KR20220097504A - 투구게 유래 재조합 FactorG 및 이것을 이용한 β-글루칸의 측정 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은, β-글루칸 의존적으로 활성화되는 투구게 유래 FactorG를 제공하는 것, 및 그것을 이용한 고감도인 β-글루칸의 측정 방법을 제공하는 것을 과제로 한다.
본 발명은, "배열 번호 2 또는 배열 번호 4로 나타나는 아미노산 배열과 동일 혹은 실질적으로 동일한 아미노산 배열을 함유하는 FactorG α 서브 유닛과, 배열 번호 6, 8, 10, 12, 14, 또는 16 중 어느 하나로 나타나는 아미노산 배열과 동일 혹은 실질적으로 동일한 아미노산 배열을 함유하는 FactorG β 서브 유닛의 조합의 헤테로 다이머, 이것을 이용한 β-글루칸의 측정 방법, 및 그 헤테로 다이머를 포함하는 β-글루칸 측정용 키트"에 관한 것이다.

Description

투구게 유래 재조합 FactorG 및 이것을 이용한 β-글루칸의 측정 방법

본 발명은, 투구게 유래의 신규 FactorG α 서브 유닛과 FactorG β 서브 유닛으로 이루어지는 헤테로 다이머, 이것을 이용하는 β-글루칸(이하, "BG"라고 약기한다.)의 측정 방법, 및 그 헤테로 다이머를 포함하는 키트에 관한 것이다.

내장, 혈액계, 및 림프계에 발생하는 심재성 진균증은, 저항력이 약해진 상태, 예를 들면 면역 부전 상태의 환자가 걸리는 기회 감염증의 일종이며, 환자는 종종 매우 심각한 병태가 된다. 심재성 진균증의 기인균의 대표예로서는, 칸디다, 아스페르길루스를 들 수 있고, 어느 세포벽에도 BG가 공통으로 존재하고 있다. 그러므로, 혈중 BG를 검출하여, 측정하는 것은 유용하다. 임상 진단의 분야에서는, 혈장 혹은 혈청 중 BG의 농도가, 심재성 진균 감염증의 조기 진단, 치료 효과 및 예후의 판정의 지표로서 이용되고 있다.

BG는, β(1→3) 결합의 글루코스 반복 구조를 주쇄로 하는 다당이며, 수천~100만 정도의 고분자량의 물질이다. (1→6) 결합이나 (1→4) 결합의 분기를 갖는 경우도 있다. 투구게의 혈구 추출물(아메보사이트 라이세이트, Amebocyte Lysate, 이하, "라이세이트"라고 약기한다.) 중에는, FactorG α 서브 유닛과 FactorG β 서브 유닛으로 구성되는 헤테로 다이머인 FactorG가 존재한다. BG는, FactorG α 서브 유닛의 BG 결합 도메인 부분에 결합하는 성질을 갖는다.

BG를 측정하는 방법으로서는, 예를 들면 상기한 라이세이트 중의 FactorG를 통한 반응 경로를 이용하여, 합성 펩타이드 기질을 이용한 하기와 같은 합성 기질법이 알려져 있다.

BG가 FactorG α 서브 유닛의 BG 결합 도메인 부분에 결합하면, FactorG는 프로테아제 활성을 갖는 활성형 FactorG가 된다. 활성형 FactorG는, 그 프로테아제 활성에 의하여, 라이세이트 중에 존재하는 프로클로팅 엔자임(Proclotting enzyme)을 클로팅 엔자임(Clotting enzyme)으로 변환시킨다(비특허문헌 1). 클로팅 엔자임은 합성 펩타이드 기질(예를 들면 Boc-DEL-pNA)의 합성 기질을 아마이드 가수분해하여 pNA를 유리한다. 따라서, 생성된 발색 물질(pNA)의 흡광도를 측정함으로써, BG를 정량할 수 있다.

타키프레우스속 투구게(Tachypleus tridentatus) 유래의 FactorG α 서브 유닛 및 β 서브 유닛은 이미 클로닝되어 있다(비특허문헌 2, 특허문헌 1).

특허문헌 2에서는, 비특허문헌 2 및 특허문헌 1에 기재된 FactorG를 이용하여 BG 무첨가로 프로테아제 활성을 측정하고 있다.

특허문헌 1: 일본 특허공보 제4832134호 특허문헌 2: 국제 공개공보 제WO2008/004674호 팸플릿

비특허문헌 1: T. Morita et al., FEBS Lett., 1981, vol. 129, p. 318-321 비특허문헌 2: N. Seki et al.,J. Biol. Chem., 1994, vol. 269, No. 2, p. 1370-1374

특허문헌 1, 특허문헌 2 등에 기재된 기술은, 비특허문헌 2에서 결정한 유전자 배열을 이용하여 행하고 있지만, 곤충 세포 배양 배지를 사용하고 있다. 그러나, 곤충 세포 배양 배지에는, 효모 추출액으로부터의 BG 오염이 있는 것이 알려져 있다. 또, 특허문헌 1에서는, BG 무첨가로 프로테아제 활성을 측정하고 있는 시험은 없다. 그 때문에, 특허문헌 1에서 제작한 타키프레우스속 투구게 유래의 FactorG가, BG 특이적으로 활성화 되었는지 아닌지는 불명확하다.

실제로, BG를 검출 한계 이하로 한 배지를 이용하여 본 발명자들이 행한 검증에 의하면, 하기에 기재하는 실시예 1의 결과로부터 명확한 바와 같이, 비특허문헌 2 및 특허문헌 2에 기재된 방법으로 제작한 재조합 타키프레우스속 투구게 유래 FactorG는, BG가 존재하고 있어도 프로테아제 활성을 확인할 수 없었다. 즉, 이들 문헌에 기재된 DNA 배열을 이용하여, BG의 존재하에서 프로테아제 활성을 갖는 활성형 FactorG로 변환하는 FactorG(전구체)를 제작하는 것은 곤란했다.

또한, 특허문헌 3에서는, 수 ng 오더의 검출 감도로 BG를 측정했다고 기재되어 있다. 그러나, 임상 진단상에서는 혈장 혹은 혈청 중 BG의 측정에서는 수 pg의 오더에서의 측정이 요구되고 있기 때문에, 수 ng 오더의 검출 감도에서는, 임상 진단에 이용하기 위한 충분한 성능을 갖고 있지 않다.

상기 상황을 감안하여, 본 발명은, BG 의존적으로 활성화되는 투구게 유래 FactorG를 제공하는 것, 및 그것을 이용한 고감도인 BG의 측정 방법을 제공하는 것을 과제로 한다.

본 발명은, 상기 과제를 해결할 목적으로 이루어진 것으로, 이하의 구성으로 이루어진다.

[1] 배열 번호 2 또는 배열 번호 4로 나타나는 아미노산 배열과 동일 혹은 실질적으로 동일한 아미노산 배열을 함유하는 FactorG α 서브 유닛과, 배열 번호 6, 8, 10, 12, 14, 또는 16 중 어느 하나로 나타나는 아미노산 배열과 동일 혹은 실질적으로 동일한 아미노산 배열을 함유하는 FactorG β 서브 유닛의 조합의 헤테로 다이머.

[2] 하기로부터 선택되는, 상기 [1]에 기재된 헤테로 다이머:

(i) 배열 번호 2로 나타나는 아미노산 배열을 함유하는 FactorG α 서브 유닛과, 배열 번호 6으로 나타나는 아미노산 배열을 함유하는 FactorG β 서브 유닛의 조합의 헤테로 다이머,

(ii) 배열 번호 2로 나타나는 아미노산 배열을 함유하는 FactorG α 서브 유닛과, 배열 번호 8로 나타나는 아미노산 배열을 함유하는 FactorG β 서브 유닛의 조합의 헤테로 다이머,

(iii) 배열 번호 2로 나타나는 아미노산 배열을 함유하는 FactorG α 서브 유닛과, 배열 번호 12로 나타나는 아미노산 배열을 함유하는 FactorG β 서브 유닛의 조합의 헤테로 다이머,

(iv) 배열 번호 2로 나타나는 아미노산 배열을 함유하는 FactorG α 서브 유닛과, 배열 번호 14로 나타나는 아미노산 배열을 함유하는 FactorG β 서브 유닛의 조합의 헤테로 다이머,

(v) 배열 번호 4로 나타나는 아미노산 배열을 함유하는 FactorG α 서브 유닛과, 배열 번호 10으로 나타나는 아미노산 배열을 함유하는 FactorG β 서브 유닛의 조합의 헤테로 다이머,

(vi) 배열 번호 4로 나타나는 아미노산 배열을 함유하는 FactorG α 서브 유닛과, 배열 번호 16으로 나타나는 아미노산 배열을 함유하는 FactorG β 서브 유닛의 헤테로 다이머.

[3] (i), (ii), 또는 (v)로부터 선택되는, 상기 [2]에 기재된 헤테로 다이머.

[4] 시료로 배열 번호 2 또는 배열 번호 4로 나타나는 아미노산 배열을 함유하는 FactorG α 서브 유닛과, 배열 번호 6, 8, 10, 12, 14, 또는 16 중 어느 하나로 나타나는 아미노산 배열과 동일 혹은 실질적으로 동일한 아미노산 배열을 함유하는 FactorG β 서브 유닛의 조합의 헤테로 다이머를 이용한, β-글루칸의 측정 방법.

[5] 배열 번호 2 또는 배열 번호 4로 나타나는 아미노산 배열을 함유하는 FactorG α 서브 유닛.

[6] 배열 번호 6, 8, 10, 12, 14, 또는 16 중 어느 하나로 나타나는 아미노산 배열과 동일 혹은 실질적으로 동일한 아미노산 배열을 함유하는 FactorG β 서브 유닛.

[7] 배열 번호 2 또는 배열 번호 4로 나타나는 아미노산 배열과 동일 혹은 실질적으로 동일한 아미노산 배열을 함유하는 FactorG α 서브 유닛과, 배열 번호 6, 8, 10, 12, 14, 또는 16 중 어느 하나로 나타나는 아미노산 배열과 동일 혹은 실질적으로 동일한 아미노산 배열을 함유하는 FactorG β 서브 유닛의 조합의 헤테로 다이머를 포함하는, β-글루칸 측정용 키트.

또, 본 발명은 이하의 구성을 포함하고 있어도 된다.

[8] 배열 번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 또는 16 중 어느 하나로 나타나는 아미노산 배열과 동일 혹은 실질적으로 동일한 아미노산 배열을 코드하는 염기 배열을 갖는 핵산 분자를 도입한 벡터.

[9] 배열 번호 2 또는 배열 번호 4로 나타나는 아미노산 배열과 동일 혹은 실질적으로 동일한 아미노산 배열을 코드하는 염기 배열을 갖는 핵산 분자, 및 배열 번호 6, 8, 10, 12, 14, 또는 16 중 어느 하나로 나타나는 아미노산 배열과 동일 혹은 실질적으로 동일한 아미노산 배열을 코드하는 염기 배열을 갖는 핵산 분자의 양방을 도입한 벡터.

[10] 배열 번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 또는 16 중 어느 하나로 나타나는 아미노산 배열과 동일 혹은 실질적으로 동일한 아미노산 배열을 코드하는 염기 배열을 갖는 핵산 분자를 도입한 형질 전환체.

[11] 배열 번호 2 또는 배열 번호 4로 나타나는 아미노산 배열과 동일 혹은 실질적으로 동일한 아미노산 배열을 코드하는 염기 배열을 갖는 핵산 분자, 및 배열 번호 6, 8, 10, 12, 14, 또는 16 중 어느 하나로 나타나는 아미노산 배열과 동일 혹은 실질적으로 동일한 아미노산 배열을 코드하는 염기 배열을 갖는 핵산 분자의 양방을 도입한 형질 전환체.

[12] BG를 함유하는 시료를, 배열 번호 2 또는 배열 번호 4로 나타나는 아미노산 배열과 동일 혹은 실질적으로 동일한 아미노산 배열을 함유하는 FactorG α 서브 유닛과 접촉시켜 처리하는, 시료로부터 BG를 제거하는 방법.

[13] 상기 FactorG α 서브 유닛이 불용성 담체에 담지되어 있는, 상기 [13]에 기재된 BG를 제거하는 방법.

[14] 배열 번호 2 또는 배열 번호 4로 나타나는 아미노산 배열과 동일 혹은 실질적으로 동일한 아미노산 배열을 함유하는 FactorG α 서브 유닛을 포함하는, β-글루칸 제거용 키트.

본 발명자들은 상기 문제를 해결하기 위하여 예의 연구의 결과, BG 존재하에서 프로테아제 활성을 갖는 FactorG를 개발하여, 이것을 이용하면 고감도인 BG의 측정을 행할 수 있는 것을 알아내, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

본 발명의 헤테로 다이머는, BG 존재하에서 프로테아제 활성을 발휘하는 BG 의존성의 프로테아제 활성을 갖는다. 또, 본 발명의 헤테로 다이머를 이용하여 BG 농도의 측정을 행하면, 종래의 BG 측정법과 비교하여, 고감도인 BG의 측정을 행할 수 있다. 또한, 본 발명의 헤테로 다이머는, 리콤비넌트품이기 때문에 로트차가 없고, 저가이며, 또한 대량으로 제조할 수 있다는 효과를 나타낸다.

도 1은 실시예 1에서 얻어진, PSM-J1 배지, 또는/및 본 발명의 FactorG α 서브 유닛 B를 이용하여 처리한 PSM-J1 배지 중의 BG의 농도를 측정한 결과를 나타낸다.
도 2는 실시예 1에서 얻어진, 시료 중의 렌티난 농도와 흡광도의 관계를 나타내는 검량선이다.
도 3은 실시예 3에 있어서, 본 발명의 FactorG α 서브 유닛 A와 FactorG β 서브 유닛 βi2의 헤테로 다이머를 이용하여 얻어진, 시료 중의 렌티난 농도와 흡광도의 관계를 나타내는 검량선이다.
도 4는 실시예 3에 있어서, 본 발명의 FactorG α 서브 유닛 B와 FactorG β 서브 유닛 β2의 헤테로 다이머를 이용하여 얻어진, 시료 중의 렌티난 농도와 흡광도의 관계를 나타내는 검량선이다.
도 5는 실시예 4에서 얻어진 본 발명의 FactorG α 서브 유닛 A와 FactorG β 서브 유닛 βi2의 헤테로 다이머를 이용하여, 시료 중의 렌티난 농도를 측정하여 얻어진, 시료 중의 BG 농도를 측정한 결과를 나타낸다.

1. 본 발명에 관한 BG

본 발명에 관한 BG로서는, BG를 그 구성 성분으로서 포함하는 다당류이며, 투구게 혈구 추출물의 효소 반응을 일으키는 성질이 있는 것을 들 수 있다. 구체적으로는, 예를 들면 각종 세균류(예를 들면, 알칼리게네스속, 아그로박테륨속 등), 효모류(예를 들면, 사카로미세스속, 칸디다속, 크립토콕쿠스속, 트리코스포론속, 로도토룰라속 등), 곰팡이류(아스페르길루스속, 뮤코르속, 페니실륨속, 트리코피톤속, 스포로트릭스속, 피알로포라속 등), 방선균류(악티노마이시즈속, 노카디아속 등), 버섯류(예를 들면, 표고 버섯, 치마 버섯, 구름 버섯 등) 등의 세포벽 등으로부터 얻어지는 천연의 다당, 구체적으로는 예를 들면 커드란, 파키만, 스클레로탄, 렌티난, 스키조필란, 코리올란 등이, 혹은 조류(藻類)(예를 들면, 갈조, 유글레나, 규조 등)의 저장성 다당, 구체적으로는 예를 들면 라미나란, 파라밀룸 등을 들 수 있다.

2. 본 발명의 FactorG α 서브 유닛

본 발명의 FactorG α 서브 유닛은, 배열 번호 2 또는 배열 번호 4로 나타나는 아미노산 배열과 동일 혹은 실질적으로 동일한 아미노산 배열을 함유하는 단백질이다.

본 발명의 FactorG α 서브 유닛은, BG에 결합하는 성질을 갖는다.

본 발명의 FactorG α 서브 유닛의 유래로서는, 리뮐루스 폴리페무스 유래의 것이 바람직하다.

배열 번호 2 또는 배열 번호 4로 나타나는 아미노산 배열과 실질적으로 동일한 아미노산 배열로서는, 배열 번호 2 또는 배열 번호 4로 나타나는 아미노산 배열과 약 80% 이상, 바람직하게는 약 90% 이상, 보다 바람직하게는 약 95% 이상, 더 바람직하게는 약 97% 이상의 상동성을 가지며, BG에 결합하는 성질을 갖는 단백질의, 아미노산 배열을 들 수 있다.

또, 배열 번호 2 또는 배열 번호 4로 나타나는 아미노산 배열과 실질적으로 동일한 아미노산 배열로서는, 배열 번호 2 또는 배열 번호 4로 나타나는 아미노산 배열에 있어서, 1~5개, 바람직하게는 1~3개, 보다 바람직하게는 1~2개, 더 바람직하게는 1개의 아미노산이 치환, 결실, 삽입, 혹은 부가된 아미노산 배열을 들 수 있다. 치환, 결실, 삽입, 혹은 부가는, 하나의 아미노산 배열의 1개소 또는 복수의 개소에 동시에 일어나고 있어도 된다. 배열 번호 2 또는 배열 번호 4로 나타나는 아미노산 배열에 치환, 결실, 삽입, 부가 등을 부여하는 위치 및 수는, 그 아미노산 배열을 갖는 단백질이 상기한 FactorG α 서브 유닛의 성질을 갖는 것인 한, 임의이다.

본 발명의 FactorG α 서브 유닛의 바람직한 구체예로서는, 배열 번호 2 또는 배열 번호 4로 나타나는 아미노산 배열을 함유하는 FactorG α 서브 유닛 단백질을 들 수 있다.

배열 번호 2로 나타나는 아미노산 배열을 함유하는 FactorG α 서브 유닛 단백질이 보다 바람직하다.

본 발명의 FactorG α 서브 유닛은, 그 N 말단 또는 C 말단에 His 태그, FLAG 태그, Hat 태그, SUMO 태그 등의 공지의 태그 펩타이드나, 이른바 스페이서가 연결되어 있어도 된다. 또, 그 N 말단에 아미노산 1~수 개, 예를 들면 1~3개 정도의, 시그널 펩타이드의 단편을 갖고 있어도 된다.

배열 번호 2로 나타나는 아미노산 배열과 동일 또는 실질적으로 동일한 아미노산 배열을 함유하는 단백질을, 이하 "FactorG α 서브 유닛 A", 또는 간단히 "α 서브 유닛 A"라고 약기하는 경우가 있다.

배열 번호 4로 나타나는 아미노산 배열과 동일 또는 실질적으로 동일한 아미노산 배열을 함유하는 단백질을, 이하 "FactorG α 서브 유닛 B" 또는 간단히 "α 서브 유닛 B"라고 약기하는 경우가 있다.

간단히 "FactorG α 서브 유닛"이라고 기재한 경우에는, "FactorG α 서브 유닛 A"와 "FactorG α 서브 유닛 B"의 양방을 포함하는 본 발명의 FactorG α 서브 유닛의 총칭을 의미한다.

또, 간단히 "FactorG α 서브 유닛의 아미노산 배열"이라고 기재한 경우는, 상기한 "배열 번호 2 또는 배열 번호 4로 나타나는 아미노산 배열과 동일 혹은 실질적으로 동일한 아미노산 배열"의 총칭을 의미한다.

3. 본 발명의 FactorG β 서브 유닛

본 발명의 FactorG β 서브 유닛은, 배열 번호 6, 8, 10, 12, 14, 및 16 중 어느 하나로 나타나는 아미노산 배열과 동일 혹은 실질적으로 동일한 아미노산 배열을 함유하는 단백질이다.

본 발명의 FactorG β 서브 유닛은, 세린프로테아제의 도메인을 갖지만, 효소 활성은 없고, 상기한 본 발명의 FactorG α 서브 유닛과의 헤테로 다이머를 형성한 경우에 프로테아제 활성을 발휘한다.

본 발명의 FactorG β 서브 유닛의 유래로서는, 리뮐루스 폴리페무스 유래의 것이 바람직하다.

배열 번호 6, 8, 10, 12, 14, 및 16 중 어느 하나로 나타나는 아미노산 배열과 실질적으로 동일한 아미노산 배열로서는, 배열 번호 6, 8, 10, 12, 14, 또는 16 중 어느 하나로 나타나는 아미노산 배열과 약 80% 이상, 바람직하게는 약 90% 이상, 보다 바람직하게는 약 95% 이상, 더 바람직하게는 약 97% 이상의 상동성을 가지며, 상기한 FactorG β 서브 유닛의 성질을 갖는 단백질의, 아미노산 배열을 들 수 있다.

또, 배열 번호 6, 8, 10, 12, 14, 및 16 중 어느 하나로 나타나는 아미노산 배열과 실질적으로 동일한 아미노산 배열로서는, 배열 번호 6, 8, 10, 12, 14, 또는 16 중 어느 하나로 나타나는 아미노산 배열에 있어서, 1~5개, 바람직하게는 1~3개, 보다 바람직하게는 1~2개, 더 바람직하게는 1개의 아미노산이 치환, 결실, 삽입, 혹은 부가된 아미노산 배열을 들 수 있다. 치환, 결실, 삽입, 혹은 부가는, 하나의 아미노산 배열의 1개소 또는 복수의 개소에 동시에 일어나고 있어도 된다. 배열 번호 6, 8, 10, 12, 14, 및 16 중 어느 하나로 나타나는 아미노산 배열에 치환, 결실, 삽입, 부가 등을 부여하는 위치 및 수는, 그 아미노산 배열을 갖는 단백질이 상기한 FactorG β 서브 유닛의 성질을 갖는 것인 한, 임의이다.

본 발명의 FactorG β 서브 유닛의 바람직한 구체예로서는, 배열 번호 6, 8, 10, 12, 14, 및 16 중 어느 하나로 나타나는 아미노산 배열을 함유하는 FactorG β 서브 유닛 단백질을 들 수 있다.

배열 번호 6, 8, 또는 10 중 어느 하나로 나타나는 아미노산 배열을 함유하는 FactorG β 서브 유닛 단백질이 보다 바람직하다.

배열 번호 6 또는 8로 나타나는 아미노산 배열을 함유하는 FactorG β 서브 유닛 단백질이 더 바람직하다.

본 발명의 FactorG β 서브 유닛은, 그 N 말단 또는 C 말단에 His 태그, FLAG 태그, Hat 태그, SUMO 태그 등의 공지의 태그 펩타이드나, 이른바 스페이서가 연결되어 있어도 된다. 또, 그 N 말단에 아미노산 1~수 개, 예를 들면 1~3개 정도의, 시그널 펩타이드의 단편을 갖고 있어도 된다.

본 발명의 배열 번호 6, 8, 10, 12, 14, 및 16 중 어느 하나로 나타나는 아미노산 배열과 동일 혹은 실질적으로 동일한 아미노산 배열을 함유하는 단백질을, 각각 하기와 같이 명명한다.

·배열 번호 6으로 나타나는 아미노산 배열과 동일 또는 실질적으로 동일한 아미노산 배열을 함유하는 본 발명의 FactorG β 서브 유닛: FactorG β 서브 유닛 βi2,

·배열 번호 8로 나타나는 아미노산 배열과 동일 또는 실질적으로 동일한 아미노산 배열을 함유하는 본 발명의 FactorG β 서브 유닛: FactorG β 서브 유닛 βi3,

·배열 번호 10으로 나타나는 아미노산 배열과 동일 또는 실질적으로 동일한 아미노산 배열을 함유하는 본 발명의 FactorG β 서브 유닛: FactorG β 서브 유닛 β2,

·배열 번호 12로 나타나는 아미노산 배열과 동일 또는 실질적으로 동일한 아미노산 배열을 함유하는 본 발명의 FactorG β 서브 유닛: FactorG β 서브 유닛 β5,

·배열 번호 14로 나타나는 아미노산 배열과 동일 또는 실질적으로 동일한 아미노산 배열을 함유하는 본 발명의 FactorG β 서브 유닛: FactorG β 서브 유닛 βC1,

·배열 번호 16으로 나타나는 아미노산 배열과 동일 또는 실질적으로 동일한 아미노산 배열을 함유하는 본 발명의 FactorG β 서브 유닛: FactorG β 서브 유닛 βC2.

"FactorG β 서브 유닛 βi2"를 "β 서브 유닛 βi2", "FactorG β 서브 유닛 βi3"을 "β 서브 유닛 βi3", "FactorG β 서브 유닛 β2"를 "β 서브 유닛 β2", "FactorG β 서브 유닛 β5"를 "β 서브 유닛 β5", "FactorG β 서브 유닛 βC1"을 "β 서브 유닛 βC1", "FactorG β 서브 유닛 βC2"를 "β 서브 유닛 βC2"라고, 각각 약기하는 경우가 있다.

또, 간단히 "FactorG β 서브 유닛의 아미노산 배열"이라고 기재한 경우는, 상기한 "배열 번호 6, 8, 10, 12, 14, 및 16 중 어느 하나로 나타나는 아미노산 배열과 동일 혹은 실질적으로 동일한 아미노산 배열"의 총칭을 의미한다.

4. 본 발명의 헤테로 다이머

본 발명의 헤테로 다이머는, "배열 번호 2 또는 배열 번호 4로 나타나는 아미노산 배열과 동일 혹은 실질적으로 동일한 아미노산 배열을 함유하는 FactorG α 서브 유닛과, 배열 번호 6, 8, 10, 12, 14, 또는 16 중 어느 하나로 나타나는 아미노산 배열과 동일 혹은 실질적으로 동일한 아미노산 배열을 함유하는 FactorG β 서브 유닛의 조합의 헤테로 다이머"이다.

바꾸어 말하면, 본 발명의 헤테로 다이머는, "배열 번호 2 또는 배열 번호 4로 나타나는 아미노산 배열과 동일 혹은 실질적으로 동일한 아미노산 배열을 함유하는 FactorG α 서브 유닛과, 배열 번호 6, 8, 10, 12, 14, 또는 16 중 어느 하나로 나타나는 아미노산 배열과 동일 혹은 실질적으로 동일한 아미노산 배열을 함유하는 FactorG β 서브 유닛으로 이루어지는 헤테로 다이머"이다.

"배열 번호 2 또는 배열 번호 4로 나타나는 아미노산 배열과 동일 혹은 실질적으로 동일한 아미노산 배열을 함유하는 FactorG α 서브 유닛", 및 "배열 번호 6, 8, 10, 12, 14, 또는 16 중 어느 하나로 나타나는 아미노산 배열과 동일 혹은 실질적으로 동일한 아미노산 배열을 함유하는 FactorG β 서브 유닛"의 구체예는, 상기한 "2. 본 발명의 FactorG α 서브 유닛"의 항, 및 "3. 본 발명의 FactorG β 서브 유닛"의 항에서 설명한 바와 같다.

본 발명의 헤테로 다이머는, BG의 존재하에서 프로테아제 활성을 갖는다.

본 발명의 헤테로 다이머를 구성하는 FactorG α 서브 유닛과 FactorG β 서브 유닛의 조합의 구체예를 하기 표 1에 나타낸다.

[표 1]

본 발명의 헤테로 다이머의 바람직한 FactorG α 서브 유닛과 FactorG β 서브 유닛의 조합으로서는, 상기 표 1의 조합 번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 또는 12의 조합을 들 수 있다.

상기 표 1의 조합 번호 1, 2, 4, 5, 9, 또는 12의 조합이, 보다 바람직하다.

상기 표 1의 조합 번호 1, 2, 또는 9의 조합이, 더 바람직하다.

상기 표 1의 조합 번호 1 또는 2의 조합이, 특히 바람직하다.

본 발명의 헤테로 다이머를 구성하는 FactorG α 서브 유닛 및 FactorG β 서브 유닛은, 그 N 말단 또는 C 말단에 His 태그, FLAG 태그, Hat 태그, SUMO 태그 등의 공지의 태그 펩타이드나, 이른바 스페이서가 결합하고 있어도 된다. 또, 헤테로 다이머를 구성하는 FactorG α 서브 유닛 및 FactorG β 서브 유닛은, 그 N 말단에 아미노산 1~수 개, 예를 들면 1~3개 정도의, 시그널 펩타이드의 단편을 갖고 있어도 된다.

5. 본 발명에 관한 핵산 분자

(1) 본 발명의 FactorG α 서브 유닛을 코드하는 핵산 분자

본 발명의 FactorG α 서브 유닛을 코드하는 핵산 분자로서는, 배열 번호 2 또는 배열 번호 4로 나타나는 아미노산 배열과 동일 혹은 실질적으로 동일한 아미노산 배열을 코드하는 염기 배열을 함유하는 핵산 분자를 들 수 있다. "배열 번호 2 또는 배열 번호 4로 나타나는 아미노산 배열과 동일 혹은 실질적으로 동일한 아미노산 배열"의 구체예는, 상기한 "2. 본 발명의 FactorG α 서브 유닛"의 항에서 설명한 바와 같다.

본 발명의 FactorG α 서브 유닛을 코드하는 핵산 분자의 구체예로서는, 예를 들면 하기 (i) 및 (ii)를 들 수 있다.

(i) 배열 번호 1 또는 배열 번호 3으로 나타나는 염기 배열과 동일 혹은 실질적으로 동일한 염기 배열을 함유하는 핵산 분자

배열 번호 1로 나타나는 염기 배열과 동일 또는 실질적으로 동일한 염기 배열을 함유하는 핵산 분자는, 배열 번호 2로 나타나는 아미노산 배열과 동일 혹은 실질적으로 동일한 아미노산 배열을 코드한다.

배열 번호 3으로 나타나는 염기 배열과 동일 또는 실질적으로 동일한 염기 배열을 함유하는 핵산 분자는, 배열 번호 4로 나타나는 아미노산 배열과 동일 혹은 실질적으로 동일한 아미노산 배열을 코드한다.

"배열 번호 1 또는 배열 번호 3으로 나타나는 염기 배열과 실질적으로 동일한 염기 배열을 함유하는 핵산 분자"의 염기 배열로서는, 배열 번호 1 또는 배열 번호 3으로 나타나는 염기 배열과 약 80% 이상, 바람직하게는 약 90% 이상, 보다 바람직하게는 약 95% 이상, 더 바람직하게는 약 97% 이상의 상동성을 갖는 염기 배열을 들 수 있다.

또, "배열 번호 1 또는 배열 번호 3으로 나타나는 염기 배열과 실질적으로 동일한 염기 배열을 함유하는 핵산 분자"의 염기 배열로서는, 배열 번호 1 또는 배열 번호 3으로 나타나는 염기 배열에 있어서, 1~5개, 바람직하게는 1~3개, 보다 바람직하게는 1~2개, 더 바람직하게는 1개의 염기가 치환, 결실, 삽입, 혹은 부가된 염기 배열을 들 수 있다. 치환, 결실, 삽입, 혹은 부가는, 하나의 염기 배열의 1개소 또는 복수의 개소에 동시에 일어나고 있어도 된다.

상기 핵산 분자 중, 배열 번호 1 또는 배열 번호 3으로 나타나는 염기 배열을 함유하는 핵산 분자가 바람직하고, 배열 번호 1로 나타나는 염기 배열을 함유하는 핵산 분자가 보다 바람직하다.

배열 번호 1 또는 배열 번호 3으로 나타나는 염기 배열과 동일 혹은 실질적으로 동일한 염기 배열을 함유하는 핵산 분자는, 이른바 시그널 펩타이드를 코드하는 염기 배열을 부가하고 있어도 된다. 이후의 본 명세서에 기재되는 시그널 펩타이드 및 그것을 코드하는 염기 배열은, 특별히 한정되지 않는다.

"시그널 펩타이드를 코드하는 염기 배열을 부가한 본 발명의 FactorG α 서브 유닛"을 코드하는 핵산 분자의 구체예로서는, 예를 들면 배열 번호 17 또는 배열 번호 19로 나타나는 염기 배열과 동일 혹은 실질적으로 동일한 염기 배열을 함유하는 핵산 분자를 들 수 있다.

"배열 번호 17 또는 배열 번호 19로 나타나는 염기 배열과 실질적으로 동일한 염기 배열을 함유하는 핵산 분자"의 염기 배열로서는, 배열 번호 17 또는 배열 번호 19로 나타나는 염기 배열과 약 80% 이상, 바람직하게는 약 90% 이상, 보다 바람직하게는 약 95% 이상, 더 바람직하게는 약 97% 이상의 상동성을 갖는 염기 배열을 들 수 있다.

또, "배열 번호 17 또는 배열 번호 19로 나타나는 염기 배열과 실질적으로 동일한 염기 배열을 함유하는 핵산 분자"의 염기 배열로서는, 배열 번호 17 또는 배열 번호 19로 나타나는 염기 배열에 있어서, 1~5개, 바람직하게는 1~3개, 보다 바람직하게는 1~2개, 더 바람직하게는 1개의 염기가 치환, 결실, 삽입, 혹은 부가된 염기 배열을 들 수 있다. 치환, 결실, 삽입, 혹은 부가는, 하나의 염기 배열의 1개소 또는 복수의 개소에 동시에 일어나고 있어도 된다.

상기 핵산 분자 중, 배열 번호 17 또는 배열 번호 19로 나타나는 염기 배열을 함유하는 핵산 분자가 바람직하고, 배열 번호 17로 나타나는 염기 배열을 함유하는 핵산 분자가 보다 바람직하다.

(ii) 배열 번호 2 또는 배열 번호 4로 나타나는 아미노산 배열과 동일 혹은 실질적으로 동일한 아미노산 배열을 코드하는 염기 배열을 함유하는 핵산 분자이며, 또한 배열 번호 2 또는 배열 번호 4로 나타나는 아미노산 배열과 동일 혹은 실질적으로 동일한 아미노산 배열을 함유하는 단백질을 유전자 공학적 수법으로 발현시키는 경우에 있어서, 이 핵산 분자를 발현시키는 숙주 세포의 종류에 맞추어 최적화된 염기 배열을 함유하는, 핵산 분자.

상기 핵산 분자 중, 배열 번호 2 또는 배열 번호 4로 나타나는 아미노산 배열을 코드하는 염기 배열을 함유하는 핵산 분자이며, 또한 배열 번호 2 또는 배열 번호 4로 나타나는 아미노산 배열을 함유하는 단백질을 유전자 공학적 수법으로 발현시키는 경우에 있어서, 이 핵산 분자를 발현시키는 숙주 세포의 종류에 맞추어 최적화된 염기 배열을 함유하는, 핵산 분자가 보다 바람직하다.

배열 번호 2로 나타나는 아미노산 배열을 코드하는 염기 배열을 함유하는 핵산 분자이며, 또한 배열 번호 2로 나타나는 아미노산 배열을 함유하는 단백질을 유전자 공학적 수법으로 발현시키는 경우에 있어서, 이 핵산 분자를 발현시키는 숙주 세포의 종류에 맞추어 최적화된 염기 배열을 함유하는, 핵산 분자가 더 바람직하다.

예를 들면, 곤충 세포를 숙주로서 이용하여, 이 배열 번호 2 또는 배열 번호 4로 나타나는 아미노산 배열과 동일 혹은 실질적으로 동일한 아미노산 배열을 코드하는 염기 배열을 함유하는 핵산 분자를 발현시키기 위하여 최적화된 염기 배열로서는, 예를 들면 배열 번호 33 또는 배열 번호 34로 나타나는 염기 배열과 동일 혹은 실질적으로 동일한 염기 배열을 함유하는 핵산 분자를 들 수 있다.

"배열 번호 33 또는 배열 번호 34로 나타나는 염기 배열과 실질적으로 동일한 염기 배열을 함유하는 핵산 분자"의 염기 배열로서는, 배열 번호 33 또는 배열 번호 34로 나타나는 염기 배열과 약 80% 이상, 바람직하게는 약 90% 이상, 보다 바람직하게는 약 95% 이상, 더 바람직하게는 약 97% 이상의 상동성을 갖는 염기 배열을 들 수 있다.

또, "배열 번호 33 또는 배열 번호 34로 나타나는 염기 배열과 실질적으로 동일한 염기 배열을 함유하는 핵산 분자"의 염기 배열로서는, 배열 번호 33 또는 배열 번호 34로 나타나는 염기 배열에 있어서, 1~5개, 바람직하게는 1~3개, 보다 바람직하게는 1~2개, 더 바람직하게는 1개의 염기가 치환, 결실, 삽입, 혹은 부가된 염기 배열을 들 수 있다. 치환, 결실, 삽입, 혹은 부가는, 하나의 염기 배열의 1개소 또는 복수의 개소에 동시에 일어나고 있어도 된다.

상기 핵산 분자 중, 배열 번호 33 또는 배열 번호 34로 나타나는 염기 배열을 함유하는 핵산 분자가 바람직하고, 배열 번호 33으로 나타나는 염기 배열을 함유하는 핵산 분자가 특히 바람직하다.

배열 번호 33 또는 배열 번호 34로 나타나는 염기 배열과 동일 혹은 실질적으로 동일한 염기 배열을 함유하는 핵산 분자는, 이른바 시그널 펩타이드를 코드하는 염기 배열을 부가하고 있어도 된다. 그와 같은 핵산 분자의 구체예로서는, 배열 번호 41 또는 배열 번호 42로 나타나는 염기 배열과 동일 혹은 실질적으로 동일한 염기 배열을 함유하는 핵산 분자를 들 수 있다.

"배열 번호 41 또는 배열 번호 42로 나타나는 염기 배열과 실질적으로 동일한 염기 배열을 함유하는 핵산 분자"의 염기 배열로서는, 배열 번호 41 또는 배열 번호 42로 나타나는 염기 배열과 약 80% 이상, 바람직하게는 약 90% 이상, 보다 바람직하게는 약 95% 이상, 더 바람직하게는 약 97% 이상의 상동성을 갖는 염기 배열을 들 수 있다.

또, "배열 번호 41 또는 배열 번호 42로 나타나는 염기 배열과 실질적으로 동일한 염기 배열을 함유하는 핵산 분자"의 염기 배열로서는, 배열 번호 41 또는 배열 번호 42로 나타나는 염기 배열에 있어서, 1~5개, 바람직하게는 1~3개, 보다 바람직하게는 1~2개, 더 바람직하게는 1개의 염기가 치환, 결실, 삽입, 혹은 부가된 염기 배열을 들 수 있다. 치환, 결실, 삽입, 혹은 부가는, 하나의 염기 배열의 1개소 또는 복수의 개소에 동시에 일어나고 있어도 된다.

상기 핵산 분자 중, 배열 번호 41 또는 배열 번호 42로 나타나는 염기 배열을 함유하는 핵산 분자가 바람직하다. 배열 번호 41로 나타나는 염기 배열을 함유하는 핵산 분자가 보다 바람직하다.

본 발명의 FactorG α 서브 유닛을 코드하는 핵산 분자는, cDNA 등의 DNA, 또는 RNA여도 된다.

또, 본 발명의 FactorG α 서브 유닛을 코드하는 핵산 분자는 1개쇄여도 되고 2개쇄여도 된다. 2개쇄의 경우에는, 예를 들면 배열 번호 1, 3, 17, 18, 33, 34, 41, 또는 42로 나타나는 염기 배열과 그 상보쇄로 이루어지는 것 등이다.

또, 본 발명의 FactorG α 서브 유닛을 코드하는 핵산 분자는, 그 5'말단 또는 3'말단에 His 태그, FLAG 태그, Hat 태그, SUMO 태그 등의 공지의 태그 펩타이드나 이른바 스페이서를 코드하는 염기 배열이 연결되어 있어도 된다. 또 그 5'말단에 시그널 펩타이드를 코드하는 염기 배열이 연결되어 있어도 된다.

본 발명에 관한 "본 발명의 FactorG α 서브 유닛을 코드하는 핵산 분자"의 바람직한 구체예로서는, 배열 번호 1, 3, 17, 19, 33, 34, 41, 또는 42 중 어느 하나로 나타나는 염기 배열을 함유하는 핵산 분자를 들 수 있다.

상기 핵산 분자 중, 배열 번호 1, 17, 33, 또는 41 중 어느 하나로 나타나는 염기 배열을 함유하는 핵산 분자가 바람직하다.

상기한 본 발명의 FactorG α 서브 유닛을 코드하는 핵산 분자를 정리하여, 이하 "핵산 분자 α"라고 약기하는 경우가 있다.

(2) 본 발명의 FactorG β 서브 유닛을 코드하는 핵산 분자

본 발명의 FactorG β 서브 유닛을 코드하는 핵산 분자로서는, 배열 번호 6, 8, 10, 12, 14, 또는 16 중 어느 하나로 나타나는 아미노산 배열과 동일 혹은 실질적으로 동일한 아미노산 배열을 코드하는 염기 배열을 함유하는 핵산 분자를 들 수 있다. "배열 번호 6, 8, 10, 12, 14, 또는 16 중 어느 하나로 나타나는 아미노산 배열과 동일 혹은 실질적으로 동일한 아미노산 배열"의 구체예는, 상기한 "3. 본 발명의 FactorG β 서브 유닛"의 항에서 설명한 바와 같다.

본 발명의 FactorG β 서브 유닛을 코드하는 핵산 분자의 구체예로서는, 예를 들면 하기 (i) 및 (ii)를 들 수 있다.

(i) 배열 번호 5, 7, 9, 11, 13, 또는 15 중 어느 하나로 나타나는 염기 배열과 동일 혹은 실질적으로 동일한 염기 배열을 함유하는 핵산 분자

배열 번호 5로 나타나는 염기 배열과 동일 또는 실질적으로 동일한 염기 배열을 함유하는 핵산 분자는, 배열 번호 6으로 나타나는 아미노산 배열과 동일 혹은 실질적으로 동일한 아미노산 배열을 코드한다. FactorG β 서브 유닛 βi2의 아미노산 배열을 코드한다.

배열 번호 7로 나타나는 염기 배열과 동일 또는 실질적으로 동일한 염기 배열을 함유하는 핵산 분자는, 배열 번호 8로 나타나는 아미노산 배열과 동일 혹은 실질적으로 동일한 아미노산 배열을 코드한다. FactorG β 서브 유닛 βi3의 아미노산 배열을 코드한다.

배열 번호 9로 나타나는 염기 배열과 동일 또는 실질적으로 동일한 염기 배열을 함유하는 핵산 분자는, 배열 번호 10으로 나타나는 아미노산 배열과 동일 혹은 실질적으로 동일한 아미노산 배열을 코드한다. FactorG β 서브 유닛 β2의 아미노산 배열을 코드한다.

배열 번호 11로 나타나는 염기 배열과 동일 또는 실질적으로 동일한 염기 배열을 함유하는 핵산 분자는, 배열 번호 12로 나타나는 아미노산 배열과 동일 혹은 실질적으로 동일한 아미노산 배열을 코드하는 핵산 분자이다. FactorG β 서브 유닛 β5의 아미노산 배열을 코드한다.

배열 번호 13으로 나타나는 염기 배열과 동일 또는 실질적으로 동일한 염기 배열을 함유하는 핵산 분자는, 배열 번호 14로 나타나는 아미노산 배열과 동일 혹은 실질적으로 동일한 아미노산 배열을 코드한다. FactorG β 서브 유닛 βC1의 아미노산 배열을 코드한다.

배열 번호 15로 나타나는 염기 배열과 동일 또는 실질적으로 동일한 염기 배열을 함유하는 핵산 분자는, 배열 번호 16으로 나타나는 아미노산 배열과 동일 혹은 실질적으로 동일한 아미노산 배열을 코드한다. FactorG β 서브 유닛 βC2의 아미노산 배열을 코드한다.

"배열 번호 5, 7, 9, 11, 13, 또는 15 중 어느 하나로 나타나는 염기 배열과 실질적으로 동일한 염기 배열을 함유하는 핵산 분자"의 염기 배열로서는, 배열 번호 5, 7, 9, 11, 13, 또는 15 중 어느 하나로 나타나는 염기 배열과 약 80% 이상, 바람직하게는 약 90% 이상, 보다 바람직하게는 약 95% 이상, 더 바람직하게는 약 97% 이상의 상동성을 갖는 염기 배열을 들 수 있다.

또, "배열 번호 5, 7, 9, 11, 13, 또는 15 중 어느 하나로 나타나는 염기 배열과 실질적으로 동일한 염기 배열을 함유하는 핵산 분자"의 염기 배열로서는, 배열 번호 5, 7, 9, 11, 13, 또는 15 중 어느 하나로 나타나는 염기 배열에 있어서, 1~5개, 바람직하게는 1~3개, 보다 바람직하게는 1~2개, 더 바람직하게는 1개의 염기가 치환, 결실, 삽입, 혹은 부가된 염기 배열을 들 수 있다. 치환, 결실, 삽입, 혹은 부가는, 하나의 염기 배열의 1개소 또는 복수의 개소에 동시에 일어나고 있어도 된다.

상기 핵산 분자 중에서도, 배열 번호 5, 7, 9, 11, 13, 또는 15 중 어느 하나로 나타나는 염기 배열을 함유하는 핵산 분자가 바람직하고, 배열 번호 5, 7, 또는 9 중 어느 하나로 나타나는 염기 배열을 함유하는 핵산 분자가 보다 바람직하며, 배열 번호 5 또는 7로 나타나는 염기 배열을 함유하는 핵산 분자가 더 바람직하다.

배열 번호 5, 7, 9, 11, 13, 또는 15 중 어느 하나로 나타나는 염기 배열과 동일 혹은 실질적으로 동일한 염기 배열을 함유하는 핵산 분자는, 이른바 시그널 펩타이드를 코드하는 염기 배열을 부가하고 있어도 된다. "시그널 펩타이드를 코드하는 염기 배열을 부가한 본 발명의 FactorG β 서브 유닛"을 코드하는 핵산 분자의 구체예로서는, 배열 번호 21, 23, 25, 27, 29, 또는 31 중 어느 하나로 나타나는 염기 배열과 동일 혹은 실질적으로 동일한 염기 배열을 함유하는 핵산 분자를 들 수 있다.

"배열 번호 21, 23, 25, 27, 29, 또는 31 중 어느 하나로 나타나는 염기 배열과 실질적으로 동일한 염기 배열을 함유하는 핵산 분자"의 염기 배열로서는, 배열 번호 21, 23, 25, 27, 29, 또는 31 중 어느 하나로 나타나는 염기 배열과 약 80% 이상, 바람직하게는 약 90% 이상, 보다 바람직하게는 약 95% 이상, 더 바람직하게는 약 97% 이상의 상동성을 갖는 염기 배열을 들 수 있다.

또, "배열 번호 21, 23, 25, 27, 29, 또는 31 중 어느 하나로 나타나는 염기 배열과 실질적으로 동일한 염기 배열을 함유하는 핵산 분자"의 염기 배열로서는, 배열 번호 21, 23, 25, 27, 29, 또는 31 중 어느 하나로 나타나는 염기 배열에 있어서, 1~5개, 바람직하게는 1~3개, 보다 바람직하게는 1~2개, 더 바람직하게는 1개의 염기가 치환, 결실, 삽입, 혹은 부가된 염기 배열을 들 수 있다. 치환, 결실, 삽입, 혹은 부가는, 하나의 염기 배열의 1개소 또는 복수의 개소에 동시에 일어나고 있어도 된다.

상기 핵산 분자 중에서도, 배열 번호 21, 23, 25, 27, 29, 또는 31 중 어느 하나로 나타나는 염기 배열을 함유하는 핵산 분자가 바람직하고, 배열 번호 21, 23, 또는 25 중 어느 하나로 나타나는 염기 배열을 함유하는 핵산 분자가 보다 바람직하며, 배열 번호 21 또는 23으로 나타나는 염기 배열을 함유하는 핵산 분자가 더 바람직하다.

(ii) 배열 번호 6, 8, 10, 12, 14, 또는 16 중 어느 하나로 나타나는 아미노산 배열과 동일 혹은 실질적으로 동일한 아미노산 배열을 코드하는 염기 배열을 함유하는 핵산 분자이며, 또한 배열 번호 6, 8, 10, 12, 14, 또는 16 중 어느 하나로 나타나는 아미노산 배열과 동일 혹은 실질적으로 동일한 아미노산 배열을 함유하는 단백질을 유전자 공학적 수법으로 발현시키는 경우에 있어서, 이 핵산 분자를 발현시키는 세포의 종류에 맞추어 최적화된 염기 배열을 갖는, 핵산 분자

상기 핵산 분자 중, 배열 번호 6, 8, 10, 12, 14, 또는 16 중 어느 하나로 나타나는 아미노산 배열을 코드하는 염기 배열을 함유하는 핵산 분자이며, 또한 배열 번호 6, 8, 10, 12, 14, 또는 16 중 어느 하나로 나타나는 아미노산 배열을 함유하는 단백질을 유전자 공학적 수법으로 발현시키는 경우에 있어서, 이 핵산 분자를 발현시키는 세포의 종류에 맞추어 최적화된 염기 배열을 갖는, 핵산 분자가 바람직하다.

배열 번호 6, 8, 또는 10 중 어느 하나로 나타나는 아미노산 배열을 코드하는 염기 배열을 함유하는 핵산 분자이며, 또한 배열 번호 6, 8, 또는 10 중 어느 하나로 나타나는 아미노산 배열을 함유하는 단백질을 유전자 공학적 수법으로 발현시키는 경우에 있어서, 이 핵산 분자를 발현시키는 세포의 종류에 맞추어 최적화된 염기 배열을 갖는, 핵산 분자가 보다 바람직하다.

배열 번호 6 또는 8로 나타나는 아미노산 배열을 코드하는 염기 배열을 함유하는 핵산 분자이며, 또한 배열 번호 6 또는 8로 나타나는 아미노산 배열을 함유하는 단백질을 유전자 공학적 수법으로 발현시키는 경우에 있어서, 이 핵산 분자를 발현시키는 세포의 종류에 맞추어 최적화된 염기 배열을 갖는, 핵산 분자가 더 바람직하다.

예를 들면, 곤충 세포를 숙주로서 이용하여, 이 6, 8, 10, 12, 14, 또는 16 중 어느 하나로 나타나는 아미노산 배열과 동일 혹은 실질적으로 동일한 아미노산 배열을 코드하는 염기 배열을 함유하는 핵산 분자를 발현시키기 위하여 최적화된 염기 배열로서는, 배열 번호 35~40, 또는 69 중 어느 하나로 나타나는 염기 배열과 동일 또는 실질적으로 동일한 염기 배열을 함유하는 핵산 분자를 들 수 있다.

"배열 번호 35~40, 또는 69 중 어느 하나로 나타나는 염기 배열과 실질적으로 동일한 염기 배열을 함유하는 핵산 분자"의 염기 배열로서는, 배열 번호 35~40, 또는 69 중 어느 하나로 나타나는 염기 배열과 약 80% 이상, 바람직하게는 약 90% 이상, 보다 바람직하게는 약 95% 이상, 더 바람직하게는 약 97% 이상의 상동성을 갖는 염기 배열을 들 수 있다.

또, "배열 번호 35~40, 또는 69 중 어느 하나로 나타나는 염기 배열과 실질적으로 동일한 염기 배열을 함유하는 핵산 분자"의 염기 배열로서는, 배열 번호 35~40, 또는 69 중 어느 하나로 나타나는 염기 배열에 있어서, 1~5개, 바람직하게는 1~3개, 보다 바람직하게는 1~2개, 더 바람직하게는 1개의 염기가 치환, 결실, 삽입, 혹은 부가된 염기 배열을 들 수 있다. 치환, 결실, 삽입, 혹은 부가는, 하나의 염기 배열의 1개소 또는 복수의 개소에 동시에 일어나고 있어도 된다.

상기 핵산 분자 중, 배열 번호 35~40, 또는 69 중 어느 하나로 나타나는 염기 배열을 함유하는 핵산 분자가 바람직하고, 배열 번호 35, 36, 37, 또는 69 중 어느 하나로 나타나는 염기 배열을 함유하는 핵산 분자가 보다 바람직하며, 배열 번호 35, 36, 또는 69 중 어느 하나로 나타나는 염기 배열을 함유하는 핵산 분자가 더 바람직하다.

배열 번호 35~40 중 어느 하나로 나타나는 염기 배열과 동일 또는 실질적으로 동일한 염기 배열을 함유하는 핵산 분자는, 이른바 시그널 펩타이드를 코드하는 염기 배열을 부가하고 있어도 된다. 그와 같은 핵산 분자의 예로서는, 배열 번호 43~48 중 어느 하나로 나타나는 염기 배열과 실질적으로 동일한 염기 배열을 함유하는 핵산 분자를 들 수 있다. 또, 하기에 기재하는 시그널 펩타이드와 태그 배열을 갖는 배열 번호 68로 나타나는 염기 배열과 실질적으로 동일한 염기 배열을 함유하는 핵산 분자를 들 수 있다.

"배열 번호 43~48, 또는 68 중 어느 하나로 나타나는 염기 배열과 실질적으로 동일한 염기 배열을 함유하는 핵산 분자"의 염기 배열로서는, 배열 번호 43~48, 또는 68 중 어느 하나로 나타나는 염기 배열과 약 80% 이상, 바람직하게는 약 90% 이상, 보다 바람직하게는 약 95% 이상, 더 바람직하게는 약 97% 이상의 상동성을 갖는 염기 배열을 들 수 있다.

또, "배열 번호 43~48, 또는 68 중 어느 하나로 나타나는 염기 배열과 실질적으로 동일한 염기 배열을 함유하는 핵산 분자"의 염기 배열로서는, 배열 번호 43~48, 또는 68 중 어느 하나로 나타나는 염기 배열에 있어서, 1~5개, 바람직하게는 1~3개, 보다 바람직하게는 1~2개, 더 바람직하게는 1개의 염기가 치환, 결실, 삽입, 혹은 부가된 염기 배열을 들 수 있다. 치환, 결실, 삽입, 혹은 부가는, 하나의 염기 배열의 1개소 또는 복수의 개소에 동시에 일어나고 있어도 된다.

상기 핵산 분자 중, 배열 번호 43~48, 또는 68 중 어느 하나로 나타나는 염기 배열을 함유하는 핵산 분자가 바람직하고, 배열 번호 43, 44, 45, 또는 68 중 어느 하나로 나타나는 염기 배열을 함유하는 핵산 분자가 보다 바람직하며, 배열 번호 43 또는 44로 나타나는 염기 배열을 함유하는 핵산 분자가 더 바람직하다.

본 발명의 FactorG β 서브 유닛을 코드하는 핵산 분자는, cDNA 등의 DNA, 또는 RNA여도 된다.

또, 본 발명의 FactorG β 서브 유닛을 코드하는 핵산 분자는 1개쇄여도 되고 2개쇄여도 된다. 2개쇄의 경우에는, 예를 들면 배열 번호 5, 7, 9, 11, 13, 15, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 35~40, 43~48, 68, 또는 69로 나타나는 염기 배열과 그 상보쇄로 이루어지는 것 등이다.

또, 본 발명의 FactorG β 서브 유닛을 코드하는 핵산 분자는, 그 5'말단 측 또는 3'말단에 His 태그, FLAG 태그, Hat 태그, SUMO 태그 등의 공지의 태그 펩타이드나 이른바 스페이서를 코드하는 염기 배열이 연결되어 있어도 된다. 또 그 5'말단에 시그널 펩타이드를 코드하는 염기 배열이 연결되어 있어도 된다.

본 발명에 관한 "본 발명의 FactorG β 서브 유닛을 코드하는 핵산 분자"의 바람직한 구체예로서는, 배열 번호 5, 7, 9, 11, 13, 15, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 35~40, 43~48, 68, 또는 69 중 어느 하나로 나타나는 염기 배열을 함유하는 핵산 분자를 들 수 있다.

배열 번호 5, 7, 9, 21, 23, 25, 35, 36, 37, 43, 44, 45, 68, 또는 69 중 어느 하나로 나타나는 염기 배열을 함유하는 핵산 분자가 바람직하다.

배열 번호 5, 7, 21, 23, 35, 36, 43, 44, 68, 또는 69 중 어느 하나로 나타나는 염기 배열을 함유하는 핵산 분자가 보다 바람직하다.

상기한 본 발명의 FactorG β 서브 유닛을 코드하는 핵산 분자를 정리하여, 이하 "핵산 분자 β"라고 약기하는 경우가 있다.

(3) 본 발명에 관한 핵산 분자

또한, 상기 "핵산 분자 α" 및 "핵산 분자 β"를 정리하여 "본 발명에 관한 핵산 분자"라고 약기하는 경우가 있다.

또, 상기한 바와 같이, 본 발명에 관한 핵산 분자는, 그 5'말단 또는 3'말단에 His 태그, FLAG 태그, Hat 태그, SUMO 태그 등의 공지의 태그 펩타이드나 이른바 스페이서를 코드하는 염기 배열이 연결되어 있어도 된다.

예를 들면, 배열 번호 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31 중 어느 하나로 나타나는 염기 배열에 태그를 코드하는 염기 배열을 연결한 염기 배열을, 발현시키는 세포의 종류에 맞추어 최적화한 핵산 분자를 들 수 있다.

예를 들면, 5'말단 측으로부터 시그널 배열, Hat 태그, SUMO 태그, FactorG β 서브 유닛 i2(아미노산 배열: 배열 번호 6)의 순서로 배치한 아미노산 배열(배열 번호 67)을 설계하여, 이 아미노산 배열을 코드하고, 또한 곤충 세포용으로 최적화한 배열 번호 68로 나타나는 염기 배열을 갖는 핵산 분자를 들 수 있다. 배열 번호 68로 나타나는 염기 배열에 있어서, FactorG β 서브 유닛 i2를 코드하는 염기 배열은, 배열 번호 69로 나타나는 염기 배열이다.

본 발명에 관한 핵산 분자는, cDNA 등의 DNA, 또는 RNA여도 된다.

본 발명의 헤테로 다이머를 구성하는 본 발명의 FactorG α 서브 유닛과 FactorG β 서브 유닛의 조합을 코드하는, 핵산 분자 α와 핵산 분자 β의 조합으로서는, 예를 들면 하기 표 2에 기재된 것을 들 수 있다.

[표 2]

바람직한 (핵산 분자 α-핵산 분자 β)의 배열 번호의 조합으로서는, 상기 표 2의 조합 번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 20, 21, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 32, 33, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 44, 45, 48, 또는 49의 조합을 들 수 있다.

상기 표 2의 조합 번호 1, 2, 4, 5, 9, 12, 13, 14, 16, 17, 21, 24, 25, 26, 28, 29, 33, 36, 37, 38, 40, 41, 45, 48, 또는 49의 조합이 보다 바람직하다.

상기 표 2의 조합 번호 1, 2, 9, 13, 14, 21, 25, 26, 33, 37, 38, 45, 또는 49의 조합이 더 바람직하다.

상기 표 2의 조합 번호 1, 2, 13, 14, 25, 26, 37, 38, 또는 49의 조합이 특히 바람직하다.

6. 본 발명의 헤테로 다이머의 취득 방법

본 발명의 헤테로 다이머의 취득 방법으로서는, 예를 들면 하기의 3가지의 방법을 들 수 있다.

(1) 공발현에 의한 취득 방법

(2) α 서브 유닛과 β 서브 유닛을 각각 취득하고 나서 결합시킴으로써 취득하는 방법

(3) 화학 합성에 의한 취득 방법

그중에서도, 헤테로 다이머의 수율 등을 고려하면, "(1) 공발현에 의한 취득 방법"이 바람직하다.

(1) 공발현에 의한 취득 방법

본 발명의 헤테로 다이머는, "본 발명에 관한 핵산 분자(핵산 분자 α, 및 핵산 분자 β)를, 적당한 바이러스나 플라스미드 등의 발현 벡터에 도입하고, 적당한 숙주 세포를 그 재조합 발현 벡터를 이용한 통상의 방법에 의하여 형질 전환(또는 형질 도입)시킨다. 얻어진 형질 전환체(형질 도입체)를 배양하여, 본 발명의 FactorG α 서브 유닛과 본 발명의 FactorG β 서브 유닛을 공발현시켜, 본 발명의 헤테로 다이머를, 세포 외 또는 세포 내에 분비시킨다."라는 유전자 조작 기술을 이용한 주지의 방법으로, 얻을 수 있다.

상기 방법으로서는, 일반적인 곤충 세포, 포유 동물 세포, 효모균 등의 진핵 세포를 이용한 발현계, 또는 대장균과 같은 원핵 생물을 이용한 발현계를 이용하는 방법을 들 수 있다.

이하에, 공발현에 의한 본 발명의 헤테로 다이머를 얻는 방법의 일례로서, 버큘로 바이러스 곤충 세포의 발현계를 이용한 방법을 예로 들어 설명한다.

1) 본 발명에 관한 핵산 분자를 도입한 본 발명에 관한 재조합체의 조제

버큘로 바이러스 곤충 세포의 발현계를 이용한 본 발명에 관한 재조합체의 조제는, 통상 본 발명에 관한 핵산 분자(핵산 분자 α 또는 핵산 분자 β)를 일단 트랜스퍼 벡터에 도입한 후, 버큘로 바이러스 게놈 DNA와 함께, 숙주가 되는 곤충 세포에 코트랜스펙션함으로써 이루어진다.

본 법에 이용되는 핵산 분자 α, 및 핵산 분자 β의 구체예는, 상기한 "5. 본 발명에 관한 핵산 분자"의 항에 기재한 바와 같다.

본 법에 이용되는 핵산 분자 α의 바람직한 예로서는, 배열 번호 1, 3, 17, 19, 33, 34, 41, 또는 42 중 어느 하나로 나타나는 염기 배열을 함유하는 핵산 분자를 들 수 있다. 배열 번호 33, 34, 41, 또는 42 중 어느 하나로 나타나는 염기 배열을 함유하는 핵산 분자가 보다 바람직하다. 배열 번호 41, 또는 42로 나타나는 염기 배열을 함유하는 핵산 분자가 특히 바람직하다. 핵산 분자의 종류로서는, cDNA가 보다 바람직하다.

본 법에 이용되는 핵산 분자 β의 바람직한 예로서는, 배열 번호 5, 7, 9, 11, 13, 15, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 35~40, 43~48, 68, 또는 69 중 어느 하나로 나타나는 염기 배열을 함유하는 핵산 분자를 들 수 있다. 배열 번호 35~40, 43~48, 68, 또는 69 중 어느 하나로 나타나는 염기 배열을 함유하는 핵산 분자가 보다 바람직하다. 배열 번호 43~48, 또는 68 중 어느 하나로 나타나는 염기 배열을 함유하는 핵산 분자가 특히 바람직하다. 핵산 분자의 종류로서는, cDNA가 보다 바람직하다.

본 발명에 관한 핵산 분자(핵산 분자 α, 및 핵산 분자 β)를 얻는 방법으로서는, 특별히 한정되지 않지만, 자체 공지의 화학 합성법에 의하여 조제하는 방법이나, DNA의 합성에 통상 이용되고 있는, DNA 신디사이저를 이용하여, 통상의 포스포아미다이트법으로 올리고 뉴클레오타이드를 합성하고, 음이온 교환 칼럼 크로마토그래피를 이용하는 통상의 방법에 의하여 정제하는 방법으로, 목적으로 하는 본 발명에 관한 핵산 분자를 얻을 수 있다.

버큘로 바이러스 곤충 세포를 이용한 발현계에 이용되는 버큘로 바이러스로서는, 핵다각체병 바이러스(Nuclear Polyhedrosis Virus, NPV)가 바람직하다. 예를 들면, 밤나방과 곤충에 감염하는 바이러스인 아우토그라파·칼리포니카·뉴클레어·폴리헤드로시스·바이러스(Autographa californica nuclear polyhedrosis virus, AcNPV) 등을 들 수 있다.

숙주가 되는 곤충 세포로서는, S. 프루기페르다 유래의 expresSF+^TM(Protein Science사제), 스포돕테라 프루기페르다 유래의 Sf9, Sf21 등, 트리코플루시아니 유래의 High 5, BTI-TN-5B1-4(인비트로젼사제) 등을 들 수 있다.

트랜스퍼 벡터로서는, pIEx/Bac-1, pIEx/Bac-3(Novagen사제), pVL1392, pVL1393, pBlueBacIII(이상, 인비트로젼사제), pBacPAK9 등의, 곤충 세포용 벡터를 들 수 있다.

본 발명에 관한 핵산 분자를 도입한 트랜스퍼 벡터는, 예를 들면, 본 발명에 관한 핵산 분자(핵산 분자 α 또는/및 핵산 분자 β)로서 cDNA를 이용하여 그 cDNA를 상기와 같은 트랜스퍼 벡터에 도입함으로써 얻어진다. 당해 트랜스퍼 벡터의 취득은, 통상의 방법에 의하여 행하면 된다.

또한, 트랜스퍼 벡터에 도입하는 핵산 분자 α 또는 핵산 분자 β인 cDNA는, 목적에 따라, 그대로 제한 효소로 소화한 후, 또는 cDNA를 트랜스퍼 벡터에 도입하기 위한 링커를 부가한 후에 사용해도 된다.

또, 본 발명의 헤테로 다이머의 검출이나 정제를 용이하게 하기 위하여, 목적으로 하는 본 발명의 헤테로 다이머를, 다른 태그 펩타이드나 단백질 등의 공지의 마커와의, 융합 단백으로서 발현시켜도 된다. 융합시키는 태그 펩타이드로서는 FLAG 태그, 3XFLAG 태그, His 태그(His tag, 예를 들면 6×His 태그), Hat 태그, SUMO 태그 등, 단백질로서는 β-갈락토시다제(β-Gal), 녹색 형광 단백질(GFP), 말토스 결합 단백질(MBP) 등을 들 수 있다.

이 경우, 예를 들면, 핵산 분자 α 또는/및 핵산 분자 β의 염기 배열의 5'말단 측 또는 3'말단 측에 His 태그 유전자의 염기 배열을 연결시킨 배열을 갖는 cDNA를 이용하여, 본 발명의 헤테로 다이머를 발현시키면 된다. 구체적으로는, 예를 들면, 트랜스퍼 벡터에, 그와 같은 배열을 갖는 cDNA를 도입해 두면 된다. 그렇다면, 본 발명의 헤테로 다이머는, His 태그 단백질과의 융합 단백질로서 발현된다. 따라서, 이 His 태그의 발현을 확인함으로써, 본 발명의 헤테로 다이머의 발현을 용이하게 확인할 수 있다.

본 발명에 관한 재조합체의 조제에 있어서, 핵산 분자를 도입한 트랜스퍼 벡터와 버큘로 바이러스 게놈 DNA를 함께, 숙주인 곤충 세포에 코트랜스펙션시키는 경우, 통상은, ScreenFect^TMA plus(후지필름 와코 준야쿠(주)제) 등의 트랜스펙션 시약을 이용하여 코트랜스펙션을 행하면 된다. 예를 들면 히트 쇼크법, 인산 칼슘법(일본 공개특허공보 평2-227075호), 리포펙션법(Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 84, 7413, 1987) 등의 통상의 방법에 의하여 코트랜스펙션을 행해도 된다.

코트랜스펙션으로부터 3~10일 후에 배양 상등을 회수하고, 한계 희석법, 플라크법 등의 통상의 방법에 의하여 재조합 버큘로 바이러스를 선택하여 순화한다.

이상의 방법으로, 목적으로 하는 핵산 분자 α의 염기 배열이 도입된 재조합 버큘로 바이러스, 또는 핵산 분자 β의 염기 배열이 도입된 재조합 버큘로 바이러스(본 발명에 관한 재조합체)가 얻어진다.

2) 숙주 세포의 트랜스펙션에 의한 본 발명에 관한 형질 전환체의 조제

상기에서 얻어진 재조합 버큘로 바이러스(본 발명에 관한 재조합체)를, 이하의 방법으로 숙주가 되는 곤충 세포에 트랜스펙션시킨다.

즉, 핵산 분자 α가 도입된 재조합 버큘로 바이러스와 핵산 분자 β가 도입된 재조합 버큘로 바이러스를, 숙주 세포의 배지에 더한다. 핵산 분자 α가 도입된 재조합 버큘로 바이러스를, volume of infection(이하, VOI라고 약기한다.)=1/400~1/200, 핵산 분자 β가 도입된 재조합 버큘로 바이러스를, VOI=1/200~1/100의 비율로 더하고, FactorG β 서브 유닛의 발현량에 대하여 FactorG α 서브 유닛의 발현량을 억제하는 것이 바람직하다. 이 경우, 다중 감염도(Multiplicity of Infection, 이하 MOI라고 약기한다)로 환산하면, 대체로 FactorG α 서브 유닛:FactorG β 서브 유닛=0.4~0.8:0.9~1.8의 비율이 된다.

이상의 방법으로, 본 발명에 관한 재조합체인 재조합 버큘로 바이러스로 트랜스펙션시킨, 본 발명에 관한 형질 전환체인 숙주 세포가 얻어진다.

또, 버큘로 바이러스를 이용하지 않는 하기 방법으로도, 본 발명에 관한 형질 전환체를 얻을 수 있다.

먼저, 본 발명에 관한 핵산 분자 α 또는 핵산 분자 β를, 예를 들면 통상의 방법에 따라 벡터 DNA에 도입한다. 이른바 발현 벡터가 유용하다.

발현 벡터로서는, 원핵 세포 및/또는 진핵 세포의 각종 숙주 세포 중에서 복제 유지 또는 자기 증식할 수 있는 것이며, 또한 본 발명의 폴리뉴클레오타이드를 발현하여, 생산하는 기능을 갖는 것이면 특별히 제한되지 않는다. 플라스미드 벡터, 파지 벡터 등이 포함된다.

이러한 벡터로서, 구체적으로는, 곤충 세포 발현계에서 이용되는 플라스미드로서 예를 들면 pIZT/V5-His, pIB/V5-His(Termo Fisher Scientific사), pIEx 및 pIEx Bac 시리즈(예를 들면 pIEx-Bac-1, Merck Millipore사), 대장균(Escherichia coli.) 유래의 플라스미드로서 예를 들면 pUC119(다카라 슈조사제), pQE-TRI 플라스미드(Qiagen사제), pBluescript II KS+(Stratagene사제), pBR322(다카라 슈조사제), pGEM, pGEX, pUC, pBS, pET, pGEM-3 ZpMAL 등이, 효모 유래 플라스미드로서 예를 들면 pB42AD, pESP, pESC 등이, 고초균 유래 플라스미드로서 예를 들면 pHT926, pTB51, pHY481 등을 들 수 있다. 포유 동물 세포 유래 플라스미드로서는 pCAT3, pcDNA3.1, pCMV, pCAG 등을 들 수 있다.

또, 파지(phage)로서는, λENBL3(Stratagene사제), λDASHII(후나코시사제), λgt10, λgt11(모두 도요 보세키(주)제) 등의 λ파지 등의 박테리오파지, Charomid DNA(와코 준야쿠 고교(주)제), Lorist6(와코 준야쿠 고교(주)제) 등의 코스미드 벡터 등을 들 수 있다.

본 발명에 관한 핵산 분자를 도입한 재조합 발현 벡터는, 상기한 벡터 등에, 본 발명에 관한 핵산 분자를 통상의 방법에 의하여 도입함으로써 조제할 수 있다. 그와 같은 벡터로서는, 핵산 분자 α, 핵산 분자 β, 또는 핵산 분자 α와 핵산 분자 β를 도입한 벡터를 들 수 있다.

본 발명에 관한 형질 전환체는, 상술한 재조합 발현 벡터 등을 숙주 세포에 도입함으로써 조제할 수 있다. 그와 같은 형질 전환체로서는, 핵산 분자 α, 핵산 분자 β, 또는 핵산 분자 α와 핵산 분자 β를 도입한 형질 전환체를 들 수 있다.

3) 숙주 세포의 배양

본 발명의 헤테로 다이머는, 상기 방법에서 얻어진 트랜스펙션된 숙주 세포(본 발명에 관한 형질 전환체)를, 그 숙주 세포에 따른 적절한 배지 중에서 배양하여, 배양물 중에 본 발명의 FactorG α 서브 유닛과 본 발명의 FactorG β 서브 유닛을 공발현시켜, 얻어진 본 발명의 헤테로 다이머를 그 배양물로부터 분리·정제함으로써 제조할 수 있다.

트랜스펙션된 숙주 세포의 배양은 당 분야에 있어서 알려져 있는 방법에 의하여 행하면 된다. 배양 조건, 예를 들면 온도, 배지의 pH 및 발효 시간은, 본 발명의 헤테로 다이머의 최고 역가가 얻어지도록 적절히 설정하면 된다.

숙주가 곤충 세포인 경우, 배지로서는, 예를 들면 PSFM-J1 배지(후지필름 와코 준야쿠(주)제), TNM-FH 배지, Grace's InsectMedium 배지〔Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., (1985) 82, 8404〕, Sf-100 II SFM 배지(라이프·테크놀로지스사제), ExCell400, ExCell405(모두 JRH 바이오 사이언시즈사제) 등을 들 수 있다. 그 pH는 5~8인 것이 바람직하다.

또한, 혈청에 포함되는 BG의 혼입을 방지하기 위하여, 배지에는 소 태아 혈청(FCS) 등을 첨가하지 않는 무혈청 배지를 이용하는 것이 바람직하다.

또, 하기에 기재하는 본 발명의 FactorG α 서브 유닛을 이용하는 BG의 제거 방법으로, 혼재하는 BG를 제거한 배지를 이용해도 된다.

트랜스펙션시킨 숙주 세포의 배양은, 통상 20~40℃, 바람직하게는 25~30℃, 약 12시간~10일간 행한다. 필요에 따라 통기, 교반, 선회 배양을 행해도 된다.

여기에서, 목적의 핵산 분자 α 및 핵산 분자 β를 도입한 형질 전환체가 얻어진 것은, 예를 들면 마커로서 His 태그 배열을 연결시키고 있는 경우에는, 항His 항체를 이용한 ELISA 등에 의하여 확인할 수 있다.

4) 본 발명의 헤테로 다이머의 조제

본 발명의 헤테로 다이머는, 상기 배양에 의하여 얻어지는 배양물로부터, 이하와 같이 하여 취득할 수 있다.

즉, 본 발명의 헤테로 다이머가 형질 전환체의 세포질 외로 분비되는 경우는, 상기 "3) 숙주 세포의 배양"에서 얻어진 본 발명에 관한 형질 전환체의 배양물을, 여과 또는 원심 분리 등의 통상의 방법에 의하여 세포를 제외하고, 배양 여과액 또는 배양 상등을 얻는다. 이어서 당해 배양 여과액 또는 배양 상등으로부터, 천연 또는 합성 단백질을 분리 및 정제하기 위하여 일반적으로 이용되는 통상의 방법에 따라 본 발명의 헤테로 다이머를 분리하여 정제한다.

또, 본 발명의 헤테로 다이머가, 형질 전환체의 페리플라즘 또는 세포질 내에 존재하는 경우는, 상기 3)에서 얻어진 본 발명에 관한 형질 전환체의 배양물을, 여과 또는 원심 분리 등의 통상의 방법에 제공하여 균체 혹은 세포를 모아, 적당한 완충액에 현탁하고, 예를 들면 계면활성제 처리, 초음파 처리, 라이소자임 처리, 동결 융해 등의 방법으로 세포 등의 세포벽 및/또는 세포막을 파괴한 후, 원심 분리나 여과 등의 방법으로 본 발명의 헤테로 다이머를 함유하는 조(粗)추출액을 얻는다. 그리고, 당해 조추출액으로부터, 천연 또는 합성 단백질을 분리 및 정제하기 위하여 일반적으로 이용되는 통상의 방법에 따라 본 발명의 헤테로 다이머를 분리하여 정제한다.

또, 상기한 바와 같은 His tag 유전자 태그 펩타이드 등의 마커를 코드하는 배열을 본 발명의 핵산 분자와 연결시킨 cDNA를 이용한 경우에는, 그 마커에 따른 공지의 방법으로, 발현된 단백질을 분리하여, 상기한 방법으로 정제할 수 있다.

본 발명의 헤테로 다이머의 분리·정제 방법으로서는, 공지의 염석, 용매 침전법 등의 용해도를 이용하는 방법, 투석, 한외 여과, 젤 여과 크로마토그래피, 도데실 황산 나트륨-폴리아크릴아마이드 젤 전기 영동 등의 분자량의 차를 이용하는 방법, 이온 교환 크로마토그래피 등의 하전을 이용하는 방법, 어피니티 크로마토그래피 등의 특이적 친화성을 이용하는 방법, 역상(逆相) 고속 액체 크로마토그래피 등의 소수성의 차를 이용하는 방법, 등전점 전기 영동 등의 등전점의 차를 이용하는 방법 등을 들 수 있다.

(2) α 서브 유닛과 β 서브 유닛을 각각 취득하고 나서 결합시킴으로써 취득하는 방법

본 발명의 헤테로 다이머의 다른 취득 방법으로서는, "본 발명의 FactorG α 서브 유닛, 및 본 발명의 FactorG β 서브 유닛을 각각 얻는다. 이어서, 얻어진 본 발명의 FactorG α 서브 유닛과 본 발명의 FactorG β 서브 유닛을 결합시킨다."는 방법을 들 수 있다.

1) 본 발명의 FactorG α 서브 유닛(본 발명의 FactorG α 서브 유닛 A, 본 발명의 FactorG α 서브 유닛 B)의 취득

본 발명의 FactorG α 서브 유닛은, 예를 들면 이하와 같은 방법으로 취득할 수 있다.

본 발명에 관한 핵산 분자 α를 이용하여, 상기 "6. (1) 공발현에 의한 취득 방법"의 "1) 본 발명에 관한 핵산 분자를 도입한 본 발명에 관한 재조합체의 조제"에 기재된 방법으로, 핵산 분자 α(시그널 펩타이드나 His 태그 배열 등의 마커를 코드하는 염기 배열을 포함하고 있어도 된다)를 도입한 재조합 버큘로 바이러스를 얻는다.

이어서, 이 재조합 버큘로 바이러스를 숙주가 되는 곤충 세포에 트랜스펙션시킨다. 트랜스펙션시킨 숙주 세포를 배양하여, 배양액을 원심 등 처리하여 상등을 회수한다. 곤충 세포의 트랜스펙션 및 배양 방법의 상세는, 상기한 "6. 2)~3)"에 기재한 바와 같다.

회수한 상등으로부터, 통상의 방법에 의하여 단백질을 분리 및 정제하여, 본 발명의 FactorG α 서브 유닛을 얻는다. 예를 들면, 본 발명에 관한 핵산 분자 α의 염기 배열에 His 태그 배열 등의 마커를 코드하는 염기 배열을 연결하고 있는 경우, 발현된 단백질은 His 태그 배열이 연결되어 있다. 따라서, 항His-Tag 항체를 이용하는 통상의 방법으로 어피니티 정제를 행하여, 배양 상등으로부터 단백질(FactorG α 서브 유닛)을 정제할 수 있다.

본 법에 이용되는 핵산 분자 α의 바람직한 예로서는, 배열 번호 1, 3, 17, 19, 33, 34, 41, 또는 42 중 어느 하나로 나타나는 염기 배열을 함유하는 핵산 분자를 들 수 있다. 배열 번호 33, 34, 41, 또는 42 중 어느 하나로 나타나는 염기 배열을 함유하는 핵산 분자가 보다 바람직하다. 배열 번호 41, 또는 42로 나타나는 염기 배열을 함유하는 핵산 분자가 특히 바람직하다. 핵산 분자의 종류로서는, cDNA가 보다 바람직하다.

2) 본 발명의 FactorG β 서브 유닛(βi2, βi3, β2, β5, βC1, 또는 βC2)의 취득

본 발명의 FactorG β 서브 유닛은, 예를 들면 이하와 같은 방법으로 취득할 수 있다.

본 발명에 관한 핵산 분자 β를 이용하여 상기 "6. (1) 공발현에 의한 취득 방법"의 "1) 본 발명에 관한 핵산 분자를 도입한 본 발명에 관한 재조합체의 조제"에 기재된 방법으로, 핵산 분자 β(시그널 펩타이드나 His 태그 배열 등의 마커를 코드하는 염기 배열을 포함하고 있어도 된다)를 도입한 재조합 버큘로 바이러스를 얻는다.

이어서, 이 재조합 버큘로 바이러스를 숙주가 되는 곤충 세포에 트랜스펙션시킨다. 트랜스펙션시킨 숙주 세포를 배양하여, 배양액을 원심 등 처리하여 상등을 회수한다. 곤충 세포의 트랜스펙션 및 배양 방법의 상세는, 상기한 "6. 2)~3)"에 기재한 바와 같다.

회수한 상등으로부터, 통상의 방법에 의하여 단백질을 분리 및 정제하여, 본 발명의 FactorG β 서브 유닛을 얻는다. 예를 들면, 본 발명에 관한 핵산 분자 β의 염기 배열에 His 태그 배열 등의 마커를 코드하는 염기 배열을 연결하고 있는 경우, 발현된 단백질은 His 태그 배열이 연결되어 있다. 따라서, 항His-Tag 항체를 이용하는 통상의 방법으로 취득하여, 어피니티 정제를 행하고, 배양 상등으로부터 단백질(FactorG β 서브 유닛)을 정제할 수 있다.

본 법에 이용되는 핵산 분자 β의 바람직한 예로서는, 배열 번호 5, 7, 9, 11, 13, 15, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 35~40, 43~48, 68, 또는 69 중 어느 하나로 나타나는 염기 배열을 함유하는 핵산 분자를 들 수 있다. 배열 번호 35~40, 43~48, 68, 또는 69 중 어느 하나로 나타나는 염기 배열을 함유하는 핵산 분자가 보다 바람직하다. 배열 번호 43~48, 또는 68 중 어느 하나로 나타나는 염기 배열을 함유하는 핵산 분자가 특히 바람직하다. 핵산 분자의 종류로서는, cDNA가 보다 바람직하다.

3) 헤테로 다이머의 취득

이어서, 정제한 FactorG α 서브 유닛 A와 FactorG βi2서브 유닛을, 각각 BG 프리의 10mM MOPS 완충액에 용해시킨 후, 각각 등몰이 되도록 혼합하여, 교반하에 수시간~하룻밤 반응시킴으로써, 본 발명의 헤테로 다이머를 얻을 수 있다.

상기 방법에 이용되는 FactorG α 서브 유닛 및 FactorG β 서브 유닛을 용해시키는 용매로서는, 주사용 증류수 등의 물, 예를 들면 pH 5.0~10.0, 바람직하게는 pH 6.0~8.5의 중성 부근에 완충 작용을 갖는, 예를 들면 인산 완충액, 트리스 완충액, 굿 완충액, 글라이신 완충액, 붕산 완충액, MOPS 완충액 등을 들 수 있다. 또, 이들 완충액 중의 완충제 농도로서는, 통상 10~500mM, 바람직하게는 10~300mM의 범위로부터 적절히 선택된다.

(3) 화학 합성에 의한 취득 방법

또, 본 발명의 헤테로 다이머는, 그 아미노산 배열에 따라, 일반적인 화학 합성법에 의하여 제조할 수 있다. 예를 들면, 플루오렌일메틸옥시카보닐법(Fmoc법), t-뷰틸옥시카보닐법(tBoc법) 등의 통상의 화학 합성법에 의하여, 본 발명의 헤테로 다이머를 얻을 수 있다. 또, 시판 중인 펩타이드 합성기를 이용하여 화학 합성할 수도 있다.

7. BG의 측정 방법

본 발명의 헤테로 다이머를 이용하여 BG를 측정하는 방법으로서는, 이른바 합성 기질법을 들 수 있다.

합성 기질법에서는, 먼저, BG를 함유하는 시료와, 본 발명의 헤테로 다이머와, 합성 펩타이드 기질을 반응시킨다. BG가 본 발명의 헤테로 다이머를 활성화시켜, 활성화한 헤테로 다이머가, 그 프로테아제 활성에 의하여 프로클로팅 엔자임(Proclotting enzyme)을 클로팅 엔자임(Clotting enzyme)으로 활성화시킨다. 클로팅 엔자임은 그 효소 활성에 의하여 합성 펩타이드 기질을 가수분해하고, 합성 펩타이드 기질로부터 발색기가 유리되어, 발색을 발생한다. 발생한 발색을 비색 정량함으로써, 시료 중의 BG양을 산출한다.

본 발명에 관한 BG의 측정 방법에 이용되는 본 발명의 헤테로 다이머의 구체예, 취득 방법, 및 그 바람직한 예는, 상기 "1."~"6."에 기재한 바와 같다.

본 발명에 관한 BG의 측정 방법에 이용되는 합성 펩타이드 기질로서는, 예를 들면 C 말단에 p-나이트로아닐린(pNA)과 같은 발색기를 결합시킨 합성 펩타이드 기질이며, 클로팅 엔자임의 효소 작용에 의하여 절단시켜 발색을 발생하는 것을 들 수 있다. 합성 펩타이드 기질은 화학 합성해도 되지만, 각종 시판되고 있으므로, 그것을 이용하면 된다.

구체적으로는, 예를 들면, Boc-Leu-Gly-Arg-pNA, Boc-Glu-Gly-Arg-pNA, Ac-Ile-Glu-Gly-Arg-pNA, Boc-Thr-Gly-Arg-pNA 등을 들 수 있다.

합성 기질법의 측정 장치로서는, 예를 들면 마이크로 플레이트 리더나 분광 광도계가 이용된다.

본 발명에 관한 BG의 측정 방법의 구체예는, 이하와 같다.

즉, BG를 함유하는 시료 10~50μL(BG를 0.1pg~1μg 함유)를, 본 발명의 헤테로 다이머를 함유하는 용액 20~100μL(본 발명의 헤테로 다이머를 0.1ng~0.1mg 함유), 프로클로팅 엔자임, 및 Boc-Thr-Gly-Arg-pNA 등의 합성 펩타이드 기질 1μM~10mM와 4~40℃에서 3분~300분간 반응시킨다. 그 후, 반응액의 예를 들면 405nm(측정 파장)와 492nm(부파장)에 있어서의 흡광도를 측정한다. 얻어진 측정값을, 미리 농도가 이미 알려진 BG 용액에 대하여 상기와 동일한 시약을 이용하고 동일한 조작을 행하여 얻은, 측정값과 BG양의 관계를 나타내는 검량선에 적용시킴으로써, 시료 중의 BG양을 구할 수 있다.

본 발명에 관한 BG의 측정 방법에 이용되는 시료로서는, 예를 들면 혈액, 혈청, 혈장, 요(尿), 림프, 골수액, 흉수, 복수 등의 임상 검체, 의약품, 의료 용구, 식품 등을 들 수 있지만 이들에 한정되지 않는다.

또한, 본 발명에 관한 BG의 측정은, 용수법(用手法) 또는 자동 분석 장치를 이용한 측정계로 실시할 수 있다. 용수법 또는 자동 분석 장치를 이용하여 측정을 행하는 경우의 시약류 등의 조합 등에 대해서는, 특별히 제약은 없고, 적용하는 자동 분석 장치의 환경, 기종에 맞추어, 혹은, 다른 요인을 고려하여 가장 양호하다고 생각되는 시약류 등의 조합을 적절히 선택하여 이용하면 된다.

8. 본 발명의 β-글루칸 측정용 키트

본 발명의 β-글루칸 측정용 키트로서는, 배열 번호 2 또는 배열 번호 4로 나타나는 아미노산 배열과 동일 혹은 실질적으로 동일한 아미노산 배열을 함유하는 FactorG α 서브 유닛과, 배열 번호 6, 8, 10, 12, 14, 또는 16 중 어느 하나로 나타나는 아미노산 배열과 동일 혹은 실질적으로 동일한 아미노산 배열을 함유하는 FactorG β 서브 유닛의 조합의 헤테로 다이머를 포함하는 것을 들 수 있다.

당해 키트 중의 본 발명의 헤테로 다이머는, 물이나 완충액에 용해시킨 용액이어도 되고, 동결 건조품이어도 상관없다. 본 발명의 헤테로 다이머를 용해시키는 용매로서는, 주사용 증류수, 예를 들면 pH 5.0~10.0, 바람직하게는 pH 6.5~8.5의 중성 부근에 완충 작용을 갖는, 예를 들면 인산 완충액, 트리스 완충액, 굿 완충액, 글라이신 완충액, 붕산 완충액, MOPS 완충액 등이 바람직하다. 또, 이들 완충액 중의 완충제 농도로서는, 통상 10~500mM, 바람직하게는 10~300mM의 범위로부터 적절히 선택된다.

또, 본 발명의 β-글루칸 측정용 키트에는, 프로클로팅 엔자임, 및/또는 상기한 합성 펩타이드 기질을 구성 시약으로서 포함하고 있어도 된다. 그 구체예는 상기한 바와 같다.

또, 본 발명의 β-글루칸 측정용 키트의 구성 시약에는, 완충제나 알칼리 토류 금속염 등 이 분야에서 통상 이용되는 그 외의 적당한 시약류가 더 포함되어 있어도 되고, 이들 시약류는 이른바 생화학 반응 등에서 사용되는 것 중에서 적절히 선택하여 이용하면 된다.

또, 본 발명의 β-글루칸 측정용 키트는, 검량선 작성용의 표준 BG를 조합한 키트로 해도 된다. 그 표준 BG는, 후지필름 와코 준야쿠(주) 등에 의하여 제조된 시판 중인 BG의 표준품을 이용해도 되고, 일본 공개특허공보 평08-075751호에 기재된 방법에 따라 제조된 것을 이용해도 상관없다. 또, 이들 시약 키트에 있어서의 시약류는 동결 건조품이어도 된다.

9. BG의 제거 방법

BG를 함유하는 시료를, 본 발명의 FactorG α 서브 유닛(α 서브 유닛 A, 또는 α 서브 유닛 B)과 접촉시켜 처리함으로써, 시료로부터 BG를 제거할 수 있다.

본 법에 이용되는 본 발명의 FactorG α 서브 유닛의 구체예는, 상기 "2. 본 발명의 FactorG α 서브 유닛"의 항에서 설명한 바와 같다.

FactorG α 서브 유닛 B가 보다 바람직하다.

구체적인 처리 방법으로서는, BG를 함유하는 시료와 본 발명의 FactorG α 서브 유닛을 담지한 불용성 담체를 혼합하는 방법, 본 발명의 FactorG α 서브 유닛을 담지한 충전제를 충전한 칼럼에, BG를 함유하는 시료를 통액하는 방법 등을 들 수 있다. 또, 칼럼법으로서는, 일반적인 액체 크로마토그래피법에 준하여 행해지는 방법을 들 수 있다.

BG를 함유하는 시료로서 세포나 세균 등의 배양용 배지를 이용하는 경우에는, "BG를 함유하는 시료와 본 발명의 FactorG α 서브 유닛을 담지한 불용성 담체를 혼합하는 방법"이 바람직하다.

"BG를 함유하는 시료와 본 발명의 FactorG α 서브 유닛을 담지한 불용성 담체를 혼합하는 방법"을 예로 들어, 이하에 의하여 구체적으로 설명한다.

먼저, 시료를 본 발명의 FactorG α 서브 유닛을 담지한 불용성 담체와 혼합하여, 바람직하게는 진탕한다. 또는, 시료를, 본 발명의 FactorG α 서브 유닛을 담지한 불용성 담체를 현탁시킨 용매와, 바람직하게는 교반시키면서 혼합한다. 그 후, 시료와 본 발명의 FactorG α 서브 유닛을 담지한 불용성 담체를 분리하면, 시료로부터 BG를 제거할 수 있다.

당해 처리를 행하는 경우의 FactorG α 서브 유닛을 담지한 불용성 담체의 양은, 많을수록 시료 중의 협잡물을 충분히 제거할 수 있지만, 너무 많아도 낭비이며, 경제적이지 않다. 그 때문에, 경제적인 양을 고려하면, 예를 들면, FactorG α 서브 유닛을 담지한 불용성 담체와 시료의 사용량비는, 1:1000~1:3, 바람직하게는 1:10~1:3 정도이면 된다. 또한, 그 비율은, 중량비(W/W), 용량비(V/V), 용량/중량비(V/W) 중 어느 것이어도 된다.

또, 시료와 FactorG α 서브 유닛을 담지한 불용성 담체를 접촉시키는 시간은, 시료 중의 BG가 FactorG α 서브 유닛과 결합하는 데 충분한 시간이면 되고, 예를 들면 5분~1일, 바람직하게는 1~8시간이다.

시료와 FactorG α 서브 유닛을 담지한 불용성 담체를 분리하기 위해서는, 예를 들면 여과, 디캔트 등의 적당한 방법을 이용하면 된다.

상기 방법에 이용되는, 본 발명의 FactorG α 서브 유닛을 고정화하는 불용성 담체로서는, 세파로스, 폴리스타이렌, 폴리프로필렌, 폴리아크릴산, 폴리메타크릴산, 폴리아크릴아마이드, 폴리글리시딜메타크릴레이트, 폴리 염화 바이닐, 폴리에틸렌, 폴리클로로카보네이트, 실리콘 수지, 실리콘 고무 등의 합성 고분자 화합물, 예를 들면 다공성 유리, 불투명 유리, 세라믹스, 알루미나, 실리카 젤, 활성탄, 금속 산화물 등의 무기 물질 등을 들 수 있다. 세파로스 등이 바람직하다.

또, 불용성 담체의 형태로서는, 비즈, 미립자, 라텍스 입자 등의 형태의 것을 들 수 있지만, 비즈상의 것이 사용하기 쉽기 때문에 바람직하다. 또, 그 입경은 특별히 한정되지 않는다.

시판 중인 세파로스 비즈로서는, 예를 들면, CNBr-activated Sepharose 4B(GE 헬스케어사제) 등을 들 수 있다.

불용성 담체에 FactorG α 서브 유닛을 고정화시키는 방법으로서는, FactorG α 서브 유닛과 불용성 담체를 접촉시킴으로써 이루어지면 되고, 특별히 한정되지 않는다.

또, 시판 중인 불용성 담체를 이용하는 경우에는, 그 취급 설명서에서 추천되고 있는 고정화 방법에 의하여, FactorG α 서브 유닛을 불용성 담체에 고정화시키면 된다.

FactorG α 서브 유닛을 불용성 담체에 담지하는 방법은, 구체적으로는 예를 들면, 본 발명의 FactorG α 서브 유닛을 통상 0.1μg/mL~20mg/mL, 바람직하게는 1μg/mL~5mg/mL의 범위에서 포함하는 용액과, 전처리한 CNBr-activated Sepharose 4B(GE 헬스케어사제) 0.05~2g을 함유하는 용액을 접촉시켜, 적당한 온도로 소정 시간, 바람직하게는 전도 혼화하면서 반응시킴으로써 이루어진다. 미반응 활성기를 비활성화하기 위하여, 새로운 용매에 재현탁시켜 인큐베이션하는 처리를 더 행해도 된다.

곤충 세포용 배지에는 통상 효모 추출액이 포함되어 있기 때문에, BG 오염되어 있다. 또, 통상의 재조합 단백질 발현용의 동물 세포용 배지, 예를 들면, FreeStyle^TM 293 Expression Medium이나 FreeStyle^TM CHO Expression Medium도, BG로 오염되어 있는 것이 알려져 있다. 본 발명에 관한 BG의 제거 방법에 의하면 이들 배지로부터 BG를 제거하여, BG의 오염을 제거할 수 있다.

또, 본 발명에 관한 BG의 제거 방법에 의하면, 배지 중에 공존하는, FactorG를 이용한 BG의 측정의 저해 인자를 제거할 수 있다.

또한 본 발명에 관한 BG의 제거 방법은, 배지의 BG 오염을 제거할 수 있을 뿐만 아니라, 이하의 용도에서도 응용할 수 있다.

즉, 예를 들면 배양 세포 등을 이용한 실험에 있어서, 배양 세포가 BG의 영향을 받기 쉬운 성질의 것일 때, 사용 시약의 BG의 오염을 배제하기 위하여 이용할 수 있다.

본 발명의 BG 제거용 키트로서는, 배열 번호 2 또는 배열 번호 4로 나타나는 아미노산 배열과 동일 혹은 실질적으로 동일한 아미노산 배열을 함유하는 FactorG α 서브 유닛을 포함하는 것을 들 수 있고, 상기 제거 방법에 이용할 수 있다.

이하에 실시예를 들어 본 발명을 더 상세하게 설명하지만, 본 발명은 이들 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.

실시예

실시예 1. 본 발명의 헤테로 다이머의 취득-1

<1. 차세대 시퀀서를 이용한 투구게 유래 FactorG RNA의 해석>

이하, "차세대 시퀀서, Next Generation Sequencer"를 "NGS"라고 약기한다.

또한, 여기에서 말하는 NGS는, 차세대 시퀀서 기기 자체뿐만 아니라, 차세대 시퀀서를 이용하여 행해지는, 샘플 조제로부터 수백만의 시퀀싱 반응이 병행하여 실행됨으로써 배열 결정의 처리량이 증대한 시퀀싱 수법, 그 후의 PC상에서 행해지는 배열 해석을 포함하는 시스템 전반도 나타낸다.

1-1. Total RNA의 회수

RNA 추출용 시약 ISOGEN(후지필름 와코 준야쿠(주)제)을 이용하여, 그 제품 부속의 프로토콜에 따라, 하기와 같은 방법으로, 리뮐루스속 투구게 혈구 세포로부터 total RNA를 회수했다.

먼저, 유발 내에서 리뮐루스속 투구게(Limulus polyphemus, 미국산) 혈구 세포를 액체 질소로 동결 후, 갈아 으깨, 파쇄했다. 거기에 ISOGEN(후지필름 와코 준야쿠(주)제)을 더하여, 파쇄물을 현탁시켜, RNA를 추출시켰다.

얻어진 추출액을 튜브로 옮겨, 실온에서 5분간 인큐베이트한 후, 40%(v/v)가 되도록 클로로폼을 첨가했다. 이어서 15초간 교반하고, 실온에서 3분간 더 인큐베이트했다. 그 후, 추출액을, 4℃, 12000 x g으로 15분간 원심 분리한 후, 수상(水相)을 새로운 튜브로 옮겼다. 다음으로, 3.5mL의 아이소프로판올을 첨가·교반 후, 실온에서 10분간 인큐베이트했다. 이어서, 추출액을 4℃, 12000 x g으로 10분간 원심 분리하여, 침전물을 얻었다. 얻어진 침전물을 7mL의 70% 에탄올로 세정하고, 건조하여, RNA 침전물을 얻었다. 얻어진 RNA 침전물을, 70μL 멸균수에 용해했다. 얻어진 RNA 수용액의 흡광도를 측정하고, 얻어진 total RNA의 농도를 측정했다. total RNA의 농도는 919.8ng/μL이며, 리뮐루스속 투구게 혈구 세포로부터 64μg의 total RNA가 얻어졌다.

1-2. NGS에 의한 FactorG 서브 유닛을 코드하는 DNA 배열의 확인

상기 1-1에서 얻어진 리뮐루스속 투구게의 혈구 세포 유래 Total RNA를 이용하고, TruSeq Stranded mRNA sample Prep kit(일루미나(주)제)를 이용하여, Kit에 기재된 설명서에 따라, 시퀀스 라이브러리를 제작했다. 제작한 시퀀스 라이브러리를, 차세대 시퀸서인 HiSeq 2500을 이용한 분석에 제공했다.

HiSeq 2500을 이용한 분석에 의하여 얻어진 시퀀스 데이터로부터 어댑터 배열과 퀄리티값이 낮은 염기를 트림 처리한 후, Trinity 소프트웨어를 이용한 통상의 방법에 의하여 어셈블을 행했다. 그 후, 어셈블 처리에서 얻어진 콘티그 배열의 ORF의 예측을 행하여, 라이브러리의 시퀀스가 코드하는 아미노산 배열을 결정했다.

이어서, 상기 어셈블에서 얻어진 아미노산 배열과, 타키프레우스속 FactorG α 서브 유닛의 아미노산 배열(Accession No. BAA04044.1(Protein ID), 배열 번호 52, DNA 배열: 배열 번호 51) 혹은 타키프레우스속 FactorG β 서브 유닛의 아미노산 배열(Accession No. BAA04045.1(Protein ID))의 상동성 검색(blastp)을 행했다.

타키프레우스속 FactorG α 서브 유닛을 코드하는 아미노산 배열과의 상동성 검색의 결과, 타키프레우스속 FactorG α 서브 유닛을 코드하는 아미노산 배열과 상동성이 있는 2종류의 아미노산 배열(id: TR44185 c2_g1_i1, id: TR44185 c2_g1_i2)과, 그것을 코드하는 2종류의 DNA 배열(배열 번호 53, 배열 번호 54)이 확인되었다.

취득한 배열 번호 53 및 배열 번호 54의 DNA 배열은 종지(終止) 코돈을 포함하지 않기 때문에, 리뮐루스속 FactorG α 서브 유닛의 전체 아미노산 배열이 아니라, 그 N 말단 측의 부분 배열을 코드하고 있다고 추정되었다.

또, 타키프레우스속 FactorG β 서브 유닛을 코드하는 아미노산 배열과의 상동성 검색의 결과, 타키프레우스속 FactorG β 서브 유닛의 아미노산 배열과 상동성이 있는 2종류의 아미노산 배열과 DNA 배열, 즉 id: TR39550_c0_g1_i2(아미노산 배열: 배열 번호 22, DNA 배열: 배열 번호 21), 및 id: TR39550_c0_g1_i3(아미노산 배열: 배열 번호 24, DNA 배열: 배열 번호 23)가 확인되어, 2종류 모두 리뮐루스속 FactorG β 서브 유닛의 아미노산 배열을 코드하고 있는 DNA 배열이라고 추정되었다.

공지의 타키프레우스속 FactorG α 서브 유닛과 타키프레우스속 FactorG β 서브 유닛의 호모 로그의 존재에 대해서는 보고가 없다. 그러나 이상의 결과로부터, NGS의 해석 결과로부터, 타키프레우스속 FactorG α 서브 유닛과 타키프레우스속 FactorG β 서브 유닛에 대하여, 적어도 각각 2종 이상의 호모 로그가 존재하는 것이 판명되었다.

<2. FactorG α 서브 유닛 전장(全長) 염기 배열의 취득>

상기 <1.>에서 확인된 리뮐루스속 FactorG α 서브 유닛 유래의 2종류의 아미노산 배열 및 DNA 배열을 갖는 FactorG α 서브 유닛에 대하여, 이하의 방법으로 전체 DNA 배열을 특정했다.

먼저, 상기 1-2에서 얻어진 2종류의 아미노산 배열을 코드하는 DNA 배열(배열 번호 53, 배열 번호 54)의, N 말단 측을 코드하는 DNA 배열 부분(개시 코돈 배열을 포함한다)의 배열을 기초로, 포워드 프라이머로서, 하기의 프라이머 F1을 설계하여, 합성했다.

프라이머 F1 5'-GATTACGCCAAGCTTgccagaatgtcgattccatc-3'(배열 번호 55)

대문자: 벡터에 대한 in-fusion 반응 시에 이용하는 부가 배열

소문자: 배열 번호 53 및 배열 번호 54 유래의 배열

2-1. 3'RACE법에 의한 PCR 프래그먼트의 취득.

SMARTer^TM RACE 5'/3' Kit(다카라 바이오(주)제)를 이용하여, 상기 1-1에서 얻어진 리뮐루스속 투구게의 혈구 세포 유래 Total RNA를 1st strand cDNA에 역전사하여, cDNA 라이브러리를 제작했다.

본 kit 부속의 UPM short primer mix, 상기에서 얻어진 프라이머 F1, 및 PrimeSTAR^TM Max DNA Polymerase(다카라 바이오(주)제)를 이용하여, PCR을 행했다. PCR 용액의 조성을 하기 표 3에, PCR 조건을 하기 표 4에, 각각 나타낸다.

[표 3]

[표 4]

아가로스 S를 TAE buffer에 1.0(w/v)%가 되도록 용해하여 굳힌 젤에, 상기 PCR에서 얻어진 PCR 반응액을 어플라이하여, 100V, 50분간, TAE buffer 중에서 아가로스 전기 영동을 행했다. 영동 종료 후, 5000배 희석한 SAFELOOK^TM 프레그린 핵산 염색액(후지필름 와코 준야쿠(주)제)으로 30분 염색 후, LED 트랜스 일루미네이터 젤 미에루로 밴드의 위치를 관찰했다.

약 2.2kbp 사이즈의 밴드를 잘라내, NucleoSpin^TM Gel and PCR Clean-up(다카라 바이오(주)제)을 이용하여, PCR 프래그먼트를 취득하고, 정제했다.

2-2. FactorG α 서브 유닛의 3' 측 프래그먼트 포함 벡터의 제작.

상기 2-1에서 얻어진 PCR 프래그먼트와 Linearized pRACE 벡터(다카라 바이오(주)제)와 5×In-Fusion HD Enzyme Premix(다카라 바이오(주)제)를 혼합하여, 50℃에서 15분 반응시켜, in-fusion 반응 용액을 얻었다. 얻어진 in-fusion 반응 용액 2.5μL를, 50μL ECOS^TM Competent E. coli DH5 α(후지필름 와코 준야쿠(주)제)에 첨가하여, 빙상에서 5분 인큐베이트했다. 42℃에서 45초 히트 쇼크 처리한 후, 100μg/mL 암피실린 포함 LB 한천 배지에 도포했다. 37℃에서 하룻밤 인큐베이트하여, 콜로니를 형성시켰다.

형성한 콜로니를 약 3mL의 100μg/mL 암피실린 포함 LB 배지에 픽업하여 식균하고, 37℃에서 하룻밤, 진탕 배양(200rpm)을 행했다. 배양액이 현탁되어 있는 것을 확인하여, 10000 x g, 1분으로 배양액을 원심하고, 상등액을 제거하여, 균체(배양액 약 3mL분 상당)를 취득했다. 얻어진 균체로부터, QIAprep Spin Miniprep Kit(Qiagen사)를 이용하여, 키트에 첨부된 설명서에 따라, 플라스미드를 추출했다.

2-3. FactorG α 서브 유닛의 3' 측 프래그먼트의 생어 시퀀스 해석

상기 2-2에서 얻어진 플라스미드를, M13-20 및 M13-P5(유니버설 프라이머, 다카라 바이오(주)제)와 혼합하여, 생어 시퀀스 해석을 행했다.

M13-20 포워드 프라이머: 5'-gtaaaacgacggccagt-3'(배열 번호 56)

M13-P5 리버스 프라이머: 5'-caggaaacagctatgac-3'(배열 번호 57)

얻어진 시퀀스 데이터를 트리밍한 결과, 배열 번호 58로 나타나는 염기 배열이 확인되었다. 이 배열 번호 58로 나타나는 염기 배열을 해석한 결과, 종지 코돈 및 폴리 A 시그널과 폴리 A 사이트의 배열이 확인되었다. 이로부터, 배열 번호 58로 나타나는 염기 배열은, 상기 <1.>에서 확인된 2종류의 아미노산 배열의 일방을 코드하는 DNA 배열의 3'말단 측의 배열이라고 판단되었다. 또한, 이 배열 번호 58의 염기 배열을, 상기 <1.>에서 확인된 2종류의 DNA 배열인 배열 번호 53의 염기 배열 및 배열 번호 54의 염기 배열과 콘티그를 실행했다. 그 결과, 배열 번호 58의 염기 배열은, 배열 번호 54의 염기 배열과 100% 겹치는 부위가 확인되었기 때문에, PC상에서 전장을 구축하는 것이 가능하다는 것을 알 수 있었다. 따라서, 배열 번호 58의 염기 배열의 트리밍과 콘티그를, Vector NTI 소프트웨어(Invitrogen사)에 의하여 행했다.

이상의 결과, 상기 <1.>에서 확인된 2종류의 아미노산 배열 중 1종류의 FactorG α 서브 유닛의 전장 아미노산 배열을 코드하고 있는 전장 DNA 배열이 확인되었다.

그러나, 상기 <1.>에 있어서의 NGS의 해석 결과에서는 2클론 존재하는 것이 상정되었지만, 여기에서는 1클론 밖에 염기 배열을 취득할 수 없었다.

따라서, 상기 <1.>에서 확인된 2종류의 DNA 배열인 배열 번호 53 및 배열 번호 54의 염기 배열을 기초로, 개시 코돈을 포함하는 프라이머 F2를 설계하고, 배열 번호 58의 3'말단 측의 염기 배열을 기초로 종시 코돈을 포함하는 프라이머 R2를 설계하여, 합성했다.

프라이머 F2 5'-TATTTACAATCCATGGCAatgtttctgtgttatgttg-3'(배열 번호 59)

대문자: 벡터에 대한 in-fusion 반응 시에 이용하는 부가 배열

소문자: 배열 번호 53 및 배열 번호 54 유래의 배열

프라이머 R2 5'-GGAGCTCCTGCGGCCGCctaaacctttgtaatcttaatc-3'(배열 번호 60)

대문자: 벡터에 대한 in-fusion 반응 시에 이용하는 부가 배열

소문자: 배열 번호 58 유래의 배열

이어서, 이하의 방법으로 재차 cDNA 전장을 취득하는 시험을 행했다.

상기 2-2에서 얻어진 플라스미드를 주형(鑄型)으로 하여, 프라이머 F2와 프라이머 R2를 이용하고, KOD DNA polymerase(도요보(주)제)를 이용하여 PCR을 행했다. PCR 용액의 조성을 표 5에, PCR 조건을 표 6에 각각 나타낸다.

[표 5]

[표 6]

PCR 반응 종료 후, PCR 반응 용액을 아가로스 전기 영동하고, 통상의 방법에 의하여 밴드의 위치를 확인했다. 약 2.2kbp 사이즈의 밴드를 잘라내, NucleoSpin^TMGel and PCR Clean-up(다카라 바이오(주)제)을 이용하여, PCR 프래그먼트를 취득하고, 정제했다. 아가로스 전기 영동, 염색, 및 밴드의 관찰은, 상기 "2-1. 3'RACE법에 의한 PCR 프래그먼트의 취득"의 항에 기재된 방법과 동일한 방법으로 행했다.

상기에서 얻어진 PCR 프래그먼트와, 제한 효소 NcoI과 NotI로 처리한 Linearized pIEx/Bac^TM-1 벡터(Novagen사)와, 5×In-Fusion HD Enzyme Premix(다카라 바이오(주)제)를 혼합하여, 50℃에서 15분 반응시켜, in-fusion 반응 용액을 얻었다. 얻어진 in-fusion 반응 용액 2.5μL를 50μL ECOS^TM Competent E. coli DH5 α(후지필름 와코 준야쿠(주)제)에 첨가하여, 빙상에서 5분 인큐베이트하고, 42℃에서 45초 히트 쇼크 처리한 후, 100μg/mL 암피실린 함유 LB 한천 배지에 도포했다. 37℃에서 하룻밤 인큐베이트하여, 콜로니를 형성시켰다.

콜로니 세포로부터의 플라스미드의 취득은, 상기 "2-2. FactorG α 서브 유닛의 3' 측 프래그먼트 포함 벡터의 제작"의 항에 기재된 방법과 동일한 방법으로 행했다.

하기의, pIEx/Bac-1 벡터 측의 포워드 프라이머, 및 리버스 프라이머를 설계했다. 이 포워드 프라이머와 리버스 프라이머를, 상기에서 얻어진 플라스미드와 혼합하여, 생어 시퀀스 해석을 행했다.

pIEx/Bac-1 벡터 측의 포워드 프라이머: cgcgttggttttagagggca(배열 번호 61)

pIEx/Bac-1 벡터 측의 리버스 프라이머: acgtcgccaactcccattgt(배열 번호 62)

얻어진 시퀀스 데이터를 트리밍하여, 콘티그를 행했다. 트리밍과 콘티그는 Vector NTI 소프트웨어(Invitrogen사)에 의하여 행했다. 그 결과, 상기 <1.>에서 확인된 2종류의 리뮐루스속 FactorG α 서브 유닛의 전장 아미노산 배열을 코드하는 전장 DNA의 염기 배열을 취득했다. 취득된 염기 배열은, 배열 번호 17로 나타나는 염기 배열, 및 배열 번호 19로 나타나는 염기 배열이다.

<3. FactorG β 서브 유닛의 배열 확인>

상기의 "1-2. 본 발명의 FactorG 서브 유닛의 아미노산 배열 및 염기 배열 등의 취득"의 공정에서, FactorG β 서브 유닛 βi2 및 FactorG β 서브 유닛 βi3의 전장 cDNA의 염기 배열, 즉 배열 번호 21 및 배열 번호 23으로 나타나는 염기 배열을 취득했다. 확인을 위하여, 이 염기 배열의 5'말단 측과 3'말단 측의 염기 배열을 기초로, 하기의 프라이머를 설계했다.

프라이머 F3 5'-AACCAAGTGACCatgaaaaccactctatggacttt-3'(배열 번호 63)

프라이머 R3 5'-GATGGTGGTGCTCGAGTtaaaatactggcacaacttc-3'(배열 번호 64)

3-1. FactorG β 서브 유닛 배열의 전장 DNA 배열의 취득

상기 1-1에서 얻어진 리뮐루스속 투구게의 혈구 세포 유래의 Total RNA와 SuperScript^TM VILO^TM Master Mix(Invitrogen사)를 이용하여, 통상의 방법에 의하여 cDNA 라이브러리를 제작했다.

그 cDNA 라이브러리를 주형으로서 이용하고, 프라이머 F3 및 프라이머 R3을 이용하여, PCR을 행했다. PCR 용액의 조성을 하기 표 7에, PCR 조건을 하기 표 8에, 각각 나타낸다.

[표 7]

[표 8]

3-2. FactorG β 서브 유닛의 전장 cDNA 포함 트랜스퍼 벡터의 제작

상기 3-1에서 얻어진 PCR 프래그먼트와, 제한 효소 NcoI과 XhoI로 처리한 Linearized pIEx^TM-4 벡터(Novagen사)와, 5×In-Fusion HD Enzyme Premix(다카라 바이오(주))를 혼합하여, 50℃에서 15분 반응시켜, in-fusion 반응 용액을 얻었다. 얻어진 in-fusion 반응 용액 2.5μL를 50μL ECOS^TM Competent E. coli DH5 α(후지필름 와코 준야쿠(주)제)에 첨가하여, 빙상에서 5분 인큐베이트하고, 42℃에서 45초 히트 쇼크 처리한 후, 100μg/mL 암피실린 포함 LB 한천 배지에 도포했다. 37℃에서 하룻밤 인큐베이트하여, 콜로니를 형성시켰다. 콜로니 세포로부터의 플라스미드의 취득은, 상기 "2-2. FactorG α 서브 유닛의 3' 측 프래그먼트 포함 벡터의 제작"의 항에 기재된 방법과 동일한 방법으로 행했다.

3-3. FactorG β 서브 유닛의 전장 cDNA 배열의 생어 시퀀스 해석

상기 3-2에서 얻어진 시퀀스 데이터의 취득은, pIEx/Bac-1 벡터 측의 포워드 프라이머(배열 번호 61) 및 pIEx/Bac-1 벡터 측의 리버스 프라이머(배열 번호 62)를 이용하여, 상기 "2-3. FactorG α 서브 유닛의 3' 측 프래그먼트의 생어 시퀀스 해석"에 기재된 방법과 동일한 방법으로 행했다.

얻어진 시퀀스 데이터를, Vector NTI 소프트웨어(Invitrogen사)를 이용하여 트리밍하여, 콘티그를 행했다.

그 결과, 리뮐루스속 FactorG β 서브 유닛을 코드하는 6종류의 DNA 배열, 즉 배열 번호 21, 23, 25, 27, 29, 및 31로 나타나는 염기 배열을 취득했다.

<4. 재조합 버큘로 바이러스 벡터의 제작>

4-1. 트랜스퍼 벡터의 구축

전항 <2.> 및 <3.>에서 확인된 염기 배열인 배열 번호 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 및 31을, 각각 아미노산 배열로 번역했다.

얻어진 아미노산 배열을 해석한 결과, 이들 아미노산 배열의 N 말단 측에 시그널 펩타이드 배열의 영역이 있는 것이 확인되었다.

번역한, 시그널 펩타이드를 포함하는 FactorG α 서브 유닛의 아미노산 배열에, PA 태그 배열(배열 번호 65: GVAMPGAEDDVV) 및 6×His 태그 배열을 C 말단 측에 연결한 아미노산 배열과 그들 태그를 연결하지 않는 아미노산 배열을 설계했다. 설계한 아미노산 배열의 단백질을 곤충 세포로 발현시키기 위하여, 유전자 배열의 코돈을 최적화했다.

또, 번역한 FactorG β 서브 유닛의 아미노산 배열에, PA 태그 배열 및 6×His 태그 배열을 C 말단 측에 연결한 아미노산 배열을 설계했다. 설계한 아미노산 배열의 단백질을 곤충 세포로 발현시키기 위하여, 유전자 배열의 코돈을 최적화했다.

하기 표 9에, 이상의 조작에 의하여 얻어진, 하기의 정보를 정리하여 나타낸다. 단, 표 9에 기재된 각 아미노산 배열 및 염기 배열은, 태그 배열을 포함하지 않는다.

또한, 하기 표 9에 있어서의 각 항목은, 각각 이하의 의미이다.

·서브 유닛명: FactorG 서브 유닛 단백질의 명칭,

·아미노산 배열 번호: FactorG 서브 유닛 단백질 아미노산 배열의 배열 번호(시그널 펩타이드 배열을 제외한다),

·염기 배열 번호: FactorG 서브 유닛 단백질의 아미노산 배열을 코드하는 염기 배열의 배열 번호(시그널 펩타이드 배열을 코드하는 염기 배열을 제외한다),

·아미노산 배열 번호(시그널 배열 포함한다): FactorG 서브 유닛 단백질 아미노산 배열의 배열 번호(시그널 펩타이드 배열을 포함한다),

·염기 배열 번호(시그널 배열 포함한다): FactorG 서브 유닛 단백질의 아미노산 배열을 코드하는 염기 배열의 배열 번호(시그널 펩타이드 배열을 코드하는 염기 배열을 포함한다),

·최적화한 염기 배열 번호: FactorG 서브 유닛 단백질을 곤충 세포로 발현시키기 위하여 최적화한 염기 배열의 배열 번호(시그널 펩타이드 배열을 코드하는 염기 배열을 제외한다),

·염기 배열 번호(시그널 배열 포함한다): FactorG 서브 유닛 단백질을 곤충 세포로 발현시키기 위하여 최적화한 염기 배열의 배열 번호(시그널 펩타이드 배열을 코드하는 염기 배열을 포함한다).

[표 9]

GENEWIZ사에 위탁하여, 배열 번호 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 또는 48로 나타나는 염기 배열을 갖는 cDNA를 합성하고, 그 cDNA를 pIEx/Bac-1 벡터(Novagen사)의 NcoI-NotI 사이트로 삽입하여, 트랜스퍼 벡터를 취득했다.

4-2. 코트랜스펙션

25cm²플라스크에 뿌린 1.0×10⁶개의 Sf9 세포(invitorgen사)에, 상기 4-1에서 얻어진 트랜스퍼 벡터 각종 2μg, Linear AcNPV DNA 90ng 및 ScreenFect^TM A plus(후지필름 와코 준야쿠(주)제) 3μL를 포함하는 무혈청 PSFM-J1 배지(후지필름 와코 준야쿠(주)제) 100μL를 첨가했다. 28℃에서 7일간 정치 배양 후에 배양 상등을 회수하고, 재조합 버큘로 바이러스 벡터 용액으로 했다.

얻어진 재조합 버큘로 바이러스 벡터는, FactorG α 서브 유닛 A, FactorG α 서브 유닛 B, FactorG β 서브 유닛 βC1, FactorG β 서브 유닛 βi2, FactorG β 서브 유닛 βi3, FactorG β 서브 유닛 β2, FactorG β 서브 유닛 β5, 또는 FactorG β 서브 유닛 βC2 중 어느 하나의 아미노산 배열을 코드하는 cDNA를 유지하고 있다.

얻어진 재조합 버큘로 바이러스 벡터를 함유하는 용액을 "코트랜스펙션 용액"으로서 이용했다.

<5. BG 제거 완료 무혈청 PSFM-J1 배지의 제작>

여기에서, 이하의 방법으로, 본 발명의 FactorG α 서브 유닛 B를 담지한 비즈를 이용하여, 곤충 세포용 배지를 처리하여, 배지 성능을 유지한 상태로 BG를 제거한 세포 배양용 배지를 제작했다.

5-1. FactorG α 서브 유닛 B의 제작

상기 4-1 및 상기 4-2에 기재된 방법에서 얻어진, PA 태그 배열(배열 번호 65: GVAMPGAEDDVV) 및 6×His 태그 배열을 C 말단 측에 연결한 FactorG α 서브 유닛 B를 코드하는 cDNA(배열 번호 66)를 갖는 재조합 버큘로 바이러스 벡터 용액(코트랜스펙션 용액)을 이용하여 이하의 조작을 행했다.

곤충 세포 expresSF+^TM(프로테인·사이언스(Protein Science)사제)를, 1.5×10⁶개/ml가 되도록 무혈청 배지 PSFM-J1(pH5.5~6.2, 후지필름 와코 준야쿠(주)제)로 희석하여, 2000ml 삼각 플라스크에 800ml 준비했다. 이것에 상기에서 얻은 코트랜스펙션 용액을 4ml 더하여, 130rpm, 27℃에서 3일간 진탕 배양했다. 배양 후, 배양액을, 3,000 x g, 4℃에서 60분간 원심하고, 상등과 침전으로 분획했다. 이 배양 상등을 회수하고, FactorG α 서브 유닛 B 발현 배양 상등으로 했다.

5-2. FactorG α 서브 유닛 B의 정제

상기 5-1에서 발현된 단백질은, C 말단 측에, 6×His 태그 배열이 연결되어 있다. 따라서, cOmplete^TM His-Tag Purification Resin(Sigma-Aldrich사)을 사용하여, 첨부된 매뉴얼에 기재된 방법에 준하여 어피니티 정제를 행하고, 상기 5-1에서 얻어진 FactorG α 서브 유닛 B 발현 배양 상등으로부터 FactorG α 서브 유닛 B 단백질을 정제했다.

5-3. FactorG α 서브 유닛 B의 비즈 고정

CNBr-activated Sepharose 4B(GE사) 1g을 1mM HCl로 현탁하고, 200mL로 세정했다. 세정이 완료된 CNBr-activated Sepharose 4B 4ml net를, 커플링 버퍼(200mM NaHCO₃, 500mM NaCl, pH 8.3)에 용해한, 상기 5-2에서 얻어진 FactorG α 서브 유닛 B 16mg과 혼합하여, 4℃, 하룻밤, 전도 혼화하면서 인큐베이트했다. 미반응 활성기를 비활성화하기 위하여 비즈를 회수하여, Tris-HCl buffer, pH 8.0으로 재현탁하고, 2시간, 4℃에서 인큐베이션했다. 이상의 방법으로, FactorG α 서브 유닛 B 고정화 비즈의 현탁액을 얻었다.

5-4. 무혈청 PSFM-J1 배지로부터의 BG 제거

1000mL 무혈청 PSFM-J1 배지에, 상기 5-3에서 얻어진 FactorG α 서브 유닛 B 고정화 비즈의 현탁액 0.5mL net를 더하고, 교반 진탕기로, 실온에서 4시간 교반했다. 그 후, 0.22μM의 PES 필터에 통과시켜, 비즈의 제거와 멸균 처리를 행했다.

5-5. BG 제거의 확인

1) BG 제거의 확인 1-BG의 제거

5-4에서 얻어진 FactorG α 서브 유닛 B 고정화 비즈 처리 배지, 또는 미처리 배지를 이용하여, 하기 표 10에 기재된 조성의 반응 용액을 조제하고, 반응용 플레이트에 순차 첨가했다. 이어서, 37℃에서 200분 반응을 행하여, 반응 종료 후, 0.04% 아질산 나트륨(1.0M 염산 용액), 0.3% 설팜산 암모늄, 0.07% N-1-나프틸에틸렌다이아민 이염산염(14% N-1-메틸-2-피롤리돈 용액)을 각각 0.05mL 순차 첨가하여 다이아조 커플링하여, 마이크로 플레이트 리더(기기명: Spark(Tecan사제))에 의하여 540nm(대조 파장: 630nm)로 흡광도를 측정했다.

또한, 여기에서 이용하고 있는 투구게 유래 천연 FactorG 함유 용액은, 일본 특허공보 제2564632호에 기재된 방법에 의하여, 조 LAL로부터 분획한 프랙션을 이용했다.

[표 10]

결과를 도 1에 나타낸다.

도 1로부터 명확한 바와 같이, 무혈청 PSFN-J1 배지에는 350pg/mL 이상의 BG가 포함되어 있었지만, FactorG α 서브 유닛 B로 처리하면, BG 농도는 수 pg/mL 이하가 되어, 검출 한계 부근의 값이 되었다.

이상으로부터, 본 발명의 FactorG α 서브 유닛 B로 배지를 처리함으로써, BG를 검출 한계까지 제거할 수 있는 것을 알 수 있었다.

2) BG 제거의 확인 2-저해 인자의 제거

렌티난(이하 LNT)을 주사용 물로 0, 5, 10, 30, 60pg/mL가 되도록 용해하여, "검량선용 용액"으로 했다. 즉, "검량선용 용액"은 배지를 포함하지 않는다.

또, 상기 5-4의 방법으로 FactorG α 서브 유닛 B 고정화 비즈 처리한 무혈청 PSFM-J1 배지 또는 미처리 무혈청 PSFM-J1 배지에, LNT를 0, 10, 30pg/mL가 되도록 첨가한 용액을 조제했다. 0pg/mL에는 주사용 물을 이용했다. 조제한 이 용액을 "조제 완료 측정 대상 배지"로 했다. 또한, LNT는 렌티난 정주용(靜注用) 1mg "아지노모토"를 1N NaOH로 용해하여 조제한 것을 이용했다.

다음으로, 하기 표 11에 기재된 조성의 반응 용액을 조제하고, 반응용 플레이트에 순차 첨가했다. 이어서, 37℃에서 200분 반응을 행하여, 반응 종료 후, 0.04% 아질산 나트륨(1.0M 염산 용액), 0.3% 설팜산 암모늄, 0.07% N-1-나프틸에틸렌다이아민 이염산염(14% N-1-메틸-2-피롤리돈 용액)을 각각 0.05mL 순차 첨가하여 다이아조 커플링하여, 마이크로 플레이트 리더(기기명: Spark(Tecan사제))에 의하여 540nm(대조 파장: 630nm)로 흡광도를 측정했다.

표 11에서 이용하고 있는 투구게 유래 천연 FactorG 함유 용액은, 일본 특허공보 제2564632호에 기재된 방법에 의하여, 조 LAL로부터 분획한 프랙션을 이용했다.

[표 11]

결과를 표 2에 정리하여 나타낸다.

도 2에 있어서, --◇--는 검량선용 용액을 이용하여 얻어진 결과를, -▲-는 본 발명의 FactorG α 서브 유닛 B를 이용하여 BG 제거 처리한 PSM-J1 배지를 이용하여 얻어진 결과를, -◆-는 미처리의 PSM-J1 배지를 이용하여 얻어진 결과를, 각각 나타낸다.

도 2로부터, 미처리의 무혈청 PSFM-J1 배지를 이용하여 얻은 검량선(◆, y=0.004X+0.1266)의 기울기(0.004) 쪽이, 검량선용 용액을 이용하여 얻은 검량선(◇, y=0.0071X+0.032)의 기울기(0.007)보다 낮은 값이 되었다. 이 결과로부터, 무혈청 PSFM-J1 배지 중에 FactorG의 저해 인자가 존재하고 있는 것이 시사되었다.

한편, 본 발명의 FactorG α 서브 유닛 B 비즈를 이용하여 BG 제거 처리를 행한 무혈청 PSFM-J1 배지를 이용하여 얻은 검량선(▲, y=0.0065X+0.0048)의 기울기는 0.065가 되고, 검량선용 용액을 이용하여 얻은 검량선의 기울기(0.007)에 근사한 값이 되었다. 이 결과로부터, 본 BG 제거 처리 방법에 의하여 FactorG를 이용한 BG 측정에 영향을 미치는 저해 인자도 제거되어 있는 것이 시사되었다.

또한, 데이터는 나타내고 있지 않지만, 곤충 세포용 배지로부터 BG 제거를 행하기 위하여 BG 활성을 제거하는 방법으로서 종래부터 행해지고 있는 기술인, 오토클레이브 처리(121℃, 20분), 포지다인 필터를 이용한 처리(폴사제), Zeta Plus^TM 흡착 뎁스 필터를 이용한 처리를 행했지만 배지 성능을 유지하면서 BG를 제거할 수 없었다.

이상으로부터, 본 발명의 FactorG α 서브 유닛 B를 이용하여 배지 중의 BG를 제거하는 방법은, 배지 성능을 유지하면서, 종래보다 간편한 방법으로 BG를 제거할 수 있는 방법으로서, 매우 우수한 방법인 것을 알 수 있었다.

<6. 재조합 FactorG α 서브 유닛과 β 서브 유닛의 조합 확인 시험>

6-1. 발현 시험용 재조합 버큘로 바이러스 용액의 제작

곤충 세포 expresSF+^TM(프로테인·사이언스(Protein Science)사제)을, 1.5×10⁶cells/ml가 되도록 BG 제거 완료 무혈청 배지 PSFM-J1(pH5.5~6.2)로 희석하여, 125ml 삼각 플라스크에 50ml 준비했다.

이것에 상기 4-2에서 얻어진 각 코트랜스펙션 용액을 0.250ml 더하여, 130rpm, 27℃에서 3일간 진탕 배양했다. 배양 후, 배양액을, 3,000 x g, 4℃에서 30분간 원심하고, 상등과 침전으로 분획했다. 이 배양 상등을 회수하고, "발현 시험용의 재조합 버큘로 바이러스 용액"으로 했다.

또한, 상기에서 이용한 "BG 제거 완료 무혈청 배지 PSFM-J1"은, 상기 "5. BG 제거 완료 무혈청 PSFM-J1 배지의 제작"의 방법으로 얻었다.

6-2. 발현 시험용 재조합 버큘로 바이러스 용액의 타이터 측정

상기 6-1에서 제작한 발현 시험용의 재조합 버큘로 바이러스 용액의 역가를 재조합 FactorG α 서브 유닛 A와 β 서브 유닛 βi2를 대표로 하여, 이하의 방법으로 측정했다.

2.0×10⁶cells의 Sf9 세포(Invtrogen사)를 직경 60mm의 샬레에 뿌리고, 28℃에서 1시간 정치하여 세포를 바닥면에 접착시켰다.

상기 6-1에서 얻어진 "FactorG α 서브 유닛 A(PA 태그 배열 및 6×His 태그 배열을 C 말단 측에 연결하고 있지 않은 것)를 코드하는 cDNA"를 갖는 발현 시험용의 재조합 버큘로 바이러스의 용액, 또는 "FactorG β 서브 유닛 βi2를 코드하는 cDNA"를 갖는 발현 시험용의 재조합 버큘로 바이러스의 용액을, 각각 무혈청 PSFM-J1 배지로 10⁵, 10⁶, 10⁷, 10⁸배로 희석하고, 이들 용액을 각각 1ml씩 Sf9 세포에 첨가하여, 실온에서 1시간 부드럽게 진탕했다. 그 후, 샬레 상등(바이러스액)을 제거하고, 0.5% SeaKemGTG agarose(BMA사제)를 함유하는 무혈청 PSFM-J1 배지 4ml를 흘려 넣어, 28℃에서 7일간 정치 배양했다. 7일 후의 플레이트에 0.03% 뉴트럴 레드 용액을 첨가하여 3시간 정치하고, 염색했다. 플라크(투명하게 되어 있는 개소) 수를 카운트하여, 타이터값을 산출했다.

얻어진 결과는 이하와 같다.

FactorG α 서브 유닛 A를 코드하는 cDNA를 갖는 재조합 버큘로 바이러스: 2.1×10⁸pfu/mL

FactorG β 서브 유닛 βi2를 코드하는 cDNA를 갖는 재조합 버큘로 바이러스 i2: 1.4×10⁸pfu/mL

6-3. 재조합 FactorG α 서브 유닛과 β 서브 유닛의 공발현

곤충 세포 expresSF+^TM(프로테인·사이언스(Protein Science)사제)을, 1.5×10⁶cells/ml가 되도록 BG 제거 완료 무혈청 배지 PSFM-J1(pH5.5~6.2)로 희석하여, 125ml 삼각 플라스크 12개에 50ml씩 준비했다.

이들에, 상기 6-1에서 조제한 발현 시험용 재조합 버큘로 바이러스 용액으로부터, FactorG α 서브 유닛 발현용의 버큘로 바이러스의 일 종류를 VOI=1/400의 비율로, 및 FactorG β 서브 유닛 발현용의 버큘로 바이러스의 일 종류를 VOI=1/100의 비율로 더하고, 선회 배양하여, 130rpm, 27℃에서 2일간 진탕 배양했다. 배양 후, 배양액을, 3,000 x g, 4℃에서 30분간 원심하고, 상등과 침전으로 분획했다. 상등은 동결시켜 보존했다(VOI=volume of infection).

상기에서 이용한 "BG 제거 완료 무혈청 배지 PSFM-J1"은, 상기 "5. BG 제거 완료 무혈청 PSFM-J1 배지의 제작"의 방법으로 얻었다.

또한, 여기에서 사용한 FactorG α 서브 유닛 발현용의 버큘로 바이러스가 갖는 DNA는, PA 태그 배열 및 6×His 태그 배열을 C 말단 측에 연결하고 있지 않은 것이다.

상기의 VOI로 감염시킨 경우, 다중 감염도(multiplicity of infection, 이하 MOI로 한다.)로 환산하면, FactorG α 서브 유닛을 코드하는 cDNA를 갖는 발현용의 버큘로 바이러스:FactorG β 서브 유닛을 코드하는 cDNA를 갖는 발현용의 버큘로 바이러스=0.4:0.9의 비율로 대체된다.

여기에서 사용한 FactorG α 서브 유닛을 코드하는 cDNA를 갖는 발현용의 버큘로 바이러스는, FactorG α 서브 유닛 A 또는 B를 코드하는 cDNA(배열 번호 41 또는 배열 번호 42)를 갖는다.

또, FactorG β 서브 유닛을 코드하는 cDNA를 갖는 발현용의 버큘로 바이러스는, FactorG β 서브 유닛 βi2, βi3, β2, β5, βC1, 또는 βC2를 코드하는 cDNA(배열 번호 43, 44, 45, 46, 47, 또는 48)를 갖는다.

<7. 재조합 FactorG α 서브 유닛과 β 서브 유닛의 발현 확인(웨스턴 블로팅)>

상기 6-2에서 얻어진 발현 시험용의 재조합 버큘로 바이러스 용액(FactorG α 서브 유닛 A 발현 시험용의 재조합 버큘로 바이러스 용액, 또는 FactorG β 서브 유닛 βi2 발현 시험용의 재조합 버큘로 바이러스 용액) 90μL와시료용 완충액(3-머캅토-1,2-프로페인다이올 함유)(×4)(후지필름 와코 준야쿠(주)제) 30μL를 혼합하여, 5분간 열처리했다. 열처리한 시료를 이지 세퍼레이터에 세팅한 슈퍼셉^TM에이스, 10-20% 젤(후지필름 와코 준야쿠(주)제)에 15μL 어플라이했다.

이지 세퍼레이터(후지필름 와코 준야쿠(주)제)를 SDS-PAGE 버퍼, pH8.5(후지필름 와코 준야쿠(주)제)로 채워, 250CV, 60분 통전시켰다. 영동 후, SDS-PAGE한 젤을 메탄올로 친수화한 클리어 트랜스^TM SP PVDF 멤브레인, 소수성, 0.2μm(후지필름 와코 준야쿠(주)제) 위에 올려, 아쿠아 블롯^TM 1×고효율 전사 버퍼로 침지한 여과지로 상하로부터 사이에 두었다. 1mA/cm² CA, 60분 통전시켰다.

통전 후, FactorG α 서브 유닛 A 발현 시험용의 재조합 버큘로 바이러스 용액을 이용한 경우는, 3% 스킴 밀크(60분)(후지필름 와코 준야쿠(주)제), 항FactorG α 서브 유닛 항체(60분), 항마우스 IgG 항체(HRP 결합)(60분)(후지필름 와코 준야쿠(주)제)로 순서대로 진탕시켰다. 반응 후에는, 임노스터^TM 제타로 발광시켜 AI-600QC로 검출을 행했다.

또, FactorG β 서브 유닛 βi2 발현 시험용의 재조합 버큘로 바이러스 용액을 이용한 경우는, 통전 후, 3% 스킴 밀크(60분)(후지필름 와코 준야쿠(주)제), 항6×His 태그 항체(HRP 결합)(후지필름 와코 준야쿠(주)제)를 순서대로 진탕시켰다. 반응 후에는, 임노스터^TM 제타로 발광시켜 AI-600QC로 검출을 행했다.

그 결과, rFactorG α 서브 유닛은 약 75kDa, rFactorG β 서브 유닛은 약 40kDa 부근의 위치에 밴드가 확인되었다.

이상으로부터, FactorG α 서브 유닛 및 본 발명의 FactorG β 서브 유닛이 발현된 것이 확인되었다.

실시예 2. 본 발명의 헤테로 다이머의 글루칸 의존성 프로테아제 활성 확인 시험

실시예 1의 6-3에서 얻어진, 본 발명의 FactorG α 서브 유닛과 FactorG β 서브 유닛의 공발현물이 포함되는 상등을 시료로서 이용하여, 얻어진 공발현물의 글루칸 의존성 프로테아제 활성의 평가를, 이하의 방법으로 행했다.

즉, 하기 표 12에 기재된 조성의 반응 용액을 조제하고, 반응용 튜브에 순차 첨가했다. 이어서, 37℃에서 200분 반응을 행하여, ELx808(BioTek제)을 이용하여, 405nm(측정 파장)와 492nm(부파장)에 있어서의 흡광도를 측정했다. LNT 첨가와 무첨가(블랭크)에 있어서의 흡광도의 차를, 표 13에 나타낸다.

또, 비교로서, 리뮐루스 폴리페무스 유래의 FactorG α 서브 유닛의 아미노산 배열(BAJ10550.1(protein_id), 배열 번호 50)을 코드하는 Genbank Accession No. AB547712의 염기 배열(배열 번호 49)을 갖는 cDNA를 조제하고, 이 cDNA를 이용하는 것 이외에는 실시예 1과 동일한 방법으로, 리뮐루스 폴리페무스 유래의 FactorG α 서브 유닛과 본 발명의 FactorG β 서브 유닛을 공발현시켜, 리뮐루스 폴리페무스 유래의 FactorG α 서브 유닛(AB547712)과 본 발명의 FactorG β 서브 유닛의 헤테로 다이머를 얻었다. 이 헤테로 다이머를 이용하는 것 이외에는, 동일하게 글루칸 의존성 프로테아제 활성 확인 시험을 행했다. 결과를 표 13에 아울러 나타낸다.

또한, 특허문헌 2에 기재된 방법으로 타키프레우스 폴리페무스 유래의 FactorG α 서브 유닛과 FactorG β 서브 유닛을 공발현시켜 헤테로 다이머를 얻었다. 이 헤테로 다이머를 이용하는 것 이외에는, 동일하게 글루칸 의존성 프로테아제 활성 확인 시험을 행했다. 결과를 표 14에 나타낸다.

[표 12]

또한, 여기에서 이용하고 있는 LNT는 렌티난 정주용 1mg "아지노모토"를 1N NaOH로 용해하여 조제한 것을 이용했다.

[표 13]

LNT 첨가와 LNT 무첨가의 경우의 흡광도의 d차를 "블랭크차"라고 한다.

표 13에 있어서,

◎는, 블랭크차>0.1의 경우를,

○는, 0.1≥블랭크차>0.01의 경우를,

△는, 0.01≥블랭크차>0의 경우를,

×는, 블랭크차=0의 경우를, 각각 나타낸다.

[표 14]

표 13으로부터 명확한 바와 같이, 본 발명의 헤테로 다이머는, BG 존재하에서 프로테아제 활성을 갖는 것이 확인되었다.

한편, 표 13으로부터 명확한 바와 같이, 공지의 배열인 AB547712와 본 발명의 FactorG β 서브 유닛의 헤테로 다이머는, 프로테아제 활성을 측정할 수 없었다. 이상으로부터, 공지의 배열인 AB547712에 대해서는, BG 의존성을 보유한 FactorG의 제작이 곤란하다는 것이 확인되었다.

또, 표 14로부터 명확한 바와 같이, 본 발명의 헤테로 다이머 대신에 타키프레우스속 유래 FactorG αβ를 이용하여 동일한 측정을 행한 결과, 프로테아제 활성을 측정할 수 없었다.

이상으로부터, 본 발명의 FactorG α 서브 유닛과 본 발명의 FactorG β 서브 유닛의 헤테로 다이머가, BG의 정량 측정이나 진균증의 진단에 이용할 수 있는 것이 시사되었다.

실시예 3. 본 발명의 헤테로 다이머를 이용한 BG의 측정

실시예 1의 6-3에서 얻어진, 본 발명의 FactorG α 서브 유닛 A와 FactorG β 서브 유닛 βi2의 공발현물이 포함되는 상등, 또는 본 발명의 FactorG α 서브 유닛 B와 FactorG β 서브 유닛 β2의 공발현물이 포함되는 상등을 시료로서 이용하여 이미 알려진 BG양을 이하의 방법으로 측정했다.

즉, 하기 표 15에 기재된 조성의 반응 용액을 조제하고, 반응용 튜브에 순차 첨가했다. 표 15에 있어서, 렌티난 정주용 1mg "아지노모토"를, 1N NaOH로 LNT 농도가 0.35pg/mL, 3.5pg/mL, 및 35pg/mL가 되도록 용해한 것을 LNT 용액으로서 이용했다.

또, 주사용 증류수를, LNT 무첨가의 블랭크로서 이용했다.

[표 15]

이어서, 37℃에서 200분 반응을 행하여, ELx808(BioTek제)을 이용하여, 405nm(측정 파장)와 492nm(부파장)에 있어서의 흡광도를 측정했다. LNT 첨가와 무첨가(블랭크)에 있어서의 흡광도의 차를 각 LTN 농도에 있어서의 흡광도로 했다.

이어서, 시료 중의 렌티난 농도(환산값, pg/mL, x축)에 대한 흡광도를 플롯한 검량선을 작성했다.

본 발명의 FactorG α 서브 유닛 A와 FactorG β 서브 유닛 βi2의 공발현물이 포함되는 상등을 이용한 측정에서 얻어진 검량선을, 도 3에 나타낸다.

또, 측정값으로부터 최소 제곱법으로 구한 회귀 직선식과 상관 계수는 하기와 같다.

y=0.2819x^0.296

R²=1

본 발명의 FactorG α 서브 유닛 B와 FactorG β 서브 유닛 β2의 공발현물이 포함되는 상등을 이용한 측정에서 얻어진 검량선을, 도 4에 나타낸다.

또, 측정값으로부터 최소 제곱법으로 구한 회귀 직선식과 상관 계수는 하기와 같다.

y=0.1601x^0.2356

R²=0.9938

도 3 및 도 4로부터 명확한 바와 같이 본 발명의 헤테로 다이머를 이용하여 BG의 측정을 행한 경우, 시료 중의 BG 농도(렌티난 농도 환산값으로 0~350pg/mL)에 비례한, 양호한 검량선이 얻어졌다. 이 점에서, 본 발명의 헤테로 다이머를 BG의 정량에 이용할 수 있는 것을 알 수 있다. 특히, 렌티난 농도의 하한이 0.35pg/mL까지 유의하게 검출 가능하다는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 임상 검사의 분야에서 BG를 측정한 경우의 BG의 컷 오프는 값 11pg/mL 이하이다.

실시예 4. 본 발명의 헤테로 다이머의 취득-2

(1) 발현 벡터의 구축

1) FactorG α 서브 유닛 A 발현 벡터의 구축

배열 번호 41(표 9에 기재된 곤충 세포용으로 최적화한 염기 배열, 시그널 배열을 포함한다)로 나타나는 염기 배열을 갖는 cDNA를 플라스미드 벡터 pIEx-Bac-1 벡터(Novagen사)의 NcoI-NotI 사이트로 삽입하여, FactorG α 서브 유닛 A 발현 벡터(α(TYPE A)/pIEx-Bac-1)를 구축했다.

2) FactorG β 서브 유닛 i2 발현 벡터의 구축

5'말단 측으로부터 시그널 배열, Hat 태그, SUMO 태그, FactorG β 서브 유닛 βi2(아미노산 배열: 배열 번호 6)의 순서로 배치한 아미노산 배열(배열 번호 67)을 설계하여, 이 아미노산 배열을 코드하고, 또한 곤충 세포용으로 최적화한 염기 배열(배열 번호 68)을 설계했다. 이 염기 배열의 FactorG β 서브 유닛 βi2를 코드하는 염기 배열은, 배열 번호 69로 나타나는 것이다.

GENEWIZ사에 위탁하여 이 염기 배열을 갖는 cDNA를 합성했다. 이 cDNA를, 플라스미드 벡터 pIEx-Bac-1 벡터(Novagen사)의 NcoI-NotI 사이트로 삽입하여, FactorG β 서브 유닛 βi2 발현 벡터(βi2/pIEx-Bac-1)를 구축했다.

(2) 발현 벡터를 이용한 공발현

곤충 세포 expresSF+(등록 상표; 프로테인·사이언스(Protein Science)사제)를, 1.0×10⁶cells가 되도록 BG 제거 완료 무혈청 배지 PSFM-J1(pH5.5~6.2)이 들어간 6웰 플레이트에 파종했다.

상기에서 구축한 발현 벡터 α(TYPE A)/pIEx-Bac-1 및 βi2/pIEx-Bac-1(각각 1μg분), 및 트랜스펙션 시약 ScreenFectA plus(후지필름 와코 준야쿠(주)제) 2μL를, PSFM-J1 배지(후지필름 와코 준야쿠(주)제) 100μL를 혼합하여, 실온에서 20분 인큐베이션한 후, 용액을 expresSF+를 파종한 6웰 플레이트에 첨가했다.

그 후, 27℃에서 3일간 배양했다. 배양 후, 배양액을, 12,000 x g, 4℃에서 2분간 원심하고, 상등과 침전으로 분획했다. 상등을 동결시켜 보존했다.

(3) 글루칸 의존성 프로테아제 활성 확인 시험

얻어진 상등(본 발명의 FactorG α 서브 유닛 A와 FactorG β 서브 유닛 βi2의 공발현물을 함유한다)을 시료로서 이용하는 것 이외에는, 실시예 2와 동일한 방법으로, 얻어진 공발현물의 글루칸 의존성 프로테아제 활성의 평가를 행했다. 또한, 35pg/mL LNT 용액은, 측정 시의 농도가 35pg/mL, 3.5pg/mL, 또는 0.35pg/mL가 되도록 더했다.

결과를 도 5에 나타낸다.

도 5로부터 명확한 바와 같이, 본 발명의 헤테로 다이머를 이용하여 BG의 측정을 행한 경우, 시료 중의 BG 농도가, 렌티난 농도 환산값으로 0.35pg/mL에서도 충분히 검출 가능하다는 것을 확인할 수 있었다.

배열표

C:\Users\17715150\Desktop\2144PCT.txt

SEQUENCE LISTING <110> FUJIFILM Corporation <120> Ricombinant Gactor G Derived from Limulus polyphemus and Method for Measuring Beta-glucan Using the Same <130> 2144 <150> 2019-223604 <151> 2019-12-11 <160> 69 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 1944 <212> DNA <213> Limulus polyphemus <400> 1 gaaccaaaat ggaagctcgt ctggtcggat gaatttacca atggaatcag ttcagattgg 60 gaattcgaaa cgggcaatgg ccccaacggt tggggcaata acgaactgca atattatcgt 120 cgtgaaaata cccgagttga gggcgggaaa ttaataatta cagctaaaga agaagattat 180 gagggtttca ggtacacttc tgccaagctg aaaacccagt tcaataaacc ttggaaagat 240 ggtaaaattg aagccagaat gtcgattcca tcatttcggg gggtctgggt ggcgttctgg 300 atgttaggag acatcaccga tactgatagc tggccctctt ccggtgaaat tgactttgag 360 gaacacataa ataccaacaa tgaagttaga ggaactattc actggtctac ttctgatgac 420 gctgatacac ttcatggcag aggaaccaat actgactatc acatttattc tgtagagtgg 480 aattcttccg ttattagatg gtttgttgat ggaaatcagt actttgaggt gaatattcag 540 agaggagcaa ctggaacaaa cgcatttcat aataacgttt tcgttatttt aaacatggct 600 attggtggaa actggccagg attcaatgtt gctgatgagg ctttccctgc taacatgtat 660 gtagattatg tccgtgtata tcaggatgcc aatacacctt ctcctgttga cgttactcat 720 ttatctggtt actattttct tcaaaatagg cacagtgaac tgtatcttga tgtcagtggt 780 tccagtaacg aagatggagc atttctacaa caatggcctt atagcggtaa tgctaaccaa 840 cagtttgatt ttgtacatct cggaaataag gtttataaaa ttatcaataa aaatagtgga 900 aaatctctgg atgtttacga gttagggact gataatggtg tcagaatcca acagtggtcg 960 tatggagggg gctacaatca gcagtttatt gtacaagatg ttggagatgg ttattataag 1020 atatttgcac gcagcactgg aaagttagtg gaagtagcag atttgaataa agacccagga 1080 ggaaagatac aacaatggtc tgatgatggc caattatccg gacagtggaa acttattcga 1140 aataaagcta attctaaatt gattcaggca gaaagttatt ttgctagttc aaaagtacaa 1200 ttggaagata cctcggatgt aggaggcggg aagaatgtca agtgtgataa tgaaggagcc 1260 tggatggctt acaaggatat caatttccca agttcaggta cttatcaagt agagtacaga 1320 gtggcaagtg aacgtgcagg aggaatgttg tctctggatt tgaatgcagg ttctatagtg 1380 cttggcatgc tgaatgttcc ttcaactgga ggattgcaga agtggaccac catttcccac 1440 acagtgaatg taagttcagg tacgtacaac ttggggatca gtgttcaacg acccgggtgg 1500 aatatcaact ggattaatat tacaaaagta tccagtcagt tgaaatctat tccaagtact 1560 aattctagag taattcaggc agaaagttat ttcgatagtt caaaagtaca attggaagac 1620 acctcggatg ttggaggcgg gaagaatgtt aagtgtgata ctaaaggagc ctggatggcc 1680 tacaaggata tcaattttcc cagttcaggt agttatcaaa tagagtacag agtggcaagt 1740 gaacgtgcag gaggaaagtt gtctctcgat ttgaatgcag gttctatagt gcttggaatg 1800 ctggatgttc cttcaactgg gggatggcag aagtggacca ccatttccca tacagtaaag 1860 gtggattcag gtacttataa cttggggatc tacgttcaac aacccgggtg gaatatcaac 1920 tggattaaga ttacaaaggt ttag 1944 <210> 2 <211> 647 <212> PRT <213> Limulus polyphemus <400> 2 Glu Pro Lys Trp Lys Leu Val Trp Ser Asp Glu Phe Thr Asn Gly Ile 1 5 10 15 Ser Ser Asp Trp Glu Phe Glu Thr Gly Asn Gly Pro Asn Gly Trp Gly 20 25 30 Asn Asn Glu Leu Gln Tyr Tyr Arg Arg Glu Asn Thr Arg Val Glu Gly 35 40 45 Gly Lys Leu Ile Ile Thr Ala Lys Glu Glu Asp Tyr Glu Gly Phe Arg 50 55 60 Tyr Thr Ser Ala Lys Leu Lys Thr Gln Phe Asn Lys Pro Trp Lys Asp 65 70 75 80 Gly Lys Ile Glu Ala Arg Met Ser Ile Pro Ser Phe Arg Gly Val Trp 85 90 95 Val Ala Phe Trp Met Leu Gly Asp Ile Thr Asp Thr Asp Ser Trp Pro 100 105 110 Ser Ser Gly Glu Ile Asp Phe Glu Glu His Ile Asn Thr Asn Asn Glu 115 120 125 Val Arg Gly Thr Ile His Trp Ser Thr Ser Asp Asp Ala Asp Thr Leu 130 135 140 His Gly Arg Gly Thr Asn Thr Asp Tyr His Ile Tyr Ser Val Glu Trp 145 150 155 160 Asn Ser Ser Val Ile Arg Trp Phe Val Asp Gly Asn Gln Tyr Phe Glu 165 170 175 Val Asn Ile Gln Arg Gly Ala Thr Gly Thr Asn Ala Phe His Asn Asn 180 185 190 Val Phe Val Ile Leu Asn Met Ala Ile Gly Gly Asn Trp Pro Gly Phe 195 200 205 Asn Val Ala Asp Glu Ala Phe Pro Ala Asn Met Tyr Val Asp Tyr Val 210 215 220 Arg Val Tyr Gln Asp Ala Asn Thr Pro Ser Pro Val Asp Val Thr His 225 230 235 240 Leu Ser Gly Tyr Tyr Phe Leu Gln Asn Arg His Ser Glu Leu Tyr Leu 245 250 255 Asp Val Ser Gly Ser Ser Asn Glu Asp Gly Ala Phe Leu Gln Gln Trp 260 265 270 Pro Tyr Ser Gly Asn Ala Asn Gln Gln Phe Asp Phe Val His Leu Gly 275 280 285 Asn Lys Val Tyr Lys Ile Ile Asn Lys Asn Ser Gly Lys Ser Leu Asp 290 295 300 Val Tyr Glu Leu Gly Thr Asp Asn Gly Val Arg Ile Gln Gln Trp Ser 305 310 315 320 Tyr Gly Gly Gly Tyr Asn Gln Gln Phe Ile Val Gln Asp Val Gly Asp 325 330 335 Gly Tyr Tyr Lys Ile Phe Ala Arg Ser Thr Gly Lys Leu Val Glu Val 340 345 350 Ala Asp Leu Asn Lys Asp Pro Gly Gly Lys Ile Gln Gln Trp Ser Asp 355 360 365 Asp Gly Gln Leu Ser Gly Gln Trp Lys Leu Ile Arg Asn Lys Ala Asn 370 375 380 Ser Lys Leu Ile Gln Ala Glu Ser Tyr Phe Ala Ser Ser Lys Val Gln 385 390 395 400 Leu Glu Asp Thr Ser Asp Val Gly Gly Gly Lys Asn Val Lys Cys Asp 405 410 415 Asn Glu Gly Ala Trp Met Ala Tyr Lys Asp Ile Asn Phe Pro Ser Ser 420 425 430 Gly Thr Tyr Gln Val Glu Tyr Arg Val Ala Ser Glu Arg Ala Gly Gly 435 440 445 Met Leu Ser Leu Asp Leu Asn Ala Gly Ser Ile Val Leu Gly Met Leu 450 455 460 Asn Val Pro Ser Thr Gly Gly Leu Gln Lys Trp Thr Thr Ile Ser His 465 470 475 480 Thr Val Asn Val Ser Ser Gly Thr Tyr Asn Leu Gly Ile Ser Val Gln 485 490 495 Arg Pro Gly Trp Asn Ile Asn Trp Ile Asn Ile Thr Lys Val Ser Ser 500 505 510 Gln Leu Lys Ser Ile Pro Ser Thr Asn Ser Arg Val Ile Gln Ala Glu 515 520 525 Ser Tyr Phe Asp Ser Ser Lys Val Gln Leu Glu Asp Thr Ser Asp Val 530 535 540 Gly Gly Gly Lys Asn Val Lys Cys Asp Thr Lys Gly Ala Trp Met Ala 545 550 555 560 Tyr Lys Asp Ile Asn Phe Pro Ser Ser Gly Ser Tyr Gln Ile Glu Tyr 565 570 575 Arg Val Ala Ser Glu Arg Ala Gly Gly Lys Leu Ser Leu Asp Leu Asn 580 585 590 Ala Gly Ser Ile Val Leu Gly Met Leu Asp Val Pro Ser Thr Gly Gly 595 600 605 Trp Gln Lys Trp Thr Thr Ile Ser His Thr Val Lys Val Asp Ser Gly 610 615 620 Thr Tyr Asn Leu Gly Ile Tyr Val Gln Gln Pro Gly Trp Asn Ile Asn 625 630 635 640 Trp Ile Lys Ile Thr Lys Val 645 <210> 3 <211> 1953 <212> DNA <213> Limulus polyphemus <400> 3 acaaattgga agctcgtctg gtcggatgaa tttaccaatg gaatcagttc agattgggaa 60 ttcgaaacag gcaatggccc caacggttgg ggcaataatg aactgcaata ttatcgtcga 120 gaaaatgccc gagttgaggg cgggaaatta ataattacag ctaaaaaaga agattatgag 180 ggtttcaggt acacttctgc caagctgaaa acccagttca ataaaccttg gaaagatggt 240 aaaattgaag ccagaatgtc gattccatca tttcgggggg tctgggtggc gttctggatg 300 ttaggagaca tcaccgatac tgatagctgg ccctcttccg gtgaaattga ctttaaggaa 360 catataaata ccaacaatga agttagagga actattcact ggtctacttc tgatggtgct 420 catacgcatc atggcagagg aaccaatact gactatcaca tttattctgt agagtggaat 480 tcttccgtta ttagatggtt tgttgatgga aatcagtact ttgaggtgaa tattcagaga 540 ggagcaactg gaacaaacgc atttcataac aaagttttcg ttattttaaa catggctatt 600 ggtggaaact ggccaggatt caatgttgct gatgaggctt tccctgctaa catgtatgta 660 gattatgtcc gtgtatatca ggatgccaat acaccttctc ctgttgacgt tgacgttact 720 gatttatctg gttactattt tcttcaaaat aggcacagtg aactgtatct tgatgtcagt 780 ttctccagta acaaagatgg agcatttcta caacaatggc cttataacgg taatgctaac 840 caacagtttg attttgtaca tctcggaaat aatatatata aaattaccaa taaaaatagt 900 ggaaaatctc tggatgtcta caatgtaggg actgaaaatg gtgtcagaat tcaacagatg 960 ccgtatagag ggagctacaa tcagcagttt attgtacaag atgttggaga tggttattat 1020 aagatatttg cacgcaacag cagaaagtta gtggaagtag cagatttcaa taaagaccca 1080 ggaggaaaga tacaacaatg gtctgatgat ggccaaatat ccggacagtg gaaacttatt 1140 cgaaataaag ttaattctaa agtaattcag gcagaaagtt attttgctag tttaggagta 1200 caattggaag acacctcgga tgtaggaggc gggaagaatg ttaagtgtga tactgaagga 1260 gcctggatgg cttacaagga tatcaatttc cccagttcag gtagttatca agtagagtac 1320 agagtggcaa gcgaacgtgc aggaggaaag ttgtctctgg atttgaatgc aggttctata 1380 gtgcttggaa tgctgaatgt tccttcaaca ggaggatggc agaagtggac caccatttcc 1440 catacagtaa aggtggattc aggtacttat aacttgggga tctacgttca acgacccagg 1500 tggaatatca actggattaa gattacagaa gcacccggac agtcaaaacc tattcaaaga 1560 agtgataccg attctaaagt aattcaggca gaaagttatt ttgctagttc aaaagtacaa 1620 ttggaagata cctcggatgt tggaggcggg aagaatgtta agtgtgataa tgaaggagcc 1680 tggatggcct acaaggatat taattttccc agttcaggta gttatcaaat agagtacaga 1740 gtggcaagtg aacgtgcagg aggaaagttg tctctcgatt tgaatgcagg ttctatagtg 1800 cttggaatgc tggatgttcc ttcaactggg ggatggcaga agtggaccac catttcccac 1860 acagtgaatg tgagttcggg tacatataac ttggggatct acgttcaacg agctgcgtgg 1920 aatatcaact ggattaagat tacaaaggtt tag 1953 <210> 4 <211> 650 <212> PRT <213> Limulus polyphemus <400> 4 Thr Asn Trp Lys Leu Val Trp Ser Asp Glu Phe Thr Asn Gly Ile Ser 1 5 10 15 Ser Asp Trp Glu Phe Glu Thr Gly Asn Gly Pro Asn Gly Trp Gly Asn 20 25 30 Asn Glu Leu Gln Tyr Tyr Arg Arg Glu Asn Ala Arg Val Glu Gly Gly 35 40 45 Lys Leu Ile Ile Thr Ala Lys Lys Glu Asp Tyr Glu Gly Phe Arg Tyr 50 55 60 Thr Ser Ala Lys Leu Lys Thr Gln Phe Asn Lys Pro Trp Lys Asp Gly 65 70 75 80 Lys Ile Glu Ala Arg Met Ser Ile Pro Ser Phe Arg Gly Val Trp Val 85 90 95 Ala Phe Trp Met Leu Gly Asp Ile Thr Asp Thr Asp Ser Trp Pro Ser 100 105 110 Ser Gly Glu Ile Asp Phe Lys Glu His Ile Asn Thr Asn Asn Glu Val 115 120 125 Arg Gly Thr Ile His Trp Ser Thr Ser Asp Gly Ala His Thr His His 130 135 140 Gly Arg Gly Thr Asn Thr Asp Tyr His Ile Tyr Ser Val Glu Trp Asn 145 150 155 160 Ser Ser Val Ile Arg Trp Phe Val Asp Gly Asn Gln Tyr Phe Glu Val 165 170 175 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tcattctccg gcctcaaccg aggaatcact 600 gatgatatga tttgtgctgg ataccaggaa ggaggaagag attcttgtga gggcgactct 660 ggtggtcctc tgatgtatca tgatccaaca acaggaagag tcgaattagt gggagttgta 720 tcatttgggt tcggatgtgc tcgtcccaac ttcccgggag tttacacgcg cctctcgagc 780 tacggtaact ggttccagaa agtcaccttt ggatatttac tcgctacttt attcgaagtt 840 gtgccagtat tttaa 855 <210> 6 <211> 284 <212> PRT <213> Limulus polyphemus <400> 6 Met Ser Val Thr Ser Arg Val Arg Arg Glu Ile Asn Glu Glu His Cys 1 5 10 15 Gly Ile Arg Pro Thr Ala Pro Arg Ile Ile Lys Gly Arg Ile Ser Ile 20 25 30 Pro His Ser Trp Pro Trp Met Val Gly Ile Phe Gln Val Asp Pro Leu 35 40 45 Leu Phe Ile Cys Gly Gly Thr Ile Ile Asn Lys Val Ser Val Val Thr 50 55 60 Ala Ala His Cys Leu Val Thr Gln Ser Gly Asn Arg Gln Asn Ser Ser 65 70 75 80 Ile Val Val Arg Val Gly Ala His Asp Ile Asp Asn Ser Gly Ile Asp 85 90 95 Tyr His Val Asp Lys Ile Ile Val His Gln Asp Tyr Lys Tyr Arg Ser 100 105 110 Gln Tyr Tyr Asp Ile Gly Leu Ile Leu Leu Ser Lys Arg Ile Glu Tyr 115 120 125 Asn Tyr 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ctgatgatat gatttgtgct ggataccagg aaggaggaag agattcttgt 720 gagggcgact ctggtggtcc tctgatgtat catgatccaa caacaggagg agtcgaatta 780 gtgggagttg tatcatttgg gttcggatgt gctcgtccca acttcccggg agtttacacg 840 cgcctctcga gctacggtaa ctggttccag aaagtcacct ttggatattt actcgctact 900 ttattcgaag ttgtgccagt attttaa 927 <210> 26 <211> 308 <212> PRT <213> Limulus polyphemus <220> <221> SIGNAL <222> (1)..(24) <400> 26 Met Lys Thr Thr Leu Trp Thr Phe Phe Ala Leu Ala Met Ala Leu Phe 1 5 10 15 Ser Ile Asn Val Thr Ala Ser Glu Met Ser Val Thr Ser Arg Val Arg 20 25 30 Arg Glu Ile Asn Glu Glu His Cys Gly Ile Arg Pro Thr Ala Pro Arg 35 40 45 Ile Ile Lys Gly Arg Ile Ser Ile Pro His Ser Trp Pro Trp Met Val 50 55 60 Gly Ile Phe Gln Val Asp Pro Leu Leu Phe Ile Cys Gly Gly Thr Ile 65 70 75 80 Ile Asn Lys Val Ser Val Val Thr Ala Ala His Cys Leu Val Thr Gln 85 90 95 Ser Gly Asn Arg Gln Asn Tyr Ser Ile Val Val Arg Val Gly Ala His 100 105 110 Asp Ile Asp Asn Ser Gly Ile Asp Tyr His Val Asp Lys Ile Ile Val 115 120 125 His 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Gly Val Arg Ile Gln Gln Trp Ser Tyr Gly Gly Ala Arg Asn Gln 340 345 350 Gln Phe Thr Val Gln Ser Val Gly Asp Gly Tyr Tyr Lys Ile Ile Pro 355 360 365 Arg Gly Ser Gly Lys Leu Val Glu Val Ala Asp Phe Ser Lys Asp Ala 370 375 380 Gly Gly Lys Ile Gln Gln Trp Ser Asp Asn Asn Gln Leu Ser Gly Gln 385 390 395 400 Trp Lys Leu Ile Lys Ser Lys Ser Tyr Ser Lys Leu Ile Gln Ala Glu 405 410 415 Ser Tyr Phe Asp Ser Ser Lys Val Gln Leu Glu Asp Thr Ser Asp Val 420 425 430 Gly Gly Gly Lys Asn Val Lys Cys Asp Asn Glu Gly Ala Trp Met Ala 435 440 445 Tyr Lys Asp Ile Asp Phe Pro Ser Ser Gly Asn Tyr Arg Ile Glu Tyr 450 455 460 Arg Val Ala Ser Glu Arg Ala Gly Gly Lys Leu Ser Leu Asp Leu Asn 465 470 475 480 Ala Gly Ser Ile Val Leu Gly Met Leu Asp Val Pro Ser Thr Gly Gly 485 490 495 Trp Gln Lys Trp Thr Thr Ile Ser His Thr Val Asn Val Asp Ser Gly 500 505 510 Thr Tyr Asn Leu Gly Ile Tyr Val Gln Arg Ala Ser Trp Asn Ile Asn 515 520 525 Trp Ile Lys Ile Thr Lys Ile Pro Glu Gln Ser Asn Leu Asn Gln Gly 530 535 540 Arg Arg Asn Ser Lys Leu Ile Gln Ala Glu Ser Tyr Phe Ser Tyr Ser 545 550 555 560 Glu Val Gln Leu Glu Asp Thr Leu Asp Val Gly Gly Gly Lys Asn Val 565 570 575 Lys Cys Asp Lys Glu Gly Ala Trp Met Ala Tyr Lys Asp Ile Asp Phe 580 585 590 Pro Ser Ser Gly Ser Tyr Arg Val Glu Tyr Arg Val Ala Ser Glu Arg 595 600 605 Ala Gly Gly Lys Leu Ser Leu Asp Leu Asn Ala Gly Ser Ile Val Leu 610 615 620 Gly Met Leu Asp Ile Pro Ser Thr Gly Gly Leu Gln Lys Trp Thr Thr 625 630 635 640 Ile Ser His Ile Val Asn Val Asp Leu Gly Thr Tyr Asn Leu Gly Ile 645 650 655 Tyr Val Gln Lys Ala Ser Trp Asn Ile Asn Trp Ile Arg Ile Thr Lys 660 665 670 Val <210> 53 <211> 1465 <212> DNA <213> Limulus polyphemus <400> 53 ctggaatgag gctatacata tagaatttgc acggctgtct cgccaacgtc acacgcatgc 60 ctactacccg gatgaaattt ggacaggaat gagatttcat agcacagcgg catggtacag 120 agttcggtga agaaggcaaa taaattcact gtataatctc ctaaattgaa atgtttctgt 180 gttatgttgt tttgtatgtt ggtgtcgcag gaatctactg tagccaggaa ccaaaatgga 240 agctcgtctg gtcggatgaa tttaccaatg gaatcagttc agattgggaa ttcgaaacgg 300 gcaatggccc caacggttgg ggcaataacg aactgcaata ttatcgtcgt gaaaataccc 360 gagttgaggg cgggaaatta ataattacag ctaaaaaaga agattatgag ggtttcaggt 420 acacttctgc caagctgaaa acccagttca ataaaccttg gaaagatggt aaaattgaag 480 ccagaatgtc gattccatca tttcgggggg tctgggtggc gttctggatg ttaggagaca 540 tcaccgatac tgatagctgg ccctcttccg gtgaaattga ctttaaggaa catataaata 600 ccaacaatga agttagagga actattcact ggtctacttc tgatgacgct gatacacttc 660 atggcagagg aaccaatact gactatcaca tttattctgt agagtggaat tcttccgtta 720 ttagatggtt tgttgatgga aatcagtact ttgaggtgaa tattcagaga ggagcaactg 780 gaacaaacgc atttcataac aaagttttcg ttattttaaa catggctatt ggtggaaact 840 ggccaggatt caatgttgct gatgaggctt tccctgctaa catgtatgta gattatgtcc 900 gtgtatatca ggatgccaat acaccttctc ctgttgacgt tgacgttact gatttatctg 960 gttactattt tcttcaaaat aggcacagtg aactgtatct tgatgtcagt ttctccagta 1020 acaaagatgg agcatttcta caacaatggc cttataacgg taatgctaac caacagtttg 1080 attttgtaca tctcggaaat aatatatata aaattaccaa taaaaatagt ggaaaatctc 1140 tggatgtcta caatgtaggg actgaaaatg gtgtcagaat tcaacagatg ccgtatagag 1200 ggagctacaa tcagcagttt attgtacaag atgttggaga tggttattat aagatatttg 1260 cacgcaacag cagaaagtta gtggaagtag cagatttcaa taaagaccca ggaggaaaaa 1320 tacaacaatg gtctgatgat ggccaattat ccggacagtg gaaacttatt cgaaataaag 1380 ctaattctaa agtaattcag gcagaaagtt attttgctag ttcaaaagta caattggaag 1440 atacctcgga tgtaggaggc gggaa 1465 <210> 54 <211> 1459 <212> DNA <213> Limulus polyphemus <400> 54 ctggaatgag gctatacata tagaatttgc acggctgtct cgccaacgtc acacgcatgc 60 ctactacccg gatgaaattt ggacaggaat gagatttcat agcacagcgg catggtacag 120 agttcggtga agaaggcaaa taaattcact gtataatctc ctaaattgaa atgtttctgt 180 gttatgttgt tttgtatgtt ggtgtcgcag gaatctactg tagccaggaa ccaaaatgga 240 agctcgtctg gtcggatgaa tttaccaatg gaatcagttc agattgggaa ttcgaaacgg 300 gcaatggccc caacggttgg ggcaataacg aactgcaata ttatcgtcgt gaaaataccc 360 gagttgaggg cgggaaatta ataattacag ctaaaaaaga agattatgag ggtttcaggt 420 acacttctgc caagctgaaa acccagttca ataaaccttg gaaagatggt aaaattgaag 480 ccagaatgtc gattccatca tttcgggggg tctgggtggc gttctggatg ttaggagaca 540 tcaccgatac tgatagctgg ccctcttccg gtgaaattga ctttaaggaa catataaata 600 ccaacaatga agttagagga actattcact ggtctacttc tgatgacgct gatacacttc 660 atggcagagg aaccaatact gactatcaca tttattctgt agagtggaat tcttccgtta 720 ttagatggtt tgttgatgga aatcagtact ttgaggtgaa tattcagaga ggagcaactg 780 gaacaaacgc atttcataat aacgttttcg ttattttaaa catggctatt ggtggaaact 840 ggccaggatt caatgttgct gatgaggctt tccctgctaa catgtatgta gattatgtcc 900 gtgtatatca ggatgccaat acaccttctc ctgttgacgt tactcattta tctggttact 960 attttcttca aaataggcac agtgaactgt atcttgatgt cagtggttcc agtaacgaag 1020 atggagcatt tctacaacaa tggccttata acggtaatgc taaccaacag tttgattttg 1080 tacatctcgg aaataaggtt tataaaatta tcaataaaaa tagtggaaaa tctctggatg 1140 tttacgagtt agggactgat aatggtgtca gaatccaaca gtggtcgtat ggagggggct 1200 acaatcagca gtttattgta caagatgttg gagatggtta ttataagata tttgcacgca 1260 gcactggaaa gttagtggaa gtagcagatt tgaataaaga cccaggagga aagatacaac 1320 aatggtctga tgatggccaa ttatccggac agtggaaact tattcgaaat aaagctaatt 1380 ctaaattgat tcaggcagaa agttattttg ctagttcaaa agtacaattg gaagatacct 1440 cggatgtagg aggcgggaa 1459 <210> 55 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide primer <400> 55 gattacgcca agcttgccag aatgtcgatt ccatc 35 <210> 56 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide primer <400> 56 gtaaaacgac ggccagt 17 <210> 57 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide primer <400> 57 caggaaacag ctatgac 17 <210> 58 <211> 2013 <212> DNA <213> Limulus polyphemus <400> 58 gggggggttc tgggtggcgt tctggatgtt aggagacatc accgatactg atagctggcc 60 ctcttccggt gaaattgact ttaaggaaca tataaatacc aacaatgaag ttagaggaac 120 tattcactgg tctacttctg atggtgctca tacgcatcat ggcagaggaa ccaatactga 180 ctatcacatt tattctgtag agtggaattc ttccgttatt agatggtttg ttgatggaaa 240 tcagtacttt gaggtgaata ttcagagagg agcaactgga acaaacgcat ttcataacaa 300 agttttcgtt attttaaaca tggctattgg tggaaactgg ccaggattca atgttgctga 360 tgaggctttc cctgctaaca tgtatgtaga ttatgtccgt gtatatcagg atgccaatac 420 accttctcct gttgacgttg acgttactga tttatctggt tactattttc ttcaaaatag 480 gcacagtgaa ctgtatcttg atgtcagttt ctccagtaac aaagatggag catttctaca 540 acaatggcct tataacggta atgctaacca acagtttgat tttgtacatc tcggaaataa 600 tatatataaa attaccaata aaaatagtgg aaaatctctg gatgtctaca atgtagggac 660 tgaaaatggt gtcagaattc aacagatgcc gtatagaggg agctacaatc agcagtttat 720 tgtacaagat gttggagatg gttattataa gatatttgca cgcaacagca gaaagttagt 780 ggaagtagca gatttcaata aagacccagg aggaaagata caacaatggt ctgatgatgg 840 ccaaatatcc ggacagtgga aacttattcg aaataaagtt aattctaaag taattcaggc 900 agaaagttat tttgctagtt taggagtaca attggaagac acctcggatg taggaggcgg 960 gaagaatgtt aagtgtgata ctgaaggagc ctggatggct tacaaggata tcaatttccc 1020 cagttcaggt agttatcaag tagagtacag agtggcaagc gaacgtgcag gaggaaagtt 1080 gtctctggat ttgaatgcag gttctatagt gcttggaatg ctgaatgttc cttcaacagg 1140 aggatggcag aagtggacca ccatttccca tacagtaaag gtggattcag gtacttataa 1200 cttggggatc tacgttcaac gacccaggtg gaatatcaac tggattaaga ttacagaagc 1260 acccggacag tcaaaaccta ttcaaagaag tgataccgat tctaaagtaa ttcaggcaga 1320 aagttatttt gctagttcaa aagtacaatt ggaagatacc tcggatgttg gaggcgggaa 1380 gaatgttaag tgtgataatg aaggagcctg gatggcctac aaggatatta attttcccag 1440 ttcaggtagt tatcaaatag agtacagagt ggcaagtgaa cgtgcaggag gaaagttgtc 1500 tctcgatttg aatgcaggtt ctatagtgct tggaatgctg gatgttcctt caactggggg 1560 atggcagaag tggaccccca tttcccacac agtgaatgtg agttcgggta catataactt 1620 ggggatctac gttcaacgag ctgcgtggaa tatcaactgg attaagatta caaaggttta 1680 gaatacaaga gtaaattaat tttatttttt tgaagaaaca acagatcttt gatcatctgg 1740 agtttatcta actactacag aatccactat cacctttcta gatgtattca ttgctgatga 1800 tagtgatgta taactaatga atgagaagat tatcaacaga accactgatg tattgttata 1860 tcttatggag ggtacataat cgttaaaaag ctacatttgt aataaatatg cctttaagaa 1920 gtgtggtttt ttttacaata aatatatttt aattttacaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1980 aaaaaaaagt actctgcgtt gataccactg ctg 2013 <210> 59 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide primer <400> 59 cgcgttggtt ttagagggca 20 <210> 60 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide primer <400> 60 acgtcgccaa ctcccattgt 20 <210> 61 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide primer <400> 61 aaccaagtga ccatgaaaac cactctatgg acttt 35 <210> 62 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide primer <400> 62 gatggtggtg ctcgagttaa aatactggca caacttc 37 <210> 63 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide primer <400> 63 aaccaagtga ccatgaaaac cactctatgg acttt 35 <210> 64 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide primer <400> 64 gatggtggtg ctcgagttaa aatactggca caacttc 37 <210> 65 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PA tag peptide <400> 65 Gly Val Ala Met Pro Gly Ala Glu Asp Asp Val Val 1 5 10 <210> 66 <211> 2073 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <220> <221> sig_peptide <222> (1)..(60) <220> <221> misc_feature <222> (2017)..(2052) <223> PA Tag <220> <221> misc_feature <222> (2053)..(2070) <223> 6 x His Tag <400> 66 atggcaatgt tcctgtgcta cgtggtgctg gtggtgggcg tgaccggcat ctgctgctcc 60 caggagacca actggaagct ggtgtggtcc gacgagttca ccaacggcat ctcctccgac 120 tgggagttcg agaccggtaa cggtcccaac ggctggggca acaacgagct gcagtactac 180 cgccgcgaga acgctcgcgt ggagggcggc aagctgatca tcaccgctaa gaaggaggac 240 tacgagggct tccgctacac ctccgctaag ctgaagaccc agttcaacaa gccctggaag 300 gacggcaaga tcgaggctcg catgtccatc ccctccttcc gcggtgtgtg ggtggctttc 360 tggatgctgg gcgacatcac cgacaccgac tcctggcctt cctccggtga gatcgacttc 420 aaggagcaca tcaacaccaa caacgaggtg cgcggcacca tccactggtc cacctccgac 480 ggcgctcaca cccaccacgg ccgcggcacc aacaccgact accacatcta ctccgtggag 540 tggaactcct ccgtgatccg ctggttcgtg gacggcaacc agtacttcga ggtgaacatc 600 cagcgcggcg ctaccggtac caacgctttc cacaacaagg tgttcgtgat cctgaacatg 660 gctatcggcg gtaactggcc cggcttcaac gtggctgacg aggctttccc cgctaacatg 720 tacgtggact acgtgcgcgt gtaccaggac gctaacaccc cctcccccgt ggacgtcgac 780 gtgaccgacc tgtccggtta ctacttcctg cagaaccgcc actccgagct gtatctcgac 840 gtcagcttca gctccaacaa ggatggcgct ttcctccagc agtggcctta caacggcaat 900 gccaaccagc aattcgactt cgtccatctc ggcaacaaca tctacaagat caccaataag 960 aactccggta agtccctgga cgtctacaac gtcggtaccg aaaacggcgt gcgcattcag 1020 cagatgccct accgcggctc ctacaaccaa cagttcatcg tccaggacgt cggcgacggc 1080 tactacaaga tcttcgcccg taattcccgc aagctcgtgg aagtggctga cttcaacaag 1140 gaccctggcg gcaagatcca acagtggagc gacgacggcc agatctccgg ccagtggaag 1200 ctcatccgca acaaggtcaa tagcaaggtc atccaggccg agagctattt cgctagcctg 1260 ggtgtccaac tggaggacac cagcgacgtg ggtggcggta aaaacgtgaa atgcgacacc 1320 gagggcgctt ggatggccta caaggacatc aatttcccct cctccggctc ctaccaggtg 1380 gagtaccgcg tcgcttccga acgtgctggc ggcaagctgt ccctggacct gaacgccggt 1440 agcatcgtgc tgggcatgct gaacgtcccc tccaccggtg gctggcagaa gtggaccacc 1500 atcagccaca ctgtgaaggt ggactccggc acctataacc tgggtatcta cgtgcagcgc 1560 ccccgctgga acatcaactg gatcaagatc accgaggccc ccggccaatc caaacccatc 1620 cagcgcagcg acaccgactc caaggtgatc caagccgagt cctactttgc tagcagcaag 1680 gtgcagctgg aggataccag cgacgtcggt ggtggcaaga acgtgaagtg cgacaacgag 1740 ggcgcctgga tggcttacaa ggacatcaac ttcccctcct ccggttccta ccagatcgag 1800 taccgcgtgg cttccgagcg tgctggtggc aagctgtccc tggacctgaa cgctggctcc 1860 atcgtgctgg gtatgctgga cgtgccttcc accggcggtt ggcagaagtg gaccaccatc 1920 tcccacaccg tgaacgtgtc ctccggcacc tacaacctgg gcatctacgt gcagcgtgcc 1980 gcctggaaca tcaactggat caagatcacc aaggtgggcg tggctatgcc cggtgctgag 2040 gacgacgtgg tgcatcacca ccatcaccac taa 2073 <210> 67 <211> 421 <212> PRT <213> Synthetic polypeptide <220> <221> SIGNAL <222> (1)..(24) <220> <221> MUTAGEN <222> (25)..(41) <223> HAT tag <220> <221> MUTAGEN <222> (42)..(137) <223> SUMO tag <400> 67 Met Lys Thr Thr Leu Trp Thr Phe Phe Ala Leu Ala Met Ala Leu Phe 1 5 10 15 Ser Ile Asn Val Thr Ala Ser Glu Lys Asp His Leu Ile His Asn Val 20 25 30 His Lys Glu Glu His Ala His Asn Lys Asp Ser Glu Val Asn Gln Glu 35 40 45 Ala Lys Pro Glu Val Lys Pro Glu Val Lys Pro Glu Thr His Ile Asn 50 55 60 Leu Lys Val Ser Asp Gly Ser Ser Glu Ile Phe Phe Lys Ile Lys Lys 65 70 75 80 Thr Thr Pro Leu Arg Arg Leu Met Glu Ala Phe Ala Lys Arg Gln Gly 85 90 95 Lys Glu Met Asp Ser Leu Thr Phe Leu Tyr Asp Gly Ile Glu Ile Gln 100 105 110 Ala Asp Gln Thr Pro Glu Asp Leu Asp Met Glu Asp Asn Asp Ile Ile 115 120 125 Glu Ala His Arg Glu Gln Ile Gly Gly Met Ser Val Thr Ser Arg Val 130 135 140 Arg Arg Glu Ile Asn Glu Glu His Cys Gly Ile Arg Pro Thr Ala Pro 145 150 155 160 Arg Ile Ile Lys Gly Arg Ile Ser Ile Pro His Ser Trp Pro Trp Met 165 170 175 Val Gly Ile Phe Gln Val Asp Pro Leu Leu Phe Ile Cys Gly Gly Thr 180 185 190 Ile Ile Asn Lys Val Ser Val Val Thr Ala Ala His Cys Leu Val Thr 195 200 205 Gln Ser Gly Asn Arg Gln Asn Ser Ser Ile Val Val Arg Val Gly Ala 210 215 220 His Asp Ile Asp Asn Ser Gly Ile Asp Tyr His Val Asp Lys Ile Ile 225 230 235 240 Val His Gln Asp Tyr Lys Tyr Arg Ser Gln Tyr Tyr Asp Ile Gly Leu 245 250 255 Ile Leu Leu Ser Lys Arg Ile Glu Tyr Asn Tyr Lys Val Arg Pro Val 260 265 270 Cys Ile Pro Glu Leu Asn Lys Leu Asn Val Asn Leu Asn Asn Lys Glu 275 280 285 Val Val Val Ile Gly Trp Gly Val Thr Glu Arg Gly Ser Glu Lys His 290 295 300 Asn Val Leu Arg Glu Leu Glu Leu Pro Val Val Thr Asn Glu Leu Cys 305 310 315 320 Asn Lys Ser Tyr Gln Thr Ile Ser Phe Ser Gly Leu Asn Arg Gly Ile 325 330 335 Thr Asp Asp Met Ile Cys Ala Gly Tyr Gln Glu Gly Gly Arg Asp Ser 340 345 350 Cys Glu Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Met Tyr His Asp Pro Thr Thr 355 360 365 Gly Arg Val Glu Leu Val Gly Val Val Ser Phe Gly Phe Gly Cys Ala 370 375 380 Arg Pro Asn Phe Pro Gly Val Tyr Thr Arg Leu Ser Ser Tyr Gly Asn 385 390 395 400 Trp Phe Gln Lys Val Thr Phe Gly Tyr Leu Leu Ala Thr Leu Phe Glu 405 410 415 Val Val Pro Val Phe 420 <210> 68 <211> 1266 <212> DNA <213> Synthetic polypeptide <220> <221> sig_peptide <222> (1)..(72) <220> <221> misc_feature <222> (73)..(123) <220> <221> misc_feature <222> (124)..(411) <223> SUMO tag <400> 68 atgaaaacca ctctgtggac tttcttcgct ctggctatgg ccctcttttc catcaacgtg 60 accgcctccg agaaggacca tctcatccac aacgtccaca aggaggagca cgcccacaac 120 aaggactccg aggtgaacca agaggctaag cccgaggtga agcccgaggt gaagcccgag 180 acccacatca atctgaaggt gagcgacggc tcctccgaga tcttcttcaa gatcaagaag 240 actacccccc tccgccgcct catggaagcc tttgctaagc gccaaggtaa ggagatggac 300 tctctgactt ttctgtacga cggcatcgaa atccaagctg accaaacccc cgaggatctg 360 gacatggagg acaacgacat catcgaggcc caccgtgaac agatcggcgg tatgtccgtg 420 accagccgtg tgcgtcgtga aatcaacgag gaacactgcg gcatccgtcc taccgcccct 480 cgcatcatta agggccgtat cagcatcccc cacagctggc cttggatggt gggcatcttc 540 caagtggacc ctctgctgtt catctgcggc ggcaccatca tcaacaaagt gagcgtcgtg 600 accgccgctc attgtctggt cactcaatcc ggtaaccgcc agaactcctc catcgtggtc 660 cgtgtgggtg cccacgacat cgacaacagc ggcatcgact accacgtcga caaaatcatc 720 gtgcaccaag actacaagta ccgcagccag tactacgaca tcggtctgat tctgctcagc 780 aaacgtatcg agtataacta caaggtgcgc cccgtgtgca tccccgagct caacaagctc 840 aacgtgaatc tcaacaacaa agaggtggtg gtgatcggtt ggggtgtgac cgaacgtggc 900 agcgaaaagc ataacgtgct gcgcgagctg gagctgcccg tggtgaccaa cgagctctgc 960 aacaagtcct accagaccat cagcttcagc ggcctcaacc gcggcatcac cgatgacatg 1020 atctgcgctg gctatcaaga gggtggccgt gatagctgcg agggtgactc cggtggtcct 1080 ctgatgtacc acgaccccac taccggccgt gtggaactcg tgggcgtggt gtccttcggt 1140 ttcggctgcg cccgtcccaa cttccccggt gtgtacaccc gtctgtcctc ctacggcaac 1200 tggttccaga aggtgacctt cggttatctg ctggctactc tgttcgaggt ggtgcccgtg 1260 ttctaa 1266 <210> 69 <211> 855 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 69 atgtccgtga ccagccgtgt gcgtcgtgaa atcaacgagg aacactgcgg catccgtcct 60 accgcccctc gcatcattaa gggccgtatc agcatccccc acagctggcc ttggatggtg 120 ggcatcttcc aagtggaccc tctgctgttc atctgcggcg gcaccatcat caacaaagtg 180 agcgtcgtga ccgccgctca ttgtctggtc actcaatccg gtaaccgcca gaactcctcc 240 atcgtggtcc gtgtgggtgc ccacgacatc gacaacagcg gcatcgacta ccacgtcgac 300 aaaatcatcg tgcaccaaga ctacaagtac cgcagccagt actacgacat cggtctgatt 360 ctgctcagca aacgtatcga gtataactac aaggtgcgcc ccgtgtgcat ccccgagctc 420 aacaagctca acgtgaatct caacaacaaa gaggtggtgg tgatcggttg gggtgtgacc 480 gaacgtggca gcgaaaagca taacgtgctg cgcgagctgg agctgcccgt ggtgaccaac 540 gagctctgca acaagtccta ccagaccatc agcttcagcg gcctcaaccg cggcatcacc 600 gatgacatga tctgcgctgg ctatcaagag ggtggccgtg atagctgcga gggtgactcc 660 ggtggtcctc tgatgtacca cgaccccact accggccgtg tggaactcgt gggcgtggtg 720 tccttcggtt tcggctgcgc ccgtcccaac ttccccggtg tgtacacccg tctgtcctcc 780 tacggcaact ggttccagaa ggtgaccttc ggttatctgc tggctactct gttcgaggtg 840 gtgcccgtgt tctaa 855

Claims (7)

1. 배열 번호 2 또는 배열 번호 4로 나타나는 아미노산 배열과 동일 혹은 실질적으로 동일한 아미노산 배열을 함유하는 FactorG α 서브 유닛과, 배열 번호 6, 8, 10, 12, 14, 또는 16 중 어느 하나로 나타나는 아미노산 배열과 동일 혹은 실질적으로 동일한 아미노산 배열을 함유하는 FactorG β 서브 유닛의 조합의 헤테로 다이머.
2. 청구항 1에 있어서,
   하기로부터 선택되는, 헤테로 다이머:
   (1) 배열 번호 2로 나타나는 아미노산 배열을 함유하는 FactorG α 서브 유닛과, 배열 번호 6으로 나타나는 아미노산 배열을 함유하는 FactorG β 서브 유닛의 조합의 헤테로 다이머,
   (2) 배열 번호 2로 나타나는 아미노산 배열을 함유하는 FactorG α 서브 유닛과, 배열 번호 8로 나타나는 아미노산 배열을 함유하는 FactorG β 서브 유닛의 조합의 헤테로 다이머,
   (3) 배열 번호 2로 나타나는 아미노산 배열을 함유하는 FactorG α 서브 유닛과, 배열 번호 12로 나타나는 아미노산 배열을 함유하는 FactorG β 서브 유닛의 조합의 헤테로 다이머,
   (4) 배열 번호 2로 나타나는 아미노산 배열을 함유하는 FactorG α 서브 유닛과, 배열 번호 14로 나타나는 아미노산 배열을 함유하는 FactorG β 서브 유닛의 조합의 헤테로 다이머,
   (5) 배열 번호 4로 나타나는 아미노산 배열을 함유하는 FactorG α 서브 유닛과, 배열 번호 10으로 나타나는 아미노산 배열을 함유하는 FactorG β 서브 유닛의 조합의 헤테로 다이머,
   (6) 배열 번호 4로 나타나는 아미노산 배열을 함유하는 FactorG α 서브 유닛과, 배열 번호 16으로 나타나는 아미노산 배열을 함유하는 FactorG β 서브 유닛의 헤테로 다이머.
3. 청구항 2에 있어서,
   (1), (2), 또는 (5)로부터 선택되는, 헤테로 다이머.
4. 시료와, 배열 번호 2 또는 배열 번호 4로 나타나는 아미노산 배열을 함유하는 FactorG α 서브 유닛과, 배열 번호 6, 8, 10, 12, 14, 또는 16 중 어느 하나로 나타나는 아미노산 배열과 동일 혹은 실질적으로 동일한 아미노산 배열을 함유하는 FactorG β 서브 유닛의 조합의 헤테로 다이머를 이용한, β-글루칸의 측정 방법.
5. 배열 번호 2 또는 배열 번호 4로 나타나는 아미노산 배열을 함유하는 FactorG α 서브 유닛.
6. 배열 번호 6, 8, 10, 12, 14, 또는 16 중 어느 하나로 나타나는 아미노산 배열과 동일 혹은 실질적으로 동일한 아미노산 배열을 함유하는 FactorG β 서브 유닛.
7. 배열 번호 2 또는 배열 번호 4로 나타나는 아미노산 배열과 동일 혹은 실질적으로 동일한 아미노산 배열을 함유하는 FactorG α 서브 유닛과, 배열 번호 6, 8, 10, 12, 14, 또는 16 중 어느 하나로 나타나는 아미노산 배열과 동일 혹은 실질적으로 동일한 아미노산 배열을 함유하는 FactorG β 서브 유닛의 조합의 헤테로 다이머를 포함하는, β-글루칸 측정용 키트.

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