KR20170116111A

KR20170116111A - 폴리디메틸실록산 친화성 펩티드 및 그의 용도

Info

Publication number: KR20170116111A
Application number: KR1020177025288A
Authority: KR
Inventors: 요이치 구마다; 료코 오츠키; 료타 아카이; 쥰코 가타야마; 가즈타카 마토바
Original assignee: 고쿠리츠 다이가쿠 호우진 교토 코우게이 센이 다이가쿠; 닛산 가가쿠 고교 가부시키 가이샤
Priority date: 2015-02-13
Filing date: 2016-02-12
Publication date: 2017-10-18
Also published as: CN107207612A; SG11201706420SA; EP3257868A1; WO2016129695A1; EP3257868A4; TW201636374A; JP6772074B2; US20180022830A1; JPWO2016129695A1

Abstract

본 발명은 폴리디메틸실록산(PDMS)에 친화성을 갖는 펩티드가 결합한 폴리디메틸실록산 기재를 제공하는 것, 목적 단백질의 폴리디메틸실록산 기재로의 고정화 방법을 제공하는 것, PDMS에 친화성을 갖는 펩티드를 제공하는 것, PDMS에 친화성을 갖는 펩티드를 코드하는 폴리뉴클레오티드를 제공하는 것, 또한 이것을 사용한 벡터 등을 제공하는 것을 목적으로 한다. 이하의 (1a) 또는 (1b)의 펩티드 또는 그의 단편을 포함하는 폴리디메틸실록산 친화성 펩티드가 결합되어서 이루어지는, 폴리디메틸실록산 기재; (1a) 서열 번호 1 내지 9로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종으로 표현되는 아미노산 서열을 포함하는 펩티드, (1b) 상기 (1a)의 아미노산 서열에 있어서 1개 또는 복수의 아미노산이 결실, 치환 및/또는 부가된 아미노산 서열을 포함하고, 또한 폴리디메틸실록산 친화성을 갖는 펩티드.

Description

폴리디메틸실록산 친화성 펩티드 및 그의 용도

본 발명은 폴리디메틸실록산에 친화성을 갖는 펩티드 및 해당 펩티드의 용도에 관한 것이다.

종래, 임상 검사, 창약 연구, 환경 모니터링, 생화학을 비롯한 여러 분야에 있어서, 단백질, 핵산, 세포 등을 기재에 고정하고, 이것을 사용해서 원하는 물질을 검출, 정량, 분석하거나 하는 방법이 널리 이용되고 있다. 일례로서, 효소나 항체 등의 단백질을 기재에 고정하고, 고정된 단백질과의 효소 반응이나 항원 항체 반응을 이용해서 원하는 물질을 검출하는 방법이 알려져 있다.

이러한 방법에 있어서는, 보다 고정밀도 또한 고효율의 검출, 정량, 분석 등을 가능하게 해야 하며 오늘도 왕성하게 연구가 행하여지고 있고, 예를 들어, 목적에 따라 기재 표면에 화학 처리나 플라스마 처리 등을 실시하는 방법이 보고되어 있다. 또한, 예를 들어, 폴리스티렌제 기재에 단백질을 고정할 수 있는 펩티드(특허문헌 1)나, 폴리카르보네이트제 기재나 폴리메타크릴산메틸제 기재에 단백질을 특이적으로 또한 견고하게 고정할 수 있는 펩티드가 보고되어 있다(특허문헌 2).

한편, 폴리디메틸실록산은 실리콘 고무의 일종이며, 미세 가공이 가능한 점에서, 마이크로 유체 유로를 대표로 하는 마이크로칩 기재의 하나로서 알려져 있다. 폴리디메틸실록산에 단백질을 바람직하게 고정할 수 있으면 원하는 물질을 보다 고정밀도로 또한 고효율로 검출하거나 할 수 있고, 폴리디메틸실록산제 기재를 사용한 방법의 발전을 한층더 기대할 수 있다. 그러나, 지금까지 폴리디메틸실록산제 기재에 대한 친화성 펩티드는 알려져 있지 않다.

WO2009/101807 A1 일본 특허 공개 제2011-168505호 공보

이러한 점에서, 본 발명은 폴리디메틸실록산(PDMS)에 친화성을 갖는 펩티드가 결합한 PDMS 기재를 제공하는 것을 목적으로 한다. 또한, 본 발명은 목적 단백질의 PDMS 기재로의 고정화 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 PDMS에 친화성을 갖는 펩티드를 제공하는 것을 목적으로 한다. 또한, 본 발명은 PDMS에 친화성을 갖는 펩티드를 코드하는 폴리뉴클레오티드를 제공하는 것을 목적으로 한다. 또한, 본 발명은 이것을 사용한 벡터 등을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명자들은 상기 과제를 해결하도록 예의 검토를 행한 결과, PDMS에 친화성을 갖는 펩티드를 알아내었다. 본 발명은 이러한 지견에 기초하여 또한 검토를 거듭함으로써 완성된 것이다. 즉, 본 발명은 하기에 내세우는 발명을 제공한다.

항 1. 이하의 (1a) 또는 (1b)의 펩티드 또는 그의 단편을 포함하는 폴리디메틸실록산 친화성 펩티드가 결합되어서 이루어지는, 폴리디메틸실록산 기재;

(1a) 서열 번호 1 내지 9로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종으로 표현되는 아미노산 서열을 포함하는 펩티드,

(1b) 상기 (1a)의 아미노산 서열에 있어서 1개 또는 복수의 아미노산이 결실, 치환 및/또는 부가된 아미노산 서열을 포함하고, 또한 폴리디메틸실록산 친화성을 갖는 펩티드.

항 2. 상기 단편이 15 내지 58의 아미노산 잔기를 포함하는 펩티드인, 항 1에 기재된 폴리디메틸실록산 기재.

항 3. 상기 폴리디메틸실록산 친화성 펩티드를 개재해서 목적 단백질이 폴리디메틸실록산 기재에 고정화되어 이루어지는, 항 1 또는 2에 기재된 폴리디메틸실록산 기재.

항 4. 목적 단백질에 도입된 이하의 (1a) 또는 (1b)의 펩티드 또는 그의 단편을 포함하는 폴리디메틸실록산 친화성 펩티드와 폴리디메틸실록산 기재를 접촉시키는 공정을 함유하는, 목적 단백질의 폴리디메틸실록산 기재로의 고정화 방법;

항 5. 항 1 또는 2에 기재된 폴리디메틸실록산 기재에 결합한 폴리디메틸실록산 친화성 펩티드와 목적 단백질을 결합시키는 공정을 함유하는, 목적 단백질의 폴리디메틸실록산 기재로의 고정화 방법.

항 6. 이하의 (1a) 또는 (1b)의 펩티드 또는 그의 단편을 포함하는 폴리디메틸실록산 친화성 펩티드를 함유하는, 폴리디메틸실록산 기재로의 목적 단백질 고정화용 조성물;

항 7. 목적 단백질을 폴리디메틸실록산 기재에 고정시키기 위한, 이하의 (1a) 또는 (1b)의 펩티드 또는 그의 단편을 포함하는 폴리디메틸실록산 친화성 펩티드의 용도;

항 8. 이하의 (1c) 또는 (1d)의 펩티드 또는 그의 단편을 포함하는, 폴리디메틸실록산 친화성 펩티드;

(1c) 서열 번호 2 내지 9로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종으로 표현되는 아미노산 서열을 포함하는 펩티드,

(1d) 서열 번호 1 내지 9로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종으로 표현되는 아미노산 서열에 있어서 1개 또는 복수의 아미노산이 결실, 치환 및/또는 부가된 아미노산 서열을 포함하고, 또한 폴리디메틸실록산 친화성을 갖는 펩티드.

항 9. 상기 단편이 15 내지 58의 아미노산 잔기를 포함하는 펩티드인, 항 8에 기재된 폴리디메틸실록산 친화성 펩티드.

항 10. 항 8 또는 9에 기재된 폴리디메틸실록산 친화성 펩티드를 코드하는 폴리뉴클레오티드.

항 11. 상기 폴리뉴클레오티드가 서열 번호 10 내지 18로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종으로 표현되는 폴리뉴클레오티드인, 항 10에 기재된 폴리뉴클레오티드.

항 12. 항 10 또는 11에 기재된 폴리뉴클레오티드를 함유하는, 폴리디메틸실록산 친화성 펩티드 발현 벡터.

항 13. 항 10 또는 11에 기재된 폴리뉴클레오티드와 목적 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드가 연결되어 이루어지는, 항 8 또는 9에 기재된 폴리디메틸실록산 친화성 펩티드와 목적 단백질과의 펩티드 융합 단백질 발현 벡터.

항 14. 항 13에 기재된 벡터를 숙주 세포에 도입해서 형질전환시킴으로써 얻어지는 형질전환체.

항 15. 항 14에 기재된 형질전환체로 얻어지는, 항 8 또는 9에 기재된 폴리디메틸실록산 친화성 펩티드와 목적 단백질과의 펩티드 융합 단백질.

항 16. 항 8 또는 9에 기재된 폴리디메틸실록산 친화성 펩티드를 포함하는, 폴리디메틸실록산 기재로의 목적 단백질의 고정화용 링커.

본 발명의 펩티드는 PDMS에 친화성을 갖는다. 이로 인해, 본 발명의 PDMS 친화성 펩티드에 의하면, 해당 PDMS 친화성 펩티드를 개재해서 목적 단백질을 PDMS 기재에 용이하게 고정할 수 있다. 이 점에서, 본 발명에 따르면, PDMS 친화성 펩티드를 개재하여 목적 단백질을 PDMS 기재에 고정밀도로 또한 고효율로 고정하는 것이 가능하게 된다.

도 1은 펩티드 융합 단백질의 PDMS 기재에 대한 흡착 밀도를 나타낸다.
도 2는 펩티드를 융합시킨 단백질의, PDMS 기재 상에서의 잔존 활성을 나타낸다.
도 3은 실시예 3에서 사용한 HPLC에서의 프로그램을 나타낸다.
도 4는 펩티드 융합 단백질의 PDMS 기재에 대한 흡착 밀도를 나타낸다.
도 5는 펩티드 융합 단백질의 항원 결합 활성을 나타낸다.
도 6은 펩티드 융합 단백질의 항원 결합 활성을 나타낸다.

본 발명은 PDMS에 친화성을 갖는 펩티드가 결합한 PDMS 기재 등을 제공한다. 이하, 본 발명에 대해서 설명한다.

1. 폴리디메틸실록산 ( PDMS ) 친화성 펩티드

본 발명에 있어서 PDMS 친화성 펩티드는 이하의 (1-1) 또는 (1-2)의 펩티드 또는 그의 단편을 포함한다;

(1-1) 서열 번호 1 내지 9로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종으로 표현되는 아미노산 서열을 포함하는 펩티드,

(1-2) 상기 (1-1)의 아미노산 서열에 있어서 1개 또는 복수의 아미노산이 결실, 치환 및/또는 부가된 아미노산 서열을 포함하고, 또한 폴리디메틸실록산 친화성을 갖는 펩티드.

본 발명에 있어서 펩티드란, 펩티드 결합에 의해 결합하고 있는 2 이상의 아미노산 잔기를 함유하는 것을 가리키고, 아미노산 잔기의 수에 따라서는 올리고펩티드, 폴리펩티드, 단백질로 칭해지는 것도 포함한다.

상기 (1-1)에 있어서 펩티드는 서열 번호 1 내지 9로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종으로 표현되는 아미노산 서열을 포함하는 한 제한되지 않고, 예를 들어, 서열 번호 1 내지 9 중 어느 것으로 표현되는 아미노산 서열을 포함하는 펩티드이어도 되고, 서열 번호 1 내지 9 중 어느 것으로 표현되는 아미노산 서열을 2 이상 갖고 있으며, 또한 PDMS 친화성을 갖는 펩티드이어도 된다.

상기 (1-2)의 펩티드에 있어서, 「1개 또는 복수」의 범위는 해당 펩티드가 PDMS 친화성을 갖는 한 특별히 제한되지 않지만, 예를 들어, 1 내지 15개, 바람직하게는 1 내지 10개, 보다 바람직하게는 1 내지 5개, 더욱 바람직하게는 1 내지 4개, 특히 바람직하게는 1 내지 3개, 더욱 특히 바람직하게는 1 또는 2개를 들 수 있다. 특정한 아미노산 서열에 있어서 1개 또는 복수의 아미노산을 결실, 치환 및/또는 부가시키는 기술은 공지다.

또한, 이렇게 결실, 치환 및/또는 부가된 펩티드로서, 서열 번호 1 내지 9로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종으로 표현되는 아미노산 서열에 대하여 50% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 또한 PDMS 친화성을 갖는 펩티드가 예시된다. 또한, 해당 펩티드로서, 바람직하게는 서열 번호 1 내지 9 중 어느 것으로 표현되는 아미노산 서열에 대하여 50% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 또한 PDMS 친화성을 갖는 펩티드가 예시된다. 이들에 있어서 보다 바람직하게는, 아미노산 서열의 동일성은 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상, 더욱 바람직하게는 95% 이상, 특히 바람직하게는 97% 이상, 더욱 특히 바람직하게는 98% 이상이다.

또한, 상기 (1-1) 또는 (1-2)의 펩티드의 단편도, 상기 (1-1) 또는 (1-2)의 펩티드의 단편이며, 해당 단편이 PDMS 친화성을 갖는 한 특별히 제한되지 않는다. 예를 들어, 해당 단편으로서, 아미노산 잔기수 15 내지 58, 바람직하게는 15 내지 45, 보다 바람직하게는 15 내지 30이며, 또한 PDMS 친화성을 갖는 단편을 들 수 있다.

본 발명을 제한하는 것이 아니지만, 일례로서, 서열 번호 5로 표현되는 아미노산 서열을 포함하는 펩티드는 서열 번호 2로 표현되는 아미노산 서열을 포함하는 펩티드의 단편이라고도 말할 수 있다. 또한, 본 발명을 제한하는 것이 아니지만, 서열 번호 8로 표현되는 아미노산 서열을 포함하는 펩티드는 17개의 아미노산 잔기 중 15개의 아미노산 잔기가 서열 번호 7로 표현되는 아미노산 서열을 포함하는 펩티드와 공통된다.

또한, 말할 필요도 없지만 본 명세서에 있어서 「서열 번호 2 내지 9로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종으로 표현되는 아미노산 서열을 포함하는 펩티드」나 「서열 번호 1 내지 9로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종으로 표현되는 아미노산 서열에 있어서 1개 또는 복수의 아미노산이 결실, 치환 및/또는 부가된 아미노산 서열을 포함하고, 또한 폴리디메틸실록산 친화성을 갖는 펩티드」라고 기재 되어 있는 경우도, 이것은 실질적으로 전술한 바와 마찬가지로 설명되고, 또한 후술하는 설명에 대해서도 실질적으로 마찬가지이다. 즉, 예를 들어 「서열 번호 2 내지 9로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종으로 표현되는 아미노산 서열을 포함하는 펩티드」는 서열 번호 2 내지 9로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종으로 표현되는 아미노산 서열을 포함하는 한 제한되지 않고, 예를 들어, 서열 번호 2 내지 9 중 어느 것으로 표현되는 아미노산 서열을 포함하는 펩티드이어도 되고, 서열 번호 2 내지 9 중 어느 것으로 표현되는 아미노산 서열을 2 이상 갖고 있으며, 또한 PDMS 친화성을 갖는 펩티드이어도 된다. 이밖에도 마찬가지로 설명된다.

여기서, 「PDMS 친화성을 갖는」이란, 상기 펩티드와 표면이 수식되어 있지 않은 PDMS 기재가 직접 결합 가능한 한 제한되지 않고, 그의 결합 조건은 사용하는 펩티드의 종류에 따라, 또는 PDMS 기재에 상기 펩티드를 개재해서 고정시키려는 목적 단백질 또는 해당 목적 단백질과 상호 작용을 갖는 원하는 물질의 특성에 따라, 적절히 결정하면 된다. 일례로서, 후술하는 실시예에 나타나는 결합(인큐베이트) 조건을 채용해도 되고, 해당 실시예에 나타나는 조건을 참고로 해서 당업자가 적절히 결정하면 된다. 예를 들어, 상기 펩티드를 함유하는 완충액이라고 한 임의의 용액, 예를 들어, PBS 용액을, PDMS 기재와 일정 시간 접촉시킴으로써 상기 펩티드와 PDMS 기재를 결합시킬 수 있다. 또한, 후술하는 실시예에서 사용한 PBS는 10×PBS(NaCl 1.38M(80.8g), KCl 27mM(2g), Na₂HPO₄·12H₂O 80mM(29g), KH₂PO₄ 15mM(2g))를 이온 교환수로 희석하여 1L가 되도록 한 것(pH7.4)이다. 또한, 해당 PBS를 적절히 희석하거나 pH 등을 변경한 경우에도 상기 펩티드와 PDMS 기재를 결합시킬 수 있다.

또한, 「PDMS 기재」란, 표면이 수식 되어 있지 않은 PDMS를 기재 표면의 일부 및/또는 전체 면에 갖고, 또한 상기 PDMS 친화성 펩티드가 PDMS 표면에 결합 가능한 한 제한되지 않는다. 예를 들어, PDMS 기재란, PDMS를 포함하는 기재, 다른 성분으로 구성되었지만 일부 또는 전체 면에 PDMS가 적층 및/또는 피복되어 이루어지는 기재 등을 들 수 있다.

본 발명의 PDMS 친화성 펩티드는 종래 공지된 유전자 공학적 방법이나 화학합성법 등에 의해 제작할 수 있다. 예를 들어, 서열 번호 1 내지 9 중 어느 것으로 표현되는 펩티드를 코드하는 폴리뉴클레오티드를 벡터 등에 삽입하고, 계속해서 해당 벡터가 삽입된 형질전환체를 배양한 뒤, 원하는 펩티드를 취득하면 된다. 또한, 본 발명의 PDMS 친화성 펩티드는 해당 펩티드의 생산능을 갖는 미생물로부터 단리, 정제함으로써 취득해도 된다. 또한, 본 발명의 PDMS 친화성 펩티드는 서열 번호 1 내지 9 중 어느 것으로 표현되는 아미노산 서열 또는 이것을 코드하는 뉴클레오티드 서열의 정보에 따라서 종래 공지된 화학합성법에 의해 합성해서 취득해도 된다. 또한, 화학합성법에는 액상법이나 고상법에 의한 펩티드 합성법이 포함된다. 보다 상세한 일례로서 후술하는 실시예의 수순을 들 수 있다. 취득한 펩티드가 PDMS에 친화성을 가질 것인지의 여부는 전술한 바와 마찬가지로, 취득한 펩티드와 표면이 수식되어 있지 않은 PDMS 기재가 직접 결합할 수 있는지의 여부에 기초해 판단하면 되고, 직접 결합하면 친화성을 갖는다고 할 수 있다. 결합 조건은 전술한 바와 마찬가지로 적절히 결정하면 된다.

본 발명의 PDMS 친화성 펩티드는 PDMS에 친화성을 갖는 점에서, 해당 PDMS 친화성 펩티드를 개재해서 목적 단백질을 PDMS 기재에 용이하게 고정할 수 있다. 이 점에서, 본 발명의 PDMS 친화성 펩티드는 목적 단백질의 PDMS 기재로의 고정화에 매우 유용하다. 또한, 이러한 본 발명에 따르면, PDMS 친화성 펩티드를 개재해서 목적 단백질을 PDMS 기재에 고밀도로 고정 가능하게 된다. 또한, 본 발명에 따르면, 목적 단백질을 그 활성이 유지된 상태에서 PDMS 기재에 고정 가능하게 된다. 또한, 본 발명에 따르면, 그의 배향이 균일해지도록 제어해서 목적 단백질을 PDMS 기재에 고정 가능하게 된다. 이와 같이, 본 발명에 따르면, PDMS 기재에서의 목적 단백질의 고밀도화, 고활성화 및/또는 고배향 제어가 가능하게 된다. 이러한 본 발명에 따르면, 목적 단백질을 PDMS 친화성 펩티드를 개재해서 PDMS 기재에 고정밀도, 고효율로 고정하는 것이 가능하게 되고, 또한 해당 목적 단백질과 상호 작용을 갖는 원하는 물질도, 상기 PDMS 친화성 펩티드를 개재해서 PDMS 기재에 고정밀도로 또한 고효율로 결합시키는 것이 가능하게 된다. 이 점에서, 본 발명의 PDMS 친화성 펩티드는 PDMS 기재로의 목적 단백질의 고정화용 링커에 유용하다.

이 점에서, 본 발명은 상기 PDMS 친화성 펩티드를 포함하는, PDMS 기재로의 목적 단백질의 고정화용 링커, 상기 PDMS 친화성 펩티드를 함유하는 PDMS 기재로의 목적 단백질 고정화용 조성물, 또한 목적 단백질을 PDMS 기재에 고정시키기 위한, PDMS 친화성 펩티드의 사용, 또한 해당 고정화용 조성물과 PDMS 기재를 포함하는 키트를 제공하고 있다고 할 수 있다. 해당 고정화용 링커, 고정화용 조성물, 사용 및 키트에 있어서, PDMS 친화성 펩티드, PDMS 기재, 목적 단백질, 고정화(결합) 조건 등, 또한 이들에 의해 얻어지는 효과는 전술한 바와 마찬가지로 설명된다.

또한 해당 고정화용 링커, 해당 고정화용 조성물 및 해당 키트에 있어서, 상기 목적 단백질은 1종이어도 되고, 2종 이상 포함하고 있어도 된다.

또한, 해당 사용에 있어서, 상기 목적 단백질은 1종이어도 되고, 2종 이상 포함하고 있어도 된다.

해당 고정화용 링커는 전술한 바와 같이 PDMS 친화성 펩티드를 개재해서 PDMS 기재에 목적 단백질을 고정할 수 있는 것이다.

해당 고정화용 조성물은 적어도 상기 PDMS 친화성 펩티드를 함유하고 있으면 되고, 또한 본 발명을 제한하는 것이 아니지만, 상기 PDMS 친화성 펩티드를 PDMS 기재에 간이한 조작으로 결합시키기 위해서, 이온 교환수, 증류수, 초순수, RO수와 같은 순수나 PBS와 같은 완충액 등의 임의의 용매, 목적 단백질, 또한 PDMS 친화성 펩티드를 개재해서 목적 단백질이 PDMS 기재에 고정되기 때문에 필요한 것을 포함하고 있어도 된다. 상기 용매로서 바람직하게는 완충액이 예시되고, 보다 바람직하게는 PBS가 예시된다. 또한, 해당 고정화용 조성물에 함유되는 PDMS 친화성 펩티드는 전술한 바와 같으며, 본 발명을 제한하는 것이 아니지만, 예를 들어, 해당펩티드가 원하는 발현 벡터를 구비하는 형질전환체(예를 들어, 대장균)를 배양해서 제조될 경우, 해당 펩티드로서, 배양 후에 얻어진 펩티드를 그대로 사용해도 되고, 바람직하게는 또한 투석법 등의 종래 공지된 정제 처리를 거쳐 얻은 펩티드를 사용하는 것이 예시된다. 이러한 조성물을 사용하면 상기 PDMS 친화성 펩티드를 PDMS 기재에 의해 간편하게 결합시킬 수 있고, 따라서 PDMS 친화성 펩티드를 개재하여, 목적 단백질을 PDMS 기재에 의해 간편하게 고정할 수 있다.

이들은 단백질 칩을 비롯한 바이오칩, 칼럼의 충전제, ELISA법에서의 마이크로플레이트, 고정화 효소 등의 제작에 있어서 적합하게 사용될 수 있다.

또한, 본 발명에 있어서 「포함한다」는, 「실질적으로 이루어진다」, 「로 이루어진다」라고 하는 의미도 또한 포함한다.

2. 폴리뉴클레오티드

본 발명은 상기 PDMS 친화성 펩티드를 코드하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 본 발명에 있어서 폴리뉴클레오티드는 상기 PDMS 친화성 펩티드를 코드하는 폴리뉴클레오티드인 한 제한되지 않고, 이하의 폴리뉴클레오티드가 예시된다;

(2-1) 상기 PDMS 친화성 펩티드를 코드하는 폴리뉴클레오티드,

(2-2) 서열 번호 10 내지 18 중 어느 것으로 표현되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드,

(2-3) 상기 (2-1) 및 (2-2) 중 어느 폴리뉴클레오티드의 상보쇄에 대하여 엄격한 조건 하에서 하이브리다이즈하고, 또한 PDMS 친화성 펩티드를 코드하는 폴리뉴클레오티드.

여기서, 상기 (2-1)의 폴리뉴클레오티드는 당업자라면 상기 PDMS 친화성 펩티드의 아미노산 서열에 기초하여, 종래 공지된 방법에 기초하여 용이하게 해석, 입수할 수 있다.

상기 (2-2)의 폴리뉴클레오티드가 코드하는 아미노산 서열은 각각 상기 서열 번호 1 내지 9로 표현되는 아미노산 서열에 상당한다.

상기 (2-3)에 있어서 「엄격한 조건 하에서 하이브리다이즈」한다란, 표준적인 하이브리다이제이션 조건 하에, 2개의 폴리뉴클레오티드 단편이 서로 하이브리다이즈할 수 있는 것을 의미하고, 본 조건은 문헌[Sambrook et al., Molecular Cloning: A laboratory manual(1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, USA]에 기재되어 있다. 보다 구체적으로는, 「엄격한 조건」이란, 6.0xSSC중, 약 45℃에서 하이브리다이제이션을 행하고, 그리고 2.0xSSC에 의해 50℃에서 세정하는 것을 의미한다.

상기 상보쇄에 대하여 엄격한 조건 하에서 하이브리다이즈하는 폴리뉴클레오티드는 통상 상기 (2-1) 및 (2-2) 중 어느 뉴클레오티드 서열과 일정 이상의 동일성을 갖고, 그 동일성은 70% 이상이 예시되고, 바람직하게는 85% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상, 더욱 바람직하게는 95% 이상, 특히 바람직하게는 98% 이상, 더욱 특히 바람직하게는 99% 이상이다. 뉴클레오티드 서열의 동일성은 시판 또는 인터넷 등의 전기 통신 회선을 통해서 이용 가능한 해석 툴을 사용해서 알 수 있고, 예를 들어, FASTA, BLAST, PSI-BLAST, SSEARCH 등의 소프트웨어를 사용해서 계산할 수 있다.

「PDMS 친화성을 갖는다」란 전술한 바와 마찬가지이며, 상기 폴리뉴클레오티드를 사용해서 제작되는 펩티드와 표면이 수식되어 있지 않은 PDMS 기재가 직접 결합 가능한 한 제한되지 않고, 그 결합 조건도 전술한 바와 같이 적절히 결정하면 된다. 상기 폴리뉴클레오티드로부터의 펩티드의 제작은 해당 분야에 있어서 종래 공지된 유전자 공학적 방법이나 화학합성법 등을 사용해서 행하면 되고, 이것은 당업자에 있어서 용이하다. 예를 들어, 후술하는 발현 벡터를 사용해서 펩티드를 제작할 수 있다.

또한, 본 발명의 폴리뉴클레오티드도 종래 공지된 유전자 공학적 방법이나 화학합성법 등을 사용해서 제작할 수 있다(Proc. Natl. Acad. Sci., USA., 78, 6613(1981); Science, 222, 778(1983); Molecular Cloning 2d Ed, Cold Spring Harbor Lab. Press(1989); 속 생화학 실험 강좌 「유전자 연구법 I, II, III」, 일본 생화학회 편(1986)등 참조). 예를 들어, 원하는 폴리뉴클레오티드를 갖는 미생물을 비롯해 적당한 기원부터 통상적인 방법에 따라서 cDNA 라이브러리를 제작하고, 해당 라이브러리로부터 적절한 프로브 등을 사용하여 원하는 폴리뉴클레오티드를 취득하면 된다. 또한, 예를 들어, 서열 번호 1 내지 9 중 어느 것으로 표현되는 아미노산의 서열 정보나, 서열 번호 10 내지 18 중 어느 것으로 표현되는 뉴클레오티드의 서열 정보에 기초하여, 종래 공지된 화학적 DNA 합성법에 의해 원하는 폴리뉴클레오티드를 제작, 취득하면 된다.

3. 발현 벡터

본 발명은 상기 폴리뉴클레오티드를 함유하는 PDMS 친화성 펩티드 발현 벡터를 제공한다. 본 발명의 PDMS 친화성 펩티드 발현 벡터는 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하고 있고, 또한 그 숙주 세포에 있어서 해당 폴리뉴클레오티드의 염기 서열에 기초하여 상기 PDMS 친화성 펩티드, 또는 상기 고정화용 링커를 발현할 수 있는 것이라면 특별히 제한되지 않는다. 벡터는 종래 공지된 바와 같이 일반적으로 숙주 세포와의 관계로부터 적절히 선택된다.

보다 구체적으로는, 본 발명에 있어서 사용되는 벡터는 유전자 공학 분야에 있어서 일반적으로 사용되고 있는 발현 벡터라면 제한되지 않고, pBR, pUC, pCD, pET, pGEX, pCMV, pMSG, pSVL을 비롯한, 대장균 등의 세균이나 효모 유래의 플라스미드 벡터나, 레트로바이러스, 아데노바이러스, 백시니아바이러스, 바큘로바이러스, 또한 파지 등에서 유래하는 바이러스 벡터가 예시된다.

이들 벡터에는 필요에 따라 프로모터가 접속되고, 프로모터는 숙주 세포에 적합한 프로모터라면 제한되지 않고, 종래 공지된 프로모터를 사용할 수 있다. 예를 들어, 프로모터로서 lac 프로모터, trp 프로모터, tac 프로모터, trc 프로모터, racA 프로모터, λPL 프로모터, lpp 프로모터, T7 프로모터 등을 들 수 있고, 이들은 예를 들어, 숙주 세포로서 대장균을 사용하는 경우에 사용된다. 또한, 예를 들어, 프로모터로서 SV40 프로모터, CMV 프로모터, RSV 프로모터, HSV-TK 프로모터, LTR 프로모터, SRα 프로모터, EF-1α 프로모터 등을 들 수 있고, 이들은 예를 들어, 숙주 세포로서 동물 세포를 사용하는 경우에 사용된다. 프로모터로서, 숙주 세포와의 관계 등을 고려하여, 효모 세포용 프로모터, 곤충 세포용 프로모터, 바이러스 프로모터 등도 사용할 수 있다. 프로모터가 내재하고 있는 벡터에 있어서는 내재하는 프로모터를 사용해도 된다.

본 발명의 PDMS 친화성 펩티드 발현 벡터에서의 프로모터의 접속 위치는 그 숙주 세포에 있어서 상기 PDMS 친화성 펩티드가 발현되는 한 제한되지 않는다. 일반적으로, 프로모터는 상기 PDMS 친화성 펩티드를 코드하는 폴리뉴클레오티드의 상류에 접속된다. 즉, 본 발명의 PDMS 친화성 펩티드 발현 벡터에 있어서, 상기 PDMS 친화성 펩티드를 코드하는 폴리뉴클레오티드는 해당 프로모터의 제어 하에 있다.

숙주 세포로서는 종래 공지된 원핵세포나 진핵세포의 각종 세포를 사용할 수 있고, 대장균, 고초균, 스트렙토코커스, 스타필로코커스, 방선균, 사상균 등의 세균, 효모, 아스퍼질러스, 드로소필러 S2, 스포도프테라 Sf9 등과 같은 곤충 등의 세포, 또한 L 세포, CHO 세포, COS 세포, Art-20 세포, HeLa 세포, C127 세포, 미엘로마 세포, GH3 세포, FL 세포, VERO 세포, CV-1 세포, Bowes 멜라노마 세포, 아프리카 발톱 개구리 등의 난모세포 등의 동식물 등의 세포가 예시된다.

이들 벡터, 프로모터 및 숙주 세포는 본 분야의 기술 상식에 기초하여 적절히 조합하여 사용하면 된다. 조합으로서 pET(T7 프로모터)/대장균 BL21(DE3), pGEX(Tac 프로모터)/대장균 BL21이 예시된다.

이 외에, 본 발명의 PDMS 친화성 펩티드 발현 벡터에는 또한 인핸서, 스플라이싱 시그널, 폴리 A 부가 시그널, 약제 내성 유전자, GFP(Green Fluorescent Protein) 등과 같은 마커 유전 등의 염기 서열이 접속되어 있어도 된다. 이들 염기 서열은 목적에 따라 상기 발현 벡터의 임의의 위치에 접속된다.

또한, 본 발명의 PDMS 친화성 펩티드 발현 벡터에는 후술하는 목적 단백질에 PDMS 친화성 펩티드를 도입하기 위한 링커를 구성하는 염기 서열이 또한 접속되어 있어도 된다. 예를 들어, 해당 링커를 구성하는 염기 서열은 PDMS 친화성 펩티드를 코드하는 폴리뉴클레오티드의 5' 말단부 및/또는 3' 말단부에 접속시킬 수 있다. 해당 링커를 구성하는 염기 서열은 본 발명의 효과가 얻어지는 한 제한되지 않고, 종래 공지된 기술을 사용해서 당업자가 통상의 검토 범위 내에서 적절히 결정하면 된다. 이러한 링커로서, 일반적으로 플렉시블 링커로 칭해지는 링커가 예시되고, 플렉시블 링커의 아미노산 서열로서는 (G₄S)n(예를 들어, n=1 내지 4)이 예시된다. 해당 링커를 사용하는 경우에는 해당 링커를 발현 가능한 뉴클레오티드 서열을 해당 링커에 적절히 접속하면 된다.

또한, 본 발명의 PDMS 친화성 펩티드 발현 벡터에는 상기 PDMS 친화성 펩티드를 코드하는 폴리뉴클레오티드에, 목적 단백질의 아미노산 서열을 코드하는 폴리뉴클레오티드가 연결되어 있어도 된다. 이에 의해, PDMS 친화성 펩티드가 도입된 목적 단백질을 발현시키는 것이 가능하게 되고, 또한 상기 고정화용 링커가 도입된 목적 단백질을 발현시키는 것이 가능하게 된다. 이와 같이, 상기 발현 벡터에, 목적 단백질의 아미노산 서열을 코드하는 폴리뉴클레오티드가 또한 연결된 발현 벡터는, PDMS 친화성 펩티드와 목적 단백질과의 펩티드 융합 단백질 발현 벡터라고 칭할 수 있다.

여기서, 목적 단백질이란 임의의 단백질을 말하며, 본 발명을 제한하는 것이 아니지만, 항원, 항체, 효소, 기질, 수용체 단백질, 렉틴 등의 단백질이 예시된다. 보다 구체적으로는, 이들에 제한되지 않지만, 글루타티온 전이효소(GST: Glutathione S-Transferase), GFP(green fluorescent protein), 알칼리 포스파타아제, 퍼옥시다아제, 루시페라아제, β-갈락토시다아제, 트립신, 키모트립신, 트롬빈, Factor Xa, 안지오텐신 변환 효소, 티로신 키나제, 인슐린 리셉터, EGF 리셉터, 말토오스 결합 단백질, 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 1본쇄 항체, 다가 성 1본쇄 항체(예를 들어, 2가성 1본쇄 항체), 정상부 융합 1본쇄 항체, Fab 단편 및 F(ab')2단편(항원 결합 부위를 포함하는 항체의 단편), 보체계 단백질 C1q, 콘카나바린 A, 렌틸 렉틴, 항체 결합 단백질(Protein A, ZZ, Protein G, Protein L 등), 비오틴, 스트렙트아비딘(아비딘) 등이 예시된다.

이들 목적 단백질의 아미노산 서열을 코드하는 뉴클레오티드 서열이 공지일 경우에는, 공지된 서열 정보에 기초하여, 종래 공지된 방법에 따라, 상기 발현 벡터에 원하는 뉴클레오티드 서열을 배치하면 된다. 또한, 목적 단백질의 아미노산 서열을 코드하는 뉴클레오티드 서열이 알려져 있지 않을 경우에는, 해당 목적 단백질의 아미노산 서열에 기초하여, 종래 공지된 유전자 공학적 방법이나 화학합성법 등을 사용하여, 목적 단백질의 아미노산 서열을 코드하는 폴리뉴클레오티드를 해석, 제작해서 상기 발현 벡터에 배치하면 된다.

상기 펩티드 융합 단백질을 발현시키는 관점에서, 목적 단백질의 아미노산 서열을 코드하는 폴리뉴클레오티드도, 상기 프로모터의 제어 하에 배치된다. 이에 관한 한에서, 목적 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드가 상기 PDMS 친화성 펩티드를 코드하는 폴리뉴클레오티드의 상류에 연결될지 하류에 연결될지, 또한 목적 단백질의 분자 내부에 PDMS 친화성 펩티드를 코드하는 폴리뉴클레오티드가 연결될지에 대해서는, 당업자가 적절히 결정하면 된다. 어느 것에 있어서도, 목적 단백질의 생리 활성이나 입체 구조를 손상시키지 않는 위치에 연결하는 것이 바람직하다. 예를 들어, 목적 단백질이 항원일 경우에는 항원 결정을 저해하지 않는 부위, 항체일 경우에는 항원 결합을 저해하지 않는 부위, 효소일 경우에는 효소 활성을 저해하지 않는 부위 등, 항원, 항체, 효소, 기질, 수용체 단백질, 렉틴 등의 목적 단백질의 특성이나 구조에 따라서 당업자가 적절히 결정하면 된다. 또한, PDMS 친화성 펩티드 또는 상기 고정화용 링커를 코드하는 폴리뉴클레오티드는 PDMS 친화성 펩티드의 기재에 대한 친화성 등의 특성에 영향을 주지 않고, 발명의 효과를 방해하지 않는 부위에 연결된다.

또한, 본 발명의 펩티드 융합 단백질 발현 벡터에서는 상기 PDMS 친화성 펩티드를 코드하는 폴리뉴클레오티드와 상기 목적 단백질의 아미노산 서열을 코드하는 폴리뉴클레오티드가 연결되어 이루어지고, 숙주 세포에 있어서 원하는 펩티드 융합 단백질이 발현되는 한, 그 연결 형태도 제한되지 않는다. 예를 들어, 본 발명의 펩티드 융합 단백질 발현 벡터에 있어서, 상기 PDMS 친화성 펩티드를 코드하는 폴리뉴클레오티드와 상기 목적 단백질의 아미노산 서열을 코드하는 폴리뉴클레오티드가 연속한 염기 서열로 존재하고 있어도 되고, 즉, 이들 폴리뉴클레오티드가 링커를 개재하지 않고 직접 연결되어 있어도 되고, 또는 이들 폴리뉴클레오티드가 어떠한 배열, 예를 들어, 전술한 플렉시블 링커 등의 링커를 구성하는 염기 서열을 개재해서 연결되어 있어도 되고, 본 발명의 효과가 얻어지는 한 제한되지 않는다. 본 발명에 있어서 목적 단백질의 아미노산 서열을 코드하는 폴리뉴클레오티드는, 본 발명의 효과를 방해하지 않는 한, 1종 단독으로 사용해도 되고, 2종 이상을 조합하여 사용해도 된다.

본 발명의 발현 벡터는 해당 분야에서 종래 공지된 방법을 사용해서 제작하면 되고, 제한 효소 등을 사용해서 폴리뉴클레오티드를 비롯한 필요한 염기 서열을 상기 벡터 상의 적절한 위치에 배치해서 제작하면 된다.

4. 형질전환체

본 발명은 상기 펩티드 융합 단백질 발현 벡터를 숙주 세포에 도입해서 형질전환시킴으로써 얻어지는 형질전환체를 제공한다.

본 발명에 있어서 숙주 세포는 전술한 숙주 세포가 예시된다.

펩티드 융합 단백질 발현 벡터를 숙주 세포에 도입해서 형질전환체를 얻는 방법은 특별히 제한되지 않고, 종래 공지된 일반적인 방법에 따라 행하면 된다. 예를 들어, 많은 표준적인 실험실 매뉴얼에 기재되는 방법에 따라서 행할 수 있고, 그 구체적 방법으로서는 염화칼슘법, 염화루비듐법, DEAE-덱스트란 매개 트랜스펙션, 현미경하주사법, 리포솜 등의 양이온성 지질 매개 트랜스펙션, 일렉트로포레이션, 형질도입, 파지 등에 의한 감염 등이 예시된다.

5. 펩티드 융합 단백질

본 발명은 상기 PDMS 친화성 펩티드와 상기 목적 단백질과의 펩티드 융합 단백질을 제공한다. 여기서,PDMS 친화성 펩티드 및 목적 단백질은 전술한 바와 같고, 펩티드 융합 단백질은 상기 PDMS 친화성 펩티드와 상기 목적 단백질을 연결함으로써 일체화시킨 융합 단백질이다.

본 발명을 제한하는 것이 아니지만, 일례로서 해당 펩티드 융합 단백질은 상기 형질전환체를 적절한 배지에서 배양하고, 해당 형질전환체 및/또는 배양물에서 원하는 펩티드 융합 단백질을 회수함으로써 제조할 수 있다. 배양, 회수 방법은 특별히 제한되지 않고, 종래 공지된 일반적인 방법에 따라 행하면 된다. 예를 들어, 배양은 숙주 세포를 관용되는 임의의 배지를 사용해서 계대배양 또는 배치배양을 행하면 되고, 또한 형질전환체 내외에 생산된 단백질량을 지표로 해서, 펩티드 융합 단백질이 적당량 얻어질 때까지 행하면 되고, 온도, 시간 등의 배양조건도 숙주 세포에 적합한 종래 공지된 조건에서 실시하면 된다.

이와 같이 하여 얻어지는 펩티드 융합 단백질은 또한 필요에 따라, 그의 물리적 성질, 화학적 성질 등을 이용한 각종 분리 조작, 예를 들어, 용매추출, 증류, 각종 크로마토그래피 등의 조작에 의해 분리, 정제해도 된다(「생화학 데이터 북 II」, 1175-1259 페이지, 제1판 제1쇄, 1980년, 가부시키가이샤 도꾜 가가꾸 도진 발행; Biochemistry, 25(25, 8274(1986); Eur. J. Biochem., 163, 313(1987) 등 참조). 또한, 본 발명의 펩티드 융합 단백질은 PDMS에 대하여 친화성을 구비하고 있는 점에서, 얻어진 배양액이나 형질전환체로부터의 산물 등을 PDMS 기재와 접촉시킴으로써 PDMS 친화성 펩티드를 PDMS 기재와 결합시켜서 분리, 정제해도 된다. 또한, 형질전환체를 사용해서 발현시킬 경우에는, 펩티드 융합 단백질이 봉입체로서 존재하고 있는 경우가 있지만, 이 경우에는 봉입체를 적절히 가용화하고, 이것을 PDMS 기재와 접촉시킴으로써 PDMS 친화성 펩티드를 PDMS 기재와 결합시켜서, 펩티드 융합 단백질을 분리, 정제해도 된다. 또한, 본 발명의 펩티드 융합 단백질의 입체 구조가 변화하고 있을 경우, 입체 구조가 변화한 상태에서 PDMS 기재와 결합시키는 것도 가능하고, 필요에 따라 결합시킨 상태에서 입체 구조의 리폴딩(refolding)을 행하여, 펩티드 융합 단백질을 분리, 정제해도 된다.

6. PDMS 친화성 펩티드가 결합되어서 되는 PDMS 기재

본 발명은 상기 PDMS 친화성 펩티드가 결합되어서 이루어지는 PDMS 기재를 제공한다. 이것은 상기 PDMS 친화성 펩티드가 PDMS 기재에 결합되어서 이루어지는 것이다. PDMS 친화성 펩티드, PDMS 기재는 전술한 바와 같다.

PDMS 기재의 형상도, PDMS 친화성 펩티드를 결합 가능한 한 제한되지 않고, 예를 들어, 판상, 필름상(시트상), 구상, 입상(비즈상), 섬유상, 마이크로플레이트 상, 통상 등 임의의 형상을 들 수 있다. 본 발명의 PDMS 기재를 단백질 칩 등의 바이오칩으로서 사용하는 경우에는, 그 형상은 판상, 필름상(시트상) 등이 바람직하게 예시된다.

상기 PDMS 친화성 펩티드가 결합되어서 되는 PDMS 기재는 상기 PDMS 친화성 펩티드 또는 상기 고정화용 링커를 PDMS 기재와 접촉시켜서, PDMS 친화성 펩티드를 PDMS 기재에 결합 시킴으로써 제조할 수 있다. 그 접촉 조건은 전술한 바와 마찬가지로 사용하는 PDMS 친화성 펩티드의 종류에 따라, 또한 PDMS 기재에 상기 PDMS 친화성 펩티드를 개재해서 고정화시키고 싶은 목적 단백질이나 해당 목적 단백질과 상호 작용을 갖는 원하는 물질의 특성에 따라서 적절히 결정하면 된다. 예를 들어, PDMS 친화성 펩티드를 임의의 용매와 혼합하여 얻은 용액을, 또는 전술한 PDMS 친화성 펩티드를 함유하는 PDMS 기재로의 목적 단백질 고정화용 조성물을 PDMS 기재에 적하하거나 하여, 또는 해당 용액 등에 PDMS 기재를 침지하거나 하여, 일정시간 방치하면 된다. PDMS 기재에 결합되어 있지 않은 불필요한 성분의 제거는 예를 들어, 완충액이나 물 등의 임의의 용매를 사용해서 PDMS 기재 상의 불필요한 성분을 씻어버리거나 하면 된다. 일례로서 후술하는 실시예에 나타나는 결합 조건을 채용해도 되고, 실시예에 나타나는 결합 조건을 참고로 해서 당업자가 적절히 결정하면 된다.

상기 PDMS 친화성 펩티드는 PDMS에 친화성을 갖고 있는 점에서, 본 발명에 있어서 PDMS 친화성 펩티드는 PDMS 기재에 직접 결합할 수 있다.

또한, 본 발명의 PDMS 친화성 펩티드가 결합되어서 되는 PDMS 기재에는 또한, 해당 PDMS 친화성 펩티드를 개재해서 목적 단백질이 고정되어 있어도 된다. 목적 단백질은 전술한 바와 같다. 또한, 해당 목적 단백질은 1종 이어도 되고, 2종 이상이어도 된다.

해당 고정은 PDMS 친화성 펩티드를 개재하여, PDMS 기재에 목적 단백질이 고정되어 있는 한 제한되지 않는다. 목적 단백질에 PDMS 친화성 펩티드를 도입한 후에, 이것을 PDMS 기재와 접촉시킴으로써 목적 단백질을 고정시켜도 되고, PDMS 기재에 결합한 PDMS 친화성 펩티드를 목적 단백질에 도입함으로써, 목적 단백질을 고정시켜도 된다. 이에 의해, PDMS 친화성 펩티드를 개재해서 목적 단백질이 고정된 PDMS 기재를 제조할 수 있다. 또한, PDMS 기재와의 접촉 조건은 전술한 바와 마찬가지이다.

목적 단백질로의 PDMS 친화성 펩티드의 도입은 본 발명의 효과를 방해하지 않는 한, 또한 PDMS 친화성 펩티드가 도입되는 한 제한되지 않지만, 직접 또는 링커를 개재해서 도입되어 있으면 된다. 해당 링커는 전술한 바와 마찬가지로 당업자가 적절히 결정하면 된다.

목적 단백질로의 PDMS 친화성 펩티드의 도입부위는 목적 단백질의 활성이나 배향, PDMS 친화성 펩티드의 기재에 대한 친화성 등의 특성에 영향을 주지 않고, 발명의 효과를 방해하지 않는 한, 임의의 부위에 도입할 수 있다. 예를 들어, 목적 단백질이 항원일 경우에는 항원 결정을 저해하지 않는 부위, 항체일 경우에는 항원 결합을 저해하지 않는 부위, 효소일 경우에는 효소 활성을 저해하지 않는 부위 등, 항원, 항체, 효소, 기질, 수용체 단백질, 렉틴 등의 목적 단백질의 특성이나 구조에 따라서 당업자가 적절히 결정하면 된다. 특히, 본 발명에 있어서는 이렇게 PDMS 친화성 펩티드의 도입부위를 적절히 결정 할 수 있는 점에서, 그 활성이 유지된 상태에서, 또한 그 배향이 균일해지도록 제어하여, 목적 단백질을 PDMS에 고정하는 것이 가능하게 된다.

또한, 목적 단백질로의 PDMS 친화성 펩티드의 도입 방법도 특별히 제한되지 않고, 종래 공지된 유전자 공학적 방법이나 화학합성법을 사용해서 적절히 도입시켜도 되고, 예를 들어, 전술한 바와 같은 발현 벡터를 이용해서 도입하면 된다. 또한, 예를 들어, 글루타르알데히드나, NHS/EDC(N-히드록시 숙신이미드/1-에틸-3- (3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드 염산염)를 비롯한 가교제를 사용해서 PDMS 친화성 펩티드를 목적 단백질에 도입해도 되고, 비오틴화한 PDMS 친화성 펩티드와 스트렙트아비딘(아비딘) 표지한 목적 단백질과의 비오틴-스트렙트아비딘(아비딘)을 개재한 특이적 결합에 의해 PDMS 친화성 펩티드를 목적 단백질에 도입해도 되고, 또한, 비오틴화한 PDMS 친화성 펩티드와 비오틴화한 목적 단백질과의 스트렙트아비딘(아비딘)을 개재한 특이적 결합에 의해 PDMS 친화성 펩티드를 목적 단백질에 도입해도 되고, 이렇게 종래 공지된 방법을 사용해서 도입하면 된다.

목적 단백질에 PDMS 친화성 펩티드가 도입되는 적합한 예로서는, 상기 펩티드 융합 단백질을 들 수 있고, 이것을 전술한 바와 같이 PDMS 기재와 접촉시킴으로써 PDMS 친화성 펩티드를 개재해서 목적 단백질을 PDMS 기재에 고정할 수 있다. 또한, 상기 가교제나 특이적 결합을 이용해서 목적 단백질에 PDMS 친화성 펩티드를 도입하고, 이것을 전술한 바와 같이 PDMS 기재와 접촉시킴으로써 PDMS 친화성 펩티드를 개재해서 목적 단백질을 PDMS 기재에 고정할 수 있다. 이 점에서, 본 발명은 또한, 상기 PDMS 친화성 펩티드를 목적 단백질에 도입시키는 공정을 함유하는, PDMS 기재에 결합하는 목적 단백질의 제조 방법, 또한 상기 PDMS 친화성 펩티드가 도입된 목적 단백질을 제공한다고 할 수 있다.

또한, 상기 가교제나 특이적 결합 등을 마찬가지로 이용하여, PDMS 기재에 결합하고 있는 PDMS 친화성 펩티드를 목적 단백질에 도입함으로써, PDMS 친화성 펩티드를 개재해서 목적 단백질을 PDMS 기재에 고정할 수 있다.

이러한 PDMS 친화성 펩티드가 결합되어서 되는 PDMS 기재에 의하면, 목적 단백질을, 높은 밀도로 그 활성을 충분히 유지시킨 채 및/또는 그 배향이 균일해지도록 제어해서 고정 가능하게 된다. 이 점에서, 본 발명의 PDMS 친화성 펩티드가 결합되어서 되는 PDMS 기재에 의하면, 고정밀도로 또한 고효율로, 목적 단백질이나, 해당 목적 단백질과 상호 작용을 갖는 원하는 물질을 검출, 측정, 분석하거나 하는 것이 가능해진다.

따라서, 본 발명의 PDMS 친화성 펩티드가 결합되어서 되는 PDMS 기재는 예를 들어, 전술한 바와 같이 판상, 필름상(시트상) 등의 형상일 경우에는 바이오칩, 특히 단백질 칩으로서 이용할 수 있다. 또한, 해당 PDMS 기재는 이 외에, 항원 항체 반응이나 효소 반응 등을 이용하는 칼럼의 충전제, ELISA법 등에서의 마이크로플레이트, 또한 고정화 효소 등으로서도 적합하게 사용되어, 임상 검사, 창약 연구, 환경 모니터링, 생화학 등의 모든 분야에서 이용할 수 있다.

7. 목적 단백질의 PDMS 기재로의 고정화 방법

본 발명은 목적 단백질에 도입된 상기 PDMS 친화성 펩티드와 PDMS 기재를 접촉시키는 공정을 함유하는, 목적 단백질의 PDMS 기재로의 고정화 방법을 제공한다.

여기서, 목적 단백질, PDMS 친화성 펩티드, PDMS 기재, 또한 목적 단백질로의 PDMS 친화성 펩티드로의 도입, 목적 단백질에 도입된 PDMS 친화성 펩티드와 PDMS 기재와의 접촉에 대해서는 전술한 바와 같다.

본 발명의 고정화 방법에 의하면, 상기 PDMS 친화성 펩티드가 PDMS 기재에 대한 친화성을 구비하고 있는 점에서, 목적 단백질에 도입된 PDMS 친화성 펩티드를 PDMS 기재에 접촉시키는 것만으로, PDMS 친화성 펩티드를 PDMS 기재에 결합시킬 수 있다. 이로 인해, 본 발명의 고정화 방법에 의하면, PDMS 친화성 펩티드를 개재해서 상기 목적 단백질을 PDMS 기재에 용이하게 고정할 수 있다.

본 발명의 고정화 방법은 또한 목적 단백질에 상기 PDMS 친화성 펩티드를 도입하는 공정을 조합해서 실시해도 되고, 즉, 목적 단백질에 상기 PDMS 친화성 펩티드를 도입하는 공정을 거친 후에 실시해도 된다. 해당 도입 등도 전술한 바와 마찬가지로 설명된다.

또한, 본 발명은 PDMS 기재에 결합한 PDMS 친화성 펩티드와 목적 단백질을 결합시키는 공정을 함유하는, 목적 단백질의 PDMS 기재로의 고정화 방법을 제공한다.

여기서, 목적 단백질, PDMS 친화성 펩티드, PDMS 기재, PDMS 친화성 펩티드의 PDMS 기재로의 결합은 전술한 바와 같다. 또한, PDMS 기재에 결합하고 있는 PDMS 친화성 펩티드와 목적 단백질과의 결합도, 본 발명의 효과를 방해하지 않는 한 제한되지 않고, 종래 공지된 기술 상식에 기초하여 당업자가 적절히 실시하면 되고, 예를 들어, 전술한 도입 방법을 들 수 있다.

또한, 본 발명의 고정화 방법은 또한, 상기 PDMS 친화성 펩티드를 PDMS 기재에 접촉시키는 공정과 조합해서 실시해도 되고, 즉, 상기 PDMS 친화성 펩티드를 PDMS 기재에 접촉시켜서 결합시키는 공정을 거친 후에 실시해도 된다. 상기 PDMS 친화성 펩티드의 PDMS 기재로의 접촉은 전술한 바와 마찬가지로 실시하면 된다.

이들 고정화 방법에 의하면, 목적 단백질이 고정화된 PDMS 기재를 간편하게 제조할 수 있다. 또한, 이들 고정화 방법에 의하면, PDMS 친화성 펩티드를 개재해서 목적 단백질이 PDMS 기재에 고정되어 있는 점에서, 목적 단백질을, 고밀도로 그 활성을 충분히 유지시킨 채 및/또는 그 배향이 균일해지도록 제어하여, 고정화할 수 있다. 따라서, 본 발명에 따르면, 단백질 칩 등의 바이오칩을 비롯해, 항원 항체 반응이나 효소 반응 등을 이용하는 칼럼의 충전제, ELISA법 등에서의 마이크로플레이트, 또한 고정화 효소 등의 제조도 용이하게 한다. 이 점에서, 본 발명의 고정화 방법은 임상 검사, 창약 연구, 환경 모니터링, 생화학 등의 모든 분야에 있어서 유용하다.

실시예

이하, 실시예를 들어서 본 발명을 설명하지만, 본 발명은 이하의 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1

이하의 수순에 따라, 서열 번호 1로 표현되는 펩티드(ELV1 펩티드), 서열 번호 2로 표현되는 펩티드(TPV1 펩티드), 서열 번호 3으로 표현되는 펩티드(OCV1 펩티드)의 폴리디메틸실록산(PDMS)에 대한 친화성에 대해서 검토하였다.

1. 수순

1-1. ELN (Elongation factor Tu ) 발현 벡터, TPA( Tryptophanase ) 발현 벡터, OMC(Outer membrane protein C) 발현 벡터의 구축

1) DNA Purification Kit(프로메가사제)를 사용해서 대장균 BL21(DE3) (Novagen사제)의 염색체 DNA의 추출을 행하였다.

2) 염색체 DNA를 주형으로 하고, KOD plus ver. 2 PCR kit(도요보사제)를 사용해서 PCR을 행하여, ELN의 유전자를 증폭하였다.

3) 증폭한 ELN의 유전자와 pET-22 벡터(Novagen사제)의 몰비가 3:1이 되게 혼합하고, 혼합 용액과 등량의 Ligation High(도요보사제)를 첨가하고, NdeI 사이트와 NotI 사이트 사이에 증폭한 ELN의 유전자를 삽입하고, 클로닝하였다.

4) 상기 벡터에서 대장균 HST08 Premium(다카라 바이오사제)을 형질전환하고, LB-Amp 한천 배지 중에서 밤새 정치 배양을 하였다.

5) Amp. 함유 LB 배지(나카라이테스크사제)를 15ml 튜브에 2ml 취하고, 한천 플레이트로부터 싱글 콜로니를 식균하여, 37℃, 200rpm으로 밤새 배양하였다.

6) 배양 후, 알칼리 SDS법에 의해 벡터를 회수·정제하였다.

7) 아가로오스 전기 영동에 의해 유전자의 삽입을 확인하고, 또한 DNA 시퀀스 해석(greiner사)에 의해 삽입된 ELN 유전자의 뉴클레오티드 서열을 확인하였다.

8) 상기 공정 6)에서 얻어진 벡터에서 대장균 Rosetta(DE3)를 형질전환하고, 배양 후, ELN 발현 대장균을 제조하였다.

OMC 발현 벡터는 ELN의 유전자 대신에 OMC의 유전자를 사용한 것 이외에는 ELN 발현 벡터와 마찬가지로 하여, 제작하였다. TPA 발현 벡터는 TPA의 전 유전자를 위탁 합성(FASMAC사)하고, KODplus ver. 2 PCRkit(도요보사제)를 사용해서 PCR을 행해 증폭한 유전자를 사용한 것 이외에는, ELN 발현 벡터와 마찬가지로 하여 제작하였다.

1-2. GST (글루타티온-S- 트랜스퍼라아제 ) 발현 벡터 pGEX -3X의 구축

1) 대장균 HST08 Premium Competent cells(다카라 바이오사제) 50μl에, GST 발현 벡터(pGEX-3X)(GE 헬스케어사제)을 1μl 첨가하고, 빙상에서 10분간 인큐베이트하였다.

2) 42℃에서 45초간 인큐베이트하고, 다시 빙상에서 냉각하였다.

3) 형질전환한 상기 대장균을, Amp. 함유 LB 한천 플레이트에 식균하고, 37℃에서 밤새 배양하였다.

4) Amp. 함유 LB 배지를 15ml 튜브에 2ml 취하고, 한천 플레이트로부터 싱글 콜로니를 식균하여, 37℃, 200rpm으로 밤새 배양하였다.

5) 10,000g에서 10분간 원심 분리하고, 상청을 제거하였다.

6) 알칼리 SDS법에 의해 pGEX-3X를 회수하였다.

7) 회수한 벡터 용액 20μl에, Cut Smart Buffer(나카라이테스크사제) 10μl, CIAP(Calf intestine Alkaline Phosphatase, 도요보사제) 2μl, Eco RI-HF(New England Biolabs사제) 2μl, Bam HI-HF(New England Biolabs사제) 2μl를 첨가하여, 37℃에서 밤새 인큐베이트하고, 벡터의 절단·탈인산화 처리를 행하였다. pGEX-3X의 절단 상황은 아가로오스 전기 영동에 의해 확인하였다.

8) 효소 처리를 행한 벡터를 illustra^TMGFXTM PCR DNA and Gel Band Purification Kit(GE Healthcare사제)를 사용해서 정제하였다.

1-3. ELV1 펩티드, TPV1 펩티드, OCV1 펩티드와의 융합 GST의 제작

1) ELV1 펩티드의 아미노산 서열로부터 이 유전자를 코드하는 뉴클레오티드 서열을 결정하고, 위탁 합성으로 올리고 DNA를 합성하였다. ELV1 펩티드를 코드하는 뉴클레오티드 서열은 서열 번호 10으로 표현된다.

2) 상기 1)에서 얻어진 뉴클레오티드 서열을, 전술한 바와 같이 구축한 GST 발현 벡터 pGEX-3X의 Bam HI 사이트와 Eco RI 사이트 사이에 클로닝하고, DNA 시퀀스 해석에 의해, 벡터 중에 삽입된 ELV1 펩티드를 코드하는 뉴클레오티드 서열을 확인하였다.

3) 구축한 발현 벡터에서 대장균 BL21(DE3)을 형질전환하고, 암피실린(Amp.나카라이테스크사제) 함유 2×YT 배지(Novagen사제) 10ml 중에서 밤새 전배양하였다.

4) 상기 3)과 마찬가지인 배지 50ml에, 전배양액을 OD₆₀₀=0.1이 되게 첨가하고, 37℃, 200rpm으로 OD₆₀₀=1.0이 될 때까지(약 1.5시간) 배양하였다.

5) 1M IPTG(Isopropyl-β-D(-)-thiogalactopyranoside, 와코준야쿠사제)를 5μl 첨가하여, 30℃, 200rpm으로 7시간 더 배양하였다.

6) 배양 후, 4500rpm으로 20분간 원심 분리하고, 상청을 제거하였다.

7) 균체에 Bug buster(BugButer Protein Extraction Reagent, Novagen사제) 3ml, Benzonase Nuclease(Novagen사제) 1.5μl, Lysozyme(세이가가꾸 고교사제) 3mg을 첨가하여 잘 교반하고, 37℃에서 1시간 인큐베이트함으로써, 균체를 용균하였다.

8) 10000rpm으로 20분간 원심 분리하고, 상청을 가용성 획분으로서 회수하였다.

9) 가용성 획분을 GSTrap HP 칼럼(GE 헬스케어사제) 중에 적용하고, 1mM DTT(Dithiothreitol, 나카라이테스크사제)를 함유하는 PBS로 칼럼 내를 세정하였다.

10) 20mM 환원형 글루타티온을 함유하는 100mM Tris-HCl(pH 8.0)의 구배 용출에 의해 ELV1 펩티드 융합 GST를 회수하였다.

11) 용리액을 PBS로 밤새 투석하고, DC Protein Assay Kit(바이오래드 래버러토리즈사제)에 의해 농도를 정량하였다.

또한, 실시예 1에 있어서 사용한 PBS는 미리 제작한 10×PBS(NaCl(80.8g) 1.38M, KCl(2g) 27mM, Na₂HPO₄·12H₂O(29g) 80mM, KH₂PO₄(2g) 15mM)를 사용 시에 이온 교환수로 희석하여 1L가 되도록 한 것이다.

TPV1 펩티드, OCV1 펩티드에 대해서도 마찬가지로 하여, 각각 TPV1 펩티드 융합 GST, OCV1 펩티드 융합 GST를 제작하였다. TPV1 펩티드를 코드하는 뉴클레오티드 서열은 서열 번호 11로 표현되고, OCV1 펩티드를 코드하는 뉴클레오티드 서열은 서열 번호 12로 표현된다.

또한, 상기 3) 이후의 수순을, 상기 구축한 발현 벡터 대신에, 상기 「1-2.」에서 구축한 GST 발현 벡터 pGEX-3X를 사용해서 행하는 것 이외에는 마찬가지로 하여, 야생형 GST를 제작하였다.

1-4. 야생형 GST(wt-GST), ELV1 펩티드 융합 GST, TPV1 펩티드 융합 GST, OCV1 펩티드 융합 GST의, PDMS 기재로의 흡착

1) PDMS(Sylgard(등록 상표) 184 Silicone Elastomer, DOW CORNING사제)를 클로로포름으로 용해하여, 2.5w/v%의 PDMS 용액을 제조하였다.

2) QCM(수정 진동자 마이크로밸런스) 센서 칩(QCMST27C, 이니시엄사제) 상에 1)의 PDMS 용액을 60μl 첨가하여, 스핀 코팅(6000rpm, 1분간)에 의해 PDMS 박막을 형성하고, 이것을 PDMS 기재(개산 표면적 81cm², 면적/체적비 27cm^-1)로 하였다.

3) 얻어진 PDMS 기재를 QCM 본체(AFFINIX QN, 이니시엄사제)에 세트하여, PBS중에서 베이스 라인이 안정될 때까지 인큐베이트하였다.

4) 최종 농도가 0.1, 0.4, 1.3, 3.4, 9.7μg/ml가 되게 순차적으로 전술한 wt-GST 또는 각 펩티드 융합 GST 용액(이하, GST 용액)을 첨가하고, 각각 1시간씩 모니터링하였다. GST 용액은 전술한 wt-GST 또는 각 펩티드 융합 GST를 PBS 중에 첨가함으로써 제작하였다.

5) 측정 데이터로부터 흡착 밀도를 산출했다(-1Hz=0.62ng/cm²). 또한, 흡착 밀도와 몰농도로부터 이하의 식을 사용해서 흡착 밀도(μg/cm²)를 산출하였다.

2. 결과

결과를 도 1에 도시하였다.

도 1은 PDMS 기재에 대한 흡착 밀도를 나타낸다. 도 1로부터 명백해진 바와 같이, wt-GST에 대하여 ELV1 펩티드 융합 GST, TPV1 펩티드 융합 GST, OCV1 펩티드 융합 GST에 있어서 PDMS 기재에 대한 흡착 밀도의 현저한 향상이 인정되었다. 이것은 서열 번호 1 내지 3으로 표현되는 펩티드를 도입함으로써, GST를 PDMS 기재에 용이하고 또한 고밀도로 고정할 수 있었음을 나타낸다. 또한, 여기에는 나타내지 않지만, ELV1 펩티드 융합 GST 대신에, OAT1 펩티드 융합 GST를 사용한 경우도, wt-GST에 대하여, PDMS 기재에 대한 흡착 밀도의 현저한 향상이 인정되었다. OAT1 펩티드는 서열 번호 4로 표현되는 펩티드이며, OAT1 펩티드를 코드하는 뉴클레오티드 서열은 서열 번호 13으로 표현된다. OAT1 펩티드 융합 GST도 전술한 바와 마찬가지로 하여 제작하였다.

이 점에서, 서열 번호 1 내지 4로 표현되는 펩티드는 PDMS 기재에 대하여 양호한 친화성을 갖고, 목적 단백질의 PDMS 기재로의 고정화에 유용한 것을 알았다. 또한, 이와 같이 해당 펩티드는 GST의 원하는 위치에 도입할 수 있고, 이것에 의해 얻어진 펩티드 융합 GST에 있어서 흡착 밀도의 향상이 인정된 점에서, 해당 펩티드에 의하면 목적 단백질의 활성 유지나 배향 제어도 가능한 것을 알았다.

또한, 해리상수 Kd(nM)에 대해서 검토한 결과, ELV1 펩티드 융합 GST의 PDMS 기재에 대한 해리상수는 5.7nM이었다. 또한, ELV1 펩티드 융합 GST의 PDMS 이외의 기재(예를 들어, 질화규소 기재)에 대한 해리상수에 대해서도 확인한 결과, 이 경우에는 82nM이었다. 해리상수가 작을수록, 펩티드가 기재로부터 해리하기 어려운 것을 나타내고 있고, 이 점에서, ELV1 펩티드의 PDMS 기재에 대한 친화력은 질화규소 기재에 대한 친화력의 약 14배이며, ELV1 펩티드는 질화규소 기재와 비교해서 PDMS 기재에 대하여 보다 높은 친화성을 구비하고 있는 것을 알았다.

실시예 2

이하의 수순에 따라, PDMS 기재에 고정시킨 펩티드 융합 GST가 GST 본래의 활성을 유지하고 있는지의 여부에 대해서 검토하였다

1. 수순

1-1. 펩티드 융합 GST의 구축

본 실시예에서는 상기 실시예 1에서 제작한 ELV1 펩티드 융합 GST, TPV1 펩티드 융합 GST, OCV1 펩티드 융합 GST, OAT1 펩티드 융합 GST, wt-GST를 사용하였다.

1-2. GST 잔존 활성의 측정

1. 수순

1) 상술한 wt-GST, ELV1 펩티드 융합 GST, TPV1 펩티드 융합 GST, OCV1 펩티드 융합 GST, OAT1 펩티드 융합 GST의 각 GST 용액을 PPB로 희석하고, 100mM CDNB, 100mM GSH를 30μl씩 첨가했을 때, GST 농도가 0.5μg/ml가 되게 각 GST 용액을 2940μl 제조하였다.

2) 100mM CDNB, 100mM GSH를 30μl씩 첨가하고, 25℃에서 분광 광도계(V-630BIO, 닛본 분꼬우사제)에 의해 340nm의 흡광도를 3분간 측정하고, 흡광도의 변화율(min^-1·cm^-1)을 산출하였다.

3) 이하의 식으로부터 흡착 전의 각 GST의 비활성 값을 산출하였다. 생성물 CDNB-GSH의 몰 흡광 계수ε=9.6mM^-1·cm^-1을 기초로 1분간에 발생한 생성물량을 산출하여, 효소 활성으로 하였다.

4) 한편, wt-GST, ELV1 펩티드 융합 GST, TPV1 펩티드 융합 GST, OCV1 펩티드 융합 GST, OAT1 펩티드 융합 GST의 각 GST 용액을 PBS로 희석하고, 100μg/ml가 되게 2ml 제조하였다. PDMS 기재(개산 표면적 54cm², 면적/체적비 27cm^- ¹)와 혼합하여, 25℃에서 2시간 흡착시켰다.

5) 상청을 제거하고, PDMS 기재를 PBS로 3회, PPB로 1회 세정하였다.

6) 세정한 PDMS 기재에 PPB 2940μl, 100mM CDNB, 100mM GSH를 30μl씩 첨가하였다. 37℃, 300rpm으로 교반하면서 30분간 마다 340nm의 흡광도의 변화를 nano drop(Thermo사제)으로 측정하여, 흡광도의 변화율(min^-1·cm^-1)을 산출하였다.

7) 상기한 식으로부터 흡착 후의 각 GST의 비활성 값을 산출하고, 흡착 전후의 비활성 값으로부터 잔존 활성을 산출하였다.

PPB는 0.1M KH₂PO₄를 이온 교환수로 희석하여 1L가 되도록 하고, KOH로 pH 6.5로 조정한 것을 사용하였다.

2. 결과

결과를 도 2에 도시하였다. 도 2로부터 명백해진 바와 같이 펩티드 융합 GST를 구성하는 GST는 PDMS 기재에 고정시킨 후에도 GST 본래의 활성을 유지하고 있었다. 이것으로부터, PDMS 친화성 펩티드가 연결한 목적 단백질은 PDMS 기재에 고정된 상태여도, 목적 단백질의 높은 활성을 발휘할 수 있음을 확인할 수 있었다.

실시예 3

이하의 수순에 따라, 서열 번호 1 내지 9로 표현되는 펩티드의 PDMS 기재에 대한 친화성에 대해서 검토하였다.

1. 수순

1) 서열 번호 1 내지 9로 표현되는 펩티드를 포함하는 PBS 용액에, 실시예 1과 같은 PDMS 기재(개산 표면적 81cm² 면적/체적비 27cm^-1)를 혼합하고, 25℃, 200rpm으로 2시간 진탕하였다. 여기서, 또한 서열 번호 1 내지 4로 표현되는 펩티드는 전술한 바와 마찬가지이며, 서열 번호 5로 표현되는 펩티드를 TPV2 펩티드, 서열 번호 6으로 표현되는 펩티드를 TPT1 펩티드, 서열 번호 7로 표현되는 펩티드를 OCT2 펩티드, 서열 번호 8로 표현되는 펩티드를 OCV2 펩티드, 서열 번호 9로 표현되는 펩티드를 OCT3 펩티드로 하였다.

2) 당해 용액의 상청 일부를 HPLC로 분석하고, 나머지 용액을 다시 PDMS 기재와 혼합하였다. 그 때, 1ml당 기재 면적/체적비가 27cm^-1이 되게 설정하였다.

3) 2)를 합계 3회 반복하였다.

4) 흡착 후의 피크 면적의 감소가 현저한 펩티드가 PDMS 기재에 대하여 친화성을 갖는다고 판단할 수 있는 점에서, 흡착 전후의 크로마토그램을 비교하였다.

또한, 상기 공정 2)에 있어서 HPLC에서의 분석은 다음과 같이 행하였다. 먼저, HPLC 시스템을 기동 후, Line A, B를 HPLC용 A액, B액으로 치환하였다. 그 후, 당해 A액을 유속 1ml/min으로 칼럼에 공급하고, 칼럼 내를 평형화하였다. 계속해서, 실험에 제공하기 전의 상기 PBS 용액과, 상기 공정 2)에서 회수한 상청 일부를 각각 전처리 필터로 여과하여, 500μl를 칼럼에 공급하였다. 이하의 도 3에 도시하는 프로그램에서 B액의 농도를 직선적으로 증가시켜, 칼럼으로부터 펩티드를 용출하였다. 그 후, 흡착 전후의 크로마토그램을 비교하였다.

상기 HPLC 시스템, A액, B액, 전처리 필터, 프로그램은 이하와 같다.

HPLC 시스템

PU-2089 Quaternary Gradient Pump(쟈스코 인터내셔널사제)

LC-NetII/ＡＤＣ(쟈스코 인터내셔널사제)

MD-2018Plus Photodiode Array Detector(쟈스코 인터내셔널사제)

UV-1575 Intelligent UV/VIS Detector(쟈스코 인터내셔널사제)

TSKgel ODS-100Z 3 ㎛(칼럼 사이즈 4.6mmI.D.x 15cm)(도소사제)

A액

초순수(1L)

TFA(Trifluoroacetic acid, 고속 액체 그래프용, 와코준야쿠사제)(1ml) 0.1v/v%

B액

Acetonitrile[Chromasolv, for HPLC, gradient grade,≥99.9%](시그마 알드리치 재팬사제)(1L)

TFA(고속 액체 그래프용)(1ml) 0.1v/v%

전처리 필터

Non-Sterile 4mm Millex(등록 상표) HV syringe Driven Filter Unit(450nm)(밀리 포어사제)

프로그램

프로그램은 도 3에 도시하였다.

2. 결과

결과를 표 1에 나타내었다.

표 1에서 알 수 있는 바와 같이, 어느 용액을 사용한 경우에도, 흡착 후의 피크 면적이 감소하고 있고, 이 점에서, 서열 번호 1 내지 9로 표현되는 펩티드는 모두 PDMS 기재에 대한 친화성을 갖는 것이 확인되었다. 따라서, 이들 아미노산 서열을 갖는 펩티드에 의하면, 이들 펩티드를 개재한, PDMS 기재에서의 목적 단백질의 고밀도화, 고활성화, 고배향 제어가 가능한 것을 알았다.

실시예 4

이하의 수순에 따라, 서열 번호 1로 표현되는 펩티드(ELV1 펩티드), 서열 번호 2로 표현되는 펩티드(TPV1 펩티드) 또는 서열 번호 3으로 표현되는 펩티드(OCV1 펩티드)와, C 반응성 단백질(CRP, C-reactive protein)에 대한 1본쇄 항체를 연결하고, 얻어진 펩티드 융합 단백질의 PDMS 기재에 대한 친화성 및 활성에 대해서 평가하였다.

1. 수순

1-1. 펩티드 융합 scFv의 제작

1-1-1. ELV1 펩티드, TPV1 펩티드, OCV1 펩티드를 갖는 벡터의 구축

1) 서열 번호 1로 표현되는 아미노산 서열을 코드하는 뉴클레오티드 서열(서열 번호 10)을 갖는 센스쇄와, 해당 서열에 대하여 상보적인 서열을 갖는 안티센스쇄를 위탁 합성하였다.

2) 해당 센스쇄와 해당 안티센스쇄 각각을 10pmol/μl가 되게 멸균수로 희석하고, 각 1μl에 10×High buffer(도요보사제)를 2μl, 멸균수를 16μl 혼합하였다. 혼합액을 90℃에서 5분간 인큐베이트한 후, 인큐베이터의 전원을 꺼 실온까지 식히고, ELV1 펩티드용의 2본쇄 DNA로 하였다.

2) pET-22 벡터 보유 대장균(pET-22-XL1 Blue, Novagen사제)을 Amp. 함유 LB 배지 10ml에 식균하고, 37℃, 회전수 200rpm으로 밤새 배양하고, 미니프레프(miniprep)에 의해 플라스미드를 회수하여, NotI과 XhoI의 제한 효소로 소화하였다.

3) 상기 1)에서 제조한 2본쇄 DNA(인서트)와 pET-22 벡터(제한 효소 처리가 끝남)를 인서트:벡터=3:1의 몰비가 되게 혼합하여, 50℃에서 10분간 인큐베이트한 후, 온도를 16℃로 내려서 혼합액과 동량의 Ligation high ver. 2(도요보사제)를 첨가하고, 3시간 인큐베이트하였다.

4) 대장균 HST08 Premium Competent cells에 대하여 라이게이션 후의 샘플을 가하여, 42℃에서 45초간 인큐베이트하여, 대장균을 형질전환하였다.

5) 형질전환한 대장균을 Amp. 함유 LB 한천 배지에 식균하고, 37℃에서 밤새 인큐베이트하였다. Amp. 함유 LB 배지 2ml에, 해당 한천 배지 상에서 발현한 콜로니를 6개 픽업해서 식균하고, 37℃, 회전수 200rpm으로 밤새 배양하였다.

6) 얻어진 배양액 2ml를 에펜도르프 튜브에 옮기고, 원심 분리(4℃, 10000rpm, 15분간)하여, 상청을 제거하였다. 또한, 알칼리 SDS법에 의해 플라스미드 DNA를 회수하였다. 회수한 플라스미드 DNA의 일부에 제한 효소 XhoI를 첨가하고, 절단될지의 여부를 아가로오스 겔 전기영동에 의해 확인하였다. 절단되지 않은 샘플을 DNA 수탁 해석에 내서 서열을 확인하였다.

1-1-2. 펩티드 융합 scFv 벡터의 구축

1) CRP에 대한 1본쇄 항체를 모델 scFv로서 PCR을 행하고, scFv 유전자의 증폭을 행하였다.

2) 상기 1-1-1에서 얻은, ELV1 펩티드를 코드하는 DNA를 갖는 pET-22 벡터와, PCR로 증폭시킨 scFv를, NdeI와 NotI의 제한 효소로 소화하였다.

3) 이어서, 상기 1-1-1의 3) 내지 6)과 마찬가지로, 라이게이션, 형질전환, 배양을 행하여, 미니프레프에 의해 플라스미드를 회수하고, 아가로오스 겔 전기영동에 의한 밴드의 확인 후, DNA 수탁 해석에 내서 서열을 확인하였다.

1-1-3. 펩티드 융합 scFv의 생산, 정제 및 발현 확인

1) 상기 1-1-2에서 얻은 펩티드 융합 scFv 벡터를 대장균 Rosetta(DE3)에 가해서 형질전환하고, Amp. 함유 2×YT 배지 10ml에 식균하고, 37℃, 200rpm으로 밤새 전배양하였다.

2) Amp. 및 클로람페니콜(Cm.) 함유 Overnight Express TB medium(OE 배지, 나카라이테스크사제) 50ml가 들어간 배플 딸린 500ml 삼각 플라스크에, 상기 1)의 배양액을 OD₆₀₀=0.1이 되게 첨가해서 37℃, 200rpm으로 밤새 배양한 후, 50ml 원심관에 배양액을 옮겨서 10000rpm으로 20분간 원심 분리하여, 상청을 제거하였다.

3) 펠릿상의 균체에 1×PBS를 10ml, Triton X-100을 100μl, Protease inhibitor Cocktail(나카라이테스크사제)을 100μl 첨가하고, 보텍스로 현탁하고, 초음파 균질기의 칩을 용액에 침지하여, 4분간×3회 초음파 파쇄를 행했다(output 50W, DUTY 30%).

3) 이어서, 원심 분리(4℃, 10000rpm, 15분간)하고, 상청을 제거한 후, 이온 교환수를 5ml 첨가 후, 보텍스로 교반해서 다시 원심 분리(4℃, 10000rpm, 15분간)하였다. 이 조작을 2회 반복하고, 상청을 제거 후, 이온 교환수를 3ml 첨가하여, 보텍스로 현탁한 후, -80℃에서 동결하고, 또한 밤새동결 건조시켰다.

4) 이어서, 6M 염산 구아니딘을 함유하는 가용화 버퍼(6M 구아니딘 염산, 2xPBS, pH 7.5) 5ml를 동결 건조물에 가하여, 봉입체를 가용화하고, 원심 분리(4℃, 10000rpm, 15분간)를 행하여, 상청을 회수하였다.

5) 다음 조건 하에서의 금속 킬레이트 친화 크로마토그래피에 의해, ELV1 펩티드 융합 scFv를 정제하였다.

칼럼: His-Trap HP

Binding buffer(1리터당): 요소 8M(480g), 이미다졸 20mM(1.36g), 10×PBS 200ml(HCl로 pH 7.5로 조정 후, 탈이온수로 희석하여 1리터가 되게 하였음)

Elution buffer(1리터당): 요소 8M(480g), 이미다졸 400mM(27.2g), 10×PBS 200ml(HCl로 pH 7.5로 조정 후, 탈이온수로 희석하여 1리터가 되게 하였음)

TPV1 펩티드, OCV1 펩티드에 대해서도 마찬가지로 하여, TPV1 펩티드 융합 scFv, OCV1 펩티드 융합 scFv를 제작하였다. 또한, 컨트롤로서, ELV1 펩티드 대신에 D10 펩티드(아스파라긴산 잔기가 10개 연속하는 펩티드)를 사용한 것 이외에는 마찬가지로 하여, D10 펩티드 융합 scFv를 제작하였다. 또한, 각 펩티드 융합 scFv는 그의 3' 말단에 히스티딘 잔기가 6개 연속하는 펩티드 서열을 갖는다.

1-2. 펩티드 융합 scFv의 리폴딩 및 회수

1) 정제 후의 scFv의 최종 농도가 1mg/ml, DTT가 100mM, 총 체적이 2ml가 되게, 8M 요소-PBS로 희석하여, 4℃에서 2시간 인큐베이트하였다.

2) 상기 1)의 용액을 투석막 내에 넣어, 8M 요소, 50mM Tris-HCl(pH8.5) 1l를 외액으로서, 4℃에서 65시간 투석을 행하고, DTT 제거와 공기 산화를 행했다(외액을 도중에 교환했음).

3) 외액을 50mM Tris-HCl(pH8.5) 1l로 교환해서 투석을 행하고, 잔존하는 요소를 제거했다(외액을 도중에 교환했음).

4) 투석 후의 내액을 4℃, 20000rpm, 5분으로 원심 분리해서 상청을 회수하고, DC Protein Assay Kit에 의해 회수한 펩티드 융합 scFv의 농도를 산출하였다.

5) 또한, 회수율은 회수한 펩티드 융합 scFv의 농도를 투석 전의 펩티드 융합 scFv 농도로 나누고, 이것에 100을 곱함으로써 산출하였다.

1-3. 펩티드 융합 scFv의 PDMS 기재로의 흡착

1) 상기 실시예 1의 1-4와 마찬가지로, PDMS를 클로로포름으로 용해하여, 2.5w/v%의 PDMS 용액을 제조하고, 스핀 코팅(6000rpm, 1min)에 의해 QCM 센서 칩 위에 PDMS 박막을 형성하였다. 이것을 PDMS 기재로 하였다.

2) 얻어진 QCM 기재를 QCM 본체에 세트하고, PBS 중에서 베이스 라인이 안정화될 때까지 인큐베이트한 후, 각 펩티드 융합 scFv 용액을 최종 농도 0.5, 1.8, 4.9, 12.7, 32.3μg/ml가 되게 첨가하여, 25℃, 회전수 1000rpm에서의 흡착 거동을 각 농도에서 1시간 모니터링하였다. 용액은 펩티드 융합 scFv를 PBS에 첨가함으로써 제작하였다.

3) 상기 2)에서 얻은 측정 데이터(ΔF: -1Hz=0.62ng/cm²)에 기초하여 흡착 밀도를 산출하였다.

1-4. 펩티드 융합 scFv의 항원 결합 활성

1) CRP(항원) 1μg/ml(1×PBS로 희석)를 Maxisorp 마이크로플레이트(서모 피셔 사이언티픽사제)에 고정화했다(4℃, overnight).

2) 플레이트를 0.1% PBST(PBS-0.1% Tween20)로 세정 후, 2% BSA-PBST를 첨가해서 25℃에서 1시간 블로킹하였다.

3) 플레이트를 0.1% PBST로 세정 후, 0.2% BSA-PBST로 0 내지 100μg/ml에 4배 단계 희석한 펩티드 융합 scFv를 첨가하고, 25℃에서 1시간 인큐베이트하였다.

4) 플레이트를 0.1% PBST로 세정 후, 0.2% BSA-PBST로 5000배 희석한 HRP(horseradish peroxidase) 표지 Anti 6×His 항체를 첨가해 25℃에서 1시간 인큐베이트하였다.

5) 플레이트를 0.1% PBST로 세정 후, TMB 기질 용액을 가해서 발색시켜(25℃, 15분), 0.3M H₂SO₄를 첨가하고, 주 파장 450nm, 부 파장 650nm의 흡광도를 측정하였다.

1-5. 펩티드 융합 scFv의 PDMS 기재로의 고정화 상태에서의 항원 결합 활성

1) 전술한 바와 마찬가지로 하여 PDMS 기재를 제작하였다.

2) QCM 기재를 QCM 본체에 세트하고, PBS 중에서 베이스 라인이 안정화될 때까지 인큐베이트한 후, 각 펩티드 융합 scFv 용액을 15μg/ml 첨가하고, 25℃, 회전수 1000rpm에 있어서 고정화하였다. 용액은 펩티드 융합 scFv를 PBS에 첨가함으로써 제작하였다.

3) 이어서, PBS를 0.2% BSA-PBST로 바꾸고, CRP를 최종 농도 0.1, 1.1, 6.1μg/ml가 되게 첨가하여, 각 농도에서 평형 도달할 때까지의 흡착 거동을 전술한 바와 마찬가지로 하여 모니터링하고, 측정 데이터(ΔF: -1Hz=0.62ng/cm²)에 기초하여 항원 결합량(ng/cm²)을 산출하였다.

2. 결과

2-1. 펩티드 융합 scFv의 회수 농도 및 회수 효율

표 2에, 상기 1-2의 결과, 즉 펩티드 융합 scFv의 회수 농도 및 회수 효율을 나타낸다.

표 2에서 명백해진 바와 같이, 어느 쪽 펩티드 융합 scFv도 고농도로 회수할 수 있고, 그 회수율은 96% 이상으로 높은 값이었다. 이것으로부터, 펩티드 융합 scFv에 의하면 높은 비율로 리폴딩을 달성할 수 있고, 고효율로 펩티드 융합 scFv를 회수 할 수 있음을 알았다.

2-2. 펩티드 융합 scFv의 PDMS로의 흡착

도 4에 상기 1-3의 결과를 나타내었다. 도 4로부터 명백해진 바와 같이, D10 펩티드 융합 scFv(D10-scFv)에서는 PDMS 기재 표면로의 흡착은 대부분 인정되지 않았다. 이에 비해, ELV1 펩티드, TPV1 펩티드, OCV1 펩티드와의 융합 scFv에서는 농도 의존적으로 PDMS 기재로의 흡착량이 증가하였다. 특히 ELV1 펩티드 융합 scFv를 사용한 경우에, 흡착량이 현저하게 높아졌다. 이 점에서, PDMS에 대한 친화성을 갖는 펩티드를 사용함으로써, 원하는 단백질을 PDMS 기재에 의해 효율적으로 고정 할 수 있음을 알았다.

2-3. 펩티드 융합 scFv의 항원 결합 활성

도 5에 상기 1-4의 결과를 나타내었다. 도 5로부터 명백해진 바와 같이, 리폴딩 후의 펩티드 융합 scFv의 항원 결합 활성을 간접 ELISA법에 의해 평가한 결과, 어느 쪽에 있어서도 양호한 항원 결합 활성이 인정되었다. 또한, 펩티드 융합 scFv 농도 의존적으로 시그널이 높아지고 있는 점에서, 펩티드 융합 scFv가 항원 항체 반응에 유용한 항원 결합 활성을 갖는 것을 알았다.

2-4. 펩티드 융합 scFv의 PDMS 기재로의 고정화 상태에서의 항원 결합 활성

도 6에 상기 1-5의 결과를 나타내었다. 도 6으로부터 명백해진 바와 같이, D10 펩티드 융합 scFv에서는 항원 결합량이 매우 적었다. 이 점에서, D10 펩티드 융합 scFv는 기재 상에 대부분 흡착하고 있지 않은 것을 알았다. 이에 비해, ELV1 펩티드, TPV1 펩티드, OCV1 펩티드의 각 융합 scFv에서는 항원 농도 의존적으로 항원 결합량이 증가하고 있고, 이들 융합 scFv는 PDMS 기재에 고정화된 상태에서 충분한 항원 결합 활성을 갖고 있는 것을 알았다.

SEQUENCE LISTING <110> NATIONAL UNIVERSITY CORPORATION KYOTO INSTITUTE OF TECHNOLOGY <110> NISSAN CHEMICAL INDUSTRIES, LTD. <120> Peptide having affinity for Polydimethylsiloxane <130> P15-186 <150> JP 2015-026489 <151> 2015-02-13 <160> 18 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 30 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 1 Met Val Met Pro Gly Asp Asn Ile Lys Met Val Val Thr Leu Ile His 1 5 10 15 Pro Ile Ala Met Asp Asp Gly Leu Arg Phe Ala Ile Arg Glu 20 25 30 <210> 2 <211> 45 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 2 Val Gly Pro Asn Asn Val Pro Tyr Ile Val Ala Thr Ile Thr Ser Asn 1 5 10 15 Ser Ala Gly Gly Gln Pro Val Ser Leu Ala Asn Leu Lys Ala Met Tyr 20 25 30 Ser Ile Ala Lys Lys Tyr Asp Ile Pro Val Val Met Asp 35 40 45 <210> 3 <211> 31 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 3 Asn Asn Ser Trp Thr Arg Val Ala Phe Ala Gly Leu Lys Phe Gln Asp 1 5 10 15 Val Gly Ser Phe Asp Tyr Gly Arg Asn Tyr Gly Val Val Tyr Asp 20 25 30 <210> 4 <211> 30 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 4 Leu Gly Trp Ser Gln Tyr His Asp Thr Gly Phe Ile Asn Asn Asn Gly 1 5 10 15 Pro Thr His Glu Asn Gln Leu Gly Ala Gly Ala Phe Gly Gly 20 25 30 <210> 5 <211> 20 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 5 Val Gly Pro Asn Asn Val Pro Tyr Ile Val Ala Thr Ile Thr Ser Asn 1 5 10 15 Ser Ala Gly Gly 20 <210> 6 <211> 17 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 6 Leu Ala Val Gly Leu Tyr Asp Gly Met Asn Leu Asp Trp Leu Ala Tyr 1 5 10 15 Arg <210> 7 <211> 32 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 7 Asn Tyr Gly Val Val Tyr Asp Val Thr Ser Trp Thr Asp Val Leu Pro 1 5 10 15 Glu Phe Gly Gly Asp Thr Tyr Gly Ser Asp Asn Phe Met Gln Gln Arg 20 25 30 <210> 8 <211> 17 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 8 Phe Gly Gly Asp Thr Tyr Gly Ser Asp Asn Phe Met Gln Gln Arg Gly 1 5 10 15 Asn <210> 9 <211> 29 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 9 Asp Ala Gly Ile Asn Thr Asp Asn Ile Val Ala Leu Gly Leu Val Tyr 1 5 10 15 Gln Phe Ala Ala Ala Leu Glu His His His His His His 20 25 <210> 10 <211> 90 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 10 atggttatgc ctggtgataa tattaaaatg gttgttactt taattcatcc tattgctatg 60 gatgatggtt tacgttttgc tattcgtgaa 90 <210> 11 <211> 135 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 11 gttggtccta ataatgttcc ttatattgtt gctactatta cttctaattc tgctggtggt 60 caacctgttt ctttagctaa tttaaaagct atgtattcta ttgctaaaaa atatgatatt 120 cctgttgtta tggat 135 <210> 12 <211> 93 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 12 aataattctt ggactcgtgt tgcttttgct ggtttaaaat ttcaagatgt tggttctttt 60 gattatggtc gtaattatgg tgttgtttat gat 93 <210> 13 <211> 90 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 13 ttaggttggt ctcaatatca tgatactggt tttattaata ataatggtcc tactcatgaa 60 aatcaattag gtgctggtgc ttttggtggt 90 <210> 14 <211> 60 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 14 gttggtccta ataatgttcc ttatattgtt gctactatta cttctaattc tgctggtggt 60 <210> 15 <211> 51 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 15 ttagctgttg gtttatatga tggtatgaat ttagattggt tagcttatcg t 51 <210> 16 <211> 96 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 16 aattatggtg ttgtttatga tgttacttct tggactgatg ttttacctga atttggtggt 60 gatacttatg gttctgataa ttttatgcaa caacgt 96 <210> 17 <211> 51 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 17 tttggtggtg atacttatgg ttctgataat tttatgcaac aacgtggtaa t 51 <210> 18 <211> 87 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 18 gatgctggta ttaatactga taatattgtt gctttaggtt tagtttatca atttgctgct 60 gctttagaac atcatcatca tcatcat 87

Claims

이하의 (1a) 또는 (1b)의 펩티드 또는 그의 단편을 포함하는 폴리디메틸실록산 친화성 펩티드가 결합되어서 이루어지는, 폴리디메틸실록산 기재;
(1a) 서열 번호 1 내지 9로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종으로 표현되는 아미노산 서열을 포함하는 펩티드,
(1b) 상기 (1a)의 아미노산 서열에 있어서 1개 또는 복수의 아미노산이 결실, 치환 및/또는 부가된 아미노산 서열을 포함하고, 또한 폴리디메틸실록산 친화성을 갖는 펩티드.
제1항에 있어서,
상기 단편이 15 내지 58의 아미노산 잔기를 포함하는 펩티드인, 폴리디메틸실록산 기재.
제1항 또는 제2항에 있어서,
상기 폴리디메틸실록산 친화성 펩티드를 개재해서 목적 단백질이 폴리디메틸실록산 기재에 고정화되어 이루어지는, 폴리디메틸실록산 기재.
목적 단백질에 도입된 이하의 (1a) 또는 (1b)의 펩티드 또는 그의 단편을 포함하는 폴리디메틸실록산 친화성 펩티드와 폴리디메틸실록산 기재를 접촉시키는 공정을 함유하는, 목적 단백질의 폴리디메틸실록산 기재로의 고정화 방법;
(1a) 서열 번호 1 내지 9로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종으로 표현되는 아미노산 서열을 포함하는 펩티드,
(1b) 상기 (1a)의 아미노산 서열에 있어서 1개 또는 복수의 아미노산이 결실, 치환 및/또는 부가된 아미노산 서열을 포함하고, 또한 폴리디메틸실록산 친화성을 갖는 펩티드.
제1항 또는 제2항에 따른 폴리디메틸실록산 기재에 결합한 폴리디메틸실록산 친화성 펩티드와 목적 단백질을 결합시키는 공정을 함유하는, 목적 단백질의 폴리디메틸실록산 기재로의 고정화 방법.
이하의 (1a) 또는 (1b)의 펩티드 또는 그의 단편을 포함하는 폴리디메틸실록산 친화성 펩티드를 함유하는, 폴리디메틸실록산 기재로의 목적 단백질 고정화용 조성물;
(1a) 서열 번호 1 내지 9로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종으로 표현되는 아미노산 서열을 포함하는 펩티드,
(1b) 상기 (1a)의 아미노산 서열에 있어서 1개 또는 복수의 아미노산이 결실, 치환 및/또는 부가된 아미노산 서열을 포함하고, 또한 폴리디메틸실록산 친화성을 갖는 펩티드.
목적 단백질을 폴리디메틸실록산 기재에 고정시키기 위한, 이하의 (1a) 또는 (1b)의 펩티드 또는 그의 단편을 포함하는 폴리디메틸실록산 친화성 펩티드의 용도;
(1a) 서열 번호 1 내지 9로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종으로 표현되는 아미노산 서열을 포함하는 펩티드,
(1b) 상기 (1a)의 아미노산 서열에 있어서 1개 또는 복수의 아미노산이 결실, 치환 및/또는 부가된 아미노산 서열을 포함하고, 또한 폴리디메틸실록산 친화성을 갖는 펩티드.
이하의 (1c) 또는 (1d)의 펩티드 또는 그의 단편을 포함하는, 폴리디메틸실록산 친화성 펩티드;
(1c) 서열 번호 2 내지 9로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종으로 표현되는 아미노산 서열을 포함하는 펩티드,
(1d) 서열 번호 1 내지 9로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종으로 표현되는 아미노산 서열에 있어서 1개 또는 복수의 아미노산이 결실, 치환 및/또는 부가된 아미노산 서열을 포함하고, 또한 폴리디메틸실록산 친화성을 갖는 펩티드.
제8항에 있어서,
상기 단편이 15 내지 58의 아미노산 잔기를 포함하는 펩티드인, 폴리디메틸실록산 친화성 펩티드.
제8항 또는 9항에 따른 폴리디메틸실록산 친화성 펩티드를 코드하는 폴리뉴클레오티드.
제10항에 있어서,
상기 폴리뉴클레오티드가 서열 번호 10 내지 18로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종으로 표현되는 폴리뉴클레오티드인, 폴리뉴클레오티드.
제10항 또는 제11항에 따른 폴리뉴클레오티드를 함유하는, 폴리디메틸실록산 친화성 펩티드 발현 벡터.
제10항 또는 제11항에 따른 폴리뉴클레오티드와 목적 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드가 연결되어 이루어지는, 제8항 또는 제9항에 따른 폴리디메틸실록산 친화성 펩티드와 목적 단백질과의 펩티드 융합 단백질 발현 벡터.
제13항에 따른 벡터를 숙주 세포에 도입해서 형질전환시킴으로써 얻어지는 형질전환체.
제14항에 따른 형질전환체로부터 얻어지는, 제8항 또는 제9항에 따른 폴리디메틸실록산 친화성 펩티드와 목적 단백질과의 펩티드 융합 단백질.
제8항 또는 제9항에 따른 폴리디메틸실록산 친화성 펩티드를 포함하는, 폴리디메틸실록산 기재로의 목적 단백질의 고정화용 링커.