JP5166240B2 - 種々の系列の抗生物質の検出および特定を同時に行なうインビトロ方法およびこの方法による分析キット - Google Patents
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Description
その一つは、試料の細菌株の増殖に対する阻害力を測定する微生物学的試験である。
この種類の試験では、結果が得られるまでに比較的長いインキュベーション時間(3〜16時間)が必要とされる。一般に、これらの試験(デルボテスト(Delvotest SP)(登録商標)、BRT試験、コパン(Copan)(商標)、エクリプス(Eclipse)(商標)、バリオ(Valio)(商標))では、使用される細菌株がしばしば種々の系列の抗生物質に敏感であるため、種々の系列の抗生物質を同時に認識し得る。
しかし、この種の試験では、分析対象の各抗生物質が属する系列を正確に特定することができない。
また、サンプル中の対象とする抗生物質と、単一認識サイトとして受容体または抗体のいずれかを有する標識競合化合物との競争反応を利用して抗生物質を検出するインビトロ試験が行なわれている。エリザ(ELISA)(酵素免疫蛍光測定法)またはRIA(放射性免疫測定法)/RRA(放射線受容体測定法)において、分析のために必要とされる時間は約2〜6時間である。これらの方法、特にRRA実験法は、種々の系列の抗生物質のいくつかを同時に検出し得る。しかしこの場合、この方法では陽性を示す各抗生物質の系列を特定することはできない。
また、最近まで、対象とする抗生物質を単離し特定することが可能な物理化学的方法は、主にクロマトグラフ分離システムと質量分析検出システム(GC/MSまたはLC/MS)とを組み合わせる方法であった。この方法では、対象とする各抗生物質に応じて、適切な条件を設定する必要がある。この方法では、単一の抗生物質、または同じ系列の複数の抗生物質を同時に分析することが可能であり、また同じ系列の抗生物質のすべてを検出することは可能であるが、複数の系列の抗生物質ではけっして可能ではない。クロマトグラフ分離の原理は、所定の抗生物質の物理化学的特性の特徴を利用しているが、これらの特性はしばしば抗生物質の系列ごとに異なる。分析しようとする抗生物質の種類が分からない場合、存在する全ての抗生物質の系列についての方法を考慮しなければならない。
アミノサイクリトール、マクロライド、クロラムフェニコールまたは他のペプチド、イオノフォア、ニトロフラン、キノロン、カルバドックス等である。これらの系列は、化学的に異なるきわめて広範囲の化合物に及ぶ。
2つの系列の抗生物質が同じ試料中に含まれている場合には、この方法では発色信号はまったく、またはほとんど生じない。これは稀なケースであるが、可能であれば、β−ラクタムとテトラサイクリンが含まれる場合、結果の判定の問題を回避するために両方の発色信号の相対強度をより容易に評価することを可能にする単一の対照線を呈する単一の対照を用いることが推奨される。明らかに、この単一の対照線は、2つ以上の試験を組み合わせて一つの方法にする場合に必要となる。
本発明は、少なくとも2つの異なる系列に属する抗生物質が(理論上無制限に)組み合わされた混合物中の抗生物質の検出と、検出された抗生物質が属する系列の特定を同時に行なうことができる新しい分析方法を提供することを目的とする。
前記担体上の捕捉位置でサンプル中の抗生物質の属する系列を特定することが可能な捕捉システムとを備えることを特徴とする。
上記の反応性混合物と、系列を決める試料とを接触させて溶液を調製し、この溶液を30℃〜50℃の温度で3〜15分間インキュベートする段階。
捕捉システムを有するディップスティックを、得られた溶液に浸漬し、3〜15分間インキュベートする段階。
ディップスティック上に現れた結果を裸眼によって視覚的に、または光学的ディップスティックリーダーによって判定する段階。
他方、複数試料分析試験の観点からは、コロイド金で標識されたプロテインAは、溶液中のすべての抗体の一般的なマーカーとして作用する。
第2の場合(フォーマット2)、分析対象の抗生物質に類似する競合物質は、コロイド金とコンジュゲートされ、受容体は特定の捕捉点に固定されることによって捕捉システムとして作用する。
場合によっては、混合システム(上記のフォーマット1および2)の複数試料分析試験も可能である。
この方法では、β−ラクタム系とテトラサイクリン系抗生物質の各受容体および各受容体に対する各種試薬を含有する反応性混合物と、各受容体の特異的リガンドが正確に区画された場所に固定された捕捉システムとが使用される。
β−ラクタム系抗生物質を検出するために、反応性混合物には、β−ラクタムを認識するための特異的受容体、この受容体の特異的抗体、およびコロイド金とコンジュゲートしたプロテインAの調製物が含まれる。また、テトラサイクリン系抗生物質を検出するために、反応性混合物には、テトラサイクリンの受容体、この受容体の特異的抗体、ビオチンとコンジュゲートしたDNAの特異的断片、およびコロイド金とコンジュゲートしたプロテインAの調製物が含まれる。
− 濃度360nM(ナノモル)のβ−ラクタム受容体(RSA) 5部
− 濃度4.2μM(マイクロモル)のテトラサイクリン受容体(TetR) 5部
− NaCl 150mMを含む50mM(ミリモル)NaPi緩衝液(pH7.8)で4倍に希釈した抗RSA血清 1部
− NaCl 150mMを含む50mM(ミリモル)NaPi緩衝液(pH7.8)で4倍に希釈した抗TetR血清 1部
− NaCl 690mM中の濃度が25μMの核酸の溶液 1部
− 520nmの光学密度(OD)=10のプロテインA−金(粒径40nm) 15部
− BSA2%、デキストラン1%、ショ糖5%を含む120mMヘペス緩衝液(pH8) 22部
この反応性混合物は必要に応じて調製され、または20時間凍結乾燥して調製される。
捕捉システムは、反応性混合物中の認識分子と錯体を形成することができる化合物が所定の場所に固定されたニトロセルロース膜を含んで成る。これらの化合物は、「ベータ」信号に対して(β−ラクタムに対して)は、抗生物質、好ましくはペニシリンまたはセファロスポリン型の抗生物質であり、プロテインA、ビオチン、またはアビジンに対して特定の反応性を有さない分子に固定される。本発明の好ましい実施形態において、β−ラクトグロブリンに固定したアンピシリンが使用される。
また、「テトラ」信号に対して(テトラサイクリンに対して)は、DNA断片の末端のビオチンを認識することができるアビジンである。卵白アビジンが好ましく使用される。
分析される溶液中に存在する抗生物質の種類の特定を可能にするのは、この区画の位置である。両方の捕捉システムが同じ場所に配置された場合は、分析には影響ないが、どの種類の抗生物質が実際に存在するか判定するのは不可能であろう。
β−ラクトグロブリンは、多くのリジン残基(10%)を含んで成る牛乳タンパク質であることから選択され、大部分のリジンは、タンパク質の外側にNH2末端が面する三次元構造を有する(Pubmed,structure,1GXA)。
ピアス社(Pierce Inc.)(米国(USA))で入手可能な5mg/mlの卵白アビジンの溶液を50mM NaPi緩衝液(pH7.5)の中で調製する。
本発明では、試験前後で一定の強度で可視的な対照ラインを使用することが好ましい。この対照ラインは、好ましくは、「試験」ラインで発生した色と同様の色を示し、次のように合成される。
免疫クロマトグラフ法は周知であり、文献(免疫クロマトグラフ試験ストリップの開発:簡潔な指針(Developing Immunochromatographic Test Strips:A Short Guide)、ミリポア(Millipore)、米国(USA)11/96印刷文献番号TB500、96−204頁)に記載されている。
本発明において、上記で得られた調製物は、ニトロセルロース膜上の所定の区画された位置に、かつ好ましくは、液体の移動方向に沿って連続して個別に沈着される。
次いで、ニトロセルロース膜の一方の面に、例えば、アールストローム社(Ahlstrom,Inc.)(米国(USA))で入手可能な142型またはワットマン(Whatman)(英国(UK))で入手可能なGFDVA型のものであるが、パル(Pall)(英国(UK))で入手可能なロイコソルブ(Leukosorb)(登録商標)型のものではない膜を接触させ、他方の面には、例えばワットマン(Whatman)(英国(UK))で入手可能な17CHR型の吸収紙を接触させる。
試料中に存在する抗生物質の種類を特定することを可能にするのが捕捉システム上の位置である。溶液は、1μL/cmの流量でQuanti−3000型のバイオドット(Biodot)(英国(UK))「ディスペンサー」によって沈着される。
冷たい牛乳200μLを、上記により調製および/または凍結乾燥された50μLの試薬の存在下に、50℃でインキュベートする。50℃で3分インキュベーションした後、上記の捕捉システムを溶液中に浸漬する。最終判定は、3分のインキュベーション後に、マテスト社(Matest)(ドイツ)で入手可能な光学ディップスティックリーダーによって行われる。
この好ましい実施形態では、テトラサイクリン系およびβ−ラクタム系受容体に加え、スルファジメトキシン系抗生物質を認識する特異的抗体を用いる。
次の調合に従って、抗スルファジメトキシン抗体をさらに上記の混合物に添加する。
− 濃度360nMのβ−ラクタム受容体(RSA) 5部
− 濃度4.2μMのテトラサイクリン受容体(TetR) 5部
− NaClを150mM含む50mM NaPi緩衝液(pH7.8)で4倍に希釈した抗RSA血清 1部
− 上記組成のNaPi緩衝液で4倍に希釈した抗−TetR血清 1部
− 上記組成のNaPi緩衝液で2倍に希釈した抗スルファジメトキシン 1部
− 濃度50μMの核酸 1部
− 520nmの光学密度(OD)=10のプロテインA−金(粒径40nm) 20部
− BSA2%、デキストラン1%、ショ糖5%を含有する120mMヘペス緩衝液(pH8) 22部
この混合物は必要に応じて調製され、または20時間凍結乾燥して調製される。
捕捉システムは実施例1のものと同様であり、ここに抗スルファジメトキシン抗体分子を特異的に捕捉する第4のラインが組込まれる(第3の試験ライン)。その他の捕捉ゾーンは前記と同様であるが、図2のように、さまざまに配置される。
ジクソン・ホランド(Dixon−Holland)およびカッツ(Katz)(9)らの方法によって調製される。スルファジメトキシン100mgとBSA200mgを、50mMリン酸緩衝液(pH7.2)2部とジオキサン1部を含んで成る25mlの混合物中に溶解し、25%グルタルアルデヒド120μLの存在下に、25℃で3時間攪拌しながらインキュベートする。次いで、50mM NaPi緩衝液(pH7.2)100容量を透析外液として、4℃で6日間、12時間ごとに緩衝液を交換しながら透析する。
3つのパラメータ(抗生物質)の検出の場合、捕捉ラインはニトロセルロース膜上の所定の区画された位置に、好ましくは液体の移動方向に沿って連続して個別に沈着される。好ましい実施形態によれば、β−ラクタム系、テトラサイクリン系、およびスルファジメトキシン系の捕捉ゾーン、および対照ゾーンは、それぞれ、液体の移動方向に沿って、第1、第2、第3、および最後に第4位置の順で配置される(図2)。単一の対照ゾーンが3つのマーカーの対照となる。別の実施形態として、前記実施例と同様、2つの対照ゾーンを各々の試験ゾーン間に組込むこともできる。
冷たい牛乳200μLを上記のように調製および/または凍結乾燥した試薬50μLの存在下に50℃でインキュベートする。50℃で3分インキュベーションした後、上記の捕捉システムを溶液中に浸漬する。最終判定は、3分のインキュベーション後に、マテスト(Matest)(ドイツ)で入手可能な光学ディップスティックリーダーによって行なう。
反応性混合物は以下を含んで成る。
− 濃度360nMのβ−ラクタム受容体(RSA)が5部
− 520nmの光学密度(OD)=10のコロイド金が付着したモノクローナル抗RSA抗体が10部
− NaClを150mM含む50mM NaPi緩衝液(pH7.8)で希釈されたビオチン化抗スルファジメトキシン抗体 1部
− BSA−スルファジメトキシン−金(粒径40nm)の希釈液 10部
− BSA2%、デキストラン1%、ショ糖5%を含む120mMヘペス緩衝液(pH8) 24部
この混合物は必要に応じて調製され、または20時間凍結乾燥して調製される。
100mM、pH9.2の炭酸塩緩衝液で透析した抗−スルファジメトキシン抗体5mg/mlを含む溶液825μLを、1.5mg/mlでビオチン−LC−NHCの溶液(ペルビオ社(Perbio,Inc.)で入手可能)165μLの存在下に、光を避けて25℃で2時間インキュベートする。1M,トリス緩衝液(pH8)を10μL添加し30分間静置して反応を止め、次いで、NaCl 150mMを含む50mM NaPi緩衝液(pH7.8)に対して10時間の透析を2回行なう。
対照BSA−金溶液は、実施例2に記載されたBSA−スルファジメトキシンの調合液を用いて、実施例1と同様の方法でコロイド金を固定して調合する。
捕捉システムは実施例1のものと同様である。しかし、この実施例では、対照ゾーンの上にある第2の捕捉部位に固定されたアビジンに、ビオチン化抗スルファミド抗体が捕捉される。
冷たい牛乳200μLを、上記の調製試薬50μLの存在下に30℃で15分間インキュベートする。この第1のインキュベーション後、上記の捕捉システムを溶液中に浸漬する。最終判定を15分間の第2のインキュベーション後に行う。結果を表5に示す。
反応性混合物は以下を含んで成る。
― 濃度4.2μMのテトラサイクリン受容体(TetR) 5部
− 50mM NaClを含む150mM NaPi緩衝液(pH7.8)で希釈したモノクローナル抗TetRマウス抗体 1部
− 上記の組成のNaPi緩衝液で希釈した抗スルファミドウサギ抗体 1部
― BSA−スルファジメトキシン−金(粒径40nm)の希釈液 10部
− 濃度50μMのビオチン化された核酸 1部
― 520nmの光学密度(OD)=10の抗ビオチン−金(粒径40nm)抗体 10部
− BSA2%、デキストラン1%、ショ糖5%を含む120mMヘペス緩衝液(pH8) 22部
この混合物は必要に応じて調製され、または20時間凍結乾燥して調製される。
捕捉システムは実施例1のものと同様である。しかし、この場合には、モノクローナル抗TetR抗体が捕捉される第1の捕捉部位を形成するのは、抗TetRマウス抗体であり、また、抗スルファミド抗体が捕捉される第2の捕捉部位を形成するのはニワトリ抗スルファミドウサギ抗体である。
ブタの筋肉10gに 50mM NaPi緩衝液(pH8)30mlを添加し、ミニミックス(MinimiX)(インターサイエンス社(Interscience)、F)型の混合機で2分間混合する。次いで、エッペンドルフ(登録商標)チューブ中に収集した溶液を1分間、6,000rpmで遠心分離し、それから上清を回収する。上清200μLを上記の調製試薬50μLの存在下に25℃で15分間インキュベートする。この第1のインキュベーション後、上記の捕捉システムを溶液中に浸漬する。最終判定を15分間の第2のインキュベーション後に行う。結果を表6に示す。
反応性混合物は以下を含んで成る。
− 濃度360nMのβ−ラクタムー受容体(RSA) 5部
− NaCl 150mMを含む50mM NaPi緩衝液(pH7.8)で希釈したモノクローナル抗RSAマウス抗体 1部
− 濃度4.2μMのテトラサイクリン受容体(TetR) 5部
− NaCl 150mMを含む50mM NaPi緩衝液(pH7.8)で希釈したモノクローナル抗TetRマウス抗体 1部
− 濃度50μMのビオチン化された核酸 1部
− NaCl 150mMを含む50mM NaPi緩衝液(pH7.8)で希釈したポリクローナル抗スルファミドウサギ抗体 1部
− BSA−スルファジメトキシン−金(粒径40nm)の希釈液 7部
− 520nmの光学密度(OD)=10のコロイド金(粒径40nm)が付着した抗マウス抗体 13部
− BSA2%、デキストラン1%、ショ糖5%を含む120mM,pH8のヘペス緩衝液 16部
この混合物は必要に応じて調製され、または20時間凍結乾燥して調製される。
捕捉システムは実施例1のものと同様である。しかし、この場合には、RSA受容体を捕捉する第1の捕捉部位を形成するのはラクトグロブリン−アンピシリンであり、TetR受容体を捕捉する第2の捕捉部位を形成するのはアビジンであり、抗スルファミドウサギ抗体を捕捉する第3の捕捉部位を形成するのは抗ウサギニワトリ抗体である。
冷たい牛乳200μLを、上記の調製試薬50μLの存在下に30℃で15分間インキュベートする。この第1のインキュベーション後、上記の回収(捕捉)要素を溶液中に浸漬する。最終判定を15分間の第2のインキュベーション後に行う。結果を表7に示す。
(1)生きた動物および動物性食品における特定の物質およびそれの残留物を監視する手段に関する1996年4月29日の理事会指令96/23/CEおよび廃止指令85/358/CEEおよび86/460/CEEおよび決定89/187/CEEおよび91/664/CEE.
(2)動物起源の食品における動物用医薬品の最大限の残留物限界の確立のための委員会手順を規定する1990年6月26日の理事会規則(EEC)第2377/90号。
(3)Off.J.Eur.Comm.2002年、L221/8 − 2002/657/CE。
(4)ヒサオ・オカ(Hisao Oka)、農業において使用される抗生物質の化学的分析、AOAC INTERNATIONAL、1995年、ISBN0−935584−57−9。
(5)ロン フェアハイジェン(Ron Verheijen)ら、Analyst 123(1998年)、2437−2441頁。
(6)ゴレミ・コルタ(Golemi−Kotra),Dら、The Journal of Biological Chemistry、第278巻、第20号(2003年5月)、18419−18425頁。
(7)カチャブ(Kachab),E.H.ら、The Journal of Immunology Methods、第147巻、第1号(1992年)、33−41頁。
(8)フレンス(Frens),G.、Nature(London)、Phys.Sci.、241(1973年)、20頁。
(9)ディクソン・ホール(Dixon−Holland)D.E.、およびカッツ(Katz)、S.E.、(1988年)、J. Assoc.Off.Anal.Chem.(1988年)71(6)、1137−40頁。
Claims (17)
- 異なる系列の抗生物質、少なくともβ−ラクタム系およびテトラサイクリン系抗生物質を同時に分析するための分析用キットであって、
少なくとも、β−ラクタム系抗生物質を特異的に認識する第1の受容体と、
第2の受容体と、ビオチン化された核酸断片とを含有し、前記第2の受容体は、分析試料中のテトラサイクリン系抗生物質および前記ビオチン化された核酸断片を競合的かつ特異的に認識する、反応性混合物と、
ニトロセルロース膜の所定の位置に区画された2つの試験ゾーンに、それぞれβ−ラクタム環を有する抗生物質及びアビジン、またはこの逆、が沈着された固体担体から成る捕捉システムとを備え、
前記捕捉システムの両試験ゾーンで検出される各々の標識強度が、標識された各受容体が各抗生物質を競合的に認識する結果に基づくように構成されることを特徴とする分析用キット。 - ニトロセルロース膜に結合したβ−ラクタム環を有する前記抗生物質がペニシリンまたはセファロスポリンであり、前記アビジンが、卵白アビジンであることを特徴とする請求項1に記載の分析用キット。
- 前記第1受容体および前記第2受容体は、コロイド金の粒子によって直接的に、または抗体及びプロテインAが付着した抗体のいずれかを介して間接的に標識されることを特徴とする請求項1に記載の分析用キット。
- ニトロセルロース膜に結合したβ−ラクタム環を有する前記抗生物質が、β−ラクトグロブリンに固定したアンピシリンであることを特徴とする請求項2に記載の分析用キット。
- 前記反応性混合物に添加された前記抗体が、化学的にまたは組換えによって修飾または非修飾され、精製または非精製であり、コロイド金の粒子に直接または間接的に付着または非付着しているモノクローナルまたはポリクローナル抗体であることを特徴とする請求項3に記載の分析用キット。
- 前記ニトロセルロース膜が沈着されたディップスティック担体の一端が膜に、他端が吸収紙に接触するとともに、
液体の流れ方向に沿って配置された前記試験ゾーンと、
2つの試験ゾーンを区画する対照ゾーンとを有することを特徴とする請求項1〜5のいずれか1項に記載の分析用キット。 - 前記対照ゾーンが、コロイド金の粒子によって標識されたタンパク質調製物によって得られることを特徴とする請求項6に記載の分析用キット。
- 前記対照ゾーンが、コロイド金の粒子に付着したウシ血清アルブミンもしくはBSAによって得られることを特徴とする請求項7に記載の分析用キット。
- β−ラクタム系、テトラサイクリン系、およびスルファミド系抗生物質を同時に分析するための請求項1に記載の分析用キットであって、
前記反応性混合物が、さらに、スルファミド系抗生物質を特異的に認識する標識抗体を含み、
前記捕捉システムが、さらに、スルファミドとコンジュゲートしたタンパク質の調製物が前記ニトロセルロース膜に固定されて成ることを特徴とする請求項1または請求項2に記載の分析用キット。 - スルファミド系抗生物質を特異的に認識する前記標識抗体が、コロイド金の粒子で直接または間接的に標識されていることを特徴とする請求項9に記載の分析用キット。
- 前記ニトロセルロース膜が沈着されたディップスティック担体の一端が膜に、他端が吸収紙に接触するとともに、
液体の流れ方向に沿って配置された3つの前記試験ゾーンと1つの対照ゾーンとを有するか、または、
液体の流れ方向に沿って配置された3つの前記試験ゾーンを有し、2つの前記試験ゾーンの間に配置された2つの前記対照ゾーンとを有することを特徴とする、β−ラクタム系、テトラサイクリン系、およびスルファミド系抗生物質を同時に分析するための請求項9に記載の分析用キット。 - 前記反応性混合物が、抗スルファミド抗体と、遊離スルファミドの標識された類似体とをさらに含有し、前記捕捉システムが、抗スルファミド抗体を標的する抗体をさらに含み前記ニトロセルソース膜の所定の位置に沈着させている、
β−ラクタム系、テトラサイクリン系、およびスルファミド系抗生物質を同時に分析するための請求項1に記載の分析用キット。 - 前記遊離スルファミドの類似体は、直接または間接的にコロイド金の粒子で標識されている、請求項12に記載の分析用キット。
- 分析試料が液体であり、牛乳、蜂蜜、または生物由来の液体のいずれかであることを特徴とする請求項1から請求項13のいずれか1項に記載の分析用キット。
- 前記β−ラクタム系及びテトラサイクリン系抗生物質の分析に使用される受容体がBlaR受容体及びTetR受容体であり、既知の系統の微生物から単離されることを特徴とする請求項1から請求項14のいずれか1項に記載の分析用キット。
- 前記β−ラクタム系及びテトラサイクリン系抗生物質の分析に使用される受容体が、黄色ブドウ球菌から単離されたBlaR受容体及び大腸菌のプラスミドpSC101から単離されたTetR受容体であることを特徴とする請求項15に記載の分析用キット。
- 請求項1から請求項16のいずれか1項に記載の分析用キットを用いた分析方法であって、
前記反応性混合物と、系列を判定する試料とを接触させて溶液を調製し、前記溶液を30℃〜50℃の温度で3〜15分間インキュベートする段階と、
前記捕捉システムを有するディップスティックを得られた前記溶液に浸漬し、3〜15分間インキュベートする段階と、
前記ディップスティック上に現れた結果を裸眼によって視覚的に、または光学的ディップスティックリーダーによって判定する段階と
を含むことを特徴とする分析方法。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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