JP2001327296A - 蛋白質−蛋白質相互作用検出方法 - Google Patents
蛋白質−蛋白質相互作用検出方法Info
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 細胞内で蛋白質−蛋白質相互作用を検出する
方法を提供する。 【解決手段】 蛋白質Ｘと、レポーター機能を有する蛋
白質Ｙとの真核細胞内における相互作用を検出する方法
であって、蛋白質Ｘおよび蛋白質Ｙがそれぞれ異なる局
在パターンで細胞内発現するように蛋白質Ｘおよび／ま
たは蛋白質Ｙを修飾し、蛋白質Ｘおよび蛋白質Ｙを真核
細胞内で共発現させ、レポーター機能を指標として蛋白
質Ｙの細胞内局在を特定する。
方法を提供する。 【解決手段】 蛋白質Ｘと、レポーター機能を有する蛋
白質Ｙとの真核細胞内における相互作用を検出する方法
であって、蛋白質Ｘおよび蛋白質Ｙがそれぞれ異なる局
在パターンで細胞内発現するように蛋白質Ｘおよび／ま
たは蛋白質Ｙを修飾し、蛋白質Ｘおよび蛋白質Ｙを真核
細胞内で共発現させ、レポーター機能を指標として蛋白
質Ｙの細胞内局在を特定する。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】この出願の発明は、蛋白質−
蛋白質間の相互作用を検出する方法に関するものであ
る。この方法は、標的蛋白質と相互作用する蛋白質のス
クリーニングを細胞内の環境下で行うことができるた
め、細胞内の蛋白質ネットワークを解明するための有力
な手段となる。細胞内の蛋白質ネットワークの解明は、
新しい医薬を開発するために役立つ。また、この方法を
用いて、新しい低分子医薬のスクリーニングを行うこと
もできる。
蛋白質間の相互作用を検出する方法に関するものであ
る。この方法は、標的蛋白質と相互作用する蛋白質のス
クリーニングを細胞内の環境下で行うことができるた
め、細胞内の蛋白質ネットワークを解明するための有力
な手段となる。細胞内の蛋白質ネットワークの解明は、
新しい医薬を開発するために役立つ。また、この方法を
用いて、新しい低分子医薬のスクリーニングを行うこと
もできる。
【０００２】
【従来の技術】ゲノムの全塩基配列解読によって、細胞
を構成している全蛋白質の一次構造が明らかになろうと
している。次の課題は、これらの蛋白質が細胞内でどの
ようなネットワークを形成し、細胞の生命活動を担って
いるを調べることである。細胞内における蛋白質ネット
ワークが解明されれば、蛋白質の異常によって起こる病
気の分子レベルでのメカニズムを解明したり、その治療
薬を開発するのに役立つ。
を構成している全蛋白質の一次構造が明らかになろうと
している。次の課題は、これらの蛋白質が細胞内でどの
ようなネットワークを形成し、細胞の生命活動を担って
いるを調べることである。細胞内における蛋白質ネット
ワークが解明されれば、蛋白質の異常によって起こる病
気の分子レベルでのメカニズムを解明したり、その治療
薬を開発するのに役立つ。
【０００３】このような蛋白質ネットワークを解明する
ためには、個々の蛋白質が細胞内でどの蛋白質と相互作
用しているかを調べる必要がある。これまで、（１）ア
フィニティークロマトグラフィー、（２）アフィニティ
ーブロッティング、（３）免疫沈降、（４）架橋、
（５）マススペクトロメトリー、（６）表面プラスモン
共鳴法、（７）酵母２ハイブリッド転写活性化法、
（８）２ハイブリッド再構成法、（９）蛍光共鳴エネル
ギー移動法など多くの蛋白質−蛋白質相互作用の検出法
が開発されてきたが、それぞれ問題点がある[E. M. Phi
zicky and S. Fields, Microbiol. Rev. 59:94−123, 1
995; A. R. Mendelsohn and R. Brent, Science284: 19
48−1950, 1999]。この中で、（１）から（６）までの
方法は、蛋白質の生産・精製を伴うものであり、多くの
労力を要する。また、いずれもインビトロでの相互作用
なので、細胞内での相互作用を反映しているとは限ら
ず、人工的な結合を見ている場合もある。他方、（７）
から（９）までの方法は、相互作用する二種類の蛋白質
をコードするｃＤＮＡをレポーターｃＤＮＡとの融合遺
伝子の形で細胞内で発現させることによって、ターゲッ
ト蛋白質同士が細胞内で相互作用した結果起こるレポー
ター蛋白質の再構成や接近を、レポーター蛋白質の転写
活性・酵素活性・蛍光共鳴エネルギー移動などを指標と
して検出しようとするものである。ただ（７）から
（９）までの方法が有効であるためには、ターゲット蛋
白質同士の結合によって、二つの蛋白質に融合させたレ
ポーター蛋白質同士が結合するか、ある距離以内に接近
する必要がある。したがって、ターゲット蛋白質が大き
すぎたり、構造の柔軟性に欠ける場合などは、これらの
方法は使用できない。（７）の方法は、このような構造
上の制限が他に比べ比較的少ないので最も良く使われて
いる。ただ、酵母の成育が遅いことや、形質転換効率が
低いなどの欠点もある。また、ターゲット蛋白質自体が
転写活性化能を有する場合には、この系は使えない。
ためには、個々の蛋白質が細胞内でどの蛋白質と相互作
用しているかを調べる必要がある。これまで、（１）ア
フィニティークロマトグラフィー、（２）アフィニティ
ーブロッティング、（３）免疫沈降、（４）架橋、
（５）マススペクトロメトリー、（６）表面プラスモン
共鳴法、（７）酵母２ハイブリッド転写活性化法、
（８）２ハイブリッド再構成法、（９）蛍光共鳴エネル
ギー移動法など多くの蛋白質−蛋白質相互作用の検出法
が開発されてきたが、それぞれ問題点がある[E. M. Phi
zicky and S. Fields, Microbiol. Rev. 59:94−123, 1
995; A. R. Mendelsohn and R. Brent, Science284: 19
48−1950, 1999]。この中で、（１）から（６）までの
方法は、蛋白質の生産・精製を伴うものであり、多くの
労力を要する。また、いずれもインビトロでの相互作用
なので、細胞内での相互作用を反映しているとは限ら
ず、人工的な結合を見ている場合もある。他方、（７）
から（９）までの方法は、相互作用する二種類の蛋白質
をコードするｃＤＮＡをレポーターｃＤＮＡとの融合遺
伝子の形で細胞内で発現させることによって、ターゲッ
ト蛋白質同士が細胞内で相互作用した結果起こるレポー
ター蛋白質の再構成や接近を、レポーター蛋白質の転写
活性・酵素活性・蛍光共鳴エネルギー移動などを指標と
して検出しようとするものである。ただ（７）から
（９）までの方法が有効であるためには、ターゲット蛋
白質同士の結合によって、二つの蛋白質に融合させたレ
ポーター蛋白質同士が結合するか、ある距離以内に接近
する必要がある。したがって、ターゲット蛋白質が大き
すぎたり、構造の柔軟性に欠ける場合などは、これらの
方法は使用できない。（７）の方法は、このような構造
上の制限が他に比べ比較的少ないので最も良く使われて
いる。ただ、酵母の成育が遅いことや、形質転換効率が
低いなどの欠点もある。また、ターゲット蛋白質自体が
転写活性化能を有する場合には、この系は使えない。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】この出願の発明は、前
記のとおりの従来技術の問題点に鑑みてなされたもので
あって、細胞内での蛋白質−蛋白質相互作用を簡便かつ
確実に検出する方法を提供することを課題としている。
記のとおりの従来技術の問題点に鑑みてなされたもので
あって、細胞内での蛋白質−蛋白質相互作用を簡便かつ
確実に検出する方法を提供することを課題としている。
【０００５】またこの出願の発明は、細胞内での蛋白質
−蛋白質相互作用に対して化合物の作用を検出する方法
を提供することを課題としてもいる。
−蛋白質相互作用に対して化合物の作用を検出する方法
を提供することを課題としてもいる。
【０００６】
【課題を解決するための手段】この出願は、前記の課題
を解決する第１の発明として、蛋白質Ｘと、レポーター
機能を有する蛋白質Ｙとの真核細胞内における相互作用
を検出する方法であって、(1) 蛋白質Ｘおよび蛋白質Ｙ
がそれぞれ異なる局在パターンで細胞内発現するように
蛋白質Ｘおよび／または蛋白質Ｙを修飾し、(2) 蛋白質
Ｘおよび蛋白質Ｙを真核細胞内で共発現させ、(3) レポ
ーター機能を指標として蛋白質Ｙの細胞内局在を特定す
ることを特徴とする方法を提供する。
を解決する第１の発明として、蛋白質Ｘと、レポーター
機能を有する蛋白質Ｙとの真核細胞内における相互作用
を検出する方法であって、(1) 蛋白質Ｘおよび蛋白質Ｙ
がそれぞれ異なる局在パターンで細胞内発現するように
蛋白質Ｘおよび／または蛋白質Ｙを修飾し、(2) 蛋白質
Ｘおよび蛋白質Ｙを真核細胞内で共発現させ、(3) レポ
ーター機能を指標として蛋白質Ｙの細胞内局在を特定す
ることを特徴とする方法を提供する。
【０００７】またこの出願は、第２の発明として、蛋白
質Ｘと、レポーター機能を有する蛋白質Ｙとの真核細胞
内における相互作用に対する化合物Ｚの阻害または促進
作用を検出する方法であって、(1) 蛋白質Ｘおよび蛋白
質Ｙがそれぞれ異なる局在パターンで細胞内発現するよ
うに蛋白質Ｘおよび／または蛋白質Ｙを修飾し、(2) 蛋
白質Ｘおよび蛋白質Ｙを真核細胞内で共発現させ、(3)
化合物Ｚを真核細胞内に導入し、(4) レポーター機能を
指標として蛋白質Ｙの細胞内局在を特定することを特徴
とする方法を提供する。
質Ｘと、レポーター機能を有する蛋白質Ｙとの真核細胞
内における相互作用に対する化合物Ｚの阻害または促進
作用を検出する方法であって、(1) 蛋白質Ｘおよび蛋白
質Ｙがそれぞれ異なる局在パターンで細胞内発現するよ
うに蛋白質Ｘおよび／または蛋白質Ｙを修飾し、(2) 蛋
白質Ｘおよび蛋白質Ｙを真核細胞内で共発現させ、(3)
化合物Ｚを真核細胞内に導入し、(4) レポーター機能を
指標として蛋白質Ｙの細胞内局在を特定することを特徴
とする方法を提供する。
【０００８】第１および第２の発明においては、レポー
ター機能を有する蛋白質Ｙが、レポーター蛋白質Ｂとの
融合蛋白質Ｙ−Ｂであり、このレポーター蛋白質Ｂが蛍
光蛋白質であることをそれぞれ好ましい態様としてい
る。
ター機能を有する蛋白質Ｙが、レポーター蛋白質Ｂとの
融合蛋白質Ｙ−Ｂであり、このレポーター蛋白質Ｂが蛍
光蛋白質であることをそれぞれ好ましい態様としてい
る。
【０００９】さらに、第１発明および第２発明では、ス
テップ(1)において、蛋白質Ｘおよび／または蛋白質Ｙ
の細胞内局在化シグナル配列を変異させること、または
蛋白質Ｘに、蛋白質Ｙとは異なる細胞内局在化シグナル
配列を有する蛋白質Ａを融合させることを好ましい態様
としている。
テップ(1)において、蛋白質Ｘおよび／または蛋白質Ｙ
の細胞内局在化シグナル配列を変異させること、または
蛋白質Ｘに、蛋白質Ｙとは異なる細胞内局在化シグナル
配列を有する蛋白質Ａを融合させることを好ましい態様
としている。
【００１０】また第２発明では、化合物Ｚは、例えば低
分子化合物、ペプチド、蛋白質などであり、化合物Ｚが
低分子化合物の場合にはステップ(3)において化合物Ｚ
を真核細胞と共存させること、あるいは化合物Ｚが蛋白
質またはペプチドの場合にはそれらを真核細胞内で発現
させることを好ましい態様としてもいる。
分子化合物、ペプチド、蛋白質などであり、化合物Ｚが
低分子化合物の場合にはステップ(3)において化合物Ｚ
を真核細胞と共存させること、あるいは化合物Ｚが蛋白
質またはペプチドの場合にはそれらを真核細胞内で発現
させることを好ましい態様としてもいる。
【００１１】なお、前記第１および第２の発明において
は、蛋白質Ｘ、Ｙ、ＡおよびＢは、それぞれ成熟蛋白質
またはその一部、あるいはペプチドであってもよい。ま
た、融合蛋白質Ｘ−Ａおよび融合蛋白質Ｙ−Ｂは、それ
ぞれ融合蛋白質Ａ−Ｘおよび融合蛋白質Ｂ−Ｙ（それぞ
れにおいて、−はペプチド結合を示す）であってもよ
い。
は、蛋白質Ｘ、Ｙ、ＡおよびＢは、それぞれ成熟蛋白質
またはその一部、あるいはペプチドであってもよい。ま
た、融合蛋白質Ｘ−Ａおよび融合蛋白質Ｙ−Ｂは、それ
ぞれ融合蛋白質Ａ−Ｘおよび融合蛋白質Ｂ−Ｙ（それぞ
れにおいて、−はペプチド結合を示す）であってもよ
い。
【００１２】以下、この出願の発明について、発明の実
施形態を詳しく説明する。
施形態を詳しく説明する。
【００１３】
【発明の実施の形態】第１発明の最良の実施形態の一つ
を説明する。この形態においては、蛋白質Ｙは、レポー
ターＢ（蛋白質またはペプチド）との融合蛋白質Ｙ−Ｂ
が使用される。具体的には、ＹのＮ末端またはＣ末端
に、レポーターＢを融合させた蛋白質Ｙ−Ｂを発現する
発現ベクターを作製し、以下のように融合蛋白質Ｘ−Ａ
発現ベクターとともに使用する。 ステップ１：ＸのＮ末端またはＣ末端に、蛋白質Ｙの細
胞内局在化シグナル配列とは異なるシグナル配列を有す
る蛋白質ＡあるいはペプチドＡを融合させた融合蛋白質
Ｘ−Ａを発現する発現ベクターを作製する。 ステップ２：先に用意したＹ−Ｂ発現ベクターと、上記
ステップ１で作製したＸ−Ａ発現ベクターを、真核細胞
に一緒に導入する。対照として、Ｙ−Ｂ発現ベクターの
みを導入した細胞も調製する。 ステップ３：細胞を培養した後、光学的手段あるいは生
化学的手段により、レポーターＢの局在部位を調べ、Ｙ
−Ｂ発現ベクターのみを導入した細胞と二種類の発現ベ
クターを導入した細胞の間でＹ−Ｂの局在部位が変化し
ているかどうかを判定する。この時、Ｙ−Ｂの細胞内局
在がＸ−Ａの局在と一致すれば、ＸとＹは結合すること
を意味している。
を説明する。この形態においては、蛋白質Ｙは、レポー
ターＢ（蛋白質またはペプチド）との融合蛋白質Ｙ−Ｂ
が使用される。具体的には、ＹのＮ末端またはＣ末端
に、レポーターＢを融合させた蛋白質Ｙ−Ｂを発現する
発現ベクターを作製し、以下のように融合蛋白質Ｘ−Ａ
発現ベクターとともに使用する。 ステップ１：ＸのＮ末端またはＣ末端に、蛋白質Ｙの細
胞内局在化シグナル配列とは異なるシグナル配列を有す
る蛋白質ＡあるいはペプチドＡを融合させた融合蛋白質
Ｘ−Ａを発現する発現ベクターを作製する。 ステップ２：先に用意したＹ−Ｂ発現ベクターと、上記
ステップ１で作製したＸ−Ａ発現ベクターを、真核細胞
に一緒に導入する。対照として、Ｙ−Ｂ発現ベクターの
みを導入した細胞も調製する。 ステップ３：細胞を培養した後、光学的手段あるいは生
化学的手段により、レポーターＢの局在部位を調べ、Ｙ
−Ｂ発現ベクターのみを導入した細胞と二種類の発現ベ
クターを導入した細胞の間でＹ−Ｂの局在部位が変化し
ているかどうかを判定する。この時、Ｙ−Ｂの細胞内局
在がＸ−Ａの局在と一致すれば、ＸとＹは結合すること
を意味している。
【００１４】図１は、Ａとしてとして核局在化シグナル
配列を有する蛋白質を用いて、融合蛋白質Ａ−Ｘとした
場合を例にとって第１発明の原理を示した模式図であ
る。融合蛋白質Ａ−Ｘは、Ａが有する核局在化シグナル
によって細胞内の核に局在化する（図１ａ）。一方、融
合蛋白質Ｙ−ＢはＡと同じ局在化シグナルを持たないの
で、Ａ−Ｘとは異なる細胞内部位（この例では細胞質と
核を含む細胞全体）に存在する（図１ｂ）。そこでＡ−
ＸとＹ−Ｂとを共に細胞内で発現させると、ＸとＹが結
合能を有している場合には、その結合を介してＹ−Ｂは
Ａ−Ｘと結合し、Ａが有する核局在化シグナルによって
両者は細胞内の核に運ばれる（図１ｃ）。一方、ＸとＹ
が結合能を持たない場合には、Ａ−Ｘは核に運ばれる
が、Ｙ−Ｂの分布は変わらない（図１ｄ）。従って、レ
ポーターＢを指標として、Ｙ−Ｂのみを発現させた細胞
内でのＹ−Ｂの分布と、Ａ−Ｘ／Ｙ−Ｂを同時に発現さ
せたときのＹ−Ｂの分布とが異なった場合には、ＸとＹ
とは結合すると判定される。その際に、Ｙ−Ｂの局在が
Ａ−Ｘの局在（Ａの局在化シグナルの種類によって推定
可能）と一致することも判定の材料とすることができ
る。
配列を有する蛋白質を用いて、融合蛋白質Ａ−Ｘとした
場合を例にとって第１発明の原理を示した模式図であ
る。融合蛋白質Ａ−Ｘは、Ａが有する核局在化シグナル
によって細胞内の核に局在化する（図１ａ）。一方、融
合蛋白質Ｙ−ＢはＡと同じ局在化シグナルを持たないの
で、Ａ−Ｘとは異なる細胞内部位（この例では細胞質と
核を含む細胞全体）に存在する（図１ｂ）。そこでＡ−
ＸとＹ−Ｂとを共に細胞内で発現させると、ＸとＹが結
合能を有している場合には、その結合を介してＹ−Ｂは
Ａ−Ｘと結合し、Ａが有する核局在化シグナルによって
両者は細胞内の核に運ばれる（図１ｃ）。一方、ＸとＹ
が結合能を持たない場合には、Ａ−Ｘは核に運ばれる
が、Ｙ−Ｂの分布は変わらない（図１ｄ）。従って、レ
ポーターＢを指標として、Ｙ−Ｂのみを発現させた細胞
内でのＹ−Ｂの分布と、Ａ−Ｘ／Ｙ−Ｂを同時に発現さ
せたときのＹ−Ｂの分布とが異なった場合には、ＸとＹ
とは結合すると判定される。その際に、Ｙ−Ｂの局在が
Ａ−Ｘの局在（Ａの局在化シグナルの種類によって推定
可能）と一致することも判定の材料とすることができ
る。
【００１５】融合蛋白質Ｘ−Ａにおいて、Ｘがすでに局
在化シグナル配列を有している場合にはＡを融合させな
くてもよい。その場合、Ｘが本来持っている局在化シグ
ナル配列を欠失あるいは変異させて、新たにＡを融合さ
せてもよい。Ａとしては、局在化シグナル配列を有して
いる蛋白質でも良いし、局在化シグナルとして働く最少
単位を含んでいるペプチドでもよい。局在化シグナルと
しては、核局在化シグナル、ミトコンドリア局在化シグ
ナル、ゴルジ局在化シグナル、膜局在化シグナルなどが
例示できるが、局在部位の同定が容易な核局在化シグナ
ルなどを用いるのが好ましい。また、Ａは局在化シグナ
ル配列の他に、レポーター機能を有する部位を含んでい
てもよい。このレポーター機能を利用すれば、融合蛋白
質Ｘ−Ａの局在部位を確認することができる。もちろ
ん、融合蛋白質Ｘ−Ａの局在は、Ａの局在化シグナルの
種類によってその部位は高い精度で推定することができ
るため、Ａのレポーター機能は不可欠ではない。
在化シグナル配列を有している場合にはＡを融合させな
くてもよい。その場合、Ｘが本来持っている局在化シグ
ナル配列を欠失あるいは変異させて、新たにＡを融合さ
せてもよい。Ａとしては、局在化シグナル配列を有して
いる蛋白質でも良いし、局在化シグナルとして働く最少
単位を含んでいるペプチドでもよい。局在化シグナルと
しては、核局在化シグナル、ミトコンドリア局在化シグ
ナル、ゴルジ局在化シグナル、膜局在化シグナルなどが
例示できるが、局在部位の同定が容易な核局在化シグナ
ルなどを用いるのが好ましい。また、Ａは局在化シグナ
ル配列の他に、レポーター機能を有する部位を含んでい
てもよい。このレポーター機能を利用すれば、融合蛋白
質Ｘ−Ａの局在部位を確認することができる。もちろ
ん、融合蛋白質Ｘ−Ａの局在は、Ａの局在化シグナルの
種類によってその部位は高い精度で推定することができ
るため、Ａのレポーター機能は不可欠ではない。
【００１６】融合蛋白質Ｙ−Ｂにおいて、Ｙにレポータ
ー機能が含まれている場合には、レポーターＢを融合さ
せなくてもよい。ＹがＸと同じ局在化シグナルを有して
いる場合には、Ｙの局在化シグナルを欠失あるいは変異
させたものを用いる。レポーターＢとしては、緑色蛍光
蛋白質(GFP)、レシフェラーゼ、βーガラクトシダー
ゼ、クロランフェニコールアセチルトランセフェラー
ゼ、各種エピトープタグなどが例示できる。細胞の顕微
鏡観察によってその局在を容易に観察できるという意味
では、GFPなどの蛍光蛋白質を用いることが好ましい。
ー機能が含まれている場合には、レポーターＢを融合さ
せなくてもよい。ＹがＸと同じ局在化シグナルを有して
いる場合には、Ｙの局在化シグナルを欠失あるいは変異
させたものを用いる。レポーターＢとしては、緑色蛍光
蛋白質(GFP)、レシフェラーゼ、βーガラクトシダー
ゼ、クロランフェニコールアセチルトランセフェラー
ゼ、各種エピトープタグなどが例示できる。細胞の顕微
鏡観察によってその局在を容易に観察できるという意味
では、GFPなどの蛍光蛋白質を用いることが好ましい。
【００１７】それぞれの融合蛋白質を細胞で発現させる
ためには、融合蛋白質発現ベクターを作成し、これら２
種類のベクターを細胞内に導入する方法を採用すること
ができる。ただし、特定部位に局在する蛋白質Ｘを産生
する細胞を用いる場合には、Ｙ−Ｂ発現ベクターのみを
この細胞に導入するようにしてもよい。
ためには、融合蛋白質発現ベクターを作成し、これら２
種類のベクターを細胞内に導入する方法を採用すること
ができる。ただし、特定部位に局在する蛋白質Ｘを産生
する細胞を用いる場合には、Ｙ−Ｂ発現ベクターのみを
この細胞に導入するようにしてもよい。
【００１８】融合蛋白質発現ベクターとしては、プロモ
ーター、スプライシング領域、ポリ(A)付加部位等を有
する真核細胞用発現ベクターであればいかなるものでも
よく、pKA1、pCDM8、pSVK3、pMSG、pSVL、pBK-CMV、pIN
D/V5-His、pFLAG-CMV-2、pEGFP-N1、pEGFP-C1、pBK-RS
V、EBVベクター、pRS、pYES2などが例示できる。これら
のベクターに、Ｘ、Ｙ、Ａ、Ｂをそれぞれコードするｃ
ＤＮＡやＤＮＡ断片をクローン化し、融合蛋白質Ｘ−
Ａ、Ｙ−Ｂの発現ベクターを作製する。これらのｃＤＮ
ＡやＤＮＡ断片は、例えば、ＸやＹのいずれか一方を固
定し、他方をｃＤＮＡライブラリーやランダムＤＮＡラ
イブラリー由来のＤＮＡ断片としてハイブリダイズすれ
ば、固定された方の蛋白質に結合する蛋白質をコードす
るＤＮＡ断片をライブラリーの中からスクリーニングす
ることもできる。
ーター、スプライシング領域、ポリ(A)付加部位等を有
する真核細胞用発現ベクターであればいかなるものでも
よく、pKA1、pCDM8、pSVK3、pMSG、pSVL、pBK-CMV、pIN
D/V5-His、pFLAG-CMV-2、pEGFP-N1、pEGFP-C1、pBK-RS
V、EBVベクター、pRS、pYES2などが例示できる。これら
のベクターに、Ｘ、Ｙ、Ａ、Ｂをそれぞれコードするｃ
ＤＮＡやＤＮＡ断片をクローン化し、融合蛋白質Ｘ−
Ａ、Ｙ−Ｂの発現ベクターを作製する。これらのｃＤＮ
ＡやＤＮＡ断片は、例えば、ＸやＹのいずれか一方を固
定し、他方をｃＤＮＡライブラリーやランダムＤＮＡラ
イブラリー由来のＤＮＡ断片としてハイブリダイズすれ
ば、固定された方の蛋白質に結合する蛋白質をコードす
るＤＮＡ断片をライブラリーの中からスクリーニングす
ることもできる。
【００１９】融合蛋白質を発現させる細胞としては、サ
ル腎臓細胞COS7、チャイニーズハムスター卵巣細胞CH
O、各種ヒト腫瘍株化細胞などの哺乳動物培養細胞、出
芽酵母、分裂酵母、カイコ細胞、アフリカツメガエル卵
細胞など、いかなる真核細胞でもよい。発現ベクターを
真核細胞に導入するには、電気穿孔法、リン酸カルシウ
ム法、リポソーム法、DEAEデキストラン法など公知の方
法を用いることができる。
ル腎臓細胞COS7、チャイニーズハムスター卵巣細胞CH
O、各種ヒト腫瘍株化細胞などの哺乳動物培養細胞、出
芽酵母、分裂酵母、カイコ細胞、アフリカツメガエル卵
細胞など、いかなる真核細胞でもよい。発現ベクターを
真核細胞に導入するには、電気穿孔法、リン酸カルシウ
ム法、リポソーム法、DEAEデキストラン法など公知の方
法を用いることができる。
【００２０】レポーターの検出法は、レポーターの種類
によって異なる。GFPなどの蛍光蛋白質を用いる場合に
は、蛍光顕微鏡下で観察することによって、その局在部
位を確認することができる。酵素をレポーターとして用
いる場合には、細胞を固定化した後、基質を加えて酵素
反応によって生成した反応物の局在部位を顕微鏡下で観
察したり、細胞を破砕後、レポーター蛋白質が含まれて
いる細胞内器官を酵素反応によって検出することによっ
て、その局在部位を決定することができる。また、エピ
トープタグをレポーターとして用いる場合には、対応す
る抗体を用いて免疫染色を行い、その局在部位を蛍光顕
微鏡下で確認することができる。
によって異なる。GFPなどの蛍光蛋白質を用いる場合に
は、蛍光顕微鏡下で観察することによって、その局在部
位を確認することができる。酵素をレポーターとして用
いる場合には、細胞を固定化した後、基質を加えて酵素
反応によって生成した反応物の局在部位を顕微鏡下で観
察したり、細胞を破砕後、レポーター蛋白質が含まれて
いる細胞内器官を酵素反応によって検出することによっ
て、その局在部位を決定することができる。また、エピ
トープタグをレポーターとして用いる場合には、対応す
る抗体を用いて免疫染色を行い、その局在部位を蛍光顕
微鏡下で確認することができる。
【００２１】この出願の第２の発明は、ＸとＹとの相互
作用を阻害あるいは促進するような化合物Ｚをスクリー
ニングする方法である。Ｚが低分子化合物の場合には、
融合蛋白質Ｘ−Ａと融合蛋白質Ｙ−Ｂを共発現させた細
胞の培養液にＺを添加し、レポーターＢを指標としてＹ
−Ｂの局在変化を測定することによって、ＸとＹとの結
合に及ぼすＺの影響を見ることができる。また、Ｚがペ
プチドや蛋白質の場合には、Ｚ発現ベクターをＸ−Ａお
よびＹ−Ｂの発現ベクターと一緒に細胞に導入して、Ｙ
−Ｂの局在変化に及ぼす影響を調べればよい。
作用を阻害あるいは促進するような化合物Ｚをスクリー
ニングする方法である。Ｚが低分子化合物の場合には、
融合蛋白質Ｘ−Ａと融合蛋白質Ｙ−Ｂを共発現させた細
胞の培養液にＺを添加し、レポーターＢを指標としてＹ
−Ｂの局在変化を測定することによって、ＸとＹとの結
合に及ぼすＺの影響を見ることができる。また、Ｚがペ
プチドや蛋白質の場合には、Ｚ発現ベクターをＸ−Ａお
よびＹ−Ｂの発現ベクターと一緒に細胞に導入して、Ｙ
−Ｂの局在変化に及ぼす影響を調べればよい。
【００２２】
【実施例】次に実施例により発明をさらに詳細かつ具体
的に説明するが、この出願の発明はこれらの例に限定さ
れるものではない。
的に説明するが、この出願の発明はこれらの例に限定さ
れるものではない。
【００２３】二種類の核蛋白質Npw38 [A. Komuro et a
l., Nucl. Acids Res. 27: 1957−1965, 1999]とNpwBP
[A. Komuro et al., J. Biol. Chem. 274: 36513−3651
9, 1999]の結合を検出した例を以下に示す。Npw38（配
列番号１)は、内部に核局在化シグナル配列（第１７６
番目のアルギニンから第１９２番目のリジン）を有して
おり、核に局在することが分かっている（図２ａ）。ま
た、NpwBP（配列番号２)は、Npw38と結合する蛋白質と
してとられたものであり、両者の結合はNpw38のWWドメ
イン部分（配列番号１の第５２番目のトリプトファンか
ら第７８番目のプロリン）とNpwBPのプロリンに富む領
域（配列番号２の第１９１番目のプロリンから第２０９
番目のプロリン並びに第３９３番目のプロリンから第５
３８番目のプロリン）が結合することが知られている
（図２ｂ）。 （１）融合蛋白質発現ベクタ−の作製 pEGFP-N1（Clonetech社）から調製したGFPのcDNAを含む
EcoRI-NotI断片をpKA1[Kato et al., Gene 150:243−25
0, 1994]のEcoRI-NotIに挿入し、pKA1-GFPを作製した。
P1オリゴマ−１（配列番号３）、P1オリゴマ−２（配列
番号４）をハイブリダイズした後、pKA1-GFPのEcoRIとS
maIに挿入し、pKA1-NpwBP(P1)-GFPを作製した。また、P
2プライマー１（配列番号５）、P2プライマー２（配列
番号６）をプライマーとして用いてPCR産物を調製し、E
coRIとSmaIで消化後、pKA1-GFPのEcoRIとSmaIに挿入しp
KA1-NpwBP(P2)-GFPを作製した。
l., Nucl. Acids Res. 27: 1957−1965, 1999]とNpwBP
[A. Komuro et al., J. Biol. Chem. 274: 36513−3651
9, 1999]の結合を検出した例を以下に示す。Npw38（配
列番号１)は、内部に核局在化シグナル配列（第１７６
番目のアルギニンから第１９２番目のリジン）を有して
おり、核に局在することが分かっている（図２ａ）。ま
た、NpwBP（配列番号２)は、Npw38と結合する蛋白質と
してとられたものであり、両者の結合はNpw38のWWドメ
イン部分（配列番号１の第５２番目のトリプトファンか
ら第７８番目のプロリン）とNpwBPのプロリンに富む領
域（配列番号２の第１９１番目のプロリンから第２０９
番目のプロリン並びに第３９３番目のプロリンから第５
３８番目のプロリン）が結合することが知られている
（図２ｂ）。 （１）融合蛋白質発現ベクタ−の作製 pEGFP-N1（Clonetech社）から調製したGFPのcDNAを含む
EcoRI-NotI断片をpKA1[Kato et al., Gene 150:243−25
0, 1994]のEcoRI-NotIに挿入し、pKA1-GFPを作製した。
P1オリゴマ−１（配列番号３）、P1オリゴマ−２（配列
番号４）をハイブリダイズした後、pKA1-GFPのEcoRIとS
maIに挿入し、pKA1-NpwBP(P1)-GFPを作製した。また、P
2プライマー１（配列番号５）、P2プライマー２（配列
番号６）をプライマーとして用いてPCR産物を調製し、E
coRIとSmaIで消化後、pKA1-GFPのEcoRIとSmaIに挿入しp
KA1-NpwBP(P2)-GFPを作製した。
【００２４】pKA1−Npw38 [A. Komuro et al., Nucl. A
cids Res. 27: 1957−1965, 1999]を鋳型にして、プラ
イマー１（配列番号７）、プライマー２（配列番号８）
をプライマーとして用いてPCR産物を調製した。これ
を、EcoRIとSmaIで消化した後、pKA1-GFPのEcoRIとSmaI
に挿入し、pKA1-Npw38(ΔC)-GFPを作製した。 （２）COS7による融合蛋白質発現と免疫染色ならびに蛍
光顕微鏡観察 サル腎臓由来培養細胞COS7は、10％ウシ胎児血清を含む
ダルベッコ改変イーグル(DMEM)培地中、５％CO2存在
下、37℃で培養した。１ｘ105個のCOS7細胞を６穴プレ
ート（ヌンク社、穴の直径３cm）に植え、５％CO2存在
下、37℃で22時間培養した。培地除去後、リン酸緩衝液
(PBS)で細胞表面を洗浄し、さらに50 mMトリス塩酸（pH
7.5）を含むDMEMで再度洗浄した。この細胞にプラスミ
ド懸濁液１μl、DMEM培地0.6 ml、TRANSFECTAMTM（IBF
社）３μlを懸濁したものを添加し、５％CO2存在下、37
℃で12時間培養した。細胞をPBSで洗浄した後、４％パ
ラホルムアルデヒド含有PBSで室温で10分間固定した。
固定した細胞をPBSで洗浄した後、0.2% Triton X-100で
処理し、ついで５％ミルクPBSでブロック処理を行っ
た。これに、抗HA抗体を45分間反応させ、PBS洗浄後、
ローダミン結合二次抗体と45分間反応させた。蛍光顕微
鏡によりGFPに由来する緑色蛍光の分布と、抗体に由来
する赤色蛍光の分布を観察し、それぞれの蛋白質の局在
部位を調べた。 （３）Npw38とNpwBPの結合検出（その１） 融合蛋白質Ａ−Ｘとして、ＸがNpw38、ＡがHAタグであ
る融合蛋白質HA-Npw38[A. Komuro et al., J. Biol. Ch
em. 274:36513-36519, 1999]を用いた。Npw38の中には
すでに核局在化シグナルが含まれているので、Ａが局在
化シグナルを含む必要はない。一方、融合蛋白質Ｙ−Ｂ
として、ＹがNpwBPのプロリンに富む領域、ＢがGFPであ
る融合蛋白質NpwBP(P1)-GFPとNpwBP(P2)-GFPを用いた。
ここでP1は配列番号２の第190番目のバリンから第210番
目のグルタミンまでのアミノ酸残基を含むもの、P2は配
列番号２の第401番目のグルタミンから第541番目のイソ
ロイシンまでのアミノ酸残基を含むものをそれぞれ表
す。
cids Res. 27: 1957−1965, 1999]を鋳型にして、プラ
イマー１（配列番号７）、プライマー２（配列番号８）
をプライマーとして用いてPCR産物を調製した。これ
を、EcoRIとSmaIで消化した後、pKA1-GFPのEcoRIとSmaI
に挿入し、pKA1-Npw38(ΔC)-GFPを作製した。 （２）COS7による融合蛋白質発現と免疫染色ならびに蛍
光顕微鏡観察 サル腎臓由来培養細胞COS7は、10％ウシ胎児血清を含む
ダルベッコ改変イーグル(DMEM)培地中、５％CO2存在
下、37℃で培養した。１ｘ105個のCOS7細胞を６穴プレ
ート（ヌンク社、穴の直径３cm）に植え、５％CO2存在
下、37℃で22時間培養した。培地除去後、リン酸緩衝液
(PBS)で細胞表面を洗浄し、さらに50 mMトリス塩酸（pH
7.5）を含むDMEMで再度洗浄した。この細胞にプラスミ
ド懸濁液１μl、DMEM培地0.6 ml、TRANSFECTAMTM（IBF
社）３μlを懸濁したものを添加し、５％CO2存在下、37
℃で12時間培養した。細胞をPBSで洗浄した後、４％パ
ラホルムアルデヒド含有PBSで室温で10分間固定した。
固定した細胞をPBSで洗浄した後、0.2% Triton X-100で
処理し、ついで５％ミルクPBSでブロック処理を行っ
た。これに、抗HA抗体を45分間反応させ、PBS洗浄後、
ローダミン結合二次抗体と45分間反応させた。蛍光顕微
鏡によりGFPに由来する緑色蛍光の分布と、抗体に由来
する赤色蛍光の分布を観察し、それぞれの蛋白質の局在
部位を調べた。 （３）Npw38とNpwBPの結合検出（その１） 融合蛋白質Ａ−Ｘとして、ＸがNpw38、ＡがHAタグであ
る融合蛋白質HA-Npw38[A. Komuro et al., J. Biol. Ch
em. 274:36513-36519, 1999]を用いた。Npw38の中には
すでに核局在化シグナルが含まれているので、Ａが局在
化シグナルを含む必要はない。一方、融合蛋白質Ｙ−Ｂ
として、ＹがNpwBPのプロリンに富む領域、ＢがGFPであ
る融合蛋白質NpwBP(P1)-GFPとNpwBP(P2)-GFPを用いた。
ここでP1は配列番号２の第190番目のバリンから第210番
目のグルタミンまでのアミノ酸残基を含むもの、P2は配
列番号２の第401番目のグルタミンから第541番目のイソ
ロイシンまでのアミノ酸残基を含むものをそれぞれ表
す。
【００２５】まず、pKA1-NpwBP(P1)-GFPあるいはpKA1-N
pwBP(P2)-GFPを単独でCOS7細胞に導入し、蛍光顕微鏡下
でこれらの融合蛋白質の局在をGFPの緑色蛍光を指標に
観察したところ、いずれの場合も細胞質および核を含む
細胞全体に蛍光がみとめられた（図３ａ）。ついで、こ
れらのNpwBP-GFP融合蛋白質発現ベクターと一緒にNpw38
の発現ベクターpKA1-Npw38をCOS7細胞に導入したとこ
ろ、緑色蛍光は核に局在化した（図３ｂ）。このとき、
タグにたいする抗体を用いて免疫染色を行い融合蛋白質
HA-Npw38の局在を調べたところ、核に局在することが示
された（図３ｃ）。また、HA-Npw38の代わりにNpw38のW
Wドメインに変異を有しているNpw38 (W52A) [A. Komuro
et al., Nucl. Acids Res. 27:1957−1965, 1999]を発
現させた場合や、NpwBP-GFPの代わりにGFPを発現させた
場合には、緑色蛍光の核への局在化は起こらなかった。
以上のことから、このような緑色蛍光の核への局在化
は、NpwBP-GFP融合蛋白とNpw38が、Npw38のWWドメイン
を介してお互いに結合することによって引き起こされた
ことが示された。 （４）Npw38とNpwBPの結合検出（その２） 前記（３）と逆の系を試した。すなわち、融合蛋白質Ｘ
−Ａに相当するものとして、NpwBPを用いた。この場合
にも、NpwBPの中にすでに核局在化シグナルが含まれて
いるので、Ａに相当するものは必要としない。一方、融
合蛋白質Ｙ−Ｂとして、ＹがNpw38の核局在化シグナル
を欠失したもの、ＢがGFPである融合蛋白質Npw38(ΔC)-
GFPを用いた。融合蛋白質Npw38(ΔC)-GFPをCOS7細胞で
発現させると、緑色蛍光は細胞質および核を含む細胞全
体に認められた。この系でNpwBPを一緒に発現させる
と、緑色蛍光は核内に移行することが示された。 （５）結合阻害作用の検出 前記（２）の系で、Npw38とNpwBP(P2)-GFPの他に、NpwB
PをNpwBP(P2)-GFPよりも多く一緒に発現させてみたとこ
ろ、NpwBP(P2)-GFPの核への局在化が阻害された。これ
は、過剰発現したNpwBPがNpw38と結合したために、Npw3
8とNpwBP(P2)-GFPの結合が阻害され、NpwBP(P2)-GFPが
核へ移行できなくなったためと考えられる。このよう
に、上記の系に結合を阻害する物質を共存させると、GF
P融合蛋白質の局在化が阻害されることから、この系を
利用して結合阻害因子を探索することができる。 （６）ミトコンドリア局在化シグナルの適用 融合蛋白質X-Aに相当するものとして、XがNpwBP(P2)、A
がミトコンドリア蛋白質の一つであるBcl-XLであるNpwB
P(P2)-Bcl-XLを用いた。まず、ヒト完全長cDNAバンク(K
ato et al., Gene 150:243-250,1994)の中からBcl-XLの
完全長cDNAクローンHP03564（ORFを配列番号９に示す）
を選択し、BclプライマーP1（配列番号１０）とBclプラ
イマーP2（配列番号１１）を用いてPCR産物を調製し、S
maIとNotIで消化後、pKA1-GFPのSmaIとNotIに挿入しpKA
1-Bclを構築した。ついで、同様にBcl-XLの完全長cDNA
クローンHP03564を鋳型にして、BclプライマーP1（配列
番号１０）とBclプライマーP3（配列番号１２）を用い
てPCR産物を調製し、SmaIとPmaCIで消化後、pKA1-Bclの
SmaIに挿入しpKA1-Bcl-SmaIを構築した。pKA1-NpwBP(P
2)-GFPをEcoRIとSmaIで消化した後、NpwBP(P2)をコード
する断片を、pKA1-Bcl-SmaIのEcoRIとSmaIに挿入し、pK
A1-NpwBP(P2)-Bcl-XLを構築した。
pwBP(P2)-GFPを単独でCOS7細胞に導入し、蛍光顕微鏡下
でこれらの融合蛋白質の局在をGFPの緑色蛍光を指標に
観察したところ、いずれの場合も細胞質および核を含む
細胞全体に蛍光がみとめられた（図３ａ）。ついで、こ
れらのNpwBP-GFP融合蛋白質発現ベクターと一緒にNpw38
の発現ベクターpKA1-Npw38をCOS7細胞に導入したとこ
ろ、緑色蛍光は核に局在化した（図３ｂ）。このとき、
タグにたいする抗体を用いて免疫染色を行い融合蛋白質
HA-Npw38の局在を調べたところ、核に局在することが示
された（図３ｃ）。また、HA-Npw38の代わりにNpw38のW
Wドメインに変異を有しているNpw38 (W52A) [A. Komuro
et al., Nucl. Acids Res. 27:1957−1965, 1999]を発
現させた場合や、NpwBP-GFPの代わりにGFPを発現させた
場合には、緑色蛍光の核への局在化は起こらなかった。
以上のことから、このような緑色蛍光の核への局在化
は、NpwBP-GFP融合蛋白とNpw38が、Npw38のWWドメイン
を介してお互いに結合することによって引き起こされた
ことが示された。 （４）Npw38とNpwBPの結合検出（その２） 前記（３）と逆の系を試した。すなわち、融合蛋白質Ｘ
−Ａに相当するものとして、NpwBPを用いた。この場合
にも、NpwBPの中にすでに核局在化シグナルが含まれて
いるので、Ａに相当するものは必要としない。一方、融
合蛋白質Ｙ−Ｂとして、ＹがNpw38の核局在化シグナル
を欠失したもの、ＢがGFPである融合蛋白質Npw38(ΔC)-
GFPを用いた。融合蛋白質Npw38(ΔC)-GFPをCOS7細胞で
発現させると、緑色蛍光は細胞質および核を含む細胞全
体に認められた。この系でNpwBPを一緒に発現させる
と、緑色蛍光は核内に移行することが示された。 （５）結合阻害作用の検出 前記（２）の系で、Npw38とNpwBP(P2)-GFPの他に、NpwB
PをNpwBP(P2)-GFPよりも多く一緒に発現させてみたとこ
ろ、NpwBP(P2)-GFPの核への局在化が阻害された。これ
は、過剰発現したNpwBPがNpw38と結合したために、Npw3
8とNpwBP(P2)-GFPの結合が阻害され、NpwBP(P2)-GFPが
核へ移行できなくなったためと考えられる。このよう
に、上記の系に結合を阻害する物質を共存させると、GF
P融合蛋白質の局在化が阻害されることから、この系を
利用して結合阻害因子を探索することができる。 （６）ミトコンドリア局在化シグナルの適用 融合蛋白質X-Aに相当するものとして、XがNpwBP(P2)、A
がミトコンドリア蛋白質の一つであるBcl-XLであるNpwB
P(P2)-Bcl-XLを用いた。まず、ヒト完全長cDNAバンク(K
ato et al., Gene 150:243-250,1994)の中からBcl-XLの
完全長cDNAクローンHP03564（ORFを配列番号９に示す）
を選択し、BclプライマーP1（配列番号１０）とBclプラ
イマーP2（配列番号１１）を用いてPCR産物を調製し、S
maIとNotIで消化後、pKA1-GFPのSmaIとNotIに挿入しpKA
1-Bclを構築した。ついで、同様にBcl-XLの完全長cDNA
クローンHP03564を鋳型にして、BclプライマーP1（配列
番号１０）とBclプライマーP3（配列番号１２）を用い
てPCR産物を調製し、SmaIとPmaCIで消化後、pKA1-Bclの
SmaIに挿入しpKA1-Bcl-SmaIを構築した。pKA1-NpwBP(P
2)-GFPをEcoRIとSmaIで消化した後、NpwBP(P2)をコード
する断片を、pKA1-Bcl-SmaIのEcoRIとSmaIに挿入し、pK
A1-NpwBP(P2)-Bcl-XLを構築した。
【００２６】融合蛋白質Npw38(ΔC)-GFPをOCS7細胞内で
単独で発現させた場合には、前記（４）で示したように
緑色蛍光は細胞質及び細胞全体に認められたが、融合蛋
白質NpwBP(P2)-Bcl-XLを共発現させるとミトコンドリア
も光るようになった（図４）。なお、ミトコンドリア
は、抗ヒトミトコンドリア抗体（Leinco Technologies,
Inc.）による免疫染色によって検出した。以上の結果、
Npw38(ΔC)-GFPがNpwBP(P2)-Bcl-XLと結合した結果、ミ
トコンドリアにも局在が認められるようになることが示
された。すなわち、この発明の系としてミトコンドリア
局在化シグナルも適用できることが確認された。
単独で発現させた場合には、前記（４）で示したように
緑色蛍光は細胞質及び細胞全体に認められたが、融合蛋
白質NpwBP(P2)-Bcl-XLを共発現させるとミトコンドリア
も光るようになった（図４）。なお、ミトコンドリア
は、抗ヒトミトコンドリア抗体（Leinco Technologies,
Inc.）による免疫染色によって検出した。以上の結果、
Npw38(ΔC)-GFPがNpwBP(P2)-Bcl-XLと結合した結果、ミ
トコンドリアにも局在が認められるようになることが示
された。すなわち、この発明の系としてミトコンドリア
局在化シグナルも適用できることが確認された。
【００２７】
【発明の効果】以上詳しく説明したとおり、この出願に
よって、蛋白質の生産・精製といったプロセスを経るこ
となく、任意の蛋白質間の相互作用を、細胞内の環境下
で迅速に検出することのできる方法が提供される。この
発明方法によって、細胞内に存在する蛋白質同士の相互
作用を検出することにより、細胞内蛋白質ネットワーク
を明らかにすることができる。得られた蛋白質間の相互
作用情報に基づいて、新しい医薬の創製や、病気の分子
レベルでの解明が期待される。
よって、蛋白質の生産・精製といったプロセスを経るこ
となく、任意の蛋白質間の相互作用を、細胞内の環境下
で迅速に検出することのできる方法が提供される。この
発明方法によって、細胞内に存在する蛋白質同士の相互
作用を検出することにより、細胞内蛋白質ネットワーク
を明らかにすることができる。得られた蛋白質間の相互
作用情報に基づいて、新しい医薬の創製や、病気の分子
レベルでの解明が期待される。
【００２８】
【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Japan Science and Technology Corporation <120> Method for detecting protein-protein interaction. <130> NP00395-YS <140> <141> <150> JP2000-073095 <151> 2000-03-15 <160> 12 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 265 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Pro Leu Pro Val Ala Leu Gln Thr Arg Leu Ala Lys Arg Gly Ile 1 5 10 15 Leu Lys His Leu Glu Pro Glu Pro Glu Glu Glu Ile Ile Ala Glu Asp 20 25 30 Tyr Asp Asp Asp Pro Val Asp Tyr Glu Ala Thr Arg Leu Glu Gly Leu 35 40 45 Pro Pro Ser Trp Tyr Lys Val Phe Asp Pro Ser Cys Gly Leu Pro Tyr 50 55 60 Tyr Trp Asn Ala Asp Thr Asp Leu Val Ser Trp Leu Ser Pro His Asp 65 70 75 80 Pro Asn Ser Val Val Thr Lys Ser Ala Lys Lys Leu Arg Ser Ser Asn 85 90 95 Ala Asp Ala Glu Glu Lys Leu Asp Arg Ser His Asp Lys Ser Asp Arg 100 105 110 Gly His Asp Lys Ser Asp Arg Ser His Glu Lys Leu Asp Arg Gly His 115 120 125 Asp Lys Ser Asp Arg Gly His Asp Lys Ser Asp Arg Asp Arg Glu Arg 130 135 140 Gly Tyr Asp Lys Val Asp Arg Glu Arg Glu Arg Asp Arg Glu Arg Asp 145 150 155 160 Arg Asp Arg Gly Tyr Asp Lys Ala Asp Arg Glu Glu Gly Lys Glu Arg 165 170 175 Arg His His Arg Arg Glu Glu Leu Ala Pro Tyr Pro Lys Ser Lys Lys 180 185 190 Ala Val Ser Arg Lys Asp Glu Glu Leu Asp Pro Met Asp Pro Ser Ser 195 200 205 Tyr Ser Asp Ala Pro Arg Gly Thr Trp Ser Thr Gly Leu Pro Lys Arg 210 215 220 Asn Glu Ala Lys Thr Gly Ala Asp Thr Thr Ala Ala Gly Pro Leu Phe 225 230 235 240 Gln Gln Arg Pro Tyr Pro Ser Pro Gly Ala Val Leu Arg Ala Asn Ala 245 250 255 Glu Ala Ser Arg Thr Lys Gln Gln Asp 260 265 <210> 2 <211> 641 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Gly Arg Arg Ser Thr Ser Ser Thr Lys Ser Gly Lys Phe Met Asn 1 5 10 15 Pro Thr Asp Gln Ala Arg Lys Glu Ala Arg Lys Arg Glu Leu Lys Lys 20 25 30 Asn Lys Lys Gln Arg Met Met Val Arg Ala Ala Val Leu Lys Met Lys 35 40 45 Asp Pro Lys Gln Ile Ile Arg Asp Met Glu Lys Leu Asp Glu Met Glu 50 55 60 Phe Asn Pro Val Gln Gln Pro Gln Leu Asn Glu Lys Val Leu Lys Asp 65 70 75 80 Lys Arg Lys Lys Leu Arg Glu Thr Phe Glu Arg Ile Leu Arg Leu Tyr 85 90 95 Glu Lys Glu Asn Pro Asp Ile Tyr Lys Glu Leu Arg Lys Leu Glu Val 100 105 110 Glu Tyr Glu Gln Lys Arg Ala Gln Leu Ser Gln Tyr Phe Asp Ala Val 115 120 125 Lys Asn Ala Gln His Val Glu Val Glu Ser Ile Pro Leu Pro Asp Met 130 135 140 Pro His Ala Pro Ser Asn Ile Leu Ile Gln Asp Ile Pro Leu Pro Gly 145 150 155 160 Ala Gln Pro Pro Ser Ile Leu Lys Lys Thr Ser Ala Tyr Gly Pro Pro 165 170 175 Thr Arg Ala Val Ser Ile Leu Pro Leu Leu Gly His Gly Val Pro Arg 180 185 190 Leu Pro Pro Gly Arg Lys Pro Pro Gly Pro Pro Pro Gly Pro Pro Pro 195 200 205 Pro Gln Val Val Gln Met Tyr Gly Arg Lys Val Gly Phe Ala Leu Asp 210 215 220 Leu Pro Pro Arg Arg Arg Asp Glu Asp Met Leu Tyr Ser Pro Glu Leu 225 230 235 240 Ala Gln Arg Gly His Asp Asp Asp Val Ser Ser Thr Ser Glu Asp Asp 245 250 255 Gly Tyr Pro Glu Asp Met Asp Gln Asp Lys His Asp Asp Ser Thr Asp 260 265 270 Asp Ser Asp Thr Asp Lys Ser Asp Gly Glu Ser Asp Gly Asp Glu Phe 275 280 285 Val His Arg Asp Asn Gly Glu Arg Asp Asn Asn Glu Glu Lys Lys Ser 290 295 300 Gly Leu Ser Val Arg Phe Ala Asp Met Pro Gly Lys Ser Arg Lys Lys 305 310 315 320 Lys Lys Asn Met Lys Glu Leu Thr Pro Leu Gln Ala Met Met Leu Arg 325 330 335 Met Ala Gly Gln Glu Ile Pro Glu Glu Gly Arg Glu Val Glu Glu Phe 340 345 350 Ser Glu Asp Asp Asp Glu Asp Asp Ser Asp Asp Ser Glu Ala Glu Lys 355 360 365 Gln Ser Gln Lys Gln His Lys Glu Glu Ser His Ser Asp Gly Thr Ser 370 375 380 Thr Ala Ser Ser Gln Gln Gln Ala Pro Pro Gln Ser Val Pro Pro Ser 385 390 395 400 Gln Ile Gln Ala Pro Pro Met Pro Gly Pro Pro Pro Leu Gly Pro Pro 405 410 415 Pro Ala Pro Pro Leu Arg Pro Pro Gly Pro Pro Thr Gly Leu Pro Pro 420 425 430 Gly Pro Pro Pro Gly Ala Pro Pro Phe Leu Arg Pro Pro Gly Met Pro 435 440 445 Gly Leu Arg Gly Pro Leu Pro Arg Leu Leu Pro Pro Gly Pro Pro Pro 450 455 460 Gly Arg Pro Pro Gly Pro Pro Pro Gly Pro Pro Pro Gly Leu Pro Pro 465 470 475 480 Gly Pro Pro Pro Arg Gly Pro Pro Pro Arg Leu Pro Pro Pro Ala Pro 485 490 495 Pro Gly Ile Pro Pro Pro Arg Pro Gly Met Met Arg Pro Pro Leu Val 500 505 510 Pro Pro Leu Gly Pro Ala Pro Pro Gly Leu Phe Pro Pro Ala Pro Leu 515 520 525 Pro Asn Pro Gly Val Leu Ser Ala Pro Pro Asn Leu Ile Gln Arg Pro 530 535 540 Lys Ala Asp Asp Thr Ser Ala Ala Thr Ile Glu Lys Lys Ala Thr Ala 545 550 555 560 Thr Ile Ser Ala Lys Pro Gln Ile Thr Asn Pro Lys Ala Glu Ile Thr 565 570 575 Arg Phe Val Pro Thr Ala Leu Arg Val Arg Arg Glu Asn Lys Gly Ala 580 585 590 Thr Ala Ala Pro Gln Arg Lys Ser Glu Asp Asp Ser Ala Val Pro Leu 595 600 605 Ala Lys Ala Ala Pro Lys Ser Gly Pro Ser Val Pro Val Ser Val Gln 610 615 620 Thr Lys Asp Asp Val Tyr Glu Ala Phe Met Lys Glu Met Glu Gly Leu 625 630 635 640 Leu <210> 3 <211> 73 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized Oligonucleotide <400> 3 aattcatggt tccacgtttg ccccctggca gaaaacctcc tggccctccc cctggtccac 60 cttcctcctc aac 73 <210> 4 <211> 68 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized Oligonucleotide <400> 4 gttgaggagg aggtggacca gggggagggc caggaggttt tctgccaggg ggcaaacgtg 60 gaaccatg 68 <210> 5 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized Oligonucleotide <400> 5 gagaattcat gcagatacaa gcacctccc 29 <210> 6 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized Oligonucleotide <400> 6 gacccgggca atcaagttgg gtggggc 27 <210> 7 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized Oligonucleotide <400> 7 gagaattcat gccgctgccc gttgcg 26 <210> 8 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized Oligonucleotide <400> 8 gacccgggct tctttgccct cttcccg 27 <210> 9 <211> 702 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(702) <400> 9 atg tct cag agc aac cgg gag ctg gtg gtt gac ttt ctc tcc tac aag 48 Met Ser Gln Ser Asn Arg Glu Leu Val Val Asp Phe Leu Ser Tyr Lys 1 5 10 15 ctt tcc cag aaa gga tac agc tgg agt cag ttt agt gat gtg gaa gag 96 Leu Ser Gln Lys Gly Tyr Ser Trp Ser Gln Phe Ser Asp Val Glu Glu 20 25 30 aac agg act gag gcc cca gaa ggg act gaa tcg gag atg gag acc ccc 144 Asn Arg Thr Glu Ala Pro Glu Gly Thr Glu Ser Glu Met Glu Thr Pro 35 40 45 agt gcc atc aat ggc aac cca tcc tgg cac ctg gca gac agc ccc gcg 192 Ser Ala Ile Asn Gly Asn Pro Ser Trp His Leu Ala Asp Ser Pro Ala 50 55 60 gtg aat gga gcc act gcg cac agc agc agt ttg gat gcc cgg gag gtg 240 Val Asn Gly Ala Thr Ala His Ser Ser Ser Leu Asp Ala Arg Glu Val 65 70 75 80 atc ccc atg gca gca gta aag caa gcg ctg agg gag gca ggc gac gag 288 Ile Pro Met Ala Ala Val Lys Gln Ala Leu Arg Glu Ala Gly Asp Glu 85 90 95 ttt gaa ctg cgg tac cgg cgg gca ttc agt gac ctg aca tcc cag ctc 336 Phe Glu Leu Arg Tyr Arg Arg Ala Phe Ser Asp Leu Thr Ser Gln Leu 100 105 110 cac atc acc cca ggg aca gca tat cag agc ttt gaa cag gta gtg aat 384 His Ile Thr Pro Gly Thr Ala Tyr Gln Ser Phe Glu Gln Val Val Asn 115 120 125 gaa ctc ttc cgg gat ggg gta aac tgg ggt cgc att gtg gcc ttt ttc 432 Glu Leu Phe Arg Asp Gly Val Asn Trp Gly Arg Ile Val Ala Phe Phe 130 135 140 tcc ttc ggc ggg gca ctg tgc gtg gaa agc gta gac aag gag atg cag 480 Ser Phe Gly Gly Ala Leu Cys Val Glu Ser Val Asp Lys Glu Met Gln 145 150 155 160 gta ttg gtg agt cgg atc gca gct tgg atg gcc act tac ctg aat gac 528 Val Leu Val Ser Arg Ile Ala Ala Trp Met Ala Thr Tyr Leu Asn Asp 165 170 175 cac cta gag cct tgg atc cag gag aac ggc ggc tgg gat act ttt gtg 576 His Leu Glu Pro Trp Ile Gln Glu Asn Gly Gly Trp Asp Thr Phe Val 180 185 190 gaa ctc tat ggg aac aat gca gca gcc gag agc cga aag ggc cag gaa 624 Glu Leu Tyr Gly Asn Asn Ala Ala Ala Glu Ser Arg Lys Gly Gln Glu 195 200 205 cgc ttc aac cgc tgg ttc ctg acg ggc atg act gtg gcc ggc gtg gtt 672 Arg Phe Asn Arg Trp Phe Leu Thr Gly Met Thr Val Ala Gly Val Val 210 215 220 ctg ctg ggc tca ctc ttc agt cgg aaa tga 702 Leu Leu Gly Ser Leu Phe Ser Arg Lys 225 230 <210> 10 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized Oligonucleotide <400> 10 gacccgggat atgtctcaga gcaaccggga g 31 <210> 11 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized Oligonucleotide <400> 11 gagcggccgc tcatttccga ctgaagagtg 30 <210> 12 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized Oligonucleotide <400> 12 gacacgtgca tccaaactgc tgctgtgcgc 30
【図１】この出願の第１発明の原理を説明する模式図で
ある。Ａ−Ｘを単独で発現させたときのＡ−Ｘの分布
(ａ)、Ｙ−Ｂを単独で発現させたときのＹ−Ｂの分布
(ｂ)、ＸとＹが結合能を有する場合にＡ−ＸとＴ−Ｂを
同時に発現させたときの両者の分布(ｃ)、ＸとＹが結合
能を有さない場合にＡ−ＸとＹ−Ｂを同時に発現させた
ときの両者の分布(ｄ)をそれぞれ示す。
ある。Ａ−Ｘを単独で発現させたときのＡ−Ｘの分布
(ａ)、Ｙ−Ｂを単独で発現させたときのＹ−Ｂの分布
(ｂ)、ＸとＹが結合能を有する場合にＡ−ＸとＴ−Ｂを
同時に発現させたときの両者の分布(ｃ)、ＸとＹが結合
能を有さない場合にＡ−ＸとＹ−Ｂを同時に発現させた
ときの両者の分布(ｄ)をそれぞれ示す。
【図２】Npw38(ａ)とNpwBP(ｂ)のドメイン構造を表示し
た図である。
た図である。
【図３】蛋白質の発現を観察した顕微鏡写真を作図した
ものであって、融合蛋白質NpwBP(P2)-GFPの局在パタ−
ン(ａ)と、HA-Npw38と一緒に発現させた場合のNpwBP(P
2)-GFPの局在パターン(ｂ)およびHA−Npw38の局在パタ
ーン(ｃ)を表示した図である。
ものであって、融合蛋白質NpwBP(P2)-GFPの局在パタ−
ン(ａ)と、HA-Npw38と一緒に発現させた場合のNpwBP(P
2)-GFPの局在パターン(ｂ)およびHA−Npw38の局在パタ
ーン(ｃ)を表示した図である。
【図４】蛋白質の発現を観察した顕微鏡写真を作図した
ものであって、融合蛋白質Npw38(ΔC)-GFPの局在パター
ン(a)と、NpwBP(P2)-Bcl-XLと一緒に発現させた場合のN
pw38(ΔC)-GFPの局在パターン(b)およびミトコンドリア
の抗体染色像(c)を表示した図である。
ものであって、融合蛋白質Npw38(ΔC)-GFPの局在パター
ン(a)と、NpwBP(P2)-Bcl-XLと一緒に発現させた場合のN
pw38(ΔC)-GFPの局在パターン(b)およびミトコンドリア
の抗体染色像(c)を表示した図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） (Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ１２Ｒ 1:91） Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 大竹 美弥子 東京都狛江市中和泉４−19−10 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA80 CA04 CA07 DA02 EA04 FA20 GA13 HA01 4B063 QA08 QQ79 QR33 QR48 QR60 QR77 QR80 QS05 QS33 QS36 QS38 QX02 4H045 AA10 AA11 BA41 CA40 DA76 EA20 FA72 FA74
Claims (12)
- 【請求項１】 蛋白質Ｘと、レポーター機能を有する蛋
白質Ｙとの真核細胞内における相互作用を検出する方法
であって、 (1) 蛋白質Ｘおよび蛋白質Ｙがそれぞれ異なる局在パタ
ーンで細胞内発現するように蛋白質Ｘおよび／または蛋
白質Ｙを修飾し、 (2) 蛋白質Ｘおよび蛋白質Ｙを真核細胞内で共発現さ
せ、 (3) レポーター機能を指標として蛋白質Ｙの細胞内局在
を特定することを特徴とする蛋白質−蛋白質相互作用検
出方法。 - 【請求項２】 蛋白質Ｙが、レポーター蛋白質Ｂとの融
合蛋白質Ｙ−Ｂである請求項１の方法。 - 【請求項３】 レポーター蛋白質Ｂが蛍光蛋白質である
請求項２の方法。 - 【請求項４】 ステップ(1)において、蛋白質Ｘおよび
／または蛋白質Ｙの細胞内局在化シグナル配列を変異さ
せる請求項１の方法。 - 【請求項５】 ステップ(1)において、蛋白質Ｘに、蛋
白質Ｙとは異なる細胞内局在化シグナル配列を有する蛋
白質Ａを融合させる請求項１の方法。 - 【請求項６】 蛋白質Ｘと、レポーター機能を有する蛋
白質Ｙとの真核細胞内における相互作用に対する化合物
Ｚの阻害または促進作用を検出する方法であって、 (1) 蛋白質Ｘおよび蛋白質Ｙがそれぞれ異なる局在パタ
ーンで細胞内発現するように蛋白質Ｘおよび／または蛋
白質Ｙを修飾し、 (2) 蛋白質Ｘおよび蛋白質Ｙを真核細胞内で共発現さ
せ、 (3) 化合物Ｚを真核細胞内に導入し、 (4) レポーター機能を指標として蛋白質Ｙの細胞内局在
を特定することを特徴とする蛋白質−蛋白質相互作用検
出方法。 - 【請求項７】 蛋白質Ｙが、レポーター蛋白質Ｂとの融
合蛋白質Ｙ−Ｂである請求項６の方法。 - 【請求項８】 レポーター蛋白質Ｂが蛍光蛋白質である
請求項７の方法。 - 【請求項９】 ステップ(1)において、蛋白質Ｘおよび
／または蛋白質Ｙの細胞内局在化シグナル配列を変異さ
せる請求項６の方法。 - 【請求項１０】 ステップ(1)において、蛋白質Ｘに、
蛋白質Ｙとは異なる細胞内局在化シグナル配列を有する
蛋白質Ａを融合させる請求項６の方法。 - 【請求項１１】 ステップ(3)において、化合物Ｚを真
核細胞と共存させる請求項６の方法。 - 【請求項１２】 ステップ(3)において、化合物Ｚを真
核細胞内で発現させる請求項６の方法。
Priority Applications (5)
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|---|---|---|---|
| JP2000254418A JP2001327296A (ja) | 2000-03-15 | 2000-08-24 | 蛋白質−蛋白質相互作用検出方法 |
| PCT/JP2001/001973 WO2001068885A1 (fr) | 2000-03-15 | 2001-03-13 | Procede de detection de l'interaction proteine-proteine |
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| EP01912323A EP1184463A4 (en) | 2000-03-15 | 2001-03-13 | METHOD FOR DETECTING PROTEIN-PROTEIN INTERACTION |
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| JP2000-73095 | 2000-03-15 | ||
| JP2000073095 | 2000-03-15 | ||
| JP2000254418A JP2001327296A (ja) | 2000-03-15 | 2000-08-24 | 蛋白質−蛋白質相互作用検出方法 |
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|---|---|
| JP2001327296A true JP2001327296A (ja) | 2001-11-27 |
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Family Applications (1)
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| JP2000254418A Pending JP2001327296A (ja) | 2000-03-15 | 2000-08-24 | 蛋白質−蛋白質相互作用検出方法 |
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| EP (1) | EP1184463A4 (ja) |
| JP (1) | JP2001327296A (ja) |
| CA (1) | CA2374155A1 (ja) |
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| WO2012125807A2 (en) | 2011-03-17 | 2012-09-20 | Cernostics, Inc. | Systems and compositions for diagnosing barrett's esophagus and methods of using the same |
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- 2001-03-13 EP EP01912323A patent/EP1184463A4/en not_active Withdrawn
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- 2001-03-13 US US09/959,987 patent/US20030040012A1/en not_active Abandoned
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