CN109030815B - 一种用于检测液相蛋白质交互作用的蛋白质芯片及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于检测液相蛋白质交互作用的蛋白质芯片及其制备方法和应用，其中所述蛋白质芯片是在固相载体的表面点阵固定有探针；所述固相载体为氨基十六烷硫醇和活化槐糖脂化学修饰的金箔芯片；所述探针包括受体sCD25蛋白、配体IL‑2蛋白、sCD25抗体或IL‑2抗体。本发明蛋白质芯片具有高特异性和敏感性，其可视检测限与ELISA法测得抗原的最低检测限近乎相同，且其可以实现高通量联合检测，本发明旨在研发一种新方法用于液相中两种蛋白质交互作用的检测。
Description
技术领域
本发明涉及一种用于检测液相蛋白质交互作用的蛋白质芯片及其制备方法和应用，属于生物技术领域。
背景技术
蛋白质相互作用已经在两种或更多种表征一种细胞或不同细胞的蛋白质之间被广泛认可。蛋白质之间的相互作用是信号转导的基本特征，并且对细胞水平上的发育和生理功能至关重要。近几十年来，大量蛋白质分析系统已被开发用于各种应用，包括免疫沉淀(IP)，免疫共沉淀(CO-IP)和酶联免疫吸附测定(ELISA)。这些工具中的每一种都具有明显的优势和局限性，但很少用于解决研究液相蛋白质相互作用的生物学或临床问题。
以IL-2和sCD25为例，酶联免疫吸附测定法(ELISA)和化学发光免疫测定法(CLIA)用于实验室血清sCD25的检测，而与ELISA相似的细胞计数珠阵列系统(CBA)人类Th1/Th2细胞因子试剂盒用于检测血清IL-2。CLIA作为一种常规的临床方法，对于sCD25检测具有参考价值，但是在样本测试批次中经常会有错误发生。更重要的是，这些技术不能同时在一个实验中对多个生物分子进行高通量并行比较分析，而具有自组装单分子层的生物芯片可以提供高通量筛选平台来检测来自血清的任何蛋白质之间的交互作用。
发明内容
本发明旨在提供一种用于检测液相蛋白质交互作用的蛋白质芯片及其制备方法和应用，以用于血清中受体sCD25和配体IL-2蛋白单体以及sCD25-IL-2复合体的检测。
本发明蛋白质芯片具有高特异性和敏感性，其可视检测限与ELISA法测得抗原的最低检测限近乎相同，且其可以实现高通量联合检测。
本发明用于检测液相蛋白质交互作用的蛋白质芯片，是在固相载体的表面点阵固定有探针；所述固相载体为氨基十六烷硫醇和活化槐糖脂化学修饰的金箔芯片。
槐糖脂酸化后的羧基用EDC和NHS活化后与氨基十六烷硫醇进行连接。
所述探针包括受体sCD25蛋白、配体IL-2蛋白、sCD25抗体或IL-2抗体。
本发明用于检测液相蛋白质交互作用的蛋白质芯片的制备方法，包括如下步骤：
步骤1：固相载体的制备
将1.45mg的氨基十六烷硫醇溶于6ml无水乙醇中获得修饰液1；将NHS和EDC溶于无菌水中作为修饰液2，在所述修饰液2中EDC浓度为150mM，NHS的浓度为50mM；50ug/ml的槐糖脂溶液作为修饰液3；
对金箔芯片进行清洗后，浸入所述修饰液1中，黑暗条件下室温摇荡孵育8-12h，氨基十六烷硫醇通过Au-S键组装到金箔芯片上，取出后用无水乙醇溶液清洗、氮气吹干；然后将所述修饰液2倒入修饰液3中，室温下反应1小时后点样于所得芯片上并于室温下孵育3小时，取出后用PBST溶液清洗、氮气吹干，获得固相载体；槐糖脂末端含有六个游离的羟基，可以增加其敏感性。
对金箔芯片进行清洗的过程如下：
将金箔芯片浸入丙酮中浸泡1小时，然后置于H2O、氨水(25wt％)及H2O2溶液(30wt％)按体积比5：1：1混合构成的TL1清洗液中，82℃下水浴6分钟，清洗2次，取出后依次用超纯水和无水乙醇清洗，最后用氮气吹干。
所述修饰液2和修饰液3的体积比为1:2。
步骤2：探针溶液的配制
所述探针溶液包括受体sCD25蛋白溶液、配体IL-2蛋白溶液、sCD25抗体溶液或IL-2抗体溶液，配制过程如下：
将受体sCD25蛋白溶于PBST-BSA溶液中，配制浓度≥6.25μg/ml的受体sCD25蛋白溶液；
将配体IL-2蛋白溶于0.1M BSA的乙酸溶液中，配制浓度≥6.25μg/ml的配体IL-2蛋白溶液；
将sCD25鼠抗人抗体溶于PBST-BSA溶液中，配制浓度≥25μg/ml的sCD25抗体溶液；
将IL-2兔抗人抗体溶于PBST-BSA溶液中，配制浓度≥12.5μg/ml的IL-2抗体溶液；
步骤3：探针的包被
将所述探针溶液点样于步骤1获得的固相载体上，室温下孵育2小时，PBST溶液清洗、氮气吹干，然后将PBST-BSA溶液点样于所得固相载体上，室温下孵育1小时，以封闭剩余的已活化羧基，最后用PBST溶液清洗、氮气吹干，即可获得探针包被的蛋白质芯片。
所述PBST溶液是由浓度0.01M、pH＝7.4的磷酸缓冲液PBS与Tween 20混合配制而成的，在所述PBST溶液中Tween20的体积浓度为0.1％。
所述PBST-BSA溶液是由浓度0.01M、pH＝7.4的磷酸缓冲液PBS、Tween20及胎牛血清BSA混合构成，在所述PBST-BSA溶液中Tween20的体积浓度为0.1％，胎牛血清BSA的质量浓度为0.1％。
本发明蛋白质芯片包括配体IL-2探针包被的蛋白质芯片、受体sCD25包被的蛋白质芯片、sCD25抗体包被的蛋白质芯片以及IL-2抗体包被的蛋白质芯片。本发明蛋白质芯片可用于人血清中游离的受体sCD25、配体IL-2蛋白以及sCD25-IL-2复合体和IL-2-sCD25复合体的检测。
本发明蛋白质芯片的应用方法之一，包括如下步骤：
1、将待检测患者血清稀释4-40倍，然后分别点样于配体IL-2探针包被的蛋白质芯片上，常温条件下孵育1小时，取出后用PBST溶液清洗、氮气吹干；
2、将Cy3标记驴抗羊IgG抗体溶于PBST-BSA溶液中，构成浓度2.5μg/ml的IgG荧光二抗溶液；
3、将浓度不低于25μg/ml的sCD25羊抗人多克隆抗体溶液(溶剂是PBST-BSA溶液)点样于步骤1获得的孵育过血清的配体IL-2探针包被的蛋白质芯片上，常温下孵育1小时；随后将IgG荧光二抗溶液点样于配体IL-2探针包被的蛋白质芯片上，常温下避光孵育1小时，然后用PBST溶液清洗、氮气吹干。通过芯片扫描仪进行扫描检测，若包被配体IL-2蛋白探针处呈现荧光色，则表明待测患者血清中含有游离受体sCD25蛋白并与包被配体IL-2蛋白探针进行了反应；若包被配体IL-2蛋白探针处无荧光色，则表明待测患者血清中不含有受体sCD25蛋白。
本发明蛋白质芯片的应用方法之二，包括如下步骤：
1、将待检测患者血清稀释4-40倍，然后分别点样于受体sCD25包被的蛋白质芯片上，常温条件下孵育1小时，取出后用PBST溶液清洗、氮气吹干；
2、将浓度不低于12.5μg/ml的Alexa Fluor@647标记IL-2兔抗人单克隆抗体溶液点样于孵育过血清的受体sCD25包被的蛋白质芯片上，常温下避光孵育1小时，然后用PBST溶液清洗、氮气吹干。通过芯片扫描仪进行扫描检测，若包被受体sCD25蛋白探针处呈现荧光色，则表明待测患者血清中游离配体IL-2蛋白并与包被受体sCD25蛋白探针进行了反应，若包被受体sCD25蛋白探针处无荧光色，则表明待测患者血清中不含有配体IL-2蛋白。
本发明蛋白质芯片的应用方法之三，包括如下步骤：
1、将待检测患者血清稀释4-40倍，然后分别点样于sCD25抗体包被的蛋白质芯片上，常温条件下孵育1小时，取出后用PBST溶液清洗、氮气吹干；
2、将浓度不低于12.5μg/ml的Alexa Fluor@647标记IL-2抗体溶液点样于孵育过血清的sCD25抗体包被的蛋白质芯片上，常温下避光孵育1小时，然后用PBST溶液清洗、氮气吹干。通过芯片扫描仪进行扫描检测，若包被sCD25抗体探针处呈现荧光色，则待测患者血清中含有sCD25-IL-2复合体，若包被sCD25抗原探针处无荧光色，则待测患者血清中不含有sCD25-IL-2复合体。
本发明蛋白质芯片的应用方法之四，包括如下步骤：
1、将待检测患者血清稀释4-40倍，然后分别点样于IL-2抗体包被的蛋白质芯片上，常温条件下孵育1小时，取出后用PBST溶液清洗、氮气吹干；
2、将Cy3标记驴抗羊IgG抗体溶于PBST-BSA溶液中，构成浓度2.5μg/ml的IgG荧光二抗溶液；
3、将浓度不低于25μg/ml的sCD25抗体溶液点样于孵育过血清的IL-2抗体包被的蛋白质芯片上，常温下孵育1小时；随后将步骤2配制的IgG荧光二抗溶液点样于蛋白质芯片上，常温下避光孵育1小时，然后用PBST溶液清洗、氮气吹干。通过芯片扫描仪进行扫描检测，若包被IL-2抗体探针处呈现荧光色，则待测患者血清中含有IL-2-sCD25复合体，若包被IL-2抗体探针处无荧光色，则待测患者血清中不含有IL-2-sCD25复合体。
在使用时，还应同时将健康人血清以及PBST-BSA溶液同时点样于同一蛋白质芯片上，分别作为阴性对照和空白对照。
本发明在片模拟免疫沉淀法和免疫共沉淀技术进行两种蛋白质之间的交互作用检测。设计二种生物芯片血清学检测策略，一种是在生物芯片上包被已知受体sCD25蛋白，用于检测液相中潜在游离配体IL-2蛋白或者包被已知配体IL-2蛋白，用于检测液相中潜在游离受体sCD25蛋白；另外一种是在生物芯片上包被sCD25抗体作为捕获抗体，以配体IL-2抗体作为检测抗体或者包被IL-2抗体作为捕获抗体，以受体sCD25抗体作为检测抗体，用于检测液相中潜在的受体配体复合物。对比传统的免疫沉淀和免疫共沉淀技术方法，我们可以直接在片进行免疫沉淀和免疫血清学反应，靶向从液相待检测物中获得所需蛋白质，为临床及基础实验室蛋白质检测与研究提供了一种新的实验途径。
与已有技术相比，本发明的有益效果体现在：
一方面，本发明制备氨基十六烷硫醇结合活化槐糖脂的新型化学修饰的金箔芯片作为基底。金箔与化学物质的结合与传统玻璃片和硅片相比更加牢固，并且金箔的生物亲和度较低，不易与基因或者蛋白质等物质产生非特异性吸附。氨基十六烷硫醇结合活化槐糖脂新型化学修饰利用多个游离的羟基末端与蛋白质结合，结合稳定且具有高敏感性。
另一方面，本发明具有通过在液相微量已稀释血清样本中检测两种蛋白质的交互作用显著优势。适用于利用受体与配体之间的交互作用在液相待测物中进行反应，可以对同一液相待测物中不同蛋白质之间的交互作用或者不同待测物中同一对待测物的交互作用进行检测。本发明以高灵敏度和特异性(SE/SP)为目标，检测时间短，简便易行，省去了细胞培养、裂解、以及转模的过程，即可获得所系特定蛋白质。
另外，本发明在片模拟了免疫沉淀技术，与传统的免疫沉淀技术相比具有一定的相似性，但省略了免疫沉淀技术所需的细胞培养时间以及细胞裂解及转模过程而直接在液相待检物(血清)中进行受体配体直接的反应以及受体配体复合物的检测，即在化学修饰的生物芯片上包被已知的抗人配体或抗人受体蛋白抗体，与液相(如血清、体液、细胞裂解液等)中潜在的游离受体-配体复合物进行特异性结合，这种共沉淀在生物芯片上的受体-配体复合物可以通过与其匹配的抗人受体或抗人配体特异性免疫学抗体所识别和显现。
附图说明
图1为原子力显微镜扫描化学修饰前后金箔芯片平面表征；其中图1a为2μm视野下原子力显微镜观察未修饰金箔芯片(清洗后的金箔芯片))的表面形貌；图1b为修饰后金箔芯片(即所得固相载体的表面形貌。
图2为受体sCD25蛋白在芯片上检测限；其中，图2a为受体sCD25蛋白在芯片上检测限所得荧光扫描图；图2b为所得荧光强度曲线图。
图3为配体IL-2蛋白在芯片上检测限；其中，图3a为配体IL-2蛋白在芯片上检测限所得荧光扫描图；图3b为所得荧光强度曲线图。
图4为受体sCD25蛋白检测实验中，血清稀释度对荧光强度的影响。
图5为受体sCD25和配体IL-2蛋白阻断的特异性实验。
图6为包被受体sCD25蛋白检测血清中配体IL-2蛋白与包被配体IL-2检测血清中受体sCD25血清结果图。其中，图6a为包被受体sCD25检测血清中配体IL-2扫描结果，图6b为包被配体IL-2检测血清中受体sCD25扫描结果。
图7为包被抗受体sCD25抗体检测血清中受体配体复合物与包被抗配体IL-2抗体检测血清中受体配体复合物血清结果图。其中，图7a为包被抗受体sCD25抗体检测血清中受体配体复合物扫描结果，图7b为包被抗配体IL-2抗体检测血清中受体配体复合体扫描结果。
具体实施方式
本发明各实施例中所用材料和试剂的来源与准备如下：
1、金箔芯片：
以玻璃片为基底、覆盖一层0.1μm厚度的纯金(纯度99.9％)的金箔芯片来自Interactiva公司(德国，乌尔姆)，其上为区域化的50μm的TEFLON膜的阵列(96孔*2，8行*12列)，阵列孔径为1.25mm。
2、表面化学修饰：
Sophorolipid(SL)购自Soliance(法国)。氨基十六烷硫醇购自东仁(日本)N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和N-(3-二甲氨基丙基)-N-乙基碳二亚胺(EDC)购自Sigma-Aldrich公司(西班牙)。
将1.45mg的氨基十六烷硫醇溶于6ml的无水乙醇为修饰液1；将NHS和EDC溶于无菌水中作为修饰液2，在所述修饰液2中EDC浓度为150mM、NHS浓度为50mM；50ug/ml的槐糖脂为修饰液3.
3、抗原、抗体、荧光素类
受体sCD25蛋白购自R&D(美国)；配体IL-2蛋白购自Abcam(USA)；Cy3标记驴抗人及Cy3标记驴抗羊IgG抗体购自Sangon公司；磷酸缓冲液(PBS)、Tween20及胎牛血清(BSA)均购自SIGMA-ALDRICH公司。
4、PBST溶液：
将商品化PBS粉末溶解在去离子水中，形成浓度0.01M、pH＝7.4的磷酸缓冲液PBS；然后加入Tween-20，混匀，获得PBST溶液，在所述PBST溶液中Tween20的体积浓度为0.1％。
5、PBST-BSA溶液：
配制：取BSA(200mg/ml)溶于PBST溶液中，震荡，静置，得PBST-BSA溶液(BSA质量浓度为0.1％)。
6、所用血清样本
本发明研发中在片模拟免疫沉淀法，即包被受体sCD25用于血清中已知游离的配体IL-2蛋白或者包被配体IL-2用于血清中已知游离的受体sCD25蛋白以及包被sCD25或者IL-2抗体检测血清中受体配体复合体，并收集门诊体检结果阴性样本作为对照组。所有血清分装并储存在-80℃以保持蛋白活性，避免反复冻融。
实施例1：分子自组装单层形成和探针固化
将金箔芯片浸入丙酮中浸泡1小时后，H2O、NH3及H2O2按体积比5：1：1混合构成TL1清洗液，，放入盛有TL1清洗液的不锈钢清洗盒内，82℃水浴6分钟，清洗2次，取出之后用超纯水冲洗4-5次，再用无水乙醇清洗3次，最后用氮气吹干，置于干净密闭芯片盒中，待用。
将1.45mg的氨基十六烷硫醇溶于6ml的无水乙醇为修饰液1；将NHS和EDC溶于无菌水中作为修饰液2，在所述修饰液2中EDC浓度为150mM、NHS浓度为50mM；50ug/ml的槐糖脂为修饰液3。
对金箔芯片进行清洗后，浸入所述修饰液1中，黑暗条件下室温摇荡孵育过夜，氨基十六烷硫醇通过Au-S键组装到金芯片，槐糖脂末端含有六个游离的羟基，可以增加其敏感性；取出后用PBST溶液清洗、氮气吹干；修饰的芯片可保存数月。
图1(a)为2μm视野下原子力显微镜观察未修饰金箔芯片(清洗后的金箔芯片))的表面形貌，图1(b)为修饰后金箔芯片(即所得固相载体的表面形貌。用Nanoscope分析软件进行AFM离线数据分析(Rq是软件中显示粗糙度的参数)，可知氨基十六烷硫醇结合活化槐糖脂修饰的金表面(Rq＝1.90nm)比未修饰表面粗糙(Rq＝0.922nm)。表明修饰后化学基团共价连接到金表面上，使其更易于蛋白质连接，增加了检测灵敏度。
实施例2：质控实验
在下述所有实验中，以pH为7.4的0.01M PBST-0.1％BSA作为受体sCD25、抗体及血清稀释的溶剂，0.1M BSA的乙酸溶液为配体IL-2蛋白的溶剂。芯片在湿盒中室温孵育，每一步骤结束后，未结合的物质都会被PBST溶液清洗掉，并用氮气干燥芯片以便下一步孵育。
1、受体sCD25蛋白检测限
为了确定受体sCD25蛋白检测的最低浓度。将商品化的配体IL-2蛋白按经验浓度稀释为6.25ug/ml，实施例1所获得的固相载体上(每点1μl，每个浓度点样2个复孔)，使固相载体上包被配体IL-2蛋白探针，常温条件下孵育抗体2h，取出后用PBST溶液清洗、氮气吹干。50μg/ml至0.049μg/ml通过PBST-BSA梯度稀释的受体sCD25蛋白溶液(共11个浓度)和空白对照PBST-BSA缓冲液分别点样孵育于配体IL-2蛋白探针上，室温孵育1h；取出后将芯片浸没在0.01M的PBST-BSA溶液中1小时，以封闭剩余的羟基，进一步有效避免实验的非特异性吸附；最后再用PBST溶液清洗、氮气吹干。
将25ug/ml的羊抗人sCD25抗体孵育于上述芯片表面，孵育1小时。PBST清洗氮气吹干后将2.5μg/ml的Cy3驴抗羊IgG荧光二抗溶液点样与前述孵育有抗体的IL-2抗原探针之上，并避光孵育1小时，用于捕获特异性目的检测抗体产生的荧光信号，取出用PBST溶液清洗、氮气吹干。通过芯片扫描仪LuxscanTM 10K-A(博奥有限公司，中国)对以上蛋白质芯片进行扫描检测，结果显示于图2(a)。图2(b)是以图2(a)中每一列同一浓度所得2个荧光强度的平均值为纵坐标、以受体sCD25蛋白浓度为横坐标绘制的荧光强度曲线图。从图中可以看出，随着受体sCD25蛋白浓度的降低，荧光值也降低。可以看到孵育配体IL-2检测受体sCD25蛋白可以达到78pg/ml。
2、配体IL-2蛋白检测限
类似的，为了确定配体IL-2蛋白检测最低浓度，将商品化的受体sCD25蛋白按经验浓度稀释为6.25ug/ml，实施例1所获得的固相载体上(每点1μL，每个浓度点样2个复孔)，使固相载体上包被受体sCD25蛋白探针，常温条件下孵育抗体2小时，取出后用PBST溶液清洗、氮气吹干。用PBST-BSA缓冲液的平均荧光强度作为背景值。将50-0.049μg/ml通过0.1M的乙酸-BSA梯度稀释的配体IL-2蛋白溶液(共11个浓度)和空白对照0.1M的乙酸-BSA缓冲液分别点样孵育于受体sCD25蛋白探针上，室温孵育1h，；取出后将芯片浸没在0.01M的BSA中1小时，以封闭剩余的羟基，进一步有效避免实验的非特异性吸附；最后再用PBST溶液清洗、氮气吹干。
将Alexa Fluor@647标记的IL-2兔抗人荧光抗体稀释于PBST-BSA成12.5ug/ml溶液，点样于上述芯片，避光进行操作，室温孵育1小时。取出用PBST溶液清洗、氮气吹干。通过芯片扫描仪LuxscanTM 10K-A(博奥有限公司，中国)对以上蛋白质芯片进行扫描检测，结果显示于图3(a)。图3(b)是以图3(a)中每一列同一浓度所得2个荧光强度的平均值为纵坐标、以配体IL-2蛋白浓度为横坐标绘制的荧光强度曲线图。从图中可以看出，孵育受体sCD25蛋白检测配体IL-2，其检测限达156pg/ml以上。
3、血清稀释度质控
任意取临床确诊抗体阳性和临床确诊抗体阴性的血清样本各三例。三例临床结果阳性血清等量混匀和三例临床结果阴性血清等量混匀后，分别以不同比例稀释(1:2、1:4、1:8、1:16、1:32、1:64、1:128、1:256、1:512、1:1028和1:2056)，然后点样到含有受体sCD25蛋白探针的芯片和配体IL-2蛋白探针的芯片上，0.01M PBST-0.1％BSA缓冲液作为空白对照。常温条件下孵育一小时，然后用PBST清洗氮气吹干。将已稀释的25ug/ml羊抗人sCD25抗体孵育于配体IL-2蛋白包被的蛋白质芯片上，12.5ug/ml的Alexa Fluor@647标记的IL-2兔抗人荧光抗体点样于受体sCD25蛋白包被的蛋白质芯片，各孵育1小时。其中，受体sCD25蛋白包被的芯片避光孵育。
图4受体sCD25蛋白实验的血清稀释度优化结果。图中(a)：上面3排是阳性组(任取3例阳性病例)，下面3排是对照组(任取3例阴性对照)；图中(b)是以病例组荧光平均值与对照组荧光平均值的比值作为纵坐标、以稀释度作为横坐标绘制的曲线图，设定比值大于3的稀释度可以用于实验检测。从图中可以看出，血清最佳稀释度应在稀释4倍到40倍之间。
实施例3：抗体阻断试验和芯片特异性
在基于受体配体的生物芯片免疫实验中，用过量受体饱和血清配体结合位点或者过来配体饱和血清受体结合位点进行阻断的预处理，来检测受体配体结合的特异性。
任意取三例临床CLIA诊断受体sCD25蛋白阳性的血清按质控优化条件混匀稀释，分装于5个PCR管。其中四管受体sCD25在孵育前，预先与0.1μg/ml、1μg/ml、10μg/ml和100μg/ml的对应配体IL-2充分反应1小时，余下一管作阳性对照。
此外，混匀稀释三例确定受体sCD25阴性的血清作为阴性对照。
配体IL-2实验也进行相似处理。
图5为受体与配体反应阻断的结果，第一列为阴性对照，第二列为阳性对照，后四列为不同浓度受体配体block的阳性血清，显示阳性受体sCD25和配体IL-2血清可以被相应配体或者受体完全阻断，特异性受体或者配体为探针的生物芯片于血清中相对应的配体或者受体的结合检测是特异性的。
实施例4：包被受体sCD25蛋白探针与血清中已知游离的配体IL-2反应或者包被配体IL-2蛋白探针与血清中已知游离的受体sCD25反应
将经验浓度6.25μg/ml受体sCD25蛋白包被于蛋白质芯片表面，孵育2小时。0.01MPBST缓冲液(pH7.4)漂洗，氮气吹干。将收集到的77例HLH患者血清按照1:4用0.01M PBST-0.1％BSA缓冲液(pH7.4)进行稀释。加样于sCD25重组蛋白包被的芯片表面，挑选44例已知阴性血清作为阴性对照。患者血清和已知阴性血清分别设置3个复孔。另外，使用0.01MPBST-0.1％BSA缓冲液(pH7.4)作为空白对照。室温，孵育1小时。0.01M PBST缓冲液(pH7.4)漂洗，氮气吹干。加样12.5μg/ml Alexa Fluor@647标记兔抗人IL-2抗体于芯片表面，室温避光，孵育1小时。0.01M PBST缓冲液(pH7.4)漂洗，氮气吹干后入芯片扫描仪进行扫描，得到结果于图6a。类似的，将6.25μg/ml配体IL-2重组蛋白包被于化学修饰后的芯片表面，室温，孵育2小时。0.01M PBST缓冲液(pH7.4)漂洗，氮气吹干。将经1:20稀释的77例HLH血清加样于芯片表面，室温，孵育1小时。0.01M PBST缓冲液(pH7.4)漂洗，氮气吹干。加样25μg/ml羊抗人sCD25抗体于芯片表面，室温，孵育1小时。最后，将2.5μg/ml Cy3标记驴抗羊IgG抗体孵育于芯片上，避光，室温，孵育1小时。0.01M PBST缓冲液(pH7.4)漂洗，氮气吹干后入芯片扫描仪进行扫描，得到结果于图6b。
实施例5：包被受体sCD25抗体和配体IL-2抗体检测血清中受体配体复合物
25μg/ml兔抗人IL-2多克隆抗体或鼠抗人sCD25单克隆抗体包被于化学修饰后芯片表面，室温，孵育2小时。0.01M PBST缓冲液(pH7.4)漂洗，氮气吹干。加样稀释后的患者血清和已知阴性血清于芯片表面，室温，孵育1小时。0.01M PBST缓冲液(pH7.4)漂洗，氮气吹干。加样25μg/ml羊抗人sCD25多克隆抗体或12.5μg/ml Fluor@647标记兔抗人IL-2单克隆抗体于芯片表面，室温，孵育1小时。IL-2单抗孵育于芯片表面，室温，避光，孵育1小时，0.01M PBST缓冲液(pH7.4)漂洗，氮气吹干，经芯片扫描仪扫描得结果于图7a。最后，将2.5μg/ml Cy3标记驴抗羊IgG抗体点于sCD25检测芯片上，避光室温，孵育1小时。0.01M PBST缓冲液(pH7.4)漂洗，氮气吹干，经芯片扫描仪扫描得结果于图7b。
Claims (7)
1.一种用于检测液相蛋白质交互作用的蛋白质芯片，其特征在于：
所述蛋白质芯片是在固相载体的表面点阵固定有探针；所述固相载体为氨基十六烷硫醇和活化槐糖脂化学修饰的金箔芯片；
所述探针包括受体sCD25蛋白、配体IL-2蛋白、sCD25抗体或IL-2抗体；
槐糖脂酸化后的羧基用EDC和NHS活化后与氨基十六烷硫醇进行连接；
所述用于检测液相蛋白质交互作用的蛋白质芯片是通过包括如下步骤的方法制备获得：
步骤1：固相载体的制备
将1.45mg的氨基十六烷硫醇溶于6ml无水乙醇中获得修饰液1；将NHS和EDC溶于无菌水中作为修饰液2，在所述修饰液2中EDC浓度为150mM，NHS的浓度为50mM；50ug/ml的槐糖脂溶液作为修饰液3；
对金箔芯片进行清洗后，浸入所述修饰液1中，黑暗条件下室温摇荡孵育8-12h，取出后用无水乙醇溶液清洗、氮气吹干；然后将所述修饰液2倒入修饰液3中，室温下反应1小时后点样于所得芯片上并于室温下孵育3小时，取出后用PBST溶液清洗、氮气吹干，获得固相载体；
步骤2：探针溶液的配制
所述探针溶液包括受体sCD25蛋白溶液、配体IL-2蛋白溶液、sCD25抗体溶液或IL-2抗体溶液，配制过程如下：
将受体sCD25蛋白溶于PBST-BSA溶液中，配制浓度≥6.25μg/ml的受体sCD25蛋白溶液；
将配体IL-2蛋白溶于0.1M的乙酸-BSA溶液中，配制浓度≥6.25μg/ml的配体IL-2蛋白溶液；
将sCD25鼠抗人抗体溶于PBST-BSA溶液中，配制浓度≥25μg/ml的sCD25抗体溶液；
将IL-2兔抗人抗体溶于PBST-BSA溶液中，配制浓度≥12.5μg/ml的IL-2抗体溶液；
步骤3：探针的包被
将所述探针溶液点样于步骤1获得的固相载体上，室温下孵育2小时，PBST溶液清洗、氮气吹干，然后将PBST-BSA溶液点样于所得固相载体上，室温下孵育1小时，以封闭剩余的已活化羧基，最后用PBST溶液清洗、氮气吹干，即可获得探针包被的蛋白质芯片；
步骤1中，所述修饰液2和修饰液3的体积比为1:2。
2.根据权利要求1所述的蛋白质芯片，其特征在于：
步骤1中，对金箔芯片进行清洗的过程如下：
将金箔芯片浸入丙酮中浸泡1小时，然后置于H2O、氨水及H2O2溶液按体积比5：1：1混合构成的TL1清洗液中，82℃下水浴6分钟，清洗2次，取出后依次用超纯水和无水乙醇清洗，最后用氮气吹干。
3.根据权利要求1所述的蛋白质芯片，其特征在于：
所述PBST溶液是由浓度0.01M、pH＝7.4的磷酸缓冲液PBS与Tween 20混合配制而成的，在所述PBST溶液中Tween20的体积浓度为0.1％；
所述PBST-BSA溶液是由浓度0.01M、pH＝7.4的磷酸缓冲液PBS、Tween20及胎牛血清BSA混合构成，在所述PBST-BSA溶液中Tween20的体积浓度为0.1％，胎牛血清BSA的质量浓度为0.1％。
4.一种权利要求1-3任一所述的蛋白质芯片的应用，其特征在于包括如下步骤：
(1)将待检测患者血清稀释4-40倍，然后分别点样于配体IL-2探针包被的蛋白质芯片上，常温条件下孵育1小时，取出后用PBST溶液清洗、氮气吹干；
(2)将Cy3标记驴抗羊IgG抗体溶于PBST-BSA溶液中，构成浓度2.5μg/ml的IgG荧光二抗溶液；
(3)将浓度不低于25μg/ml的sCD25羊抗人多克隆抗体溶液点样于步骤1获得的孵育过血清的配体IL-2探针包被的蛋白质芯片上，常温下孵育1小时；随后将IgG荧光二抗溶液点样于配体IL-2探针包被的蛋白质芯片上，常温下避光孵育1小时，然后用PBST溶液清洗、氮气吹干；通过芯片扫描仪进行扫描检测，若包被配体IL-2蛋白探针处呈现荧光色，则表明待测患者血清中含有游离受体sCD25蛋白并与包被配体IL-2蛋白探针进行了反应；若包被配体IL-2蛋白探针处无荧光色，则表明待测患者血清中不含有受体sCD25蛋白。
5.一种权利要求1-3任一所述的蛋白质芯片的应用，其特征在于包括如下步骤：
(1)将待检测患者血清稀释4-40倍，然后分别点样于受体sCD25包被的蛋白质芯片上，常温条件下孵育1小时，取出后用PBST溶液清洗、氮气吹干；
(2)将浓度不低于12.5μg/ml的Alexa Fluor@647标记IL-2兔抗人单克隆抗体溶液点样于孵育过血清的受体sCD25包被的蛋白质芯片上，常温下避光孵育1小时，然后用PBST溶液清洗、氮气吹干；通过芯片扫描仪进行扫描检测，若包被受体sCD25蛋白探针处呈现荧光色，则表明待测患者血清中游离配体IL-2蛋白并与包被受体sCD25蛋白探针进行了反应，若包被受体sCD25蛋白探针处无荧光色，则表明待测患者血清中不含有配体IL-2蛋白。
6.一种权利要求1-3任一所述的蛋白质芯片的应用，其特征在于包括如下步骤：
(1)将待检测患者血清稀释4-40倍，然后分别点样于sCD25抗体包被的蛋白质芯片上，常温条件下孵育1小时，取出后用PBST溶液清洗、氮气吹干；
(2)将浓度不低于12.5μg/ml的Alexa Fluor@647标记IL-2抗体溶液点样于孵育过血清的sCD25抗体包被的蛋白质芯片上，常温下避光孵育1小时，然后用PBST溶液清洗、氮气吹干；通过芯片扫描仪进行扫描检测，若包被sCD25抗体探针处呈现荧光色，则待测患者血清中含有sCD25-IL-2复合体，若包被sCD25抗原探针处无荧光色，则待测患者血清中不含有sCD25-IL-2复合体。
7.一种权利要求1-3任一所述的蛋白质芯片的应用，其特征在于包括如下步骤：
(1)将待检测患者血清稀释4-40倍，然后分别点样于IL-2抗体包被的蛋白质芯片上，常温条件下孵育1小时，取出后用PBST溶液清洗、氮气吹干；
(2)将Cy3标记驴抗羊IgG抗体溶于PBST-BSA溶液中，构成浓度2.5μg/ml的IgG荧光二抗溶液；
(3)将浓度不低于25μg/ml的sCD25抗体溶液点样于孵育过血清的IL-2抗体包被的蛋白质芯片上，常温下孵育1小时；随后将步骤2配制的IgG荧光二抗溶液点样于蛋白质芯片上，常温下避光孵育1小时，然后用PBST溶液清洗、氮气吹干；通过芯片扫描仪进行扫描检测，若包被IL-2抗体探针处呈现荧光色，则待测患者血清中含有IL-2-sCD25复合体，若包被IL-2抗体探针处无荧光色，则待测患者血清中不含有IL-2-sCD25复合体。
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