸铜(CuSO4)和抗坏血酸钠(VcNa)，抗坏血酸钠(VcNa)将Cu2+还原为Cu+并催化叠氮和炔基发生点击反应(铜催化的叠氮-炔基Husigen环加成反应)。
进一步地，在本发明的一个实施方案中，所述铜离子催化的点击反应是在铜离子配体存在下进行。
所述铜离子配体包括BTTAA、BTTES、TBTA或THPTA但不限于此，铜离子配体的存在可以稳定一价铜盐，保护一价铜离子免受氧化或者歧化作用，增强对点击反应的催化效果，降低一价铜的毒性。
在本发明的一个实施方案中，铜离子配体为BTTAA。BTTAA是一种铜盐催化的“叠氮-炔基"生物正交反应的加速配体，同时也是一种超低毒性的配体，生物相容。
进一步地，上述方法中，步骤(1)进行酶促反应处理条件为：1mM MnCl2，100μMUDP-GlcNAz，1mg/mL B3GNT6(43-384)，在37℃条件下反应30分钟。
进一步地，上述方法中，步骤(2)进行点击反应的条件为：50μM炔基修饰的染料(Alkyne-Cy5),200μM硫酸铜(CuSO4),1mM配体BTTAA，10mM VcNa，37℃条件下反应5分钟。
上述方法中，所述样本可为蛋白、细胞或组织切片。
进一步地，所述细胞可为癌细胞，如乳腺癌细胞、前列腺癌细胞、肺癌细胞、胰腺癌细胞、卵巢癌细胞或胃食管癌细胞等。
本发明还提供了上述方法在对癌细胞或肿瘤进行检测、标记和/或成像中的应用。
本领域技术人员应当理解，本文所述点击反应(click reaction)是指通过小单元的拼接，完成各种分子的化学合成。点击反应的代表反应为铜催化的叠氮-炔基Husigen环加成反应(Copper-Catalyzed Azide–Alkyne Cycloaddition)，其基本反应原理是Cu+催化叠氮化物基团和炔基发生点击反应，使叠氮化物(azide)和炔烃(alkyne)作用形共价键，从而形成环加成产物五元三唑环。因此，利用点击反应对Tn抗原进行标记时，叠氮化物和炔烃部分是可互换的，即本发明所述的含有炔烃的标记分子(Alkyne-Cy5)和糖基转移酶供体底物叠氮糖(UDP-GlcNAz)也可以替换为含有叠氮基团的标记分子(如荧光基团叠氮化物或半抗原叠氮化物)和含有炔烃的糖基转移酶供体底物(如UDP-GlcNAl)，同样能够实现本发明的目的，没有脱离本发明的保护宗旨。
本文所述Tn抗原是癌细胞表面的一种特异性糖类抗原，在乳腺癌、前列腺癌、肺癌、胰腺癌等恶性细胞表面以簇状的形式过量表达。作为乙酰氨基半乳糖衍生物，Tn抗原在正常细胞中能进一步延长糖链形成复合的低聚糖，所以对于正常细胞而言，它是隐形的。而在大多数癌细胞中，由于其糖链延伸受阻，Tn抗原就暴露在细胞表面，因此Tn抗原的过量表达对于某些癌细胞有高度的专一性，在癌症的早期诊断方面是重要的参考数据。
本发明为癌症标志物Tn抗原的标记新方法的开发，首次提供一种全新的化学酶法策略，实现了对Tn抗原的化学选择性标记。具体地，本发明提供了一种基于化学酶法的快速、简单、高效地对体内或体外Tn抗原进行标记的方法和试剂盒，该方法和试剂盒可用于方便、准确、快速地对体内或体外的Tn抗原进行标记和/或成像，进一步地可以快速检所述Tn抗原。
本发明首次克隆并表达了糖基转移酶B3GNT6的截短体(SEQ ID No.1)，构建了糖基转移酶B3GNT6(43-384)，该酶能够将乙酰胺基葡萄糖(GlcNAc)以β1-6的方式连接到Tn抗原上，特异性识别Tn抗原。糖基转移酶B3GNT6(43-384)还可以高效地利用核酸形式的非天然糖，通过酶促反应和生物正交反应(如点击反应)将非天然糖携带的生物正交基团以共价键的形式转移到Tn抗原上，可以快速、特异地实现对癌症细胞表面的Tn抗原标记和成像。被标记的Tn抗原可以多种方式在分子、细胞、组织水平上被准确的分离鉴定、检测和分析，从而对癌症的早期诊断以及靶向治疗提供有效帮助。
本发明所述应用和方法的目的可以是疾病诊断目的、疾病预后目的和/或疾病治疗目的，它们的目的也可以是非疾病诊断目的、非疾病预后目的和非疾病治疗目的；它们的直接目的可以是获取疾病诊断结果、疾病预后结果和/或疾病治疗结果的中间结果的信息，它们的直接目的可以是非疾病诊断目的、非疾病预后目的和/或非疾病治疗目的。
实验证明，本发明与现有技术相比，具有以下优点：
1、发掘了全新的工具酶，可以实现对Tn抗原的特异性标记。本发明首次开发并探究了的人源化的糖基转移酶工具B3GNT6(43-384)，利用哺乳动物细胞分泌蛋白纯化体系，优化了人源化糖基转移酶的表达和纯化，并对其酶活、酶的底物特异性进行了详细的探究，证明了该酶能够高效的识别Tn抗原。
2、发展了一种高效的化学酶法标记策略，可以实现对癌症细胞表面Tn抗原的检测。本发明借助新兴的生物正交反应，结合高度选择性的工具酶，可以实现靶向标记癌症细胞表面的多糖抗原，为癌症的早期诊断和靶向治疗提供技术平台。
附图说明
图1为B3GNT6(43-384)蛋白纯化SDS-PAGE分析图。
图2为不同金属离子对B3GNT6(43-384)酶促反应的影响结果图。
图3为不同pH值对B3GNT6(43-384)酶促反应的影响结果图。
图4为共聚焦荧光显微镜拍摄的利用化学酶法对细胞表面Tn抗原的标记情况示意图。“+”表示添加该物质，“-”表示不添加该物质。图4中B3GNT6表示B3GNT6(43-384)。
图5为流式细胞术检测利用化学酶法对细胞表面Tn抗原的标记情况示意图。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中的载体pFlag-CMV-3为西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司公司产品；
下述实施例结合附图对本发明提供的一种人源的工具酶B3GNT6(43-384)(蛋白质B3GNT6(43-384)，糖基转移酶B3GNT6(43-384))及其具体应用进行详细说明。
实施例1糖基转移酶B3GNT6(43-384)基因的获得及表达载体的构建
将人源的B3GNT6(43-384)基因从cDNA文库中进行扩增，然后整合到载体pFlag-CMV-3中，进行基因测序、确认质粒载体构建成功。具体操作如下：
1、聚合酶链式反应(PCR)
以Sigma公司提供的cDNA文库作为扩增模板，利用诺唯赞(Vazyme)公司的快速基因扩增试剂盒(P510)进行扩增。设计扩增糖基转移酶B3GNT6(43-384)cDNA基因的上游引物和下游引物分别为：
上游引物：5’-AAGCTTCATGCAGGAGGAGACGCCAGAGGG-3’(SEQ ID No.3)，
下游引物：5’-GCGGCCGCGACCCGGTGTCCCCGGTC-3’(SEQ ID No.4)，
上游引物中下划线序列为限制性内切酶HindⅢ位点，
下游引物中下划线序列为限制性内切酶NotⅠ位点。
扩增反应体系50μL，具体如下：
表1 快速PCR扩增反应体系的组成
打开PCR仪，设置各个阶段的温度和时间如下：
表2 PCR各个阶段的温度与时间
反应结束后，得到扩增产物，扩增产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测，扩增产物即为含有糖基转移酶B3GNT6(43-384)基因编码区(SEQ ID NO.2)的片段(B3GNT6(43-384)cDNA基因片段)。
所述糖基转移酶B3GNT6(43-384)基因编码区(cDNA基因)的核苷酸序列如SEQ IDNo.2所示(由1026个核苷酸组成)；
SEQ ID NO.2所示的糖基转移酶B3GNT6(43-384)cDNA基因编码氨基酸序列是SEQID No.1的蛋白质B3GNT6(43-384)(糖基转移酶B3GNT6(43-384))。SEQ ID No.1由342个氨基酸残基组成。
2、PCR产物的验证、连接及测序
(1)利用全式金快速PCR产物回收试剂盒进行PCR产物回收，并进行DNA浓度测定。
(2)将载体pFlag-CMV-3和PCR产物进行Hind III和Not I酶切，然后利用T4连接酶进行连接反应，构建重组载体，将连接产物进行转化并通过菌落PCR进行阳性单克隆筛选。
(3)挑取阳性单克隆进行测序验证，确定载体构建成功，将序列正确的重组载体(重组质粒)命名为pFlag-CMV-3-B3GNT6(43-384)，选取序列正确的单克隆，进行质粒大提操作。
测序结果表明，重组载体pFlag-CMV-3-B3GNT6(43-384)是将pFlag-CMV-3载体的Hind III和Not I识别位点间的片段(小片段)替换为核苷酸序列是序列表中SEQ ID NO.2的DNA片段，保持pFlag-CMV-3载体的其他序列不变，得到的重组表达载体。
所述重组载体pFlag-CMV-3-B3GNT6(43-384)表达带有Flag标签的蛋白质B3GNT6(43-384)(Flag-B3GNT6(43-384))。
实施例2糖基转移酶B3GNT6(43-384)的分泌表达及纯化
利用哺乳动物细胞HEK293F分泌蛋白体系纯化人源的糖基转移酶B3GNT6(43-384)。具体操作如下：
1、HEK293F悬浮细胞培养及转染
(1)取用HEK293F细胞进行悬浮培养(5％CO2和85rpm/min)，细胞密度长到106个/mL后进行细胞转染。
(2)取大提质粒pFlag-CMV-3-B3GNT6(43-384)约20μg，加入到500μL细胞培养基中，再取用转染试剂(PEI，浓度为1mg/mL)60μL，加入到500μL细胞培养基中，混匀。然后将包含质粒的培养基加入到包含PEI转染试剂的培养基中，混匀，静置20分钟。将混匀的含有转染试剂和质粒的培养基加入到20mL的细胞中，悬浮培养5天(即转染5天)。
2、B3GNT6(43-384)的蛋白纯化
(1)收取步骤1中转染5天后的悬浮细胞，800×g离心，去掉细胞沉淀，收取上层细胞培养基。
(2)收取的上层细胞培养基利用0.45μM的滤膜进行过滤，除掉细胞碎片。
(3)过滤后的上层细胞培养基利用Flag-beads(Flag标签抗体磁珠)进行4℃下振荡孵育2小时，用PBS清洗beads三次，然后再利用包含3×Flag多肽(1mM)的PBS缓冲液进行竞争洗脱，从Flag-beads上洗脱B3GNT6(43-384)蛋白，收集目标蛋白(B3GNT6(43-384)蛋白)，最后进行离心浓缩、进行SDS-PAGE鉴定，结果如图1所示，蛋白胶第四泳道约50KDa左右为带有Flag标签的蛋白质B3GNT6(43-384)(即糖基转移酶B3GNT6(43-384)，氨基酸序列为SEQ ID No.1)。
实施例3糖基转移酶B3GNT6(43-384)的活性研究
本实施例是对糖基转移酶B3GNT6(43-384)的酶活性质进行探究，从酶的供体底物、金属离子依赖、pH敏感性等方面进行探究。具体操作如下：
1、B3GNT6(43-384)的供体底物探究
采用商业化购买的苄基-2-乙酰胺基-2-脱氧-α-D-吡喃半乳糖苷(α-GalNAc-Bn，CAS:3554-93-6，上海麦克林生化科技有限公司)作为受体底物，分别利用供体底物5’-二磷酸尿嘧啶核苷-N-乙酰半乳糖胺(UDP-GlcNAc)(CAS:91183-98-1，西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司)及其叠氮衍生物(UDP-GlcNAz)(CAS:1611490-64-2，青岛曙格生物技术有限公司)和炔基衍生物(UDP-GlcNAl)(青岛曙格生物技术有限公司)对实施例2制备的糖基转移酶B3GNT6(43-384)(带有Flag标签)进行酶活性差异的比较。酶促反应为体系30ul，包含pH＝8.0Tris-HCl(100mM),MnCl2(2mM),α-GalNAc-Bn(10mM),UDP-GlcNAc或者UDP-GlcNAz或UDP-GlcNAl(15mM)，B3GNT6(43-384)(0.2mg/ml),用去离子水补齐，37℃水浴条件下反应60分钟，95摄氏度加热2分钟终止反应，反应液进行HPLC检测分析。HPLC检测中，HPLC分析中采用Agilent ZORBAX C18分析柱，柱温40℃，进样量20μl,流动相为由乙腈和水组成的液体，梯度乙腈为10％-40％(20分钟)，流速为1ml/min,利用UV检测器在波长220nm处检测并自动形成分离图谱。
检测分析结果见表3：
表3 酶促反应的产率
供体底物 UDP-GlcNAc UDP-GlcNAz UDP-GlcNAl
产率 100％ 96.3％ 82.7％
结果表明，B3GNT6(43-384)能将UDP-GlcNAc的GlcNAc基团转移到α-GalNAc-Bn上，得到产物GlcNAc-GalNAc-Bn，产率是100％；B3GNT6(43-384)能将UDP-GlcNAz的GlcNAz基团转移到α-GalNAc-Bn上，得到产物GlcNAz-GalNAc-Bn，产率是96.3％；B3GNT6(43-384)能将UDP-GlcNAl的GlcNAl基团转移到α-GalNAc-Bn上，得到产物GlcNAl-GalNAc-Bn，产率是82.7％。说明B3GNT6(43-384)是一种糖基转移酶，B3GNT6(43-384)可以高效利用天然核酸糖及其类似物，具有高效的生物催化活性。
2、B3GNT6(43-384)的金属离子依赖性和pH敏感性范围的探究
(1)金属离子依赖性：该部分实验操作使用苄基-2-乙酰胺基-2-脱氧-α-D-吡喃半乳糖苷(α-GalNAc-Bn，CAS:3554-93-6)作为受体底物，5’-二磷酸尿嘧啶核苷-N-乙酰半乳糖胺(UDP-GlcNAc)作为供体底物，采用不同种类的二价金属离子作为酶促反应催化剂，如镁离子(Mg2+)、锰离子(Mn2+)、钙离子(Ca2+)、钴离子(Co2+)或锌离子(Zn2+)，考察不同金属离子对酶促反应的影响。酶促反应体系为30uL，包含pH＝8.0Tris-HCl(100mM),金属离子(2mM),α-GalNAc-Bn(10mM),UDP-GlcNAc(15mM)，B3GNT6(43-384)(0.2mg/ml),用去离子水补齐，37℃水浴条件下反应60分钟，95摄氏度加热2分钟终止反应(相同反应条件下，同时设置了加入5mM EDTA的实验组和空白对照组)，反应液进行HPLC检测分析。检测分析结果如图2所示。
结果表明，在没有金属离子作为酶促反应催化剂时，B3GNT6(43-384)不具有酶活力；不同的金属离子对B3GNT6(43-384)的催化作用也不同，催化作用由大到小依次为锰离子(Mn2+)、钴离子(Co2+)、锌离子(Zn2+)，而镁离子(Mg2+)和钙离子(Ca2+)对B3GNT6(43-384)不具有催化作用。可以看出，锰离子(Mn2+)作为催化剂时，酶活最大，酶促反应相对产率可以达到100％。表明B3GNT6(43-384)催化需要Mn等金属离子，表现为金属离子依赖性。
(2)pH敏感性范围的探究：该部分实验操作使用苄基-2-乙酰胺基-2-脱氧-α-D-吡喃半乳糖苷(α-GalNAc-Bn，CAS:3554-93-6)作为受体底物，5’-二磷酸尿嘧啶核苷-N-乙酰半乳糖胺(UDP-GlcNAc)作为供体底物，采用pH＝6-10的缓冲液(pH 6、pH 7、pH 7.5、pH 8、pH 9、pH 10)。酶促反应体系为30uL，包含pH＝6.0-10的缓冲液(100mM),MnCl2(2mM),α-GalNAc-Bn(10mM),UDP-GlcNAc(15mM)，B3GNT6(43-384)(0.2mg/ml),用去离子水补齐，37℃水浴条件下反应60分钟，95摄氏度加热2分钟终止反应，反应液进行HPLC检测分析。检测分析结果如图3所示。
结果表明，B3GNT6(43-384)最适pH为7-8，最佳反应pH为7.5。
实施例4糖基转移酶B3GNT6(43-384)在Tn抗原标记中的应用
本实施例利用化学酶法对人乳腺癌细胞MCF7细胞表面的Tn抗原进行标记，该部分内容主要包含化学酶法技术的开发和应用，借助荧光共聚焦显微镜成像和细胞流式分析手段，证明糖基转移酶B3GNT6(43-384)能够高效地识别细胞表面的Tn抗原，并能进行成像观察和定量分析。具体操作如下：
1、共聚焦荧光显微镜观察化学酶法标记细胞表面Tn抗原，该部分操作分为两步，具体如下：
(1)酶促反应：首先将乳腺癌细胞MCF7种植于成像专用培养皿中。其次，实验组(B3GNT6(43-384)+UDP-GlcNAz+)：将培养密度约40％的细胞进行酶促反应处理：将培养皿中的培养基更换为HBSS缓冲溶液，溶液中包含1mM MnCl2，100μMUDP-GlcNAz，1mg/mLB3GNT6(43-384)，在37℃条件下反应30分钟。然后，去掉反应溶液，用1×PBS溶液洗三次，得到酶促处理的细胞。空白对照实验组(B3GNT6(43-384)-UDP-GlcNAz+)采用不加酶B3GNT6(43-384)作为对照实验，其他操作与实验组保持一致。
(2)生物正交反应标记：实验组(B3GNT6(43-384)+UDP-GlcNAz+)获得酶促处理的细胞后，加入PBS缓冲液，体系中包含50μM炔基修饰的染料(Alkyne-Cy5),200μM硫酸铜(CuSO4),1mM配体BTTAA，10mM VcNa，37℃条件下反应5分钟(点击反应)。反应完成后，去掉反应溶液，用PBS缓冲液清洗三遍，再利用4％的多聚甲醛对细胞进行固定，用Hoechst33342进行细胞核染色，最后进行成像观察。空白对照实验组也进行上述相同的处理。结果如图4所示：红色为Cy5染料的颜色，蓝色为细胞核染料颜色(Hoechst 33342)，Merge为蓝色、红色的叠加图。可以看出，与不加酶的对照组(B3GNT6(43-384)-，UDP-GlcNAz+)相比，实验组(B3GNT6(43-384)+，UDP-GlcNAz+)中被标记Cy5的MCF7细胞有明显的红色荧光信号，空白对照实验组(B3GNT6(43-384)-UDP-GlcNAz+)的MCF7细胞没有红色荧光信号。
2、细胞流式分析，该部分操作分为两步，具体如下：
(1)酶促反应：首先将乳腺癌细胞MCF7种植于6孔板中，细胞密度约80％的时进行酶促反应处理：加入500μL浓度为10mM EDTA的PBS溶液，于37℃下静置5分钟。然后去掉上清液，加入1mL PBS，吹打混匀细胞，800×g离心5分钟，去掉上清液，实验组(B+，U+)用HBSS缓冲溶液进行混匀，HBSS缓冲溶液中包含1mM MnCl2，100μM UDP-GlcNAz，1mg/mL B3GNT6(43-384)，在37℃条件下反应30分钟。然后，去掉反应溶液，用1×PBS溶液洗三次，获得酶促处理的细胞。空白对照实验组(B-U+)采用不加酶B3GNT6(43-384)作为对照实验(B-，U+组)和不加供体底物UDP-GlcNAz作为对照实验(B+,U-组)，其他操作与实验组(B+，U+)保持一致。
(2)生物正交反应标记：实验组(B+，U+)获得酶促处理的细胞后，加入PBS缓冲液，体系中包含50μM炔基修饰的染料(Alkyne-Cy5),200μM硫酸铜(CuSO4),1mM配体BTTAA，10mMVcNa，37℃条件下反应5分钟(点击反应)。反应完成后，去掉反应溶液，用PBS缓冲液清洗三遍，最后进行流式细胞仪的荧光分析检测。其它两组也进行上述相同的处理。结果如图5所示：与对照组(B+，U-组和B-，U+组)相比，被标记组(B+，U+)的MCF7细胞表面有明显的荧光信号。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。
SEQUENCE LISTING
<110> 北京大学
<120> 一种糖基转移酶及其在Tn抗原的标记、成像和检测中的应用
<160> 4
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 342
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 1
Met Gln Glu Glu Thr Pro Glu Gly Pro Thr Asp Ala Pro Ala Ala Asp
1 5 10 15
Glu Pro Pro Ser Glu Leu Val Pro Gly Pro Pro Cys Val Ala Asn Ala
20 25 30
Ser Ala Asn Ala Thr Ala Asp Phe Glu Gln Leu Pro Ala Arg Ile Gln
35 40 45
Asp Phe Leu Arg Tyr Arg His Cys Arg His Phe Pro Leu Leu Trp Asp
50 55 60
Ala Pro Ala Lys Cys Ala Gly Gly Arg Gly Val Phe Leu Leu Leu Ala
65 70 75 80
Val Lys Ser Ala Pro Glu His Tyr Glu Arg Arg Glu Leu Ile Arg Arg
85 90 95
Thr Trp Gly Gln Glu Arg Ser Tyr Gly Gly Arg Pro Val Arg Arg Leu
100 105 110
Phe Leu Leu Gly Thr Pro Gly Pro Glu Asp Glu Ala Arg Ala Glu Arg
115 120 125
Leu Ala Glu Leu Val Ala Leu Glu Ala Arg Glu His Gly Asp Val Leu
130 135 140
Gln Trp Ala Phe Ala Asp Thr Phe Leu Asn Leu Thr Leu Lys His Leu
145 150 155 160
His Leu Leu Asp Trp Leu Ala Ala Arg Cys Pro His Ala Arg Phe Leu
165 170 175
Leu Ser Gly Asp Asp Asp Val Phe Val His Thr Ala Asn Val Val Arg
180 185 190
Phe Leu Gln Ala Gln Pro Pro Gly Arg His Leu Phe Ser Gly Gln Leu
195 200 205
Met Glu Gly Ser Val Pro Ile Arg Asp Ser Trp Ser Lys Tyr Phe Val
210 215 220
Pro Pro Gln Leu Phe Pro Gly Ser Ala Tyr Pro Val Tyr Cys Ser Gly
225 230 235 240
Gly Gly Phe Leu Leu Ser Gly Pro Thr Ala Arg Ala Leu Arg Ala Ala
245 250 255
Ala Arg His Thr Pro Leu Phe Pro Ile Asp Asp Ala Tyr Met Gly Met
260 265 270
Cys Leu Glu Arg Ala Gly Leu Ala Pro Ser Gly His Glu Gly Ile Arg
275 280 285
Pro Phe Gly Val Gln Leu Pro Gly Ala Gln Gln Ser Ser Phe Asp Pro
290 295 300
Cys Met Tyr Arg Glu Leu Leu Leu Val His Arg Phe Ala Pro Tyr Glu
305 310 315 320
Met Leu Leu Met Trp Lys Ala Leu His Ser Pro Ala Leu Ser Cys Asp
325 330 335
Arg Gly His Arg Val Ser
340
<210> 2
<211> 1026
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 2
atgcaagaag aaacccccga ggggcctact gacgcgcccg ctgctgacga acctccatca 60
gaactggttc ctgggccccc gtgcgttgcg aatgcctctg ctaacgcgac tgcggatttt 120
gagcaacttc cggcgcgaat ccaggatttt ctgcgataca gacattgcag acacttcccc 180
ctgctgtggg acgccccggc taaatgtgca gggggccgag gtgtcttcct gttgttggca 240
gtgaaatccg ccccagaaca ttacgaaagg cgcgaattga ttcgcaggac ttggggtcaa 300
gaacggtctt acggtggcag accagttagg cgactctttt tgcttggaac gccggggcct 360
gaggatgaag ctagagccga aaggcttgcc gaacttgtag cactggaagc ccgagagcat 420
ggagatgtat tgcaatgggc ctttgcagac acatttctta acttgactct taaacacctt 480
catcttttgg attggctggc agcgcggtgc ccccatgcaa gatttttgct tagtggtgat 540
gacgatgttt ttgttcatac ggcaaacgtc gttaggttcc tgcaagcaca gcctcccgga 600
cgccacctct tcagcgggca gttgatggag ggtagtgtac caatacgaga cagctggagt 660
aagtattttg taccgccgca gctcttccct ggatcagcgt atcccgtata ctgttctggc 720
ggaggcttcc tgttgtcagg accgacagcg cgggccctca gggccgcagc tcggcacaca 780
cccctttttc cgattgacga cgcttacatg ggtatgtgtc ttgagcgagc aggtctcgcc 840
ccttctggtc acgaaggaat ccgccctttt ggggttcagc tgccgggggc acagcagtct 900
tctttcgatc catgcatgta ccgcgaactc ctgttggtgc accgatttgc gccatacgag 960
atgctcctta tgtggaaggc tttgcatagt cctgctctca gttgtgaccg aggacatcga 1020
gtatct 1026
<210> 3
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 3
aagcttcatg caggaggaga cgccagaggg 30
<210> 4
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 4
gcggccgcga cccggtgtcc ccggtc 26

Claims (15)

1.蛋白质在制备Tn抗原标记试剂或试剂盒中的应用，所述蛋白质为下述任一种：
A1）氨基酸序列是SEQ ID No.1的蛋白质；
A2）在A1）的N端和/或C端连接标签或信号肽得到的具有相同功能的融合蛋白质；
所述应用是基于化学酶法通过点击反应对Tn抗原进行标记。
2.权利要求1中所述的蛋白质在制备检测Tn抗原的产品中的应用。
3.权利要求1中所述的蛋白质在制备用于Tn抗原成像的试剂中的应用。
4.核酸分子在制备Tn抗原标记试剂或试剂盒中的应用，所述核酸分子为编码权利要求1中所述蛋白质的核酸分子；所述应用是基于化学酶法通过点击反应对Tn抗原进行标记。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述核酸分子为编码序列是SEQ ID No.2所示的cDNA分子。
6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述核酸分子为核苷酸序列是SEQ IDNo.2的DNA分子。
7.权利要求4-6中任一所述核酸分子在制备检测Tn抗原的产品中的应用。
8.权利要求4-6中任一所述核酸分子在制备用于Tn抗原成像的试剂中的应用。
9.一种Tn抗原检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1中所述的蛋白质、糖基转移酶供体底物叠氮糖、含炔烃的检测试剂、酶促反应催化剂、铜离子配体和点击反应催化剂，所述试剂盒是基于化学酶法通过点击反应对Tn抗原进行标记。
10.根据权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，所述糖基转移酶供体底物叠氮糖为UDP-GlcNAz；所述含炔烃的检测试剂为Alkyne-Cy5；所述酶促反应催化剂为MnCl2；所述铜离子配体为BTTAA、BTTES、TBTA或THPTA；所述点击反应催化剂为亚铜离子化合物。
11.一种Tn抗原的标记方法，其特征在于，所述方法为基于化学酶法通过点击反应对Tn抗原进行标记，包括如下步骤：
（1）采用权利要求1中所述的蛋白质作为糖基转移酶，以糖基转移酶供体底物叠氮糖为酶促反应底物，对含有Tn抗原的样本进行酶促反应处理；
（2）步骤（1）处理后的样本与含炔烃的检测试剂在点击反应催化剂的作用下进行点击反应，得到被所述含炔烃的检测试剂标记的Tn抗原；
所述糖基转移酶供体底物叠氮糖为UDP-GlcNAz；所述点击反应催化剂为亚铜离子化合物。
12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，所述酶促反应以金属离子作为催化剂，所述金属离子为锰离子、钴离子和/或锌离子；和/或，所述酶促反应的最适pH值为7-8。
13.根据权利要求11或12所述的方法，其特征在于，所述含炔烃的检测试剂为下述任一种：
D1）炔基修饰的小分子标记物；
D2）炔基修饰的染料；
D3）炔基修饰的半抗原；
D4）Alkyne-Cy5。
14.根据权利要求11-13中任一所述的方法，其特征在于，所述酶促反应处理条件为：1mM MnCl2，100 μM UDP-GlcNAz，1 mg /mL B3GNT6，在37 ℃条件下反应30分钟，B3GNT6的氨基酸序列为SEQ ID No.1；所述点击反应的条件为：50 μM Alkyne-Cy5,200 μM 硫酸铜,1mM 配体BTTAA，10 mM VcNa，37℃条件下反应5分钟。
15.根据权利要求11-13中任一所述的方法，其特征在于，所述样本为蛋白、细胞或组织切片。
CN202111180580.3A 2021-10-11 2021-10-11 一种糖基转移酶及其在Tn抗原的标记、成像和检测中的应用 Active CN113943718B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202111180580.3A CN113943718B (zh) 2021-10-11 2021-10-11 一种糖基转移酶及其在Tn抗原的标记、成像和检测中的应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202111180580.3A CN113943718B (zh) 2021-10-11 2021-10-11 一种糖基转移酶及其在Tn抗原的标记、成像和检测中的应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN113943718A CN113943718A (zh) 2022-01-18
CN113943718B true CN113943718B (zh) 2023-10-24

Family

ID=79330159

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202111180580.3A Active CN113943718B (zh) 2021-10-11 2021-10-11 一种糖基转移酶及其在Tn抗原的标记、成像和检测中的应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN113943718B (zh)

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1998044123A2 (en) * 1997-03-31 1998-10-08 The Government Of The United States Of America Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services O-LINKED GlcNAc TRANSFERASE (OGT): CLONING, MOLECULAR EXPRESSION, AND METHODS OF USE
CN110452987A (zh) * 2019-08-27 2019-11-15 北京泱深生物信息技术有限公司 一组肺腺癌诊断标记及其应用
CN113661180A (zh) * 2019-03-27 2021-11-16 宾夕法尼亚大学董事会 Tn-MUC1嵌合抗原受体(CAR)T细胞疗法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1998044123A2 (en) * 1997-03-31 1998-10-08 The Government Of The United States Of America Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services O-LINKED GlcNAc TRANSFERASE (OGT): CLONING, MOLECULAR EXPRESSION, AND METHODS OF USE
CN113661180A (zh) * 2019-03-27 2021-11-16 宾夕法尼亚大学董事会 Tn-MUC1嵌合抗原受体(CAR)T细胞疗法
CN110452987A (zh) * 2019-08-27 2019-11-15 北京泱深生物信息技术有限公司 一组肺腺癌诊断标记及其应用

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
黏蛋白型O-聚糖在人类肿瘤中的结构异常及生物学功能;刘春亮;吴士良;;生物化学与生物物理进展(第05期);摘要，第476页左栏第1段-477页右栏第1段，第480页最后1段，图1 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN113943718A (zh) 2022-01-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US7166449B2 (en) α1,3-fucosyltransferase
EP0816503B1 (en) Alpha-1-6 fucosyltransferases
EP3137493B1 (en) A protein secretory factor with high secretory efficiency and an expression vector comprising the same
KR20190013627A (ko) 재조합 콜라겐의 수산화를 제어하기 위한 효모 균주 및 방법
KR20140057331A (ko) 유방암의 치료 및 진단을 위한 방법 및 조성물
WO2000026383A1 (en) Alpha 1,2-fucosyltransferase from helicobacter pylori
WO2021185360A1 (en) Novel truncated sortase variants
CN113943718B (zh) 一种糖基转移酶及其在Tn抗原的标记、成像和检测中的应用
JP7307158B2 (ja) 抗ヒト心筋型トロポニンｉ抗体及びその応用
JP2004533206A (ja) 化学療法のための標的としてのガン関連遺伝子
CN114380920A (zh) 人甲胎蛋白融合蛋白及其制备方法和应用
KR20220097504A (ko) 투구게 유래 재조합 FactorG 및 이것을 이용한 β-글루칸의 측정 방법
CN110194801B (zh) 一种融合蛋白和多克隆抗体及其应用
CA2662915A1 (en) Methods, compositions, and kits for the detection and monitoring of colon cancer
CN113087807B (zh) 用于检测糖类抗原的基于志贺毒素b亚基重组蛋白的探针、制备方法
CN111217913A (zh) 一种抗pg ii的抗体及其应用
CN113960310A (zh) 重组蛋白在制备用于诊断或辅助诊断IgA肾病的产品中的应用
CN111018978B (zh) 一种抗人心肌肌钙蛋白i的抗体及其应用
CN116068198B (zh) Ppi原位检测方法及其载体、诊断试剂、试剂盒和应用
CN111018982B (zh) 一种抗人心肌肌钙蛋白i的抗体及其应用
JP4517189B2 (ja) 糖ヌクレオチド運搬作用を有するタンパク質、組織の癌化の検出方法
CN110437341B (zh) 一种具有红色荧光活性的检测蛋白及其应用
US20030143563A1 (en) Method for identifying a nucleic acid
CN111018980B (zh) 一种抗人心肌肌钙蛋白i的抗体及其应用
KR20120094173A (ko) 유방암 줄기세포 특이적 마커인 ｃｄ４４ 단백질 표적용 펩타이드 및 이의 이용

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant