JP6141205B2 - 窒化ケイ素(Si3N4)親和性ペプチド、及びその利用 - Google Patents
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Description
項1.以下の(1−1)もしくは(1−2)のペプチドまたはその断片からなる、窒化ケイ素親和性ペプチド;
(1−1)配列番号1、2及び23〜27のいずれかで表されるアミノ酸配列からなるペプチド、
(1−2)前記(1−1)のアミノ酸配列において1または複数のアミノ酸が欠失、置換及び/または付加されたアミノ酸配列からなり、且つ、窒化ケイ素親和性を有するペプチド。
項2.前記断片が6〜77のアミノ酸残基からなるペプチドである、項1に記載の窒化ケイ素親和性ペプチド。
項3.前記断片が配列番号3〜11及び28〜35のいずれかで表されるアミノ酸配列からなるペプチドである、項1または2に記載の窒化ケイ素親和性ペプチド。
項4.項1〜3のいずれかに記載の窒化ケイ素親和性ペプチドをコードするポリヌクレオチド。
項5.前記ポリヌクレオチドが配列番号12〜22及び36〜48のいずれかで表されるポリヌクレオチドである、項4に記載のポリヌクレオチド。
項6.項4または5に記載のポリヌクレオチドを含有する、窒化ケイ素親和性ペプチド発現ベクター。
項7.項6に記載のポリヌクレオチドと目的タンパク質をコードするポリヌクレオチドとが連結されてなる、項1〜3のいずれかに記載の窒化ケイ素親和性ペプチドと目的タンパク質とのペプチド融合タンパク質発現ベクター。
項8.項7に記載のベクターを宿主細胞に導入して形質転換させることにより得られる形質転換体。
項9.項8に記載の形質転換体から得られる、項1〜3のいずれかに記載の窒化ケイ素親和性ペプチドと目的タンパク質とのペプチド融合タンパク質。
項10.項1〜3のいずれかに記載の窒化ケイ素親和性ペプチドが結合されてなる、窒化ケイ素基材。
項11.前記窒化ケイ素親和性ペプチドを介して目的タンパク質が窒化ケイ素基材に固定化されてなる、項10に記載の窒化ケイ素基材。
項12.目的タンパク質に導入された項1〜3のいずれかに記載の窒化ケイ素親和性ペプチドと窒化ケイ素基材とを接触させる工程を含有する、目的タンパク質の窒化ケイ素基材への固定化方法。
項13.窒化ケイ素基材と接触される窒化ケイ素親和性ペプチドが、項7に記載のベクターまたは項8に記載の形質転換体を用いて作製されたペプチド融合タンパク質を構成する窒化ケイ素親和性ペプチドである、項12に記載の固定化方法。
項14.項10に記載の窒化ケイ素基材に結合した窒化ケイ素親和性ペプチドと目的タンパク質とを結合させる工程を含有する、目的タンパク質の窒化ケイ素基材への固定化方法。
項15.項1〜3のいずれかに記載の窒化ケイ素親和性ペプチドを含有する、窒化ケイ素基材への目的タンパク質固定化用組成物。
項16.項1〜3のいずれかに記載の窒化ケイ素親和性ペプチドからなる、窒化ケイ素基材への目的タンパク質の固定化用リンカー。
項17.目的タンパク質を窒化ケイ素基材へ固定させるための、項1〜3のいずれかに記載の窒化ケイ素親和性ペプチドの使用。
1.窒化ケイ素親和性ペプチド
本発明は窒化ケイ素親和性ペプチドを提供する。本発明の窒化ケイ素親和性ペプチドは、以下の(1−1)もしくは(1−2)のペプチドまたはその断片からなる;
(1−1)配列番号1、2及び23〜27のいずれかで表されるアミノ酸配列からなるペプチド、
(1−2)前記(1−1)のアミノ酸配列において1または複数のアミノ酸が欠失、置換及び/または付加されたアミノ酸配列からなり、且つ、窒化ケイ素親和性を有するペプチド。
本発明は、更に、前記窒化ケイ素親和性ペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。本発明においてポリヌクレオチドは、前記窒化ケイ素親和性ペプチドをコードするポリヌクレオチドである限り制限されず、以下のポリヌクレオチドが例示される;
(2−1)前記窒化ケイ素親和性ペプチドをコードするポリヌクレオチド、
(2−2)配列番号12〜22及び36〜48のいずれかで表されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、
(2−3)前記(2−1)及び(2−2)のいずれかのポリヌクレオチドの相補鎖に対して、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つ、窒化ケイ素親和性ペプチドをコードするポリヌクレオチド。
本発明は、前記ポリヌクレオチドを含有する窒化ケイ素親和性ペプチド発現ベクターを提供する。本発明の窒化ケイ素親和性ペプチド発現ベクターは、前記ポリヌクレオチドを含んでおり、且つ、その宿主細胞において当該ポリヌクレオチドの塩基配列に基づき前記窒化ケイ素親和性ペプチド、あるいは、前述の窒化ケイ素親和性ペプチドを含有する窒化ケイ素基材への目的タンパク質の固定化用リンカーを発現できるものであれば特に制限されない。ベクターは、従来公知のように一般に宿主細胞との関係から適宜選択される。
本発明は、前記ペプチド融合タンパク質発現ベクターを宿主細胞に導入して形質転換させることにより得られる形質転換体を提供する。
本発明は、前記形質転換体から得られる、前記窒化ケイ素親和性ペプチドと前記目的タンパク質とのペプチド融合タンパク質を提供する。
本発明は、前記窒化ケイ素親和性ペプチドが結合されてなる窒化ケイ素基材を提供する。これは、前記窒化ケイ素親和性ペプチドが窒化ケイ素基材に結合されてなるものである。窒化ケイ素親和性ペプチドは前述の通りである。
本発明は、目的タンパク質に導入された前記窒化ケイ素親和性ペプチドと窒化ケイ素基材とを接触させる工程を含有する、目的タンパク質の窒化ケイ素基材への固定化方法を提供する。
実施例1
以下の手順に従い、配列番号1で表されるポリペプチド(SIN1ペプチド)、及び、配列番号2で表されるポリペプチド(SIN2ペプチド)の窒化ケイ素(Si3N4)基材に対する親和性について検討した。
Elongation factor Tu(ELN)発現ベクターの構築
1)DNA Purification Kit (プロメガ株式会社製)を用いて大腸菌BL21(DE3)(Novagen製)の染色体DNAの抽出を行った。
2)染色体DNAを鋳型とし、KOD plus ver.2 PCR kit(東洋紡績株式会社製)を用いてPCRを行い、ELNの遺伝子を増幅した。
3)増幅したELNの遺伝子をpET-22(b)ベクター(Novagen製)のNdeIサイトとNotIサイトの間にIn-Fusion(登録商標)Advantage PCR Cloning Kit(クロンテック社製)を用いて挿入し、クローニングした。
4)上記のベクターで大腸菌HST08 Premium(タカラバイオ株式会社製)を形質転換し、LB-Amp寒天培地中で一晩静置培養をした。
5)Amp.含有プラスグロウ(ナカライテスク株式会社製)を1.5mlチューブに1mlとり、寒天プレートからコロニー植菌し、37℃、200rpmで約7時間培養した。
6)培養後、アルカリSDS法によってベクターを回収・精製した。
7)アガロース電気泳動によって遺伝子の挿入を確認し、さらに、DNAシーケンス解析によって挿入されたELN遺伝子のヌクレオチド配列を確認した。
8)上記工程6)で得られたベクターで大腸菌JM109(タカラバイオ株式会社製)を形質転換し、培養後、ELN発現ベクターを回収、精製した。
1)大腸菌JM109のコンピテントセル500μlに、GST発現ベクター(pGEX-3X)(GEヘルスケア株式会社製)を1μl加え、氷上で10分間インキュベートした。
2)42℃で45秒間インキュベートし、氷上で冷却した。
3)Amp.含有プラスグロウを15mlチューブに10mlとり、形質転換した上記大腸菌を500μl加え、37℃、200rpmで一晩培養した。
4)4500rpmで15分間遠心分離し、上清を除去した。
5)アルカリ溶解法によってpGEX-3Xを回収した。
6)回収したベクター溶液215μlに、NEBuffer(New England Biolabs製)25μl、×100 BSA(New England Biolabs製)2.5μl、CIAP(Calf intestine Alkaline Phosphatase、東洋紡績株式会社製)2.5μl、Eco RI-HF(New England Biolabs製)2.5μl、Bam HI-HF(New England Biolabs製)2.5μlを加え、37℃で一晩インキュベートし、ベクターの切断・脱リン酸化処理を行った。pGEX-3Xの切断状況はアガロース電気泳動により確認した。
7)酵素処理を行ったベクターをPCR Clean-Up System (プロメガ株式会社製)を用いて精製した。
1)前述のELN発現ベクターを鋳型として、SIN1ペプチド及びSIN2ペプチドをコードするヌクレオチド配列をそれぞれ増幅した。SIN1ペプチドをコードするヌクレオチド配列は配列番号12で表され、SIN2ペプチドをコードするヌクレオチド配列は配列番号13で表される。
2)前記1)で得られたヌクレオチド配列を、前述のように構築したGST発現ベクターpGEX-3XのBam HIサイトとEco RIサイトの間にクローニングし、DNAシーケンス解析によってベクター中に挿入されたSIN1ペプチド及びSIN2ペプチドをコードするヌクレオチド配列をそれぞれ確認した。
3)構築した発現ベクターで大腸菌BL21(DE3)を形質転換し、アンピシリン(Amp.、ナカライテスク株式会社製)含有2×YT培地(Novagen製)10ml中で一晩前培養した。
4)前記3)と同様の培地50mlに、前培養液をOD600=0.1になるように加え、37℃、200rpmでOD600=1.0になるまで(約2時間)培養した。
5)1M IPTG(Isopropyl-β-D(-)-thiogalactopyranoside、和光純薬株式会社製)を5μl加え、30℃、200rpmでさらに7時間培養した。
6)培養後、4500rpmで20分間遠心分離し、上清を除去した。
7)菌体にBug buster(BugButer Protein Extraction Reagent、Novagen製) 3ml、Benzonase Nuclease(Novagen製)1.5μl、Lysozyme(生化学工業株式会社製)3mgを加えよく撹拌し、37℃で1時間インキュベートすることにより、菌体を溶菌した。
8)10000rpmで20分間遠心分離し、上清を可溶性画分として回収した。
9)可溶性画分をGSTrap HPカラム(GEヘルスケア株式会社製)中にアプライし、1mM DTT(Dithiothreitol、ナカライテスク株式会社製)を含むPBSでカラム内を洗浄した。
10)20mM 還元型グルタチオンを含む100mM Tris-HCl(pH 8.0)のグラジェント溶出によって野生型GST、SIN1ペプチド融合GST、及びSIN2ペプチド融合GSTを回収した。
11)溶離液をPBSで一晩透析し、DC Protein Assay Kit(バイオラッドラボラトリーズ株式会社製)によって濃度を定量した。
1)wt-GST、SIN1ペプチド融合GSTまたはSIN2ペプチド融合GSTが50μg/ml(1cm3)となるようPBSを用いてGST溶液を作製し、このGST溶液1mlとSi3N4基材2g(表面積31.2cm2、面積/体積:31.2cm-1)とを接触させ、25℃で3時間インキュベートした。
2)上清を回収し、DC Protein Assay(バイオラッドラボラトリーズ株式会社製)によって上清中のGST濃度をそれぞれ定量した。
3)吸着前後のGSTの濃度差より吸着量を算出し、接触面積(31.2cm2)で除することで吸着密度を計算した。
結果を図1に示す。
以下の手順に従い、配列番号4、5、7及び11で表されるペプチドのSi3N4基材に対する親和性について検討した。なお、以下においてTP24は配列番号4で表されるペプチド、TP25は配列番号5で表されるペプチド、TP14は配列番号7で表されるペプチド、TP19は配列番号11で表されるペプチドを指す。
1)N末端部にビオチンを標識した前記4種類のペプチド(TP24、TP25、TP14、TP19)を委託合成した。これらの各ビオチン化ペプチドは、1mg/mlとなるようにDMFで溶解し、−20℃で保存した。
2)Alexa-Fluor 633標識ストレプトアビジン(SA)10μl(10μg(190pmol))と1.5等量(284pmol)に相当する前記ビオチン化ペプチドを混合し、PBSを加えて1mlとした。
3)得られた混合液1mlをSi3N4基材1g(15.6cm2)と接触させ、25℃で2時間インキュベートした。コントロールとして、SAにPBSを加えて同様にSi3N4基材と接触させ、インキュベートした。
4)インキュベート後、各Si3N4基材をPBSで5回洗浄し、PBS 5ml中に浸した。
5)Si3N4基材をマイクロプレート(Nunc #267061)上に移し、マイクロプレートリーダーにて基材表面の蛍光強度を測定した(励起波長:620nm、蛍光波長:666nm)。なお、シグナル強度のばらつきを考慮して各サンプルとも測定を合計98回行い、平均値と標準偏差を求めた。
結果を図2に示す。
以下の手順に従い、配列番号1〜11で表されるペプチドについて、Si3N4基材に対する親和性の有無を調べた。
1.手順
1)配列番号1〜11で表されるペプチド含むPBS溶液に、実施例1と同じSi3N4基材12g(概算表面積187.4cm2)を混合し、25℃、200rpmで2時間振盪した。
2)当該溶液の上清の一部をHPLCで分析し、残りの溶液を更にSi3N4基材と混合した。その際、1ml当たりの基材量を1.5gとなるように設定した。
3)2)を合計5回繰り返した。
4)吸着後のピーク面積の減少が著しいペプチドがSi3N4基材に対して親和性を有すると判断できることから、吸着前後のクロマトグラムを比較した。
PU-2089 Quaternary Gradient Pump(ジャスコインターナショナル株式会社製)
LC-NetII/ADC(ジャスコインターナショナル株式会社製)
MD-2018Plus Photodiode Array Detector(ジャスコインターナショナル株式会社製)
UV-1575 Intelligent UV/VIS Detector(ジャスコインターナショナル株式会社製)
TSKgel ODS-100Z 3μm (カラムサイズ4.6mmI.D.x15cm)(東ソー株式会社製)
超純水(1L)
TFA(Trifluoroacetic acid、高速液体グラフ用、和光純薬株式会社製)(1ml) 0.1v/v%
Acetonitrile [Chromasolv, for HPLC, gradient grade, ≧99.9%](シグマアルドリッチ ジャパン株式会社製)(1L)
TFA(高速液体グラフ用)(1ml) 0.1v/v%
Non-Sterile 4mm Millex(登録商標)HV syringe Driven Filter Unit (450nm)(ミリポア株式会社製)
プログラム
その結果、吸着前後のクロマトグラムを比較することによって、これらのいずれの溶液を用いた場合であっても、吸着後のピーク面積が減少しており、このことから、配列番号1〜11で表されるペプチドはいずれもSi3N4基材に対する親和性を有することが確認された。従って、これらのアミノ酸配列を有するペプチドによれば、これらのタンパク質を介した、窒化ケイ素基材における目的タンパク質の高密度化、高活性化、高配向制御が可能であることが分かった。更に、そのピーク面積の減少率は50%以上であることが確認された。クロマトグラムの比較によって吸着前後のピーク面積の減少率も把握することができ、減少率が高いほど、そのペプチドの窒化ケイ素に対する親和性が高いと判断できる。窒化ケイ素に対する親和力が一層高い点から、ピーク面積の減少率は50%以上、より好ましくは70%以上、さらに好ましくは80%以上が例示されると考えられた。
以下の手順に従い、各ペプチドの窒化ケイ素基材に対する親和性について検討した。
1.手順
配列番号1及び2で表されるペプチドに代えて、配列番号6〜8及び10で表されるポリペプチド(配列番号17〜19及び21で表されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド)を用いる以外は実施例1と同様の手順にて、各ペプチドとの融合GTSを調製した。以下においてV821は配列番号6で表されるペプチド、TP14は配列番号7で表されるペプチド、V829は配列番号8で表されるペプチド、CT22は配列番号10で表されるペプチドを指す。また、調製された各ペプチドとの融合GTSは、それぞれGST-V821、GST-TP14、GST-V829、GST-CT22と示す。これらも、GSTのC末端部にペプチドを融合させたものである。
結果を図3に示す。図3は、Si3N4基材に対する吸着密度を示す。図3から明らかなように、wt-GSTに対して、GST-V821、GST-CT22、GST-TP14、GST-V829のいずれにおいてもSi3N4基材に対する吸着密度の顕著な向上が認められた。これは、配列番号6〜8及び10で表されるペプチドを導入することによって、GTSをSi3N4基材に容易且つ高密度に固定化できたことを示す。従って、配列番号6〜8及び10のいずれかで表されるペプチドはSi3N4基材に対して良好な親和性を有し、目的タンパク質のSi3N4基材への固定化に有用であることが分かった。また、当該ペプチドはGSTの所望の位置に導入することができ、得られたペプチド融合GSTにおいて吸着密度の向上が認められたことから、当該ペプチドによれば目的タンパク質の活性の維持や配向制御も可能であることが分かった。また、ここには示さないが、配列番号3〜5、9及び11で表されるペプチドをそれぞれGTSに導入した場合も、同様の傾向が認められた。また、図3はpH7における結果であるが、pH9において行った場合も同様の傾向が認められた。
実施例4とは異なる機器を用いて、以下の手順に従い、前述のようにして構築したGST-TP14、GST-V821、GST-V829及びGST-CT22のSi3N4基材に対する親和性について検討した。
1.手順
wt-GSTまたは各ペプチドとの融合GSTが0.1μg/ml、1μg/ml、10μg/ml、100μg/ml(1cm3)となるように、実施例4と同様にしてPBSを用いてGST溶液を作製した。また、本実施例においても各濃度のGST溶液において、更にイオン強度の異なる溶液(イオン強度0.075、0.15、0.3)を作製した。RIfSセンサ(日本写真印刷製Wacaris)にSi3N4基材(センサチップ)を装着し、流速100μl/min でPBSを供給して流路内を平衡化した。GST溶液を100μLずつセンサチップ上に供給し、検出される波長シフト量(Δλ(nm))の値をモニタリングした。2〜3回のインジェクションによって吸着平衡に達した際の波長シフト量の値を吸着量の指標として評価した。
結果を図4に示す。図4から明らかなように、本実施例においても、いずれもペプチド融合GSTを用いた場合であっても、wt-GSTと比較して、吸着量の顕著な向上が認められた。また、ここには示さないが、配列番号3〜5、9及び11で表されるペプチドをそれぞれGTSに導入した場合も、同様の傾向が認められた。
ペプチド融合GSTの吸着密度について検討するとともに、Si3N4基材に固定化させたペプチド融合GSTを構成するGTSが、GTS本来の活性を維持しているかどうかについて検討した。
1.手順
1)wt-GST、GST-TP14またはGST-V821が100μg/ml(1cm3)となるようPBSを用いてGST溶液を作製し、このGST溶液2mlとSi3N4基材2g(表面積31.2cm2、面積/体積:31.2cm-1)とを接触させ、25℃で2時間インキュベートした。
2)上清を回収し、DC Protein Assayによって上清中のGST濃度をそれぞれ定量した。
3)吸着前後のGSTの濃度差より吸着量を算出し、接触面積(31.2cm2)で除することで吸着密度を計算した。
4)次いで、Si3N4基材をPBSで3回、0.1Mリン酸カリウム水溶液(pH6.5)で1回洗浄し、アスピレーターで溶液を完全に除去した。
5)CDNB 1mM、GSH 1mMをそれぞれ含む0.1Mリン酸カリウム水溶液を3ml添加し、25℃、300rpmで撹拌しながら30秒ごとに340nmの吸光度変化を微量分光光度計nano drop (Thermo製)で計測し、吸光度変化(min-1・cm-1)を算出した。生成物CDNB-GSHのモル吸光係数ε=9.6 mM-1・cm-1を基に1分間に生じた生成物量を算出し、酵素活性とした。ただし、1Uとは、1分間に1μmolのCDNB-GSHを生じるのに必要な酵素量である。
6)検出された酵素活性をSi3N4基材の面積で除して単位面積あたりの酵素活性mU/cm-2を計算した。
結果を図5に示す。当該結果から明らかなようにGSTはSi3N4基材に高密度で固定化されており、また、ペプチド融合GSTを構成するGTSは、Si3N4基材に固定化させた後であってもGTS本来の活性を維持していた。このことから、Si3N4親和性ペプチドを目的タンパク質に連結させることによって、目的タンパク質をSi3N4基材上に高密度に固定化でき、固定化された状態であっても目的タンパク質は高い活性を発揮できることが確認できた。また、ここには示さないが、配列番号3〜5及び9〜11で表されるペプチドをそれぞれGSTに導入した場合も、同様の傾向が認められた。
以下の手順に従い、配列番号23〜35で表される各ペプチドについて、Si3N4基材に対する親和性の有無を調べた。
1.手順
1)配列番号23〜35で表されるペプチド含むPBS溶液に、実施例1と同じSi3N4基材10.5g(概算表面積164.02cm2)を混合し、25℃、200rpmで2時間振盪した。
2)当該溶液の上清の一部をHPLCで分析し、残りの溶液を更にSi3N4基材と混合した。その際、1ml当たりの基材量を1.5gとなるように設定した。
3)2)を合計6回繰り返した。
4)吸着後のピーク面積の減少が著しいペプチドがSi3N4基材に対して親和性を有すると判断できることから、吸着前後のクロマトグラムを比較した。
その結果、吸着前後のクロマトグラムを比較することによって、これらのいずれの溶液を用いた場合であっても、吸着後のピーク面積が減少しており、このことから、配列番号23〜35で表される各ペプチドはいずれもSi3N4基材に対する親和性を有することが確認された。従って、これらのアミノ酸配列を有するペプチドによっても、これらのタンパク質を介した、Si3N4基材における目的タンパク質の高密度化、高活性化、高配向制御が可能であることが分かった。更に、そのピーク面積の減少率は50%以上であることが確認された。
以下の手順に従い、配列番号23、24及び26で表される各ペプチドのSi3N4基材に対する親和性について検討した。
1.手順
Isocitrate dehydrogenase (ISD)発現ベクターの構築
ELN遺伝子に代えて、Isocitrate dehydrogenase(ISD)遺伝子を用いた以外は実施例1と同様にしてISD発現ベクターを回収、精製した。
本実施例では、実施例1において精製したものと同一のベクターを用いて、以下の実験を行った。
配列番号6〜8及び10で表されるペプチドに代えて、配列番号23、24及び26で表されるペプチドを用いる以外は実施例5と同様の手順にて、各ペプチドとの融合GTSを調製した。以下においてSIN3は配列番号23で表されるペプチド、SIN4は配列番号24で表されるペプチド、TP4は配列番号26で表されるペプチドを指す。また、調製された各ペプチドとの融合GTSは、それぞれGST-SIN3、GST-SIN4、GST-TP4と示す。調製された各ペプチドとの融合GTSのSi3N4基材への吸着量について、RIfSセンサ(日本写真印刷製Wacaris)にSi3N4基材(センサチップ)を装着したものを用いて、実施例5と同様の手順で評価した。コントロールとして、ペプチドを融合させていない野生型GST(wt-GST)を用いた。なお、GST濃度は、wt-GSTでは100ug/ml、ペプチド融合GTSでは50ug/mlとした。
結果を図6に示す。図6から明らかなように、wt-GSTと比較してGST-SIN3、GST-SIN4、GST-TP4のいずれのペプチド融合GSTでも、Si3N4基材に対する吸着量の向上が認められた。特に、wt-GSTの濃度はGST-SIN3、GST-SIN4、GST-TP4よりも2倍高いにもかかわらず、GST-SIN3、GST-SIN4、GST-TP4において吸着量の有意な向上が認められた。この結果は配列番号23、24及び26のいずれかで表されるペプチドを導入することによっても、GTSをSi3N4基材に容易且つ高密度に固定化できたことを示す。従って、配列番号23、24及び26で表されるペプチドもSi3N4基材に対して良好な親和性を有し、目的タンパク質のSi3N4基材への固定化に有用であることが分かった。また、このように、これらのペプチドもGSTの所望の位置に導入することができ、得られたペプチド融合GSTにおいても吸着密度の向上が認められたことから、当該ペプチドによれば目的タンパク質の活性の維持や配向制御も可能であることが分かった。また、このほか配列番号25及び27〜35で表される各ペプチドとの融合GSTにおいても同様の傾向が認められる。
Claims (16)
- 以下の(1−1)または(1−2)のペプチドからなる窒化ケイ素親和性ペプチドが結合されてなる、窒化ケイ素基材;
(1−1)配列番号1〜11のいずれかで表されるアミノ酸配列からなるペプチド、
(1−2)配列番号1、2、6及び8のいずれかで表されるアミノ酸配列において1、2または3個のアミノ酸が欠失、置換及び/または付加されたアミノ酸配列からなり、且つ、窒化ケイ素親和性を有するペプチド。 - 前記窒化ケイ素親和性ペプチドを介して目的タンパク質が窒化ケイ素基材に固定化されてなる、請求項1に記載の窒化ケイ素基材。
- 目的タンパク質に導入された以下の(1−1)または(1−2)のペプチドからなる窒化ケイ素親和性ペプチドと窒化ケイ素基材とを接触させる工程を含有する、目的タンパク質の窒化ケイ素基材への固定化方法;
(1−1)配列番号1〜11のいずれかで表されるアミノ酸配列からなるペプチド、
(1−2)配列番号1、2、6及び8のいずれかで表されるアミノ酸配列において1、2または3個のアミノ酸が欠失、置換及び/または付加されたアミノ酸配列からなり、且つ、窒化ケイ素親和性を有するペプチド。 - 窒化ケイ素基材と接触される窒化ケイ素親和性ペプチドが、
前記(1−1)または(1−2)のペプチドからなる窒化ケイ素親和性ペプチドをコードするポリヌクレオチドと目的タンパク質をコードするポリヌクレオチドとが連結されてなる、前記(1−1)または(1−2)のペプチドからなる窒化ケイ素親和性ペプチドと目的タンパク質とのペプチド融合タンパク質発現ベクターまたは
前記ベクターを宿主細胞に導入して形質転換させることにより得られる形質転換体
を用いて作製されたペプチド融合タンパク質を構成する窒化ケイ素親和性ペプチドである、請求項3に記載の固定化方法。 - 請求項1に記載の窒化ケイ素基材に結合した窒化ケイ素親和性ペプチドと目的タンパク質とを結合させる工程を含有する、目的タンパク質の窒化ケイ素基材への固定化方法。
- 以下の(1−1)または(1−2)のペプチドからなる窒化ケイ素親和性ペプチドを含有する、窒化ケイ素基材への目的タンパク質固定化用組成物;
(1−1)配列番号1〜11のいずれかで表されるアミノ酸配列からなるペプチド、
(1−2)配列番号1、2、6及び8のいずれかで表されるアミノ酸配列において1、2または3個のアミノ酸が欠失、置換及び/または付加されたアミノ酸配列からなり、且つ、窒化ケイ素親和性を有するペプチド。 - 目的タンパク質を窒化ケイ素基材へ固定させるための、以下の(1−1)または(1−2)のペプチドからなる窒化ケイ素親和性ペプチドの使用;
(1−1)配列番号1〜11のいずれかで表されるアミノ酸配列からなるペプチド、
(1−2)配列番号1、2、6及び8のいずれかで表されるアミノ酸配列において1、2または3個のアミノ酸が欠失、置換及び/または付加されたアミノ酸配列からなり、且つ、窒化ケイ素親和性を有するペプチド。 - 以下の(2−1)または(2−2)のペプチドからなる、窒化ケイ素親和性ペプチド;
(2−1)配列番号1〜6及び8〜11のいずれかで表されるアミノ酸配列からなるペプチド、
(2−2)配列番号1、2、6及び8のいずれかで表されるアミノ酸配列において1、2または3個のアミノ酸が欠失、置換及び/または付加されたアミノ酸配列からなり、且つ、窒化ケイ素親和性を有するペプチド。 - 前記窒化ケイ素親和性ペプチドが配列番号3〜6及び8〜11のいずれかで表されるアミノ酸配列からなるペプチドである、請求項8に記載の窒化ケイ素親和性ペプチド。
- 請求項8または9に記載の窒化ケイ素親和性ペプチドをコードするポリヌクレオチド。
- 前記ポリヌクレオチドが配列番号12〜17及び19〜22のいずれかで表されるポリヌクレオチドである、請求項10に記載のポリヌクレオチド。
- 請求項10または11に記載のポリヌクレオチドを含有する、窒化ケイ素親和性ペプチド発現ベクター。
- 請求項10または11に記載のポリヌクレオチドと目的タンパク質をコードするポリヌクレオチドとが連結されてなる、請求項8または9に記載の窒化ケイ素親和性ペプチドと目的タンパク質とのペプチド融合タンパク質発現ベクター。
- 請求項13に記載のベクターを宿主細胞に導入して形質転換させることにより得られる形質転換体。
- 請求項14に記載の形質転換体から得られる、請求項8または9に記載の窒化ケイ素親和性ペプチドと目的タンパク質とのペプチド融合タンパク質。
- 請求項8または9に記載の窒化ケイ素親和性ペプチドからなる、窒化ケイ素基材への目的タンパク質の固定化用リンカー。
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