KR100741160B1 - 단백질 나노어레이 상에서 단백질-단백질 상호작용의고성능 분석법 - Google Patents

단백질 나노어레이 상에서 단백질-단백질 상호작용의고성능 분석법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 단백질 나노어레이 상에서 단백질-단백질 상호작용의 고성능 분석법에 관한 것이다.
단백질 나노어레이, 캔틸레버

Description

단백질 나노어레이 상에서 단백질-단백질 상호작용의 고성능 분석법{High-throughput analysis of protein-protein interaction on protein nanoarray}
도 1은 단백질 나노어레이 상에서 분자적 상호작용력의 직접 측정 및 골드 코팅된 실리콘 기지 상에서 나노어레이 제조에 대한 실험 과정을 나타낸 도식도. (a) ProLinker™ SAM으로 금 코팅된 실리콘 기질 상에서 단백질 나노어레이의 형성을 나타냄. 금 코팅된 실리콘 웨이퍼(50nm)는 ProLinker™ SAM의 고정화 및 단백질 나노어레이에 대한 기질로 사용됨. 인테그린, BSA, 및 항-안지오제닌 Ab를 포함하는 단백질 용액들이 100 ㎍/ml의 농도로 제조. 단백질 나노어레이 패터닝은 0.01 nN의 컨택트 포스와 6 초의 컨택트 타임을 가지는 골드 코팅된 캔틸레버(NSC14 Cr-Au)를 사용하여 수행. (b) 단백질 나노어레이들에서 상호작용력의 직접 측정을 나타냄. 단백질의 단단한 고정을 위하여 캔틸레버 표면을 ProLinker™ SAM (A 및 B)으로 모디화이. ProLinker™ 코팅된 캔틸레버는 비트로넥틴 및 안지오제닌 용액(C 및 D)에 침지하였다. 물리적으로 흡착된 과량의 단백질을 제거하기 위하여, 캔틸레버를 PBS (E 및 F)로 세척하고 N2 가스 스트림(G 및 H) 하에서 건조하였다. 인테그린 및 비트로넥틴 또는 BSA와 비트로넥틴 사이의 분자적 상호작용력 측정은 비트로넥틴으로 모디화이된 캔틸레버를 사용하여 각각 수행하였다(I). 안지오제닌과 항- 안지오제닌 Ab 사이의 분자적 상호작용력 측정은 안지오제닌으로 모디화이된 캔틸레버를 사용하여 수행하였다(J). 상호작용력 측정은 넌-컨택트 모드로 골드 코팅된 캔틸레버(NSC36 Cr-Au)를 사용하여 수행하였다.
도 2는 여러 실험 조건에서 단백질 나노어레이의 AFM 이미지 및 분자적 상호작용의 도식 도면. (a) Au 기질 vs. Au-코팅된 캔틸레버. (b) ProLinker™ SAM vs. Au 코팅된 캔틸레버. (c) ProLinker™ SAM vs. 비트로넥틴-고정화된 캔틸레버. (d) BSA 나노어레이 vs. 비트로넥틴-고정화된 캔틸레버. AFM 이미지는 나노어레이된 BSA 스팟들을 보인다. 라인 프로화일은 12에서 25 nm의 BSA 나노어레이의 높이를 보인다. (e) 인테그린 나노어레이 vs. 비트로넥틴 고정화된 캔틸레버. AFM 이미지는 상기 나노어레이된 인테그린 스팟들을 나타낸다. 라인 프로화일은 12에서 16 nm의 인테그린 나노어레이의 높이를 보인다. (f) 항-안지오제닌 Ab 나노어레이 vs. 안지오제닌-고정화된 캔틸레버. AFM 이미지는 상기 나노어레이된 항체 스팟들을 보인다. 라인 프로화일은 20nm의 항체 나노어레이의 높이를 보인다.
도 3은 캔틸레버 말단에서 컨택트되는 분자들의 수와 캔틸레버의 구조적 차원 사이의 관계를 나타낸 그림. (a) AFM 캔틸레버의 특성(NSC36/Cr-Au). (b) 상호작용력의 측정을 위한 단백질 나노어레이 상의 선택된 접근 지점들. (c) 캔틸레버 말단에서 컨택트되는 분자들의 수. 캔틸레버의 구조적 특성으로 인하여 캔틸레버 상의 타겟 단백질의 제한된 수가 단백질 나노어레이 상의 프로브 분자들과 접촉할 수 있다. (d) 측정된 상호작용력 곡선.
도 4는 다양한 실험 조건에 대한 히스토그램과 상호작용력 곡선. (a) 다른 여섯 개의 실험 조건에 대한 전형적인 상호작용력 곡선. (b) 다른 여섯 개의 실험 조건에 대한 상호작용의 히스토그램.
본 발명은 단백질 나노어레이 상에서 단백질-단백질 상호작용의 고성능 분석법에 관한 것이다.
일반적으로, 고체 표면에 고정화된 생체분자의 어레이들은 과학기술의 여러 분야에서 소형화된 바이오분석에 대한 새로운 도구로 사용될 수 있다(Charboneau, L., 외, Brief. Funct . Genomics Proteomics 2002, 1, 305-315;Cutler, P., Protein arrays: The current state-of-the-art, Proteomics 2003, 3, 3). 특히 단백질 또는 DNA 고정화된 마이크로어레이들은 고성능 스크리닝 및 매우 패킷된 진단 칩에 대한 새로운 분석법의 개발과 같은 생물학적 용도에 유용한 플랫폼으로 간주된다(Knezevic, V., 외, Proteomics 2001, 1, 1271-1278;Liotta, L., 외, Nat. Rev. Genet . 2000, 1, 48-56).
생체분자 상호작용에서 통상의 검출 방법들은 동위원소, 형광 염료 및 발색 염료와 같은 다른 시약들과 생체분자의 추가적인 태깅이 필요하다. 특히, 단백질 마이크로어레이의 어레이들은 형광과 같은 광학성을 사용하여 수행되고, 단백질-단백질 상호작용을 검출하는 형광 물질로 표지된 분자를 필요로 한다(Lesaicherre, M. L., 외, Bioorg . Med. Chem . Lett . 2002, 12, 2085-2088). 그러나 형광물질들을 사용한 이들 추가적인 태킹은 단백질의 구조형태에 영향을 주어 단백질의 기능적 변화를 야기할 수 있다. 따라서 표지된 프로브없이 단백질의 분자적 상호작용들을 검출하는 기술을 개발할 필요가 있다. 그러나 형광기술을 넘어서는 단백질-단백질 상호작용을 분석할 수 있는 검출 기술은 현재까지 제한적이다.
최근에 마이크로-컨택트 프린팅(MCP) 및 답-펜 나노리소그래피 (DPN)을 포함하는 새로운 기술들 중 일부가 초소형화된 생체분자 어레이의 패터닝 기술로 개발되었다. Method 원자력 현미경(AFM)을 사용하는 답-펜 나노리소그래피(Dip-pen nanolithography;DPN)는 패터닝 기술뿐 아니라 추가적인 태깅없는 검출 방법으로 관심이 있다. 상기 DPN 방법은 나노미터 스캐일에서 고밀도 어레이의 제조의 경로를 제공한다(Hong,S., 외, Science, 1999, 286, 523-525;Pinder, R. D., 외, Science, 1999, 283, 661-663).
DPN 방법에 의해 패턴된 단백질 나노어레이에서, 표면에 고정화된 프로브 단백질과 용액 상태 내의 타겟 단백질 사이의 단백질-단백질 상호작용은 배양과 건조 과정을 거친 후에 각 단백질 스팟의 높이 변화를 측정하여 검출할 수 있다(K. B. Lee, 외, J. Am. Chem . Soc. 2003, 125, 5588-5589). 이 방법에서, 배양 과정을 통한 타겟 단백질의 상호작용 후에 각 스팟의 높이 정보를 얻기 위하여 여러 번의 단백질 나노어레이의 이미지를 스캐닝하여야 한다. AFM에 의한 주어진 표면 면적의 토포로지컬 이미지들을 스캐닝하는데 비교적 오랜 시간이 소요된다. 이들 이유로 인하여 DPN 방법 기반의 단백질-단백질 상호작용 분석은 비교적 긴 검출 시간과 복잡한 과정을 요구한다. 따라서 매우 빠르고 간단한 검출 원리를 가진 바이오분석 방법의 필요성이 대두되었다.
본 발명은 상기의 필요성에 의하여 안출된 것으로서 본 발명의 목적은 단백질 나노어레이 상의 단백질-단백질 상호작용의 고성능 분석에 대한 나노스캐일에서 새로운 향상된 검출 방법을 제공하는 것이다.
상기의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 a)골드 코팅된 캔틸레버 표면에 크라운-에테르 모이어티를 가지는 캘릭스[4]아렌(calix[4]arene)] 유도체 용액를 처리하는 단계;
b)상기 캔틸레버 표면 상에 크라운-에테르 모이어티를 가지는 캘릭스[4]아렌(calix[4]arene)] 유도체 자가 조립 단층구조(SAM) 형성 후 캔틸레버를 단백질 단층 형성을 위하여 대상 단백질 용액에 침지하는 단계;
c)버퍼로 세척하여 물리적으로 흡착된 과량의 단백질을 제거하는 단계;
d) 단백질 모디화이된 캔틸레버를 건조하여 상기 단백질로 모디화인된 캔틸레버 팁을 제조하는 단계;
e) 상기 단백질로 모디화인된 캔틸레버 팁을 크라운-에테르 모이어티를 가지는 캘릭스[4]아렌(calix[4]arene)] 유도체 코팅된 웨이퍼 상의 타겟 단백질 나노어레이 또는 상기 고정화된 단백질들의 항체 나노어레이 스팟에 접근하는 단계;및
f) 캔틸레버 팁과 웨이퍼 모두가 분리될 때 양 단백질 사이의 분리력을 측정하는 것을 포함하는 단백질 나노어레이 상에서 단백질-단백질 상호작용의 고성능 분석법을 제공하는 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 대상 단백질은 타겟 단백질과 상호작용할 수 있는 특징을 가지는 모든 단백질이 가능하며, 상기 대상 단백질은 보바인 시럼 알부민, 비트로넥틴 또는 안지오제닌인 것이 더욱 바람직하다.
또한 본 발명에서 상기 타겟 단백질은 대상 단백질들과 상호작용할 수 있는 항체를 포함한 모든 단백질이 가능하며, 상기 타겟 단백질은 안테그린 또는 항-안지오제닌 항체인이 더욱 바람직하다.
또한 본 발명은 a) 골드-코팅된 캔틸레버 표면에 크라운-에테르 모이어티를 가지는 캘릭스[4]아렌(calix[4]arene)] 유도체 용액를 처리하는 단계;
b)상기 캔틸레버 표면 상에 크라운-에테르 모이어티를 가지는 캘릭스[4]아렌(calix[4]arene)] 유도체 자가 조립 단층구조(SAM) 형성 후 캔틸레버를 단백질 단층 형성을 위하여 대상 단백질 용액에 침지하는 단계;
c)버퍼로 세척하여 물리적으로 흡착된 과량의 단백질을 제거하는 단계; 및
d) 단백질 모디화이된 캔틸레버를 건조하여 상기 단백질로 모디화인된 캔틸레버 팁을 제공한다.
이하 본 발명을 설명한다.
본 발명에서는 나노어레이된 단백질과 AFM 캔틸레버 표면 상에 고정화된 타겟 단백질 사이의 상호작용을 측정하여 단백질 나노어레이 상에 나노스캐일화된 단백질 분자 상호작용을 검출하는 새로운 기술을 제공한다. 본 발명자들은 AFM을 사 용하는 DPN 방법에 의하여 ProLinker™-표면화된 Si 웨이퍼 상에 인테그린 avb3의 단백질 나노어레이를 제조하였다. 인테그린 avb3은 비트로넥틴에 대한 주된 수용체 작용을 하는 막 단백질이다.비트로넥틴은 ProLinker™ -코팅된 캔틸레버 팁 상에 고정화하였다. BSA 및 항-안지오제닌(ANG) mAb의 단백질 나노어레이들을 여러 분자적 상호작용을 측정하는 레퍼런스 물질로 고안하였다. 인테그린 avb3 및 비트로넥틴 사이의 분자적 상호작용은 AFM 이미지 상의 나노어레이된 단백질 스팟의 높이 변화를 측정하는 대신에 ProLinker™ 표면 상의 양 단백질 사이의 분리력(unbinding force)을 측정하여 검출하였다. 또 비트로넥틴 및 BSA 사이 또는 항-ANG mAb 및 ANG 사이의 분자적 상호작용력을 동시에 측정하고 평가하였다.
단백질 나노어레이들은 초소형(ultraminiaturized) 바이오분석에 대한 유용한 프랫폼으로 작용할 수 있다. 많은 경우에서 단백질 샘플들은 매우 제한적이고 일시적으로 유일무이하다. 따라서 단백질 나노어레이 기술을 사용하여 고성능 분석을 위한 단백질 칩을 제조하는 것은 많은 잇점을 얻을 수 있다. 본 발명에서는 캔틸레버 표면에 고정화된 타겟 단백질과 Au-코팅된 Si 웨잎 상의 나노어레이된 캡쳐 단백질 사이의 상호작용력을 측정하였다. Anti-angiogenin(ANG) mAb, integrin avb3 및 BSA를 포함하는 여러 단백질 나노어레이들을 딥-펜 나노리소그래피(dip-pen nanolithography;DPN)에 의하여 ProLinker™ -코팅된 금 표면상에 제조하였다. ProLinker™가 코팅된 원자력 현미경(AFM) 팁은 인테그린 avb3 및 ANG의 특 정 리간드인 비트로넥틴에 의하여 모디화이되었다. 단백질-고정화된 AFM 팁을 사용하여, 나노어레이된 단백질들(인테그린 avb3 및 BSA)과 팁에 고정화된 단백질 사이의 상호작용력을 양 단백질에 대한 테더링(tethering) 및 언바인딩 방법을 통하여 조사하였다. 인테그린 avb3 및 비트로넥틴 사이의 측정된 분리력은 대조군으로 사용된 BSA-비트로넥틴의 것보다 더 높았다. 그리고 또 항-ANG mAb-ANG 상호작용에 대한 특정 단백질 상호작용은 BSA-비트로넥틴 및 BSA-ANG와 같은 음성 대조군 단백질들의 것과 비교하여 더 높았다.
본 발명에서 사용된 크라운-에테르 모이어티를 가지는 캘릭스[4]아렌(calix[4]arene)] 유도체중의 하나인 ProLinker™은 화학식 1a의 구조가 바람직하다. 화학식 1a에서 m=0-2, n=0-2이 더욱 바람직하다. 본 발명에 있어서 캘릭스 크라운 유도체는 화학식 1a의 구조가 바람직하다. 화학식 1a에서 m=0-2, n=0-2이 더욱 바람직하다. 또 화학식 1a의 R1은 -CH2SH, -CHO, -CH2Cl, -CH2CN, -CH2CHO, -CH2NH2, -CH2COOH, -NH2, -NO2 R2은 -H, methyl, ethyl, propyl, isopropyl, isobutyl를 갖는 것이 바람직하고, 상기 캘릭스 크라운 유도체는 화학식 1b 또는 1c 구조를 갖는 것이 더욱 바람직하다.
Figure 112006073488404-pat00001
Figure 112006073488404-pat00002
Figure 112006073488404-pat00003
실시예
본 발명의 단백질 나노어레이 제조를 위하여 ANG, 보바인 시럼 알부민(BSA) 및 인테그린 avb3을 케미콘(CA, Temecula, USA)으로부터 구입하여 단백질 나노어레이의 소스 물질로 사용하였다. 안지오제닌 및 인테그린 샘플 용액을 제조하여 PBS 버퍼 용액에서 500 mg/ml 농도로 사용하였다. 단백질 용액은 1 M MgCl2 및 0.1 mM CaCl2 을 포함한다. 메캅토-운데카노익산(MUDA), PBS 용액, RGD (Arg-Gly-Asp) 펩타이드, RGE (Arg-Gly-Glu) 및 다른 시약들은 시그마 케미컬(St. Louis, MO)에서 구 입하였다. Milli-Q 급(>18.2 mΩ/cm) 워터를 샘플 및 버퍼 용액 제조에 사용하였다. 크라운-에테르 모이어티를 가지는 캘릭스[4]아렌(calix[4]arene)] 유도체중의 하나인 ProLinker™은 프로테오젠(Seoul, Korea)으로부터 구입하여 단백질의 고정화에 대한 링커 시스템으로 사용하였다.
실시예 1:
ProLinker™-코팅된 Si 웨이퍼 상의 단백질 나노어레이의 제조
금-코팅된 AFM 캔틸레버(PSIA Co., NSC 14/Cr-Au, Korea)를 금-코팅된 실리콘 웨이퍼의 표면에 단백질 분자를 운반하는 전달체로 사용하였다. 캔틸레버 표면의 친수성을 증가하기 위하여, 금-코팅된 캔틸레버 팁을 에탄올 안에 1 mM 메캅토-운데카노익산(MUDA) 속에서 30분간 침지한 후 상온에서 N2 가스 스트림으로 건조하였다. MUDA로 골드-코팅된 실리콘 캔틸레버를 변형한 후, 상기 캔틸레버 100 mg/ml 농도의 단백질 용액에 담가서 캔틸레버 표면에 단백질을 흡착하도록 1시간 배양하였다. 캔틸레버 표면 상에 단백질 흡착을 통하여 단백질 분자들은 골드-코팅된 실리콘 웨이퍼의 표면으로 전달되어 단백질 나노어레이를 제조하였다.
50 nm Au 증착층을 가지는 실리콘 웨이퍼를 단백질 나노어레이에 대한 기질로 사용하였다. 단백질의 안정한 고정화에 대한 링커 층을 제조하기 위하여, 골드-코팅된 실리콘 웨이퍼를 클로로포름 내의 1 mM ProLinker™ 용액에 1시간 동안 침지하였다. 프로링커™자기 조립 단층구조(self-assembled monolayer;SAM) 제조 후, 아세톤과 에탄올로 세척한 후 상온에서 dried under the N2 가스 스트림하에서 건조 하였다. 컨택드 모드로 캔틸레버 팁 상에 흡착된 단백질들의 나노어레이 패턴닝을 수행한 후 80 % 습도 조건의 상온에서 3시간 동안 단백질칩을 배양하였다. ProLinker™과 단백질 사이의 안정한 상호작용을 위하여 배양 후에, 단백질 나노어레이의 토포로직 이미지들과 높이 프로화일을 넌-컨택트 모드로 얻었다. 모든 단All 백질 나노어레이의 제조 과정은 컨택트 및 넌-컨택트 모드로 AFM XE-100 (PSIA, Sungnam, Korea)로 수행되었다.
실시예 2-3: 상호작용 측정
골드-코팅된 캔틸레버 표면은 클로로포름 내에 1 mM ProLinkerTM 용액으로 1시간 동안 변형하였다. 캔틸레버 표면 상에 프로링커 SAM 형성 후, 단백질 단층을 제조하기 위하여 캔틸레버를 비트로넥틴(실시예 2) 또는 ANG 용액(실시예 3)에 침지하였다. PBS 버퍼로 강한 세척 후 물리적으로 흡착된 과량의 단백질을 화학적으로 흡착된 단층을 제외하곤 제거하였다. N2 스트림 하에서 건조 후, 단백질-변형된 캔틸레버를 넌-컨택트 모드로 상호작용을 측정하기 위하여 적용하였다.비트로넥틴 또는 ANG로 고정화된 캔틸레버 팁은 0.0001 ㎛/분의 접근 속도 및 0.015N/m 스프링 링 상수를 가지고 ProLinker™-코팅된 Si 웨이퍼 상의 인테그린 나노어레이 스팟(실시예 2)또는 항-ANG mAb 웨이퍼 나노어레이 스팟(실시예 3)에 접근하였다. 그리고 후에 캔틸레버 팁과 상기 Si 웨이퍼 모두가 멀리 분리되었을 때, 양 단백질 들 사이의 분리력(unbinding force)을 수치값으로 측정하였다.
상기 실시예의 결과는 다음과 같다. 두 다른 단백질들 사이의 상호작용력의 직접적인 측정을 통하여 단백질 나노어레이 상의 단백질 분자 상호작용의 검출 및 측정을 수행하였다. 고체 기질상에서 나노 스케일로 단백질 분자 결합의 상호작용을 측정하기 위해서 고정화 물질로 인테그린 avb3, BSA, 및 항-ANG mAb을 포함하는 단백질 나노어레이들을 DPN 방법에 의한 ProLinker™-코팅된 Si 웨이퍼 상에 고안하였고(도 1a) 캔틸레버 팁들을 인테그린 avb3의 특정한 리간드인 비트로넥틴과 항-ANG mAb의 항체인 ANG을 포함하는 여러 단백질들로 변형(modify)하였다(도 1b). Si 웨이퍼 상에 단백질 단층의 강한 고정화를 위하여, 상기 골드-코팅된 Si 웨이퍼 상에 자가 조립 단층구조를 형성하기 위하여 ProLinker™을 사용하였다. Au 기질 vs. Au-코팅된 캔틸레버, ProLinker™ SAM vs. Au 코팅된-캔틸레버, ProLinker™ SAM vs. 비트로넥틴-고정화된 캔틸레버를 포함하는 세 가지 다른 실험 조건의 도시적인 그림 및 AFM 이미지를 도 2에서 보여준다. 부가적으로, ProLinker™ 표면에 스팟된 BSA, 인테그린 avb3, 및 항-ANG mAb 나노어레이의 라인 프로화일 및 토포로지컬 AFM 이미지는 단일 단백질 분자의 스팟 높이를 가지는 잘 조절된 규칙적인 배열을 보였다(도 2d, 2e, 및 2f). 항-ANG mAb 나노스팟들은 규칙적인 결정 구조로 배열되었고 20 nm 내의 모든 항체 나노스팟들의 유사한 높이 값들을 나타냈다(도 2f). 항체는 이론적으로 Y-형태를 가지는 매우 특이적인 차원을 가지는 것으로 알려졌다(높이 = 14.5 nm, 폭= 8.5 nm, 두께 = 4.0 nm)[Silverton, E.W., 외 Proc Natl Acad Sci U S A., 1977, 74, 5140-5144; Wadu-Mesthrige, K, 외 , Biophys J. 2001, 80, 1891-1899]. 게다가 고체 표면에 고정화된 항체 차원의 실험 값이 6.5 = 0.9 nm로 보고되었다[K. B. Lee, 외, Science, 2002, 295, 1702-1705]. 따라서 본 발명에서 얻은 항-ANG mAb 나노어레이들의 높이 값은 단일 분자 층을 보여준다.
두 단백질들 사이의 상호작용력의 직접 검출을 조사하기 위하여, AFM 캔틸레버 팁들을 ProLinker™-코팅된 웨이퍼 상에 나노어레이된 다른 캡쳐 단백질들에 해당하는 상호작용하는 단백질로 변형하였다. 많은 수의 스팟 이미지들이 서포트 상의 캡쳐 단백질과 캔틸레버 팁 상의 상호작용하는 단백질 사이의 분리력을 측정하기 위한 캡쳐 단백질 스팟들을 보여준다. 단백질-변형된 캔틸레버 접근을 통한 단백질 나노어레이 상에서 힘 측정 과정의 이미지와 도식적인 그림들이 도 3에 기재된다. 캔틸레버 끝에서 접촉되는 분자들의 수 및 캔틸레버의 구조 차원 사이의 관계는 캔틸레버 타입들에 의존적이다. AFM 캔티레버 NSC36/Cr-Au는 특히 양 단백질 사이의 분리력을 측정하는데 유용하다. ProLinker™ 층으로 모디화이된 캔틸레버 표면은 비트로넥틴 및 안지오제닌을 포함하는 상호작용하는 단백질 단층의 형성에 대한 적당한 베이스로 작용할 수 있다. 이 표면의 특징들은 직접 힘 측정을 사용하여 단백질 나노어레이 상의 분자 상호작용의 검출력에 대한 두 가지 이론적 기초를 제공한다. 먼저, 단백질-변형된 캔틸레버가 상호작용하는 단백질 용액에 단순하게 침지하여 제조되었을 때, ProLinker™ 층은 단순한 세척 과정을 통하여 안정한 단백질 단층의 형성을 보장한다. 캡쳐 (나노어레이) 및 상호작용하는 단백질(캔틸레버 상) 사이의 접촉에 대한 기질에 대한 단백질 나노어레이에 캔틸레버를 접근할 때, 캔틸레버 표면 상의 상호작용하는 단백질의 이 단층 구조는 나노어레이 상의 캡쳐 단백질에 접촉하는 단백질 분자들의 수를 제한할 수 있다(도 3c). 둘째, 본 발명자들이 나노어레이 상의 캡쳐 단백질로부터 상호작용하는 단백질을 떨어트려서 상호작용력을 측정하는 경우에 고정화된 단백질에 대한 ProLinker™ 층의 강한 홀딩이 서포트 또는 캔틸레버 팁 상의 한 방향으로 단백질 분자들을 튀어나가게 하는 것을 보호한다.
힘 커브들(힘-대-거리 곡선)은 전형적으로 캔틸레버의 고정된 말단이 수직적인 방향으로 이동하고 샘플 표면으로부터 멀어질 때 AFM 캔틸레버의 자유 말단의 치우침을 보인다. 측정된 힘 곡선들은 여러 실험 조건에 의하여 그래프적으로 형성되었다. 일반적으로, AFM 힘의 주된 측정은 결합이 파괴되고 캔틸레버가 서포트로부터 자유로와 지는 지점에 정확한 위치 관계이다. 서포트 및 팁 모드로부터 결합이나 부착을 파괴하는데 필요한 상호작용력(탈착력)을 측정하는데 사용될 수 있다. 도 4(b)에서 알 수 있는 바와 같이, 빈 기질(bare Au 표면) vs. 캔틸레버(bare Au 표면) 및 ProLinker™ 표면 vs. 캔틸레버(bare Au 표면) 의 상호작용력은 각각 258 및 415 pN으로 측정되었다. 이 두 실험 조건들은 그들은 각 표면상에서 상호작용이 없거나 매우 적기에 음성 대조군으로 사용되었다. 인테그린과 비트로넥틴 사이의 분리력은 1087 pN로 계산되고 이 값은 항-ANG mAb과 ANG을 사용한 항체-항원 상호작용의 값(1028 pN)과 유사하였다. 그러나 음성 대조군으로 사용된 BSA -비트로넥틴 상호작용은 인테그린-비트로넥틴의 값(1087 pN)보다 매우 적은 상호작용 값(643 pN)을 나타내었다. 상호작용력의 수치 값은 ProLinker™ 표면 vs. 비트로넥틴 변형된 캔틸레버의 경우에 가장 높았다(1359 pN). 이 결과는 것은 ProLinker™ 층이 단백질 표면의 아민 잔기를 강하게 잡고 있다는 것을 나타내고, ProLinker™ 층과 관련되 우리의 상기 두 가정을 증명하는 것이다. 이 결과들은 단백질 나노어레이 상 의 인테그린 및 비트로넥틴 또는 항-ANG mAb 및 ANG 사이의 분자적 상호작용이 강하고 특이적인 결합 사건이고 따라서 AFM을 사용한 단백질 나노어레이 상에서 직접적인 힘 측정을 통하여 BSA-비트로넥틴과 같은 다른 비 특이적인 상호작용으로부터 특이적인 단백질 상호작용들을 구별할 수 있다. 표 1은 분리 이벤트 동안에 상호 작용력 및 높이(z축 거리)의 측정된 수치 값을 보여준다. 높이 값은 분리 이벤트 동안에 힘 제로 지점(기준선과 같은)과 분리 지점 사이에서 거리 차이를 의미한다. 표 1에서 나타난 바와 같이, 상호작용력과 높이의 측정 값들은 아주 작은 오차 범위를 가진다. 이들 결과들은 프로브 및 타겟 단백질 사이의 분자적 상호작용의 측정이 성공적으로 이루어졌다는 것을 의미한다. 한편 분리 이벤트 동안에 z-축 높이는 ProLinker™ 표면 vs. 비트로넥틴의 경우가 가장 높았다(44.1 nm). 빈 기질(Au 표면) vs. 캔틸레버 (Au 표면)과 ProLinker™ 표면 vs. 캔틸레버 (Au 표면)의 경우의 높이 값은 각각 13.6과 17.3 nm였다. z-축 높이 값은 분리 이벤트 동안에 상호작용력이 증가함에 따라서 증가하였다. 인테그린 vs. 비트로넥틴의 경우에, z-축 높이 값은 예외적으로 약간 높았다(40.5 nm). 특히, 인테그린 vs. 비트로넥틴에서 z-축 높이 값은 비록 그들은 상호작용력이 비슷한 값을 가지지만 항체 vs. 항원(안지오제닌)의 경우보다 더 높다. 이들 결과들은 이들 두 프로브 및 타겟 단백질 사이의 구조적 차이에 의하여 설명될 수 있다. 인테그린 vs. 비트로넥틴의 경우에는, 이들 두 단백질들이 약간 풀린 구조를 가지지만, 항체 및 BSA는 더 조밀하고 구형 구조를 가진다. 따라서 비록 그들은 상호작용력이 비슷한 값을 가지지만 높이 값에는 차이가 있다. 반면에, 상호작용력(pN)과 높이(z-축 거리, nm)의 측정 값들은 정량적 비교 및 용이한 이해를 위한 분리 에너지(kcal/mol)와 수소 결합의 수에 용이하게 전용할 수 있다.
Figure 112006073488404-pat00004
상기 표에서 PRO, INT, VITRO, 및 ANG는 각각 ProLinker™, 인테그린, 비트로넥틴 및 안지오제닌을 의미하고, △ 높이 값은 분리 이벤트 동안에 힘 제로 지점(기준선과 같은)과 분리 지점 사이에서 z-축 상의 높이 차이를 의미한다. Ed 는 단백질 나노어레이 상에서 타겟 분자들의 분리 에너지를 나타낸다.
먼저, 분자적 상호작용의 단위(N·m)은 단순한 변환을 통하여 직접 에너지 단위 (J 또는 cal)로 전용될 수 있다. 에너지 단위 정의에 기초하여, 1 pn·nm은 23.9x10-23 cal와 같다. 각 실험 조건에 대한 변환된 분리 에너지를 표 1에 나타내었다. 일반적으로, 수소 결합은 1에서 3 kcal/mol의 결합 에너지를 가지는 것으로 알려졌다. 이 사실에 기초하여 아보가드로 수로 나눈 후에, 본 발명자들은 그것을 수소 결합의 수로 전용할 수 있었고 분자적 상호작용 정도의 상대적 차이를 비교하려하였다.
DPN에 의한 단백질 나노어레이 및 직접 힘 측정을 사용한 단순 검출 방법에 기초하여, 단일 분자 수준에서 단백질들의 분자적 상호작용을 분석하는데 적용할 수 있다. 또한 이 기술은 제한된 생물학적 샘플에 대한 나노-스팟 당 매우 적은 양의 단백질 용액(피코리터 수준)을 필요로 한다. 또 이 기술은 단백질 상호작용의 이미지를 얻기 위한 세척 및 재스캐닝에 대한 추가적인 복합체 과정을 필요로 하지 않고 본 발명의 기술은 스캐닝 모드에서 전형적인 DPN 방법보다 더 단순하고 빠르다. 이러한 점에서 본 발명은 매우 병렬(parallel) 형태로 단백질들의 다중 상호작용들을 검출하는데 사용될 수 있다. 따라서 단백질 나노어레이에 대한 직접 힘 측정에 기초한 본 발명의 원리는 DPN에 의한 단백질 나노어레이를 새로운 약물의 개발을 위한 고성능 스캐닝(HTS)에 적용할 수 있다.
본 발명에서 본 발명자들은 ProLinkerTM 코팅된 Au 표면상에 인테그린, BSA 및 항-안지오제닌 Ab를 사용하여 단백질 나노어레이를 고안하였다. 또 본 발명자들은 단백질 나노어레이들 상에 여러 단백질들(인테그린, BSA 및 Ab)과 그들의 카운 터 파트 (리간드 또는 항원) 사이의 상호작용력을 측정하였다. 이들 결과들은 단백질 나노어레이 상에서 단백질-단백질 상호작용은 힘 측정에 의하여 직접적으로 검출될 수 있다는 것을 나타낸다. 특히 단백질 나노어레이에서 직접 힘 측정은 단백질-단백질 상호작용에 대한 연구 및 고성능 스캐닝(HTS)에 대한 새로운 검출 방법을 제공한다. 상호작용력을 측정하는 본 발명의 방법은 단백질 나노어레이 상의 고상 단백질-단백질 상호작용의 고성능 분석에 대한 나노스캐일에서 새로운 향상된 검출 방법이고, 이것은 단백질 칩을 더욱 축소한 형태이며 무 표지로 단일 분자의 단백질 상호작용을 측정할 수 있는 원천 기술이며, 더 나아가 나노 스캐일로 단백질의 High-throughput multiple analysis가 가능한 기반 기술이다.

Claims (6)

  1. a)골드 코팅된 캔틸레버 표면에 크라운-에테르 모이어티를 가지는 캘릭스[4]아렌(calix[4]arene)] 유도체 용액를 처리하는 단계;
    b)상기 캔틸레버 표면 상에 크라운-에테르 모이어티를 가지는 캘릭스[4]아렌(calix[4]arene)] 유도체 자가 조립 단층구조(SAM) 형성 후 캔틸레버를 단백질 단층 형성을 위하여 대상 단백질 용액에 침지하는 단계;
    c)버퍼로 세척하여 물리적으로 흡착된 과량의 단백질을 제거하는 단계;
    d) 단백질 모디화이된 캔틸레버를 건조하여 상기 단백질로 모디화인된 캔틸레버 팁을 제조하는 단계;
    e) 상기 단백질로 모디화인된 캔틸레버 팁을 크라운-에테르 모이어티를 가지는 캘릭스[4]아렌(calix[4]arene)] 유도체 코팅된 웨이퍼 상의 타겟 단백질 나노어레이 또는 상기 고정화된 단백질들의 항체 나노어레이 스팟에 접근하는 단계;및
    f) 캔틸레버 팁과 웨이퍼 모두가 분리될 때 양 단백질 사이의 분리력을 측정하는 것을 포함하는 단백질 나노어레이 상에서 단백질-단백질 상호작용의 고성능 분석법.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 대상 단백질은 타겟 단백질과 상호작용할 수 있는 특징을 가지는 단백질인 것을 특징으로 하는 단백질 나노어레이 상에서 단백질-단백질 상호작용의 고성능 분석법.
  3. 제 1항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 대상 단백질은 보바인 시럼 알부민, 비트로넥틴 또는 안지오제닌인 것을 특징으로 하는 단백질 나노어레이 상에서 단백질-단백질 상호작용의 고성능 분석법.
  4. 제 1항에 있어서, 상기 타겟 단백질은 대상 단백질들의 항체인 것을 특징으로 하는 단백질 나노어레이 상에서 단백질-단백질 상호작용의 고성능 분석법.
  5. 제 4항에 있어서, 상기 타겟 단백질은 안테그린 또는 항-안지오제닌 항체인 것을 특징으로 하는 단백질 나노어레이 상에서 단백질-단백질 상호작용의 고성능 분석법.
  6. a)골드 코팅된 캔틸레버 표면에 크라운-에테르 모이어티를 가지는 캘릭스[4]아렌(calix[4]arene)] 유도체 용액를 처리하는 단계;
    b)상기 캔틸레버 표면 상에 크라운-에테르 모이어티를 가지는 캘릭스[4]아렌(calix[4]arene)] 유도체 자가 조립 단층구조(SAM) 형성 후 캔틸레버를 단백질 단층 형성을 위하여 대상 단백질 용액에 침지하는 단계;
    c)버퍼로 세척하여 물리적으로 흡착된 과량의 단백질을 제거하는 단계; 및
    d)단백질 모디화이된 캔틸레버를 건조하여 상기 단백질로 모디화인된 캔틸레버 팁.
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