CN102565415B - 蛋白质原位表达芯片及其构建方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种固定量高、蛋白质活性高且有序固定的三维蛋白质原位表达芯片，该芯片包括基底(1)、表面修饰层以及固定在表面修饰层上的蛋白质(5)；其中表面修饰层包括第二链状分子(4)和由第一链状分子(3)和环糊精(2)组成的聚轮烷，所述第二链状分子和聚轮烷通过第二链状分子和第一链状分子一端的固定基团固定在基底上。本发明还提供了构建该蛋白质芯片的方法和装置，并进一步提供了所述蛋白质芯片、构建方法和装置的应用。
Description
技术领域
本发明涉及生物芯片领域，尤其涉及通过无细胞表达体系和三维自组装超分子结构而构建的蛋白质原位表达芯片领域。
背景技术
蛋白质阵列为研究蛋白质分子之间、蛋白质分子和核酸及其他小分子之间的相互作用提供了高通量的方法和手段。但是，由于缺少类似DNA阵列中PCR扩增技术的蛋白质扩增方法，在阵列表面构建高活性的功能蛋白一直是研究功能蛋白相互作用的难点所在。无细胞表达体系提供了蛋白质阵列新的构建方法——蛋白质原位表达阵列(In Situ Protein Array)，该方法的原理如下：首先，它在阵列表面构建可以表达的基因阵列，包括含启动子的PCR DNA、质粒DNA以及mRNA等，然后通过转录与翻译偶联的无细胞表达体系，使得该阵列原位表达新鲜的蛋白质，以此构建出具有活性的功能蛋白质阵列(Mingyue He & Michael Taussig 2001；Niroshan Ramachandran &Joshua LaBaer et al.2004；Sheng-Ce Tao & Heng Zhu 2006)。用原位表达的方法，不仅避免了由于分离纯化储存造成的蛋白质失活，而且可以表达在细胞内难以表达的毒素蛋白、膜蛋白以及真核细胞特有的转录后修饰蛋白。
原位构建蛋白质阵列的方法主要有蛋白质原位阵列技术(PISA，ProteinIn Situ Array)、多重点样技术(MIST，Multiple Spotting Technique)、核酸编程性蛋白质阵列技术(NAPPA，Nucleic Acid Programmable Protein Array)、DNA阵列复印蛋白质阵列技术(DAPA，DNA Array to Protein Array)以及mRNA阵列来源原位嘌呤霉素捕捉技术(ISPCFmA，In Situ Puromycin Capture FrommRNA Array)等方法。其中，PISA由Mingyue He等人于2001年提出，这种方法是将原核细胞裂解液和PCR DNA共混，利用蛋白质上的His标签特异识别芯片Ni包被表面，从而固定在基底表面；MIST技术由Dolores J.Cahill等人与2003年提出，这种方法是PISA方法的改进，它重复在一块芯片上进行多次准确的打印，首先是将DNA模板打印在氨丙基三乙氧基硅烷和Ni处理过的基底表面，然后再在DNA原位置第二次打印原核细胞裂解液使带有His标签的蛋白质表达并和Ni包被的表面识别固定；NAPPA技术由Joshua LaBaer于2004年提出，这项技术首先在固定了GST抗体的基底上用生物素-链霉素的方法固定质粒DNA分子，之后将芯片表面浸泡在真核细胞裂解液中，使得带有GST标签的蛋白质表达并原位固定在GST抗体上面，相关工作发表在Science杂志上；DAPA技术是PISA方法的进一步改进，于2008年提出，这个方法使用两个基底表面，其一打印并固定好模板PCR DNA分子，另一块基底表面用Ni包被的表面，之后将含有原核细胞裂解液的渗透性膜放置在两个芯片基底之间，使带有His标签的蛋白表达并穿过渗透性膜被Ni包被的基底捕获，最终形成蛋白质芯片，相关工作发表在NatureMethod；ISPCFmA由Heng Zhu等人于2008年提出，这项技术在芯片表面固定3’mRNA模板的同时，固定有嘌呤霉素，当蛋白质从mRNA的5’端向3’端翻译的最后阶段，嘌呤霉素会进入到核糖体中与合成的多肽键合，从而将多肽固定在芯片表面，之后再用RNA酶将mRNA降解，相关工作发表在Nature Method上面。
以上这些方法各有优点，但是都存在着相同的缺点，其一，采用这些方法得到的蛋白固定量小(小于50pmoles/cm2)；其二，蛋白质由于直接吸附在基底表面导致空间构象发生变化，以致丧失活性；其三，模板分子和捕获分子不能有序逐步地固定在基底表面。
针对现有的无细胞体系蛋白质微阵列构建方法中出现的问题，亟需一种可以解决蛋白质固定量小，蛋白活性受到基底影响，以及可以有序可控地将模板分子和捕获分子固定在基底表面的原位表达蛋白质方法。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明的一个目的是提供一种基于蛋白质原位表达的蛋白质芯片。本发明的另一个目的是提供所述蛋白质原位表达芯片的构建方法。本发明的又一个目的是提供所述蛋白质原位表达芯片和所述方法的应用。此外，本发明的目的还在于提供构建所述蛋白质原位表达芯片的装置。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：
一方面，本发明提供一种蛋白质原位表达芯片，其中，所述芯片包括基底(1)、表面修饰层以及固定在表面修饰层上的蛋白质(5)；所述表面修饰层包括第二链状分子(4)和由环糊精(2)包合第一链状分子(3)形成的聚轮烷，该第二链状分子和聚轮烷均匀间隔排列，分别通过第二链状分子和第一链状分子的一端固定在基底上，并且第二链状分子的长度未达到第一链 状分子被环糊精包合的部分；所述蛋白质通过修饰在第一链状分子和/或环糊精上的活性基团固定在聚轮烷上；
优选地，所述蛋白质通过环糊精上的活性基团固定于环糊精上；
优选地，所述基底的材料包括金属、如金、银、铂、铜、铝和/或铬；金属氧化物，如Al2O3、TiO2、SnO2；金属类和金属氧化物类以各种形式复合而成的基材；以及Si，玻璃，石英和/或高分子聚合物；进一步优选的基材选自玻璃、高分子聚合物以及表面蒸镀50纳米厚的金的高折射率玻璃基底。
优选地，所述第二链状分子包括聚乙二醇、硫醇以及有类似结构的分子，分子量为50～10000，进一步优选为50～1000；所述第一链状分子包括聚乙二醇、聚丙二醇、聚二苯己三烯、具有相应类似结构的分子以及前述化合物组成的嵌段化合物，分子量为400-50000，进一步优选为400～10000；组装于基底的第一链状分子和第二链状分子的混合摩尔比例为1∶0～1∶100000，进一步优选为1∶1～1∶1000，更优选为1∶10～1∶100。第一链状分子和第二链状分子购买自上海炎怡生物科技有限公司。
优选地，所述环糊精选自α-环糊精、β-环糊精和/或γ-环糊精，进一步优选为α-环糊精和/或β-环糊精；所述聚轮烷超分子层中第一链状分子和环糊精的混合摩尔比例为1∶1～1∶100，进一步优选为1∶2～1∶20，更优选为1∶5～1∶10；
优选地，所述第一链状分子和第二链状分子通过一端的固定基团固定于基底上，所述固定基团包括单巯基、双巯基、羧基、氨基、氨基硅烷，通过共价键与基底连接；第二链状分子的另一端用惰性基团修饰，所述惰性基团包括Z型酪氨酸(Z-Tyr)和/或2.4-二硝基氟苯(参考文献参考文献Themolecular necklace:a rotaxane containing many threadedα-cyclodextrins.Akira Harada，Jun Li&Mikiharu Kamachi.nature，1992)，从而使第二链状分子不能与环糊精发生包合反应；第一链状分子的另一端和/或环糊精上的活性基团包括-COOH、-NH2、-SH、乙二胺、谷氨酸、甘氨酸、天冬氨酸、乙醇胺、链霉亲和素、马来酰亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺、环氧、-CHO、NTA-螯合基团、-OH、-CH3和/或-OCH3；
优选地，所述蛋白质包括酶、病毒的特征蛋白、细胞内单个行使功能的蛋白以及复合蛋白中的一个单体蛋白；
优选地，所述蛋白质来自一种或多种模板分子(6)的原位表达，所述模板分子固定或不固定于所述芯片的表面修饰层，其包括RNA和DNA，如单链或双链的环状DNA、线性DNA或PCR扩增产物；
优选地，所述模板分子通过第一链状分子和/或环糊精上的活性基团固定 于聚轮烷上；进一步优选地，所述模板分子通过第一链状分子上的活性基团固定于第一链状分子上。
优选地，所述模板分子含有一种或多种标签，使表达的蛋白质带有位于其不同位置的一种或多种标签，从而使得所述蛋白质通过标签连接于第一链状分子和/或环糊精的活性基团上；
优选地，所述聚轮烷上第一链状分子和/或环糊精的活性基团还连接了对所述标签具有特异亲和性的捕获分子，所表达的蛋白质通过捕获分子固定于第一链状分子和/或环糊精上，所述捕获分子包括蛋白质、多肽和糖类；进一步优选地，所述捕获分子通过环糊精上的活性基团连接于环糊精上，从而使表达的蛋白质固定于环糊精上。
优选地，所述蛋白质的标签包括酶类、多肽结合位点、特异识别多肽的肽段、识别金属螯合的肽段以及识别生物素链霉素的肽段，所述标签的数量可以为一个或一个以上，其位置可以在蛋白质的C端或N端，其与蛋白质之间可以相邻，亦可以相隔数个或数十个氨基酸；
优选地，所述蛋白质原位表达芯片上同时包含编码蛋白质的模板分子和捕获该蛋白质的捕获分子；优选地，所述模板分子和捕获分子之间的摩尔比例为10∶1～1∶100，进一步优选为5∶1～1∶50，更优选为1∶1～1∶10；
优选地，所述蛋白质可以由单一或多种模板分子表达后经原位组装成具有功能的蛋白质复合体，经捕获分子的识别固定于聚轮烷上；进一步优选地，所述蛋白质复合体通过捕获分子固定于环糊精上。
另一方面，本发明提供一种构建所述蛋白质原位表达芯片的方法，其中，所述方法包括以下步骤：
1)选取适合的基底，清洗表面；
2)选取适合的第一链状分子、第二链状分子和环糊精，其中第二链状分子一端含有能够固定到基底的固定基团，并且长度短至无法被环糊精包合或者使其另一端含惰性基团，使其不能和环糊精发生包合反应；第一链状分子一端含固定到基底的固定基团，另一端和/或环糊精含有用于固定蛋白质的活性基团；
3)配制第一链状分子和第二链状分子的混合溶液，将混合溶液用于处理基底表面，使第一链状分子和第二链状分子固定于基底表面后，清洗表面；
4)在基底表面包合经处理的环糊精分子，使基底表面形成由第一链状分子和环糊精组成的聚轮烷，从而聚轮烷和第二链状分子形成表面修饰层，清洗表面；
5)选择细胞裂解液和编码要固定的蛋白质的模板分子，将模板分子溶解于细胞裂解液中，然后用细胞裂解液在芯片表面孵育产生蛋白质，反应温度为20℃～35℃，反应时间为30分钟～180分钟；优选地，反应温度为约30℃左右，反应时间约为90分钟左右；
6)降低温度使蛋白质固定在第一链状分子和/或环糊精的活性基团上，反应温度为10℃～30℃，反应时间为10分钟～过夜；优选地，反应温度为约15℃，反应时间为约30分钟左右；
蛋白质充分固定后，清洗表面。
可选地，在步骤2)中，选择含有用于固定蛋白质的活性基团的环糊精，修饰第一链状分子的另一端使其含有用于固定模板分子的活性基团；在步骤5)中，选择合适的模板之后使其固定于第一链状分子的活性基团上，然后使细胞裂解液在芯片表面孵育产生蛋白质。
优选地，在上述方法中，所述步骤2)的环糊精的活性基团上还含有用于捕获蛋白质的捕获分子，当步骤5)中含或不含模板分子的细胞裂解液在芯片表面孵育产生蛋白质后，所述蛋白质通过捕获分子固定于环糊精的活性基团上。
优选地，在上述方法中，所述步骤5)可以通过清洗芯片后再次加入含或不含模板分子的细胞裂解液重复进行，使得模板分子充分表达蛋白质。
优选地，在上述方法中，步骤5)和6)在微反应腔进行，将用于表达的细胞裂解液置于微反应腔中，使经过处理的基底表面与微反应腔中的细胞裂解液接触，以使模板分子表达蛋白；可选地，如模板分子未固定于聚轮烷上，将模板分子固定于微反应腔的表面；
优选地，所述微反应腔在反应前经亲水处理。
又一方面，本发明提供一种用于构建所述蛋白质芯片的装置，其中，所述装置为制作成阵列的微反应腔，将用于表达蛋白质的细胞裂解液置于所述微反应腔中，通过与经过预处理的芯片基底相接触，使模板分子表达蛋白从而构建蛋白质芯片；
优选地，所述模板分子经预处理固定于所述聚轮烷上；或者，所述模板分子被加入到细胞裂解液中；或者，所述模板分子固定在所述微反应腔的表面；
优选地，制备微反应腔的材料包括聚二甲基硅氧烷和/或PMMA，其中，模具整体需要与基底大小匹配，微反应腔数量为1～1000个，每个微反应腔形状为长方体空间或圆柱体空间，其底部面积约100nm2～1cm2，高度约10 nm～1cm。
再一方面，本发明提供所述蛋白质芯片的应用，优选地，用于检测与所述蛋白质相互作用的物质，所述物质包括蛋白质、DNA、RNA、糖类、脂类以及其他小分子。
此外，本发明还提供所述装置在构建蛋白质芯片中的应用。
以下是本发明的详细描述：
本发明的目的是利用聚轮烷超分子材料构建蛋白质原位表达芯片，其具有三维、蛋白质固定量大、活性高以及模板分子和蛋白质固定有序可控等特征。
用于实现本设计目的的技术方案如下：
一种构建的三维无细胞体系原位表达蛋白质芯片，所采用的装置包括基底、聚轮烷超分子层、模板分子和捕获分子的固定、无细胞蛋白质表达体系以及微流控反应腔。所述的表面修饰是由超分子自组装形成的三维聚轮烷结构表面，原位表达中需要的模板分子和/或表达形成的蛋白质有序的固定在三维环境中。
本发明中使用的基底选自金属类，如金、银、铂、铜、铝、铬，金属氧化物类如Al2O3、TiO2、SnO2，Si，玻璃，石英，高分子聚合物以及前述几种基材以各种形式复合而成的基材。
本发明中使用的表面修饰包括能够在基底表面上形成的三维有序的超分子聚轮烷结构，由两种或两种以上的化学物质通过分子间相互作用缔结而成的具有特定结构和功能的超分子体系——聚轮烷结构。这种超分子结构的形成利用的是氢键和各种非共价键的作用。
下面以聚乙二醇和α-环糊精为例，说明这种表面修饰结构的特征。聚乙二醇是具有[C-C-O]单元结构的分子，其重复单元的数量由2到10000个以上。表面修饰中可以含有1种到100种不同重复单元数量的聚乙二醇分子，以任意比例组合。比如使用45个重复单位的长链聚乙二醇(作为第一链状分子)和6个重复单位的短链聚乙二醇(作为第二链状分子)，其比例可以由1∶0，1∶1，1∶10000等摩尔比例构成。比例的不同，使得组装在基底表面的长链聚乙二醇分子之间的距离不同。长链聚乙二醇的末端修饰是多样的。包括单巯基、双巯基、羧基、氨基和/或氨基硅烷；另一端可用包括-COOH、-NH2、-SH、乙二胺、谷氨酸、甘氨酸、天冬氨酸、乙醇胺、链霉亲和素、马来酰亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺、环氧、-CHO、NTA-螯合基团、-OH、-CH3 和/或-OCH3等分子修饰，其作用是方便在长链聚乙二醇末端进一步共价连接其他化学或生物分子。α-环糊精的作用是包合在聚乙二醇分子上形成纳米管型的聚轮烷结构，其浓度可以由1ng/L到其饱和浓度。本发明中对环糊精分子进行了一种及以上的分子修饰(可参考本领域现有技术和戴荣继等人的“含有氨基和羧基的β-环糊精衍生物合成及性能测试”，北京理工大学学报，18卷第2期，第159-164页)，修饰后所含功能基团包括-COOH、-NH2、-SH、乙二胺、谷氨酸、甘氨酸、天冬氨酸、乙醇胺、链霉亲合素、马来酰亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺和/或-CHO。除使用聚乙二醇和α-环糊精，其他可以构成超分子纳米管状的聚轮烷结构的化合物也可以使用，比如使用聚丙二醇和β-环糊精、聚乙二醇和γ-环糊精以及聚二苯己三烯和γ-环糊精形成的聚轮烷结构等等(环糊精如图1所示)。
本发明在包含超分子纳米管状的聚轮烷结构的表面上打印阵列，可以直接用移液枪在芯片表面点样，也可使用打印机点样。点样的成分可以是模板分子和捕获分子的物质以及其他分子，其中捕获分子可以是蛋白质、糖类等。每一点打印的量可以是1nl～10μl；本发明中，捕获分子需要固定到聚轮烷结构的活性基团上，而模板分子可以固定，也可以不固定。模板分子和捕获分子之间的摩尔比例可以为1∶1到1∶10000甚至更高。其目的是使能够表达的模板分子和能够固定的捕获分子根据实际表达量进行匹配。在每平方厘米的面积里，打印的点数可以由1个到105个以上。两点圆心间距离的范围为10nm～5mm。
本发明中使用的表达蛋白质的模板分子可以是RNA分子、DNA分子。其中DNA分子可以是环状DNA，如质粒DNA、单链环状DNA，或者是单链DNA，比如PCR扩增后的产物。
本发明中使用的质粒DNA分子需要含有多种元件，例如包括不翻译的前导序列、核糖体识别位点、启动子、特异性的切割位点、3’不表达序列、目的蛋白序列、5’不表达序列以及3’或5’端的标签和终止子等必要成分。其中特异性的切割位点包括：Nhel、Xhol、EcoRl、Mlul、Xbal、Sall、Accl、Smal、BstZl、Notl等切割位点。其启动子可以是强启动子，包括T3、T7和SP6等启动子。其中目的蛋白可以是酶，比如β-糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶等；也可以是病毒的特征蛋白，比如乙肝病毒表面抗原、乙肝病毒核心抗原等；亦可以是细胞内单个行使功能的蛋白，比如p53、p21等；还可以是一个复合蛋白中的一个单体蛋白，比如DNA合成酶复合体中的一个单体蛋白或者是氧化还原酶体的一个单体等。
本发明中每一个模板分子可以含有不同的标签，可以是较大的酶类，比如b-半乳糖苷酶(b-Galactosidase)、谷胱甘肽转移酶(GST)、氯霉素(Chloramphenicol acetyltransferase)、二氢叶酸还原酶(Dihydrofolatereductase)等；也可以是多肽结合位点，比如Protein A、Protein G、Z、SPG、ABP等；还可以是一些特异识别多肽的肽段，比如FLAG、c-myc、B-tag、T7tag、S-tag、calmodulin-binding tag、Coiled-coil多肽等；识别金属螯合的肽段，比如His、ProHis5Pro、HAT和FISaH tag CCXXCC等；除此之外，还有识别生物素链霉素的肽段，比如Biotag、AviTag、Strep tag II、Streptavidinbinding peptide、Nanotag、Photocleavable Tag等。
本发明中，一个模板中，可以使用多种不同的标签，标签的数目可以是1个、2个甚至更多个。本发明中，标签的位置可以位于表达出的蛋白质的C端，也可以位于蛋白质的N端。根据各种标签使用方法的不同，其标签距离表达蛋白可以紧邻，也可以距离1到100个甚至更多的连接氨基酸。
本发明中，模板分子可以固定在阵列的表面，亦可以不固定在阵列的表面。固定的方法可以选用生物素亲和素特异连接，也可以使用生物素链霉素特异连接以及其他使DNA或RNA分子固定在阵列表面的方法。固定在阵列上需要的是保持模板分子表达蛋白质的能力。以由聚乙二醇和α-环糊精构建而成的聚轮烷表面为例说明有序固定质粒DNA分子和蛋白质分子的方法。其中第一链状分子聚乙二醇分子含有45个重复单元，其末端用马来酰胺修饰，另一端为巯基。第二链状分子聚乙二醇分子含有6个重复单位，其一端为羟基，另一端为巯基。长短两种聚乙二醇在金片表面以1∶10的摩尔比例共混，在金片表面形成两种链状分子交替的三维结构。然后使用带有羧基修饰的 环糊精，以浓度为100ug/ml加入100ul到修饰表面，环糊精与第一链状分子聚乙二醇组装成聚轮烷结构。在此之后，加入用巯基修饰的质粒DNA分子(含有GST的标签)，使其与马来酰胺分子结合。最后用NHS/EDC活化环糊精上的羧基，加入GST抗体，使GST抗体与环糊精上的羧基结合。最终形成聚轮烷末端为质粒DNA，环糊精外侧为捕获标签蛋白的三维结构(如图2所示)。冲洗掉未捕获蛋白后，即可用于蛋白质与蛋白质相互作用实验。
本发明中模板分子可以是不单一的，其数量可以是1种、2种、3种甚至更多种，以此在同一位置上同时表达多种多肽段，形成由多肽组成的蛋白质。质粒种类的添加变化可以用于研究多肽形成蛋白质中某一组成成分缺失所造成的构象以及活性影响方面的研究。
本发明需要捕获标签的捕获分子例如蛋白、糖类以及其他分子可以固定在聚轮烷上任何的活性基团上。修饰到功能基团上的捕获分子根据目的蛋白上带有的标签种类不同而不同，它利用与其相应标签的特异亲和性，将模板分子表达出的蛋白质固定在聚轮烷活性基团上，构成捕获蛋白质的三维空间表面。需要的捕获分子与使用标签的对应关系示例性的参照列表1。
表1：标签与捕获分子对照表
本发明中的模板分子和捕获分子可以固定在临近位置上，比如同一个环糊精上面；或者模板分子固定在同链的一个环糊精上，另一个捕获分子固定在同链的另一个环糊精上；或者模板分子或捕获分子其一固定在聚乙二醇或聚丙二醇末端，而另一个固定在环糊精上面；或者模板分子固定在一个聚轮烷上，而另一个捕捉物质固定在相邻的聚轮烷上。一般来说，实际固定在聚乙(丙)二醇或环糊精上的具有活性的捕捉物质，比实际可以表达的模板的数量多，所述模板分子和捕获分子之间的摩尔比例为10∶1～1∶100，进一步优选为5∶1～1∶50，更优选为1∶1～1∶10。其目的是使能够表达的模板分子和能够固定蛋白质的捕获分子根据实际表达量进行匹配。还可以使用两种或多种不同修饰的环糊精，例如马来酰胺和羧基修饰末端，可使巯基化的模板分子和捕获标签蛋白在三维环境中均匀分布。
本发明中使用的细胞裂解液可以选用原核细胞裂解液，比如大肠杆菌裂解液；也可以选用真核细胞裂解液，比如兔网织红细胞裂解液，麦胚裂解液，昆虫细胞裂解液等提取液。裂解液的选择根据表达蛋白的来源来选择。比如表达原核细胞的蛋白，通常采用大肠杆菌裂解液，表达植物蛋白一般选用麦胚裂解液。如果使用的模板是mRNA模板，则可以直接使用兔网织红细胞裂解液，麦胚裂解液，昆虫细胞裂解液等提取液。如果使用DNA分子作为模板，则需使用转录翻译偶联的兔网织红细胞裂解液，麦胚裂解液，昆虫细胞裂解液等提取液。其产量一般为10ng/ml到10mg/ml。一般来说，加入细胞裂解液之后，要保证蛋白质表达过程中周围环境的湿度和温度。
本发明在构建聚轮烷表面和原位表达蛋白质过程中可以包括如下步骤：
1)选取适宜于检测的基底层，清洗表面。
2)以一定比例，配制可以固定在基底表面的第一链状分子和第二链状分子的混合溶液，其末端可以固定模板分子或捕获分子。
3)在环糊精上修饰可以固定模板分子或捕获分子的官能团。
4)在基底表面修饰第一链状分子和第二链状分子，以共价键的形式固定在基底表面，用水冲洗。
5)在修饰有第一链状分子和第二链状分子的表面上包合具有特定官能团的环糊精分子，用水冲洗。
6)通过第一链状分子末端的活性基团和环糊精表面活性基团的不 同，分别固定模板分子和捕获蛋白质的分子，用水冲洗。
7)用细胞裂解液在芯片表面孵育蛋白质的产生，温度在30摄氏度左右，时间为1小时左右。之后降低温度到15摄氏度左右，使蛋白质固定在捕获分子上面。用水冲洗掉未固定的表达的蛋白质和细胞裂解液中残留在芯片表面的物质。(蛋白质表达过程如图4所示)。
本发明加入无细胞蛋白质表达系统的方法，可以采取二次打印的方法，将裂解液打印到之前打印模板分子和捕捉物质的地方；也可以采用浸泡的方法，让整个芯片表面处于细胞裂解液浸润的状态。在本发明中，为了避免表达蛋白的扩散现象，可以使用聚二甲基硅氧烷(PDMS)或PMMA等材料制作成阵列的微反应腔(如图5所示)。经亲水处理过的微反应腔内盛有可供蛋白质表达的细胞裂解液，扣在固定好模板分子的表面，与模板分子接触并表达蛋白。其微反应腔的底部面积范围为100nm2～1cm2，高度为10nm～1cm。在本发明中，模板分子也可以固定在微反应腔表面，蛋白质表达后被芯片表面聚轮烷活性基团上的捕获分子所捕获。模板分子也可以直接溶解于微反应腔中的细胞裂解液中。
本发明中加入无细胞蛋白质表达系统后，还可以采用渗透膜的方法不断供给蛋白质表达过程中所消耗的4种核糖核酸分子，多种氨基酸分子，多种tRNA分子以及ATP、GTP等能量小分子。如果蛋白质表达的量不足，如模板分子固定在芯片表面，可以在清洗掉细胞裂解液以及不能捕获在芯片表面的各种小分子后，再次重复加入无细胞蛋白质表达体系，使模板分子继续表达需要的蛋白质分子。
在本发明中，可以采用多种手段使分析相与固定相相互接触与识别。可以直接将分析相点到芯片表面，使单一的分析相与表达出来的蛋白质阵列相互接触与识别。分析相可以带有荧光标签、放射性同位素标签、纳米颗粒以及其它可以被识别出的标签。本发明中，也可以使用微流体技术，比如使用PMMA或PDMS以及其他模具材料制成的微流体模板，使带有标记的分析物以一定速度流经蛋白质阵列。其流速为100nl/min～100μl/min，进一步优选为1μl/min～50μl/min，更优选为2μl/min～25μl/min。上述两种方法的浓度为0.1ng/ml～1mg/ml，进一步优选为1ng/ml～100μg/ml，更优选为10ng/ml～10μg/ml。
本发明可以融合酶联免疫吸附分析法(ELISA)对抗原抗体之间的相互作用进行检测，使用第一抗体对该三维结构中固定的表达抗原进行检测，再使用第二抗体对与抗原相互作用的第一抗体进行检测。其中第二抗体带有酶 联免疫分析的酶类，可以使用ELISA的常规方法对其抗原的表达进行检测。
本发明可以荧光检测抗原抗体之间的相互作用，使用第一抗体对三维结构中固定的表达抗原进行检测，再使用第二抗体对与抗原相互作用的第一抗体进行检测。其中第二抗体带有荧光标记分子，在酶标仪或者其他检测荧光仪器下检测。
本发明可以采用放射性自显影方法检测抗原抗体之间的相互作用，使用第一抗体对三维结构中固定的表达抗原进行检测，再使用第二抗体对与抗原相互作用的第一抗体进行检测。其中第二抗体带有放射性自显影标签，用传统放射性自显影技术检测蛋白质和抗体的相互作用。
本发明也可以使用表面等离子共振成像(SPR，Surface PlasmonResonance)的方法(图3所示)进行检测，在高折射率的玻片表面蒸镀有2nm的铬和40nm的金。其上自组装有PEG，PEG与羧基化的α-环糊精形成聚轮烷，并在无细胞表达体系的三维环境中表达出蛋白质。配合适应微流体进样系统，检测表达蛋白和分析物之间的相互作用，并得到其动态结合和解离常数。其分析物可以是抗体蛋白，可以是功能蛋白，也可以是糖类等其他与表达蛋白相互作用的小分子。所述方法一般包含如下步骤：
1)先在玻璃基片的一个表面上蒸镀或溅射1-2nm铬膜，再在铬膜上蒸镀或溅射45-55nm厚的金膜，制备成裸金芯片；
2)按照本发明的方法制备环糊精超分子组装的生物芯片，其中第一链状分子的末端固定质粒DNA分子(如环氧修饰)，环糊精上固定捕获表达蛋白的分子(如NTA-Ni螯合剂团)。
3)将芯片固定在SPR仪器上，通入PH＝7.4的PBS缓冲液稳定基线并开始进行实时监测；
4)取不表达蛋白质的质粒DNA分子做参考信号，选表达蛋白为实验信号，通入待检测蛋白质溶液，判定待测蛋白和表达蛋白是否存在相互作用关系。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
首先，本发明芯片的表面修饰层采用了不同长度的第一链状分子和第二链状分子组合组装，该第一链状分子和第二链状分子可以分别采用不同的长度，并以任何比例组合，使得三维空间结构疏密可控、结构多变；
其次，本发明芯片表面修饰层中的第一链状分子和环糊精包合形成了聚轮烷结构，蛋白质固定于该结构之上，不仅大大提高了所固定蛋白质的量， 而且避免了现有技术中蛋白质直接吸附于芯片基底上造成空间构象发生变化、以致丧失活性的缺陷；
再次，在本发明芯片的表面修饰层可引入各种活性基团，该活性基团可以位于第一链状分子和/或环糊精上，通过活性基团的种类、总量、比例和位置关系，可以实现模板分子和/或捕获分子的有序固定，进而实现蛋白质的有序固定，从而提高了检测的灵敏度、检测限和准确性；
此外，在本发明的蛋白质芯片表面基础上还可构建更复杂新颖的表面结构，为不同目的的生化检测提供更广阔的选择空间，体现了优越的综合性能，深度开发的潜力很大，为基因诊断及研究、免疫检测、蛋白质组学研究、疾病诊断和药物筛选等提供了强有力的工具。
附图说明
以下，结合附图来详细说明本发明，其中：
图1为本发明所涉及的环糊精的分子结构示意图。
图2为本发明的蛋白质原位表达芯片的结构示意图，其中1为基底，2为环糊精，3为第一链状分子，4为第二链状分子，5为蛋白质，6为模板分子。
图3为本发明所述的表面等离子共振成像仪(SPRI)的工作原理示意图。其中：
1-芯片；2-入射光；3-反射光检测器CCD；4-棱镜；5-流通池；6-检测样本。
图4为本发明所涉及的蛋白质原位表达示意图，其中1-基底，2-环糊精，3-第一链状分子，4-第二链状分子，5-表达蛋白1，6-模板分子，7-表达蛋白2，8-模板分子转录产生的mRNA，9-检测蛋白1，10-检测蛋白2。
图5为本发明所述的用于构建芯片的聚二甲基硅氧烷(PDMS)微反应腔结构示意图。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述。应当理解给出的实施例仅为了对制备和使用本发明的特定方法和产品进行说明，而不是为了限制本发明的范围。
本发明中所用的芯片打印机为Continμoμs Flow Microspotter(CFM)Printer，Wasatch Company，MSA。所用的BIAOMIANDENGLIZISPRI为 PlexeraTM Analyzer第三代，Plexera Bioscience Company，MSA。使用的MV/Ozone清洗机为BioForce Nanosciences，IA，MSA。所使用的细胞裂解液是TnT Quick Coupled Transcription/Translation System(in vitro proteinexpression)，Promega Corporation，货号为L1170，以及TnT T7coupled wheatgerm extract system，Promega Corporation，货号为L4140和TnT T7Quick forPCR DNA，Promega Corporation，货号为L5540。
实施例1：检测乙肝患者体内乙肝病毒核心抗体(HBc Ab)、乙肝病毒e抗体(HBe Ab)和乙肝病毒表面抗体(HBs Ab)三种抗体的含量的三维蛋白质芯片
在高折射率的玻片表面蒸镀2nm的铬和40nm的金(玻片为75mm*25mm)，并用带有巯基的长短链PEG分子进行表面修饰，其中第一链状分子PEG 45末端为羧基，第二链状分子PEG 6末端为羟基，以1∶10的比例混合，自组装到金表面上，总浓度为1mM，用量为100ul，均匀平铺在金片表面。之后，加入Ni-NTA修饰的α-环糊精分子溶液(浓度为100ug/ml，40ul)，静置1天，使环糊精分子自组装到第一链状分子PEG上面，构成聚轮烷结构。利用NHS/EDC溶液(NHS浓度为50mM，EDC浓度为200mM，两者1∶1混合，1.5ml，充满整个金片表面)使第一链状分子PEG 45末端的羧基活化后，加入亲和素分子(50ug/ml，200ul)固定到PEG 45的末端。之后，去活化羧基基团(使用乙醇胺溶液，50ug/ml)。在金表面三个不同区域加入3种带有T7启动子的生物素化的质粒分子(0.5mg/ml，每种0.5ul)，其表达蛋白分别是HBc Ag、HBe Ag以及HBs Ag，其标签为His6。带有生物素标签的质粒会固定到亲和素上(如图2所示)。加入转录翻译偶联的兔网织红细胞无细胞表达体系裂解液(Promega，1reaction或者2reaction)，30℃，100％湿度条件下保持1.5小时，表达蛋白；然后在15℃，100％湿度条件下保存，使蛋白质固定在Ni-NTA上(如图4所示)。用PBST(PBS+0.05％TWEEN，pH值为中性)冲洗掉细胞裂解液以及没有固定的蛋白质。之后安装与金片配套的微流控反应腔(40ul)，在SPRi(如图3所示)下观察稀释后病人血清中HBc Ab、HBe Ab和HBs Ab三种抗体的响应曲线(抗体浓度为10ug/ml)。
实施例2：含p21、p31、gp41和gp120四种特征蛋白的防蛋白质扩散芯片
在金包被的玻璃基材上，并采用带有巯基的长短链状分子双硫醇分子进行表面修饰，其中第一链状分子双硫醇(Mw：8000)末端为羧基，第二链状分子双硫醇Mw：1500末端为羟基，结构式如下。其中，第一链状分子R为羧基，n为45；第二链状分子R为羟基，n为6：
以1∶50的比例混合，自组装到金表面上，总浓度为1mM。之后，加入50ug/ml，50ul的Ni-NTA修饰的α-环糊精分子溶液，静置1天，使环糊精分子自组装到第一链状分子双硫醇上面，构成聚轮烷结构。利用NHS/EDC溶液使第一链状分子双硫醇上的羧基活化后，加入亲和素分子(50ug/ml，200ul)固定到双硫醇的末端。之后，去活化羧基基团。制作含有4个反应腔的亲水处理的PDMS模具(如图5所示)，在不同的反应腔中点入4种带有T7启动子的生物素化的PCR DNA分子(每个0.5mg/ml，1ul)，其表达蛋白分别是p21、p31、gp41和gp120，其标签为His6。带有生物素标签的质粒会固定到亲和素上。加入TnT T7Quick for PCR DNA无细胞表达体系裂解液(Promega，1reaction或者2reaction)，30℃，100％湿度条件下保持1.5小时，表达蛋白；然后在15℃，100％湿度条件下将PDMS反应腔倒置于金片上，使反应腔中的表达蛋白的裂解液接触到金片表面，保存30分钟，使蛋白质固定在Ni-NTA上。用PBST冲洗掉细胞裂解液以及没有固定的蛋白质。加入表达蛋白质相应的抗体，和相应荧光分子标记的二抗。在荧光显微镜体式镜下观察稀释后病人血清或其他样本中p21、p31、gp41和gp120抗体的响应曲线(抗体浓度为10ug/ml)。
实施例3：自身免疫疾病生物标志物的发现
在高折射率的玻片表面蒸镀有2nm的铬和40nm的金，并采用带有巯基的长短链PEG分子进行表面修饰，其中第一链状分子PEG45末端为羧基，第二链状分子PEG6末端为羟基，以1∶10的比例混合，自组装到金表面上，总浓度为1mM，用量为100μl，均匀平铺在金片表面。之后，加入饱和浓度α-羧甲基环糊精分子溶液(125mg/ml，50ul)，静置1天，使环糊精分子自组装到第一链状分子PEG上面，构成聚轮烷结构。利用NHS/EDC溶液使第一 链状分子PEG 45和羧甲基环糊精上的羧基活化后，加入多肽E coil(2.5mg/ml，50ul)固定到PEG45或羧甲基环糊精的羧基基团上。之后，去活化羧基基团。在芯片上使用非接触式打印机打印100种质粒(浓度为0.5mg/ml，每个点0.1ul)分子，其表达蛋白为人体内表达的蛋白质，表达蛋白标签为K coil(由于E coil对DNA分子有结合作用，因此DNA分子会结合到E coil上面)。加入转录翻译偶联的麦胚细胞无细胞表达体系裂解液(Promega，1reaction或者2reaction)，30℃，100％湿度条件下保持1.5小时，表达蛋白；然后在15℃，100％湿度条件下保存，使蛋白质固定在E coil上。用PBST冲洗掉细胞裂解液以及没有固定的蛋白质。之后安装与金片配套的微流控反应腔，在SPRi下观察稀释后病人血清或其他样本与这些蛋白质相互作用的强度。
实施例4：自身免疫疾病病人恢复程度的鉴定
在高折射率的玻片表面蒸镀有2nm的铬和40nm的金，并采用带有巯基的长短链PEG分子进行表面修饰，其中第一链状分子PEG100末端为羧基，第二链状分子PEG45末端为2.4-二硝基氟苯，以1∶20的比例混合，自组装到金表面上，总浓度为2mM，用量为100ul，均匀平铺在金片表面。之后，加入浓度为50mg/ml的Ni-NTA修饰的α-环糊精分子溶液，总量为100ul，静置1天，使环糊精分子自组装到第一链状分子PEG上面，构成聚轮烷结构。利用NHS/EDC溶液使第一链状分子PEG 45上的羧基活化后，加入亲和素分子固定到PEG45的末端。之后，去活化羧基基团。在芯片上使用非接触式打印机打印生物素化的1000种质粒分子，其表达蛋白为人体内表达的蛋白质，带有生物素标签的质粒会固定到亲和素上。加入转录翻译偶联的兔网织红细胞无细胞表达体系裂解液(Promega，1reaction或者2reaction)，30℃，100％湿度条件下保持1.5小时，表达蛋白；然后在15℃，100％湿度条件下保存，使蛋白质固定在Ni-NTA上。用PBST冲洗掉细胞裂解液以及没有固定的蛋白质。安装与之相匹配的微流控反应腔，在SPRi上观察，通过与病人之前的血清样本相互比对，定量分析其自身免疫疾病生物标志物的变化，给出病人疾病的诊断。
实施例5：研究线粒体内蛋白质相互作用网络的功能蛋白质芯片。
在高折射率的玻片表面蒸镀有2nm的铬和40nm的金，并采用带有巯基的长短链PEG分子进行表面修饰，其中第一链状分子PEG45末端为羧基， 第二链状分子PEG6末端为羟基，以1∶10的比例混合，自组装到金表面上，总浓度为1mM，用量为100μl，均匀平铺在金片表面。之后，加入浓度为100ug/ml的羧甲基-α-环糊精分子溶液200ul，静置1天，使环糊精分子自组装到第一链PEG上面，构成聚轮烷结构。利用NHS/EDC溶液使第一链状分子PEG45和环糊精上的羧基活化后，加入亲和素分子(50KD，0.1mg/ml)和Anti-GST Ab(GE company，150KD，0.3mg/ml)的混合物固定到PEG45的末端。之后，去活化羧基基团。在芯片上使用非接触式打印机打印生物素化的质粒DNA分子，其表达蛋白分别是人线粒体内的100种功能蛋白，包括水溶性蛋白和膜结合蛋白，其标签为GST。质粒会固定到Anti-GST Ab上。加入转录翻译偶联的麦胚无细胞表达体系裂解液，30℃，100％湿度条件下保持1.5小时，表达蛋白；然后在15℃，100％湿度条件下保存30分钟，使蛋白质固定在Anti-GST Ab上。安装与之相匹配的微流控反应腔，用PBST冲洗掉细胞裂解液以及没有固定的蛋白质，分别加入纯化并稀释后的线粒体中的各种蛋白，在SPRi下观察，记录其与固定在芯片表面的蛋白质之间的相互作用。
实施例6：实时的蛋白质相互作用分析，用于确定两者之间的亲和常数与解离常数。
选择基材为玻片、硅片、石英、聚苯乙烯、聚二甲基硅氧烷，将其表面用乙醇、水进行清洗，氮气吹干。放入以1∶50丙酮稀释的3-氨丙基三乙氧基硅烷(APES)中，停留20～30秒，取出稍停片刻，再放入纯丙酮溶液中除去未结合的APES，使3-氨丙基三乙氧基硅烷(APES)与基材键合，在基材表面形成一层单分子层。在25％戊二醛中浸泡30分钟，用丙酮清洗，浸入1mM的两端均为氨基的PEG60和一端为氨基另一端为羧基的PEG15且二者分子比例为10∶1的水溶液中孵育1小时，后取出用水清洗以除去未固定到表面的双氨基PEG；将其浸入饱和浓度(125ug/ml)的α-环糊精水溶液中室温孵育12小时，使环糊精与PEG产生包合，取出洗净；放入Z型酪氨酸溶液中1小时与PEG未固定到基材的氨基进行反应，对形成的(准)聚轮烷进行封端；放入丁二酸酐的吡啶溶液中2小时对包合在PEG上的环糊精进行羧基化即可。
利用NHS/EDC溶液使第一链状分子PEG45的羧基活化后，加入亲和素分子(50ug/ml，100ul)固定到PEG45的末端。之后，去活化羧基基团。在芯片上使用非接触式打印机打印生物素化的100种质粒分子，其表达蛋白为与待 测蛋白相互作用的功能蛋白。带有生物素标签的质粒会固定到亲和素上。加入转录翻译偶联的兔网织红细胞无细胞表达体系裂解液，30℃，100％湿度条件下保持1.5小时，表达蛋白；然后在15℃，100％湿度条件下保存，使蛋白质固定在Ni-NTA上。用PBST冲洗掉细胞裂解液以及没有固定的蛋白质。加入表达蛋白质相应的抗体，和相应荧光分子标记的二抗。在荧光显微镜下观察。
实施例7：研究磷酸化对蛋白质功能的影响
在高折射率的玻片表面蒸镀有2nm的铬和40nm的金，并采用带有巯基的长短链PEG分子进行表面修饰，其中第一链状分子PEG45末端为羧基，第二链状分子PEG6末端为羟基，以1∶10的比例混合，自组装到金表面上，总浓度为1mM，用量为100μl，均匀平铺在金片表面。之后，加入浓度为50ug/ml的Ni-NTA修饰的α-环糊精分子溶液100ul，静置2～3天，使环糊精分子自组装到第一链状分子PEG上面，构成聚轮烷结构。利用NHS/EDC溶液使第一链PEG45的羧基活化后，加入亲和素分子(50ug/ml，100ul)固定到PEG45的末端。之后，去活化羧基基团。在芯片上使用非接触式打印机打印生物素化的10种PCR DNA分子，其表达蛋白为与待测蛋白相互作用的功能蛋白。带有生物素标签的质粒会固定到亲和素上。加入TnT T7Quick forPCR DNA无细胞表达体系裂解液(Promega，1reaction或者2reaction)，30℃，100％湿度条件下保持1.5小时，表达蛋白；然后在15℃，100％湿度条件下保存，使蛋白质固定在Ni-NTA上。用PBST冲洗掉细胞裂解液以及没有固定的蛋白质。其中实验芯片再加入进行相应的磷酸激酶(依照实验调整)，使表达的蛋白质磷酸化。对照芯片加入等体积去活性的磷酸激酶(如紫外或高温使酶失去活性)。用PBST(PBS+0.05％TWEEN，pH值为中性)冲洗掉细胞裂解液以及没有固定的蛋白质。之后安装与金片配套的微流控反应腔，在SPRi生物传感器上检测该蛋白在磷酸化与否的情况下与其他蛋白相互作用的动力学曲线。
Claims (50)
1.一种蛋白质原位表达芯片，其中，所述芯片包括基底(1)、表面修饰层以及固定在表面修饰层上的蛋白质(5)；所述表面修饰层包括第二链状分子(4)和由环糊精(2)包合第一链状分子(3)形成的聚轮烷，该第二链状分子和聚轮烷均匀间隔排列，并分别通过第二链状分子和第一链状分子的一端固定在基底上，并且第二链状分子的长度未达到第一链状分子被环糊精包合的部分；所述蛋白质通过修饰在第一链状分子和/或环糊精上的活性基团固定在聚轮烷上。
2.如权利要求1所述的蛋白质原位表达芯片，其中，所述蛋白质通过环糊精上的活性基团固定于环糊精上。
3.如权利要求1所述的蛋白质原位表达芯片，其中，所述基底选自金属金、银、铂、铜、铝和/或铬；金属氧化物Al2O3、TiO2、SnO2；所述金属和所述金属氧化物以各种形式复合而成的基材；以及Si，玻璃，石英和/或高分子聚合物。
4.如权利要求2所述的蛋白质原位表达芯片，其中，所述基底选自金属金、银、铂、铜、铝和/或铬；金属氧化物Al2O3、TiO2、SnO2；所述金属和所述金属氧化物以各种形式复合而成的基材；以及Si，玻璃，石英和/或高分子聚合物。
5.如权利要求3所述的蛋白质原位表达芯片，其中，所述基材选自玻璃、高分子聚合物以及表面蒸镀50纳米厚的金的高折射率玻璃基底。
6.如权利要求4所述的蛋白质原位表达芯片，其中，所述基材选自玻璃、高分子聚合物以及表面蒸镀50纳米厚的金的高折射率玻璃基底。
7.如权利要求1-6中任一项所述的蛋白质原位表达芯片，其中，所述第二链状分子包括聚乙二醇、硫醇，分子量为50～10000；所述第一链状分子包括聚乙二醇、聚丙二醇、聚二苯己三烯以及前述化合物组成的嵌段化合物，分子量为400-50000；组装于基底的第一链状分子和第二链状分子的摩尔比例为1：0～1：100000。
8.如权利要求7所述的蛋白质原位表达芯片，其中，所述第二链状分子的分子量为50～1000。
9.如权利要求7所述的蛋白质原位表达芯片，其中，所述第一链状分子的分子量为400～10000。
10.如权利要求7所述的蛋白质原位表达芯片，其中，组装于基底的第一链状分子和第二链状分子的摩尔比例为1:1～1:1000。
11.如权利要求10所述的蛋白质原位表达芯片，其中，组装于基底的第一链状分子和第二链状分子的摩尔比例为1:10～1:100。
12.如权利要求1-6中任一项所述的蛋白质原位表达芯片，其中，所述环糊精选自α-环糊精、β-环糊精和/或γ-环糊精；所述聚轮烷超分子层中第一链状分子和环糊精的摩尔比例为1:1～1:100。
13.如权利要求12所述的蛋白质原位表达芯片，其中，所述环糊精为α-环糊精和/或β-环糊精。
14.如权利要求12所述的蛋白质原位表达芯片，其中，所述聚轮烷超分子层中第一链状分子和环糊精的摩尔比例为1:2～1:20。
15.如权利要求14所述的蛋白质原位表达芯片，其中，所述聚轮烷超分子层中第一链状分子和环糊精的摩尔比例为1:5～1:10。
16.如权利要求1-6中任一项所述的蛋白质原位表达芯片，其中，所述第一链状分子和第二链状分子通过一端的固定基团固定在基底上，所述固定基团通过共价键与基底连接；第二链状分子的另一端用惰性基团修饰；第一链状分子的另一端和/或环糊精上的活性基团包括-COOH、-NH2、-SH、乙二胺基团、谷氨酸基团、甘氨酸基团、天冬氨酸基团、乙醇胺基团、链霉亲和素基团、马来酰亚胺基团、N-羟基琥珀酰亚胺基团、环氧基团、-CHO、NTA-螯合基团、-OH、-CH3和/或-OCH3。
17.如权利要求16所述的蛋白质原位表达芯片，其中，所述固定基团包括单巯基、双巯基、羧基、氨基、氨基硅烷基。
18.如权利要求16所述的蛋白质原位表达芯片，其中，所述惰性基团包括Z型酪氨酸和/或2.4-二硝基氟苯。
19.如权利要求1-6中任一项所述的蛋白质原位表达芯片，其中，所述蛋白质包括酶、病毒的特征蛋白、细胞内单个行使功能的蛋白以及复合蛋白中的一个单体蛋白。
20.如权利要求19所述的蛋白质原位表达芯片，其中，所述蛋白质来自一种或多种模板分子(6)的原位表达，所述模板分子固定或不固定于所述芯片的表面修饰层，包括RNA和DNA。
21.如权利要求20所述的蛋白质原位表达芯片，其中，所述DNA为单链或双链的环状DNA、线性DNA。
22.根据权利要求21所述的蛋白质原位表达芯片，其中，所述线性DNA为PCR扩增产物。
23.如权利要求20所述的蛋白质原位表达芯片，其中，所述模板分子通过第一链状分子和/或环糊精上的活性基团固定于所述表面修饰层的聚轮烷上。
24.如权利要求20所述的蛋白质原位表达芯片，其中，所述模板分子通过第一链状分子上的活性基团固定于第一链状分子上。
25.如权利要求20所述的蛋白质原位表达芯片，其中，所述模板分子含有一种或多种标签，使表达的蛋白质带有位于其不同位置的一种或多种标签，从而使得所述蛋白质通过标签连接于第一链状分子和/或环糊精的活性基团上。
26.如权利要求25所述的蛋白质原位表达芯片，其中，所述聚轮烷上第一链状分子和/或环糊精的活性基团还连接了对所述标签具有特异亲和性的捕获分子，所表达的蛋白质通过捕获分子固定于第一链状分子和/或环糊精上，所述捕获分子包括蛋白质、多肽和糖类。
27.如权利要求26所述的蛋白质原位表达芯片，其中，所述捕获分子通过环糊精上的活性基团连接于环糊精上，从而使表达的蛋白质固定于环糊精上。
28.如权利要求25-27中任一项所述的蛋白质原位表达芯片，其中，所述蛋白质的标签包括酶类、多肽结合位点、特异识别多肽的肽段、识别金属螯合的肽段以及识别生物素链霉素的肽段，所述标签的数量可以为一个或一个以上，其位置可以在蛋白质的C端或N端，其与蛋白质之间可以相邻，亦可以相隔数个或数十个氨基酸。
29.如权利要求28所述的蛋白质原位表达芯片，其中，所述蛋白质原位表达芯片上同时包含编码蛋白质的模板分子和捕获该蛋白质的捕获分子。
30.如权利要求29所述的蛋白质原位表达芯片，其中，所述模板分子和捕获分子之间的摩尔比例为10:1～1:100。
31.如权利要求30所述的蛋白质原位表达芯片，其中，所述模板分子和捕获分子之间的摩尔比例为5:1～1:50。
32.如权利要求31所述的蛋白质原位表达芯片，其中，所述模板分子和捕获分子之间的摩尔比例为1:1～1:10。
33.如权利要求28所述的蛋白质原位表达芯片，其中，所述蛋白质可以由单一或多种模板分子表达后经原位组装成具有功能的蛋白质复合体，经捕获分子的识别固定于聚轮烷上。
34.如权利要求33所述的蛋白质原位表达芯片，其中，所述蛋白质复合体通过捕获分子固定于环糊精上。
35.一种用于构建蛋白质原位表达芯片的方法，其中，所述方法包括以下步骤：
1)选取基底，清洗表面；
2)选取第一链状分子、第二链状分子和环糊精，其中第二链状分子一端含有能够固定到基底的固定基团，并且长度短至无法被环糊精包合或者使其另一端为惰性基团，使其不能和环糊精发生包合反应；第一链状分子一端含固定到基底的固定基团，另一端和/或环糊精含有用于固定蛋白质的活性基团；
3)配制步骤2)中第一链状分子和第二链状分子的混合溶液，将混合溶液用于处理基底表面，使第一链状分子和第二链状分子固定于基底表面后，清洗表面；
4)在基底表面包合步骤2)中的环糊精分子，使基底表面形成由第一链状分子和环糊精组成的聚轮烷，从而聚轮烷和第二链状分子形成表面修饰层，清洗表面；
5)选择细胞裂解液和编码要固定的蛋白质的模板分子，将模板分子溶解于细胞裂解液中，然后用细胞裂解液在芯片表面孵育产生蛋白质，反应温度为20℃～35℃，反应时间为30分钟～180分钟；
6)降低温度使蛋白质固定在第一链状分子和/或环糊精的活性基团上，反应温度为10℃～30℃，反应时间为10分钟～过夜；
蛋白质充分固定后，清洗表面。
36.如权利要求35所述的方法，其中，在步骤2)中，选择含有用于固定蛋白质的活性基团的环糊精，修饰第一链状分子的另一端使其含有用于固定模板分子的活性基团；在步骤5)中，选择合适的模板之后使其固定于第一链状分子的活性基团上，然后使细胞裂解液在芯片表面孵育产生蛋白质。
37.如权利要求36所述的方法，其中，所述步骤2)的环糊精的活性基团上还含有用于捕获蛋白质的捕获分子，当步骤5)中的细胞裂解液在芯片表面孵育产生蛋白质后，所述蛋白质通过捕获分子固定于环糊精的活性基团上。
38.如权利要求35所述的方法，所述步骤5)可以通过清洗芯片后再次加入含或不含模板分子的细胞裂解液重复进行，使得模板分子充分表达蛋白质。
39.如权利要求36-38中任一项所述的方法，其中，步骤4)中所述环糊精采用1ng/L到饱和浓度的水溶液。
40.如权利要求36-38中任一项所述的方法，其中，步骤5)中的反应温度为30℃，反应时间为90分钟。
41.如权利要求36-38中任一项所述的方法，其中，步骤6)中的反应温度为15℃，反应时间为30分钟。
42.如权利要求36-38中任一项所述的方法，其中，所述步骤5)和6)在微反应腔进行，将用于表达的细胞裂解液置于微反应腔中，使经过处理的基底表面与微反应腔中的细胞裂解液接触，以使模板分子表达蛋白。
43.如权利要求42所述的方法，其中，如模板分子未固定于聚轮烷上，将模板分子固定于微反应腔的表面。
44.如权利要求42所述的方法，其中，所述微反应腔在反应前经亲水处理。
45.一种用于构建如权利要求1-34中任一项所述的蛋白质芯片的装置，其中，所述装置为制作成阵列的微反应腔，将用于表达蛋白质的细胞裂解液置于所述微反应腔中，通过与经过预处理的芯片基底相接触，使模板分子表达蛋白并固定于基底上从而构建蛋白质芯片。
46.如权利要求45所述的装置，其中，所述模板分子经预处理固定于聚轮烷上；或者，所述模板分子被加入到细胞裂解液中；或者，所述模板分子固定在所述微反应腔的表面。
47.如权利要求45所述的装置，其中，制备微反应腔的材料包括聚二甲基硅氧烷和/或PMMA，其中，模具整体需要与基底大小匹配，微反应腔数量为1～1000个，每个微反应腔形状为长方体空间或圆柱体空间，其底部面积100nm2～1cm2，高度10nm～1cm。
48.如权利要求1-34中任一项所述的蛋白质芯片的应用。
49.如权利要求48所述的应用，其中，所述芯片用于检测与所述蛋白质相互作用的物质，所述物质包括蛋白质、DNA、RNA、糖类、脂类以及其他小分子。
50.如权利要求45-47中任一项所述的装置在构建蛋白质芯片中的应用。
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