CN101539573A - 蛋白-蛋白相互作用的高通量可视化芯片检测方法以及一种蛋白-蛋白相互作用检测试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种蛋白－蛋白相互作用的高通量可视化芯片检测方法以及一种蛋白－蛋白相互作用检测试剂盒。该方法为：制备一Flag抗体芯片，然后将含有Flag－诱饵融合蛋白和Myc－猎物融合蛋白的细胞裂解液加入到芯片表面进行免疫共沉淀反应，再经胶体金结合银增强显色技术检测诱饵蛋白和猎物蛋白是否具有相互作用。该试剂盒包括一具有多个分区的醛基玻片，FLAG和c－Myc标签载体和其对应的单抗，链亲和素胶体金，银增强溶液A和B以及基于上述方法的使用说明书。本发明建立的蛋白－蛋白相互作用高通量可视化芯片检测技术将成为蛋白质组学研究中高效有力的工具。

Description

蛋白-蛋白相互作用的高通量可视化芯片检测方法以及一种蛋白-蛋白相互作用检测试剂盒

技术领域

本发明涉及生物领域，具体涉及一种对蛋白-蛋白相互作用的检测方法以及一种蛋白-蛋白相互作用检测试剂盒。

背景技术

蛋白-蛋白相互作用(protein-protein interaction，PPI)对于所有生物学过程都至关重要，为此，蛋白质相互作用研究一直是细胞生物学与分子生物学领域的一大研究热点。

根据标记物的种类，可将免疫分析方法分为酶免疫分析、荧光免疫分析、放射免疫分析、化学或生物发光免疫分析等。金属免疫分析是基于金属标记物的一类免疫分析方法。早期的金属免疫分析多是通过用金属鳌合物来标记抗原或抗体，由于一个蛋白质分子只能标记上几个金属鳌合物，因此这类方法的灵敏度受到很大的限制，通常只能达到nmol级。为了克服这一缺点，利用纳米金作为标记物标记，由于纳米金能催化银离子的还原，因此通过银染色放大可在纳米金表面催化沉积大量的金属银，用酸性溶液将银溶解后可释放出成千上万的银离子，结合高灵敏的金属溶出分析，极大地提高了金属免疫分析的灵敏度，达到或超过了酶联免疫分析和基于Eu鳌合物标记的时间分辨荧光免疫分析的灵敏度(pmol级)，成为一种超灵敏的免疫分析方法。

免疫沉淀(immunoprecipitation，IP)是利用抗原蛋白质和抗体的特异性结合以及细菌蛋白质的“prorein A″特异性地结合到免疫球蛋白的FC片段的现象开发出来的方法。如果用蛋白X的抗体免疫沉淀X，那么与X在体内结合的蛋白Y可能也被沉淀下来。基于与蛋白X的生理性相互作用，蛋白Y的免疫沉淀就叫免疫共沉淀(co-immunoprecipitation，Co-IP)。

免疫共沉淀是发现或验证两种蛋白质间生理性相互作用的最有效、最常用的方法。在保持蛋白-蛋白相互作用(protein-protein interaction，PPI)的条件下收获和裂解细胞，从细胞提取液中特异性的免疫沉淀目的蛋白，然后通过聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离免疫沉淀物。目前多用纯化的prorein A预先结合固定在琼脂糖(argarose)的磁珠(beads)上，使之与抗原、抗体反应后的细胞裂解液作用，磁珠上的prorein A就能吸附抗原，从而达到沉淀靶标蛋白及其相互作用蛋白的目的。再进一步通过SDS-PAGE分离及免疫印迹(Western blot)检测相互作用蛋白。

不可否认，传统的Co-IP作为检测和鉴定PPI最经典和有效的方法，在功能基因组研究中发挥了巨大的作用，然而这种方法本身也存在着一些明显的不足：如操作过程因为复杂烦琐而费时、费力，并且常需要大量的培养细胞；另外，通过SDS-PAGE分离免疫沉淀物及Western blot检测相互作用则进一步延长了实验过程，这些缺陷大大的限制了检测样品的数量，这也是它不能成为高通量检测方法的主要原因。

在当今蛋白质组时代，随着相关科学研究的逐步深入，人们需要越来越多的数据信息作为分析研究蛋白质的基础，由此蛋白质芯片(protein array)应运而生。蛋白质芯片是近年来兴起的一种强有力的高通量研究方法，它类似于基因芯片，是将蛋白质点到固相物质上，然后与要检测的组织或细胞等进行“杂交”，再通过自动化仪器分析得出结果。这里所指的“杂交”是指蛋白与蛋白之间如(抗体与抗原)在空间构象上能特异性的相互识别。与传统的研究方法相比，其最大的特点是小型化和高通量化，能够一次平行分析成千上万的蛋白样品，具有很高的敏感度与准确性。

发明内容

本发明的目的是提供一种将胶体金结合银增强显色技术与免疫共沉淀芯片结合应用，建立的简捷实用、快速灵敏的高通量可视化芯片检测蛋白-蛋白相互作用(PPI)的方法。

本发明所提供的基于胶体金结合银增强显色技术与免疫共沉淀检测蛋白-蛋白相互作用的高通量可视化芯片检测方法，其特征在于，制备一Flag抗体芯片，然后将含有Flag-诱饵融合蛋白和Myc-猎物融合蛋白的细胞裂解液加入到芯片表面进行免疫共沉淀反应，再经胶体金结合银增强显色技术检测诱饵蛋白和猎物蛋白是否具有相互作用。

具体来讲，本发明所提供的检测方法，可包括以下步骤：

步骤一：制备Flag抗体芯片，将醛基玻片分成多个芯片框，将anti-flag M2单抗及作为抗体对照的鼠IgG喷点到各芯片框内，保存备用；

步骤二：构建诱饵和猎物蛋白表达载体，将诱饵蛋白的编码基因构建到flag标签载体上，将猎物蛋白的编码基因构建到Myc标签载体上，分别形成诱饵融合蛋白和猎物融合蛋白；

步骤三：细胞转染及制备裂解液，将诱饵和猎物真核表达载体共转染到细胞中，收集细胞并充分裂解，将实验品细胞裂解液上清收集待用；同样制备阴性对照品细胞裂解液收集待用；

步骤四：将实验品细胞裂解液和对照品细胞裂解液分别加入处理后的芯片中不同芯片框内进行免疫共沉淀反应，洗涤；

步骤五：加单克隆Anti-c-Myc-biotion孵育，洗涤，以洗去未结合的Anti-c-Myc-biotion；

步骤六：加链亲和素胶体金孵育，洗涤，以洗去未结合的链亲和素胶体金；

步骤七：加银增强溶液A和B反应，反应后用重蒸水冲洗芯片终止反应；

步骤八：芯片上出现肉眼可见的黑色信号点，通过观察实验品与对照品信号点的差异对结果进行判读。采用普通扫描仪扫描并保存图片，再通过GenePix软件读取各信号点的相对灰度值获得信号的数字化结果。

本发明提供的基于蛋白芯片的免疫共沉淀检测蛋白相互作用的方法，步骤一中：Flag抗体芯片用贴膜分为3×6个芯片框，每个芯片框内平行点入anti-flag M2单抗及作为抗体对照的小鼠IgG，anti-flag M2单抗和小鼠IgG各点3个重复点。

本发明提供的检测方法，步骤四中：

芯片处理是指用封闭液封闭芯片，室温孵育，然后用TBST重复洗涤；

将实验品细胞裂解液和对照品细胞裂解液加入芯片框中的量为20μl/框；

所述免疫共沉淀反应指在室温保湿条件下反应2小时；

所述洗涤指用TBST洗涤15分钟，重复3次。

步骤五中：

所述加入Anti-c-Myc-biotion单抗的浓度为1∶50，加入量为25μl/芯片框，在室温下放置于湿盒中孵育1小时；

所述洗涤指用TBST洗涤15分钟，重复3次。

步骤六中：

所述加入链亲和素胶体金的浓度为1∶25，加入量为25μl/芯片框，在室温下放置于湿盒中孵育1小时；

所述洗涤指用TBST洗涤15分钟，重复3次。

步骤七中：银增强溶液A和B的比例为1∶1，加入量为35μl/芯片框，反应时间为18至20分钟。

本发明还提供一种蛋白-蛋白相互作用检测试剂盒，包括一具有多个分区的醛基玻片，上述方法中的FLAG和c-Myc标签载体和其对应的单抗，链亲和素胶体金，银增强溶液A和B，阳性对照和阴性对照质粒以及基于上述方法的使用说明书。

本发明提供的试剂盒中醛基玻片分为3×6个分区。

本发明提供的试剂盒中，醛基玻片型号为CSS-100，FLAG标签载体为SIGMA公司的pFLAG-CMV-2，c-Myc标签载体为CLONTECH公司的pCMV-Myc，FLAG单抗为SIGMA公司的ANTI-单克隆抗体，c-Mye单抗为SIGMA公司的Anti-c-Myc-biotion单克隆抗体，链亲和素胶体金为SIGMA公司的biotion Conjugate Streptavidincolloidal gold-labeled，银增强溶液A和B为SIGMA公司产品；还可提供阳性对照质粒Flag-p50/c-Myc-p65(已知阳性相互作用对)和阴性对照质粒Flag-Jun/c-Myc-lacZ(已知阴性相互作用对)。

本发明提供的高通量可视化芯片检测蛋白-蛋白相互作用的方法，首次将银增强显色技术和免疫胶体金技术结合，用于蛋白质芯片研究蛋白质相互作用，利用FLAG和c-Myc表位标签和其对应的单抗，建立了一种基于芯片的高通量可视化检测蛋白相互作用的新型技术。该技术采用胶体金作为一个成核的位点，使还原出来的金属银在其周围沉积，黑色沉积物不断增大形成肉眼可见的明显信号，省去了一般荧光标记法检测时必须采用共聚焦荧光扫描仪获得信号的步骤，也省去了传统CoIP过程中的琼脂糖磁珠沉淀、SDS-PAGE分离、Western blot检测等诸多费时、繁琐的步骤，大大简化了实验过程。另外，该技术对样品、试剂的需求量大大减少，并且同一样品可同时进行对照抗体的平行实验，大大降低实验成本。更难能可贵的是：该技术充分利用了芯片高通量化、流程简单、耗时短等特点，从而可实现对样品的通量化检测。在进行蛋白相互作用检测时，重复性好，背景噪音小，灵敏度高。因此，本发明建立的蛋白-蛋白相互作用高通量可视化芯片检测技术将成为蛋白质组学研究中高效有力的工具。

下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。

附图说明

图1为本发明方法的实验流程示意图

图2为本发明方法的实验原理示意图

图3为pCMV-myc-p65和pFlag-p50重组子的双酶切电泳鉴定图

图4A为本发明高通量可视化芯片检测方法检测p65-p50相互作用的检测结果；

图4B为荧光标记抗体检测方法对照检测p65-p50相互作用的检测结果；

图5为本发明高通量可视化芯片检测方法与作为对照的荧光标记抗体检测方法对19对具潜在相互作用蛋白的检测结果。

具体实施方式

下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。

本发明所用到的试剂包括：

抗体：单克隆抗FLAG抗体(Monoclonal anti-M2 antibody，Sigma)；生物素标记单克隆抗c-Myc抗体(Monoclonal anti-c-Myc-biotion antibody，Sigma)；Cy3标记单克隆抗c-Myc抗体(Monoclonal anti-c-Myc-Cy3 antibody，Sigma)；p50多克隆抗体(polyclonal anti-p50 antibody，Santa Cruz)；p65多克隆抗体(polyclonalanti-p65 antibody，Santa Cruz)；小鼠IgG(中山金桥生物公司)。

脂质体：脂质体2000(Lipofectamine^TM2000 reagent，Invitrogen)。

醛基玻片：CSS-100醛基玻片(Aldehyde CSS-100 Silylated Slides，CELAssociates，Inc.)。

蛋白酶抑制剂：无EDTA型完全蛋白酶抑制剂药片(complete mini，EDTA free，protease inhibitor cocktail tablets，Roche)

链亲和素胶体金：biotion Conjugate Streptavidin colloidal gold-labeled(Sigma)

银增强试剂A：Silver Enhancer Solution A(Sigma)

银增强试剂B：Silver Enhancer Solution B(Sigma)

其他各种分子生物学常用试剂均为进口试剂。

试剂配制：

EBC裂解缓冲液：Tris-Cl    50mmol/L，pH8.0

               NaCl       120mmol/L

               NP-40      0.5％(V/V)

               EDTA       1mmol/L

               用前补加50μg/mL PMSF，蛋白酶抑制剂

TBS：          Tris-Cl    20mmol/L，pH8.0

               NaCl       150mmol/L

TBST：         含0.05％(V/V)吐温20的TBS

封闭液：       10mg/mL BSA(牛血清白蛋白)，溶于TBST中。

本发明检测诱饵蛋白和猎物蛋白之间的相互作用，可采用以下操作，参见图1所示流程以及图2(MCS：多克隆位点；X，Y为待测蛋白，其以单体或复合体的形式存在于细胞裂解液中。)所示原理。

Flag抗体芯片的制备：在醛基玻片上贴上贴膜，使其分区形成3×6个用于区分样品的芯片框。在每一芯片框内，将anti-flag M2单抗和小鼠IgG(作为对照抗体)分别喷点到醛基玻璃片分区框内，每个反应框内平行点3个含anti-flag M2单抗的点和对应数量的含小鼠IgG的点(形成2×3阵列)。4℃保存备用。

本发明实施例采用M2单抗，由于M2单抗是鼠源IgG，因此采用小鼠IgG作为抗体对照。本发明不限于采用M2单抗，也可以选用其它型号的单抗。

诱饵蛋白和猎物蛋白表达载体的构建：将诱饵蛋白的编码基因构建到flag标签载体上，将猎物蛋白的编码基因构建到Myc标签载体上，分别形成flag-诱饵融合蛋白和Myc-猎物融合蛋白。

细胞转染及裂解液的制备：选择培养细胞，当细胞培养到80％密度时，以脂质体将诱饵和猎物真核表达载体共转染，收集细胞并充分裂解，将实验品细胞裂解液上清收集待用。用同样方法制备得到对照品细胞裂解液。

芯片CoIP及相互作用的检测：封闭液封闭芯片，洗涤后在其中之一芯片框内加入实验品细胞裂解液，同时在另一芯片框内加入对照品细胞裂解液作为阴性对照，反应一定时间后，洗涤；在每一芯片框内再加入生物素标记的抗myc单克隆抗体(anti-c-Myc-biotion)，孵育一段时间后洗涤；加链亲和素胶体金孵育，洗涤；加银增强溶液A和B反应，反应后用重蒸水冲洗芯片终止反应。肉眼观察芯片上信号点的颜色变化。通过比较实验品与对照品信号点的差异对结果进行判读：如果存在相互作用，在实验品对应的芯片框内会出现黑色信号点，而对照品对应的框内则无明显黑色信号点出现。采用普通扫描仪扫描并保存图片，可再通过GenePix软件读取各信号点的相对灰度值获得信号的数字化结果。

实施例1：核转录因子-κB(NF-κB)的p65和p50亚基相互作用的免疫共沉淀芯片分析

NF-κB的p65和p50亚基在生理条件下，以异二聚体的形式存在，因此，以p65和p50的相互作用为阳性模型设计本实施例。

一、Flag抗体芯片的制备：在醛基玻片上贴上贴膜，使其分区形成3×6个芯片框。用微阵列点样器(microarrayer，CAPITALBIO博奥，晶芯SmartArrayer-48)在每一芯片框中将anti-flag M2单抗和小鼠IgG(作为对照抗体)分别喷点到醛基玻璃片框内，每个反应框内点3个含anti-flag M2单抗的点(上一行)和3个含小鼠IgG的点(下一行)形成2×3点阵。至少制备两个Flag抗体芯片，4℃保存备用。

二、诱饵和猎物表达载体的构建和鉴定：将p65(NM_021975)和p50(NM_003998)分别构建到pCMV-Myc和pCMV-Flag-2载体上，获得pCMV-myc-p65和pFLAG-p50表达载体。

构建过程具体操作：

a)设计p65和p50特异性引物，由赛百盛公司合成：

引物名称       引物序列      限制性内切酶

p50-up    5’-CCGCGAATTCAATGGCAGAAGATGATCC-3’(序列1)    EcoRI

p50-down  5’-CAGAGTCGACCTAAGTGTCCATGGTTCC-3’(序列2)    SalI

p65-up    5’-ATCTCTCGAGGTATGGACGAACTGTTCCCC-3’(序列3)  XhoI

p65-down  5’-CAATGCGGCCGCTTAGGAGCTGATCTGACTC-3’(序列4) NotI

b)以肝脏cDNA文库(Invitrogen)为模板，PCR扩增p65和p50基因：PCR体系为：10×Buffer 5μl，dNTP Mixture(2.5mM)4μl，合成引物(10μM)p50-up、p50-down各1μl，Pyrobest Taq(5U/μl)0.5μl，cDNA文库1μl，加去离子水至50μl。PCR反应条件为：94℃预变性2min；94℃变性1min，55℃退火1min、72℃延伸2min，扩增35个循环；72℃继续延伸7min。

c)PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下切下目的条带(p65大小为1656bp，p50大小为1314bp)，使用凝胶回收试剂盒(Promega)并按照其说明书所述方法回收目的基因。

d)目的基因及相应载体进行限制性酶切：p50和pFLAG-CMV-2用EcoRI&SalI进行双酶切，p65和pCMV-Myc用XhoI&NotI进行双酶切，反应体系如下：

10×H buffer             5μl

PCR纯化产物P50(或P65)    20μl

EcoRI(或XhoI)            2.5μl

SalI(或NotI)             2.5μl

加无菌水至50μl，37℃水浴酶切4h。

e)酶切产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，使用凝胶回收试剂盒(

SV Gel andPCR Clean-Up System，Promega)并按照其说明书所述方法回收酶切片段，切下目的基因(P50或P65)和载体酶切片段(pFLAG-CMV-2或pCMV-Myc)。

f)用T4连接酶连接，连接体系如下：

10×Buffer       2μl

目的基因         10μl

载体酶切片段     1μl

T4 DNA Ligase    1μl

加去离子水至20μl，室温连接2小时或4℃连接过夜。

g)连接产物转化大肠杆菌JM109感受态细胞：将20μl连接产物加入100μl大肠杆菌JM109感受态细胞中，轻轻旋转混匀；冰水浴30分钟；42℃热休克90秒；冰上放置2分钟；加入500μl LB培养液，37℃摇床(150rpm)培养45分钟；将培养液涂于加有氨苄的LB固体培养基平板上；超净工作台中吹干后，37℃培养箱倒置培养过夜。

采用以下步骤对pCMV-Myc-p65和pFLAG-p50载体进行鉴定：

h)从平板上挑取单克隆菌落到一加有3～5mL含氨苄的LB液体培养基的无菌玻璃试管中，37℃摇床(200rpm)过夜。

i)使用小量质粒DNA提取试剂盒(

Plus SV Minipreps，Promega)并按照其说明书所述方法提质粒。

j)质粒进行双酶切鉴定重组子：pFLAG-p50用EcoRI&SalI进行双酶切，pCMV-Myc-p65用XhoI&NotI进行双酶切，反应体系如下：

10×H buffer                                   2μl

含有重组子pFLAG-p50(或pCMV-Myc-p65)的质粒DN    5μl

EcoRI(或XhoI)                                  1μl

SalI(或NotI)                                   1μl

加无菌水至20μl，37℃水浴酶切4h。

k)酶切产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，如果电泳结果显示大小与预期相一致的两条带，则表明该质粒为重组子。结果如图3所示(1.pCMV-myc-p65(未酶切)；2.pCMV-myc-p65(xhoI和NotI酶切)；3.pFlag-p50(未酶切)；4.pFlag-p50(EcoRI和SalI酶切))：其中2，4分别为pCMV-myc-p65和pFlag-p50的重组子。

l)选择重组子进行测序确认。

三、细胞转染及裂解液的制备：

1、pCMV-myc-p65和pFLAG-p50共转染细胞裂解液(实验品)的制备

用含10％FBS(胎牛血清)(杭州四季青生物工程材料有限公司)的DMEM高糖培养液(北京天润善达生物技术有限公司)，在含5％CO₂的37℃培养箱内培养接种于24孔细胞培养板上的HEK-293细胞(人胚肾细胞，中国协和医科大学基础医学研究所细胞中心)，显微镜下观察细胞，当细胞长到约80％密度时，以脂质体2000将pCMV-myc-p65和pFLAG-p50共转染细胞：在一个0.5mL无菌EP管中同时加入300ngpCMV-myc-p65、300ng pFLAG-p50和50μl无血清的DMEM培养基，混匀；在另一个0.5mL无菌EP管中同时加入2μl脂质体2000和50μl无血清的DMEM培养基，混匀；室温孵育5分钟后，将两者混合到一起，混匀后室温孵育20分钟；将上述混合物加入24孔细胞培养板的各孔细胞中；将细胞放回含5％CO₂的37℃培养箱内培养。

转染24-36小时后收集细胞：将细胞培养液吸走，然后用预冷到4℃的PBS(磷酸盐缓冲液，137mmol/L NaCl，2.7mmol/L KCl，10mmol/L Na₂HPO₄，2mmol/L KH₂PO₄，pH 7.4)清洗细胞，之后向24孔细胞培养板的各孔中加入EBC裂解缓冲液(50μl/孔)，室温放置15分钟进行充分裂解。将24孔细胞培养板各孔中的细胞裂解液回收到EP管中，4℃，12000rpm离心10分钟，收集细胞裂解液上清放入另一干净的EP管中，作为实验品备用。

2、pCMV-myc-p65和pFLAG-CMV-2共转染细胞裂解液(阴性对照品)的制备

用和1相同的操作制备对照品，其中以脂质体2000将pCMV-myc-p65和pFLAG-CMV-2共转染，作为验证免疫沉淀特异性的阴性对照(flag-p50缺失)。

四、芯片CoIP及相互作用的检测：

取一Flag抗体芯片，用封闭液(25μl/框)封闭芯片，室温孵育1小时；TBST洗涤5分钟，重复3次；在第一芯片框内加入实验品细胞裂解液(20μl/框)，在第二芯片框内加入阴性对照品细胞裂解液(20μl/框)，室温保湿反应2小时；对所有芯片框，用TBST洗涤15分钟，重复3次；加单克隆Anti-c-Myc-biotion(1∶50，25μl/框)，在室温下放置于湿盒中孵育1小时；TBST清洗芯片3次，每次5分钟；加链亲和素胶体金(1∶25，25μl/框)，在室温下放置于湿盒中避光孵育1小时；TBST清洗芯片3次，每次5分钟；加银增强溶液A和B(1∶1，35μl/框)反应18到20分钟；使用重蒸水冲洗芯片终止反应，肉眼观察芯片上信号点的颜色变化。通过比较实验品(第一芯片框)与阴性对照品(第二芯片框)信号点的差异对结果进行判读：如果存在相互作用，在实验品对应的芯片框内会出现黑色信号点，而对照品对应的框内则无明显黑色信号点出现，结果参见图4A中左侧图片，在第一芯片框上一行实验品出现黑色信号点，在第二芯片框对照品没有出现黑色信号点。采用普通扫描仪扫描并保存图片，再通过GenePix软件读取各信号点的相对灰度值获得信号的数字化结果(参见图4A中右侧柱图)。

同时以荧光标记抗体检测方法为对照，检测方法为：用另一Flag抗体芯片，用封闭液(20μl/框)封闭芯片，室温孵育45分钟；TBST洗涤5分钟，重复3次；在第一芯片框内加入实验品细胞裂解液(20μl/框)，在第二芯片框内加入阴性对照品细胞裂解液(20μl/框)；室温保湿反应2小时；TBST洗涤15分钟，重复3次；加入anti-Myc-Cy3单抗(1∶200<抗体∶封闭液>，20μl/芯片框)，室温避光保湿反应1小时；TBST洗涤15分钟，重复3次；将芯片上的贴膜取下，待玻片干燥后放入共聚焦荧光芯片扫描仪(LuxScan-10K/A，CapitalBio)中扫描，保存图片并读取数据。检测结果见图4B，左侧图片显示在第一芯片框上一行实验品出现荧光信号点，在第二芯片框对照品没有出现荧光信号点；同时参见右侧柱图显示的荧光强度。

五、检测结果：

NF-κB的p65和p50亚基在生理条件下，以异二聚体的形式存在，因此，本实施例以p65和p50的相互作用为阳性相互作用建立芯片免疫共沉淀技术。首先，将p65和p50分别构建到pCMV-Myc和pCMV-Flag-2载体上，获得pCMV-myc-p65和pFLAG-p50表达载体。然后将pCMV-myc-p65和pFLAG-p50共转染细胞，同时以pCMV-myc-p65和pFLAG-CMV-2共转染作为阴性对照。获得细胞裂解液后，在芯片上进行免疫共沉淀反应，再经胶体金结合银增强显色技术检测诱饵蛋白和猎物蛋白是否具有相互作用。经可视化芯片检测技术检测后，得到相应的相互作用信号(如图4A所示)，检测结果与荧光标记抗体检测结果(图4B)一致，显示本例蛋白对之间具有相互作用。从结果可以看出：本发明的可视化芯片检测技术用于检测蛋白-蛋白相互作用是可行的，并且有相当的可信度。

实施例2、用本发明的高通量可视化芯片检测技术对19对具潜在相互作用的蛋白进行相互作用的验证，并与荧光标记抗体检测方法检测效果进行比较

为了检验本发明高通量可视化银增强芯片检测方法的可靠性，随机选择了19对具潜在相互作用的蛋白(见表1)用本发明的高通量可视化芯片检测技术进行验证，并同步采用荧光免疫检测方法进行检验，每组实验均带了已知阳性相互作用对Flag-p50/c-Myc-p65和已知阴性相互作用对Flag-Jun/c-Myc-lacZ分别作为阳性对照和阴性对照，并将两组实验结果进行比对。

将诱饵分别构建到pFLAG-CMV-2真核表达载体上(请参照实施例1的方法)，将猎物分别构建到pCMV-Myc真核表达载体上(请参照实施例1的方法)。

参照实施例1中的方法；将19种pCMV-Myc-猎物蛋白分别和相应的pFLAG-诱饵蛋白共转染HEK-293细胞，获得细胞裂解液后，分别在芯片上不同芯片框内(每一芯片框内对应一对蛋白)进行免疫共沉淀反应，经本发明实施例1所用的高通量可视化芯片检测技术和荧光免疫检测方法进行检测后，得到相应的相互作用信号。

结果如图5所示，本发明高通量可视化芯片检测方法结果(图中“可视法”组)与荧光免疫检测方法结果(图中“荧光法”组)具有很好的一致性，其中，1、2、3、9、Y号蛋白对之间具有明显相互作用。该实施例进一步证明本发明的高通量可视化芯片检测技术在分析蛋白相互作用中是非常有效的。

表119对相互作用对蛋白名称及对照

本发明在具体实施中，还可以形成一种蛋白-蛋白相互作用检测试剂盒，该试剂盒可包括：具有多个分区的醛基玻片(每个醛基片可进行18个样品的检测，可根据需要检测的相互作用数量选择醛基片的数量)；FLAG标签载体pFLAG-CMV-2；c-Myc标签载体pCMV-Myc；单克隆抗FLAG抗体；生物素标记单克隆抗c-Myc抗体；小鼠IgG；链亲和素胶体金；银增强溶液A和B；阳性对照和阴性对照质粒及使用说明书。具体的一种试剂盒，其中醛基玻片型号为CSS-100，FLAG标签载体为SIGMA公司的pFLAG-CMV-2，c-Myc标签载体为CLONTECH公司的pCMV-Myc，FLAG单抗为SIGMA公司的ANTI-

单克隆抗体，c-Myc单抗为SIGMA公司的Anti-c-Myc-biotion单克隆抗体，链亲和素胶体金为SIGMA公司的biotion Conjugate Streptavidin colloidalgold-labeled，银增强溶液A和B为SIGMA公司产品，阳性对照质粒可以为Flag-p50/c-Myc-p65(已知阳性相互作用对)，阴性对照质粒为Flag-Jun/c-Myc-lacZ(已知阴性相互作用对)。

Claims (10)

1、一种蛋白-蛋白相互作用的高通量可视化芯片检测方法，其特征在于，制备一Flag抗体芯片，然后将含有Flag-诱饵融合蛋白和Myc-猎物融合蛋白的细胞裂解液加入到芯片表面进行免疫共沉淀反应，再经胶体金结合银增强显色技术检测诱饵蛋白和猎物蛋白是否具有相互作用。

2、根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述检测方法，包括以下步骤：

步骤一：制备Flag抗体芯片：将醛基玻片分成多个芯片框，将anti-flag M2单抗及作为抗体对照的鼠IgG分别喷点到每一芯片框内，保存备用；

步骤二：构建诱饵和猎物蛋白表达载体：将诱饵蛋白的编码基因构建到flag标签载体上，将猎物蛋白的编码基因构建到Myc标签载体上，分别形成诱饵融合蛋白表达载体和猎物融合蛋白表达载体；

步骤三：细胞转染及制备裂解液：将诱饵和猎物真核表达载体共转染到细胞中，收集细胞并充分裂解，将实验品细胞裂解液上清收集待用；同样制备阴性对照品细胞裂解液收集待用；

步骤四：将实验品细胞裂解液和对照品细胞裂解液分别加入处理后的芯片中不同芯片框内进行免疫共沉淀反应，洗涤；

步骤五：加单克隆Anti-c-Myc-biotion孵育，洗涤；

步骤六：加链亲和素胶体金孵育，洗涤；

步骤七：加银增强溶液A和B反应，反应后用重蒸水冲洗芯片终止反应；

步骤八：肉眼观察芯片上信号点的颜色变化。通过比较实验品与对照品信号点的颜色差异对结果进行判读：如果存在相互作用，在实验品对应的芯片框内会出现黑色信号点，而对照品对应的框内则无明显黑色信号点出现。

3、根据权利要求2所述方法，其特征在于，所述步骤八可进一步用扫描仪扫描并保存图片，再通过GenePix软件读取各信号点的相对灰度值获得信号的数字化结果，通过相对灰度值的大小判断诱饵蛋白和猎物蛋白是否存在相互作用。

4、根据权利要求2或3所述方法，其特征在于，所述步骤四中：

芯片处理是指用封闭液封闭芯片，室温孵育，然后用TBST重复洗涤；

将实验品细胞裂解液和对照品细胞裂解液加入芯片框中的量为20μl/框；

所述免疫共沉淀反应指在室温保湿条件下反应2小时；

所述洗涤指用TBST洗涤15分钟，重复3次。

5、根据权利要求2或3所述方法，其特征在于，所述步骤五中：

所述加入Anti-c-Myc-biotion单抗的浓度为1∶50，加入量为25μl/芯片框，在室温下放置于湿盒中孵育1小时；

所述洗涤指用TBST洗涤15分钟，重复3次。

6、根据权利要求2或3所述方法，其特征在于，所述步骤六中：

所述加入链亲和素胶体金的浓度为1∶25，加入量为25μl/芯片框，在室温下放置于湿盒中孵育1小时；

所述洗涤指用TBST洗涤15分钟，重复3次。

7、根据权利要求2或3所述方法，其特征在于，所述步骤七中：银增强溶液A和B的比例为1∶1，加入量为35μl/芯片框，反应时间为18至20分钟。

8、一种蛋白-蛋白相互作用检测试剂盒，包括一具有多个分区的醛基玻片，权利要求1至7任一所述方法中的FLAG和c-Myc标签载体和其对应的单抗，链亲和素胶体金，银增强溶液A和B，阳性对照和阴性对照质粒以及基于权利要求1-7任一所述方法的使用说明书。

9、根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述醛基玻片分为3×6个分区。

10、根据权利要求8或9所述的试剂盒，其特征在于，所述醛基玻片型号为CSS-100，FLAG标签载体为SIGMA公司的pFLAG-CMV-2，c-Myc标签载体为CLONTECH公司的pCMV-Myc，FLAG单抗为SIGMA公司的ANTI-

单克隆抗体，c-Myc单抗为SIGMA公司的Anti-c-Myc-biotion单克隆抗体，链亲和素胶体金为SIGMA公司的biotion Conjugate Streptavidin colloidal gold-labeled，银增强溶液A和B为SIGMA公司产品，阳性对照质粒为Flag-p50/c-Myc-p65(已知阳性相互作用对)，阴性对照质粒为Flag-Jun/c-Myc-lacZ(已知阴性相互作用对)。

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