ES2312122T3 - Procedimiento in vitro para la deteccion y la identificacion simultaneas de antibioticos de clases diferentes y kit de diagnostico correspondiente. - Google Patents
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Abstract
Kit de diagnóstico para la determinación simultánea de antibióticos de clases diferentes, por lo menos de las Beta-lactamas y de las tetraciclinas, caracterizado porque comprende: - por un lado, una única mezcla de reacción que contiene por lo menos un primer receptor, específico del reconocimiento de las Beta-lactamas, un segundo receptor que reconoce de manera específica y competitiva una tetraciclina, y un fragmento de ácido nucleico biotinilado, siendo los dos receptores marcados preferentemente mediante unas partículas de oro coloidal, o bien directamente o bien indirectamente mediante un anticuerpo o un anticuerpo en asociación con proteína A; y - por otro lado, un sistema de recuperación en forma de un soporte sólido que comprende una membrana de nitrocelulosa sobre la cual se fijan en dos sitios conocidos y distintos denominados zonas de ensayo, respectivamente un antibiótico con núcleo Beta-lactama y una avidina o inversamente; de tal manera que la intensidad de marcación detectada sobre el sistema de recuperación en las dos zonas de ensayo resulte de manera independiente de un reconocimiento competitivo de cada antibiótico por su receptor marcado.
Description
Procedimiento in vitro para la detección
y la identificación simultáneas de antibióticos de clases diferentes
y kit de diagnóstico correspondiente.
La presente invención se refiere a un
procedimiento que consiste en hacer reaccionar simultáneamente en
una única mezcla de reacción un conjunto de diversas moléculas
biológicas de reconocimiento, capaces de detectar específicamente
varios analitos distintos con una sensibilidad elevada, y de
determinar la clase de analitos a la que pertenece cada uno de los
compuestos detectados, sin que el principio de reconocimiento
específico de una clase de analitos determinada pueda interferir en
el principio de reconocimiento específico de otra clase de
analitos.
La invención se refiere asimismo al kit de
diagnóstico concebido especialmente para poner en práctica dicho
procedimiento.
Un principio fundamental que rige las buenas
prácticas de observación y de control de la cadena alimenticia
impone realizar unos análisis de control lo más corriente arriba
posible de la producción para permitir identificar y aislar lo más
rápidamente posible los alimentos con sospecha de estar
contaminados.
Como regla general, cuando se procede a unos
ensayos de detección frecuentemente denominados "ensayos de
cribado", una muestra detectada positiva durante un primer
análisis de control sólo se supone que es efectivamente positiva y
debe sufrir obligatoriamente un segundo ensayo denominado "de
confirmación". Por el contrario, si un ensayo inicial de
detección da una respuesta negativa, es suficiente, y no debe
confirmar de nuevo el resultado ningún análisis posterior
^{(1)}.
Una primera consecuencia de esta regla es que el
primer procedimiento de detección debe poder cubrir la detección de
un máximo de compuestos. Los ensayos de cribado o de detección deben
ser, por lo tanto preferente y lógicamente unos "ensayos
multi-analitos".
Una segunda consecuencia de esta regla es que es
importante conocer la clase a la que pertenece el compuesto
encontrado en una muestra positiva durante el ensayo de cribado con
el fin de poder orientar directamente el procedimiento de
confirmación que es en general muy particular, puesto que se
recomienda aislar e identificar el compuesto en cuestión.
Una tercera consecuencia de esta regla es que un
ensayo de cribado no puede dar ningún resultado de tipo "falso
negativo" puesto que éstos escaparán entonces del análisis en
esta etapa preliminar y no se confirmarán
posterior-
mente.
mente.
Actualmente se conocen diversos procedimientos
para la detección de antibióticos:
- -
- los ensayos microbiológicos que miden el poder inhibidor de una muestra sobre el crecimiento de una cepa bacteriana. Este tipo de ensayo necesita un tiempo de incubación relativamente largo (entre 3 y 16 horas) antes de la obtención del resultado. En general, estos ensayos (Delvotest® SP, BRTTest, Copan^{TM}, Eclipse^{TM}, Valio^{TM}) tienen la capacidad de reconocer varias clases de antibióticos simultáneamente puesto que las cepas bacterianas usadas son con frecuencia sensibles a varios compuestos de clases diferentes. Sin embargo, este tipo de ensayo no permite identificar a qué clase precisa pertenece el compuesto de antibiótico ensayado;
- -
- los ensayos in vitro funcionan, en el caso de la detección de pequeñas moléculas, según un principio de competición entre el compuesto a buscar que está presente en la muestra y un competidor marcado que se ha introducido voluntariamente en la muestra para un único y mismo sitio de reconocimiento que puede estar constituido o bien por un receptor, o bien por un anticuerpo. En una formulación de tipo ELISA (Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay) o RIA (Radio Immuno Assay)/RRA (Radio Receptor Assay), el tiempo necesario para un análisis es del orden de 2 a 6 horas. Algunos de estos procedimientos, en particular los procedimientos RRA de laboratorio, permiten la detección simultánea de varios compuestos de clases diferentes. Sin embargo, en este caso, el procedimiento no permite identificar a qué clase pertenece el compuesto que ha dado una respuesta positiva;
- -
- los procedimientos físico-químicos, más complejos, que permiten aislar e identificar el compuesto buscado son, por su parte, y desde hace poco tiempo, principalmente unos procedimientos en los que un sistema de separación cromatográfico se acopla a un sistema de detección en espectrometría de masas (GC/MS o LC/MS). Estos procedimientos necesitan la adaptación de protocolos particulares para cada compuesto distinto a identificar. Unas veces, un único compuesto o una parte de los compuestos de una misma clase se pueden analizar simultáneamente, otras veces es el conjunto de los compuestos de una misma clase el que se puede detectar pero esto nunca es posible con unos compuestos de clases distintas. En efecto, el principio de separación cromatográfica es característico de las propiedades físico-químicas de un compuesto dado, siendo estas últimas con frecuencia diferentes de una clase a otra. En el caso en el que el operario no conozca el tipo de compuesto a identificar, debe pasar revista a tantos procedimientos como clases de compuestos existen.
Desde hace algunos años, se asiste asimismo al
desarrollo de procedimientos mucho más rápidos. Estos
procedimientos, denominados "RAPID TESTS" se usan para
efectuar una detección rápida sobre un gran número de muestras. En
general, estos procedimientos explotan el reconocimiento de los
compuestos buscados frente a una molécula biológica según un
principio de competición. Para hacer el análisis rápido y práctico,
estos tipos de ensayos funcionan con la ayuda de dispositivos
membranarios de flujo lateral (Tetrasensor^{TM}, SNAP®,
Beta-STAR^{TM}, ROSA). Estos ensayos se declinan
según diversas clases de antibióticos pero ningún producto conocido
en la actualidad permite detectar en una única operación unos
compuestos que pertenecen a unas clases diferentes.
Aunque es razonable prever e imponer al sector
agro-alimentario unos análisis de detección
primaria, el sector en cuestión solicitará el análisis más completo
posible y que pueda identificar preferentemente un máximo de
compuestos sospechosos. En efecto, es más práctico y económico
realizar un único ensayo múltiple a partir de una única muestra en
lugar de tener que realizar un ensayo particular para cada compuesto
particular. Esta práctica es pesada en tiempo, en gestión de las
muestras y en coste. Constituye un freno a la buena gestión y al
control eficaz de los productos alimenticios.
El control encuentra por lo tanto en esta etapa
un límite importante a la eficacia que se caracteriza por la
ausencia de ensayos multi-analitos que permitirían
detectar en una única operación y en menos de 10 minutos por
ejemplo, el conjunto de los compuestos de varias clases de
analitos.
En particular, el sector
agro-alimentario estaría interesado en un nuevo
procedimiento que permite prever en una única operación el análisis
de los compuestos que pertenecen a por lo menos dos clases
diferentes de antibióticos.
El tipo de antibiótico que se puede administrar
a unos animales puede variar según se trate de una aplicación
terapéutica o profiláctica, según la especie animal, el germen a
combatir, las prácticas veterinarias, la legislación en vigor, los
medios disponibles o también las zonas geográficas. En el caso de
ciertos tratamientos particulares, se usa una mezcla de
medicamentos. Como regla general, el experto en la materia usa unos
productos antibióticos seleccionados de entre todos los compuestos
comercialmente disponibles según su apreciación de la mejor
eficacia.
Las principales clases de antibacterianos y de
antibióticos usados son: las penicilinas y cefalosporinas, las
tetraciclinas, las sulfamidas, los aminoglucósidos y
aminociclitoles, los macrólidos, los cloramfenicoles u otros
péptidos, ionóforos, nitrofuranos, quinolonas, carbadox, etc. Todas
estas clases agrupan un conjunto muy amplio de compuestos
químicamente diferentes.
Se cree que el uso, a veces intensivo, de
antibióticos en medicina veterinaria y en producción agrícola podría
ser el origen de la emergencia de cepas bacterianas que se han
vuelto resistentes a los antibióticos. Para preservar la salud
humana y legiferar en la materia, numerosos países (Unión Europea,
USA, Canadá, etc.) han establecido unos límites máximos autorizados
(MRL) para los residuos de antibióticos en los productos
alimenticios ^{(2)}. Estos MRL fijan de alguna forma el límite
entre una muestra positiva y una muestra negativa, es decir, entre
una muestra rechazada y una muestra aceptada.
Por otro lado, la decisión de la Comisión del 12
de agosto de 2002 ha fijado los límites de prestaciones mínimos
requeridos (LPMR) aplicables a los procedimientos de análisis a usar
para el examen de las muestras, y ha definido unos criterios comunes
para la interpretación de los resultados ^{(3)}.
Se entiende que únicamente las técnicas de
análisis de las que se puede demostrar, en base a unas pruebas
identificables, que están validadas y que tienen un índice de falsos
conformes inferior a 5% al nivel considerado, deben ser aplicadas
para los fines de detección según la Directiva 96/23/CE.
En 1995, como media el uno por ciento de todas
las muestras analizadas con relación a su contenido en antibióticos
presentaba un contenido superior a la MRL y daba una respuesta
positiva. Cuando estos resultados positivos se han confirmado, los
productos encontrados con la mayor frecuencia eran unas penicilinas
y unas tetraciclinas ^{(4)}.
Se describe un sistema de reconocimiento de las
moléculas de tetraciclina en la solicitud de patente del solicitante
WO-A-03/048770 y titulado
"Procedimiento para efectuar un diagnóstico in vitro
mediante unos mecanismos de regulación genética y kit de
diagnóstico correspondiente". Este procedimiento únicamente
permite detectar unas tetraciclinas. En una formulación preferida,
los agentes reactivos están constituidos por un receptor tetR,
aislado del mecanismo de regulación genética de E. coli para
la resistencia a las tetraciclinas, por un anticuerpo capaz de
reconocer el receptor y por una preparación de proteína A conjugada
con unas partículas de oro coloidales. Por otro lado, el sistema de
recuperación es un fragmento de ADN específico y biotinilado que se
puede inmovilizar sobre una molécula de avidina fijada sobre una
membrana de nitrocelulosa. Es durante la incubación en presencia de
la muestra cuando el receptor y el fragmento de ADN interactúan
únicamente en ausencia de tetraciclina. En este caso, el fragmento
de ADN forma un complejo con el receptor y aparece una señal
generada por las partículas de oro fijadas al receptor. En el caso
contrario, el receptor que ha reconocido previamente una molécula
de tetraciclina ya no es capaz de enlazarse al fragmento de ADN y
por consiguiente no aparece ninguna señal.
En la patente
WO-A-99/67416 titulada
"Procedimiento para la determinación de antibióticos con núcleos
\beta-lactama en un líquido biológico" se
describe un sistema de reconocimiento de las
\beta-lactamas. Según este procedimiento,
únicamente es posible detectar unas
\beta-lactamas. En una formulación preferida, los
inventores describen por un lado un receptor aislado de Bacillus
licheniformis, purificado y acoplado químicamente a unas
moléculas de biotina, al que se asocia una preparación de
anticuerpos anti-biotina conjugados con unas
partículas de oro coloidales, y por otro lado un conjugado formado
por una cefalosporina acoplada a una inmunoglobulina humana e
inmovilizada sobre una membrana de nitrocelulosa. En el caso en el
que la muestra no contenga ninguna \beta-lactama,
el receptor se fija al antibiótico inmovilizado y aparece una señal
generada por las partículas de oro fijadas al receptor de biotina,
mediante un anticuerpo anti-biotina acoplado al oro.
En el caso contrario, si el receptor es inhibido durante una
incubación previa con la muestra a ensayar, ya no es capaz de
enlazarse al antibiótico inmovilizado y por consiguiente no aparece
ninguna señal.
Se conoce asimismo un sistema de reconocimiento
rápido de las sulfamidas descrito por R. Verheijen et al.
^{(5)} y titulado "Development of a one step strip test for the
detection of sulfamidine residues". Este sistema usa un
principio similar al de la detección de las
\beta-lactamas mencionado anteriormente. Por un
lado, se conjuga un anticuerpo específico de las sulfadimidinas a
unas partículas de oro coloidales y es una sulfadimidina la que se
conjuga con una ovoalbúmina y se inmoviliza sobre una membrana de
nitrocelulosa. Si la muestra contiene unas sulfadimidinas
reconocidas por el anticuerpo, éste forma un complejo que es incapaz
de encontrar ulteriormente el compuesto inmovilizado y por
consiguiente no podrá fijarse en el mismo. En el caso contrario, en
ausencia de sulfadimidina en la muestra, el anticuerpo conjugado
podrá reconocer la sulfadimidina inmovilizada y aparecerá una señal
coloreada. Este artículo no indica la especificidad de este
ensayo.
Todos los métodos y procedimientos rápidos de
flujo lateral, conocidos en la actualidad, se aplican únicamente a
la detección de una única y misma clase de compuestos y no existe en
la actualidad ningún procedimiento que permita detectar en una
única operación todos los compuestos que pertenecen a por lo menos
dos clases distintas de antibióticos. Las principales razones son
una incompatibilidad técnica para reunir de manera independiente y
no interferente, en un único y mismo procedimiento, todos los
agentes reactivos necesarios para la detección de cada una de las
clases. La segunda dificultad reside a continuación en la manera de
alcanzar la identificación de la clase a la cual pertenece el
compuesto detectado.
En resumen, los sistemas rápidos conocidos para
la detección de pequeñas moléculas (MW < 2.000) funcionan sobre
el principio de competición que necesita el uso de dos elementos
particulares que son, por un lado, una molécula que pueda reconocer
específicamente el compuesto a detectar, siendo esta molécula en
general un receptor bacteriano o una inmunoglobulina (anticuerpo),
y por otro lado, un competidor para el sitio de reconocimiento.
Según el procedimiento elegido, se inmoviliza uno de los elementos
sobre un soporte y se marca el otro elemento. En cierto casos
(formato 1, véase a continuación), es la molécula de reconocimiento
la que está marcada y un análogo del analito el que está
inmovilizado; en otros casos (formato 2, véase a continuación), es
un análogo del analito el que está marcado y es la molécula de
reconocimiento la que es solidaria de una fracción insoluble.
La originalidad del sistema de detección de las
tetraciclinas se caracteriza porque el receptor comprende dos
sitios de reconocimiento interdependientes y por consiguiente, el
competidor no es un análogo del analito buscado sino un fragmento
de ADN capaz de fijarse al segundo sitio de reconocimiento del mismo
receptor.
En todos los procedimientos denominados "RAPID
TESTS" la apreciación se realiza comparando la intensidad de la
señal obtenida con la zona "ensayo", es decir, en el sitio en
el que el elemento de recuperación del receptor activo está
inmovilizado con relación a la intensidad de otra señal que se
obtiene en la zona "control", es decir, en el sitio en el que
se recuperan otros agentes reactivos (o el excedente de los agentes
reactivos). En general, cuando la intensidad en la zona
"ensayo" es más marcada que en la zona "control", el
resultado es negativo para el elemento buscado.
En todos los casos relativos a la determinación
de las moléculas de \beta-lactamas, la molécula de
reconocimiento se obtiene a partir de la preparación de
Bacillus, y en todos los casos, esta molécula está marcada
después de la purificación. Para realizar esta marcación, se
necesita proceder a una modificación química de superficie. Por
ejemplo, puede estar enlazada químicamente a una enzima, tal como es
el caso con el receptor de Bacillus stearothermophillus
acoplado a peroxidasa (EP-A-0 593
112 y US-A-5.434.053 de Giest
Brocades) o a una biotina, tal como es el caso con el receptor de
Bacillus licheniformis acoplado a una biotina
(WO-A-99/67416 y
US-A-6.524.804 de U.C.B. S.A.) o
también al receptor de Bacillus stearothermorphillus
directamente conjugado con oro coloidal
(US-A-6.475.805 de Charm Inc.). Con
la excepción del procedimiento Tetrasensor^{TM}, en los demás
casos conocidos en la actualidad, es necesario modificar
químicamente la molécula de reconocimiento para obtener un complejo
coloreado. Por consiguiente, es necesario purificarla y modificar
ciertos sustituyentes de superficie, con el riesgo de modificar una
propiedad importante de funcionalidad o de estabilidad.
En los demás casos conocidos en la actualidad
por consiguiente es generalmente imposible trabajar o bien con unos
extractos brutos no purificados o bien con unos receptores que no
estarían modificados químicamente.
Por otro lado, el tipo de marcación que se
explota en la determinación "tetraciclina" no es compatible con
la determinación de las \beta-lactamas puesto
que, en ésta, es una inmunoglobulina la que se inmoviliza en la
zona "control" en todos los casos mostrados. En el caso del
documento WO-99/67416, es también una
inmunoglobulina la que sirve de proteína de anclaje para
inmovilizar el competidor en la zona "ensayo". El uso de la
proteína A, tal como en la determinación de las tetraciclinas,
provocaría inevitablemente una marcación no específica sobre una o
sobre las dos líneas de captura necesarias para la detección de las
\beta-lactamas.
En otro orden de ideas, cuando se debe recurrir
al uso del conjunto avidina-biotina para facilitar o
bien la fijación sobre el soporte, o bien la marcación, el conjunto
avidina-biotina se puede usar en un procedimiento
dado únicamente para un único reconocimiento específico. En efecto,
si una avidina constituye un punto de anclaje, todas las moléculas
biotiniladas podrán fijarse en la misma. En tal caso, es
irrealizable en particular prever un ensayo para la detección común
de las \beta-lactamas y de las tetraciclinas que
estaría basado, por ejemplo, en la reunión de los dos principios de
determinación descritos en el documento
WO-A-99/67416 y en el documento
WO-A-03/048770. En efecto, en el
primer caso el receptor está biotinilado para después estar marcado
con la ayuda de antibiotina-oro y, en un segundo
caso se inmoviliza avidina para recuperar un fragmento de ADN
biotinilado. La reunión de estos dos principios conduciría también a
otro conflicto entre los dos sistemas independientes que usan los
pares avidina-biotina. En una reunión de dos
sistemas existentes, el receptor biotinilado del sistema
\beta-lactama se fijaría en la avidina necesaria
para recuperar el ADN del sistema tetraciclina y por consiguiente
ocasionaría una marcación no específica independientemente del
contenido de tetraciclina en la muestra. Además, la presencia de
antibiotina-oro en la fase móvil, interferiría con
el ADN biotinilado impidiendo que éste encontrara la avidina
necesaria para su captura, lo que conduciría también a otro
conflicto.
En un tercer orden de ideas, la reunión de dos
sistemas independientes de reconocimiento necesitaría un sistema de
lectura y de interpretación del resultado bastante complejo en el
que cada uno de los marcadores se debe apreciar mediante la
intensidad relativa a una referencia interna. Por lo tanto, habría
dos bandas "ensayo" ("beta" y "tetra") y dos bandas
"control". Esta visión no hace del análisis ni simple ni
práctico. En el ámbito de una reunión de dos ensayos, sería mejor
apreciar cada una de las intensidades de los ensayos por comparación
entre sí. En dicha práctica, la zona "ensayo" para el analito
nº 1 se volvería la zona "control" para el analito nº 2 y
viceversa. En el caso en el que las dos clases de analitos en
cuestión estuvieran presentes en el mismo tiempo en una misma
muestra, este enfoque no generaría ninguna señal o generaría poco
una señal. Es poco frecuente el caso pero si se presentara, para
evitar una interpretación difícil en el caso de una doble
contaminación mediante unas \beta-lactamas y unas
tetraciclinas, conviene preconizar la adición de una referencia
única en forma de una única línea de control que permite apreciar
más fácilmente la intensidad relativa de las dos señales de
ensayos. Resulta evidente que está única línea de control se
volvería necesaria en el caso en el que más de dos ensayos
estuvieran integrados en un mismo procedimiento.
En un cuarto orden de ideas, los materiales
elegidos expresa y preferentemente para constituir el dispositivo
de varilla del kit de diagnóstico deben ser compatibles para el
análisis simultáneo de las dos clases de analitos. En efecto, en un
modo de realización preferido descrito en el documento WO 99/67416,
se recomienda usar la membrana de tipo "Leukosorb®" que no es
compatible con el enfoque que se preconiza para el ensayo de las
tetraciclinas y no convendría para una determinación
multi-analito. En efecto, muy extrañamente, en una
formulación en la que los dos receptores están marcados con la
ayuda de sus anticuerpos respectivos, es imposible obtener un punto
de corte limpio mediante la adición de
\beta-lactamas cuando los agentes reactivos
encuentran la membrana Leukosorb® antes de alcanzar el punto de
captura. Esta membrana, cuya eficacia ha sido demostrada para la
purificación de la leche y el uso en flujo lateral, es la causa de
señales de reconocimiento no específicas cuando la marcación se
realiza con la ayuda de anticuerpos y de proteína A conjugada con
oro coloidal.
En un quinto orden de ideas, la elección de los
receptores implicados en el reconocimiento del conjunto de los
compuestos de cada unas de las clases es importante. Esta elección
no está determinada únicamente por las prestaciones de
reconocimiento de los compuestos sino también por unos criterios de
estabilidad, de estructura, de reactividad antigénica, de
composición en aminoácidos, etc.
En conclusión, en base a los procedimientos
conocidos, es imposible a priori reunir en un único y mismo
procedimiento por lo menos dos procedimientos independientes, por
ejemplo para el reconocimiento mediante unos receptores de las
\beta-lactamas y de las tetraciclinas, sin prever
unas modificaciones sustanciales que permiten reunir todos los
elementos necesarios asegurando que el sistema de reconocimiento de
un compuesto no interfiere con el sistema de reconocimiento de otro
compuesto.
La presente invención tiene por objetivo
proporcionar un nuevo procedimiento de diagnóstico que permite
detectar simultáneamente un conjunto -en principio limitado- de
compuestos que pueden pertenecer a por lo menos dos clases
distintas de analitos y caracterizar la clase a la que pertenece
efectivamente un compuesto detectado.
En particular, la invención pretende demostrar
la compatibilidad técnica y práctica de reunir en un único y mismo
procedimiento por lo menos dos mecanismos de detección sin que el
funcionamiento de uno de ellos pueda interferir con el
funcionamiento del otro mecanismo.
\newpage
Otro objetivo de la invención es demostrar la
factibilidad técnica de una determinación
multi-analitos que puede realizarse rápidamente, por
ejemplo en menos de 30 minutos y en una única y misma etapa de
análisis con la ayuda de una única y misma muestra.
Otro objetivo de la invención es proporcionar un
procedimiento y un kit de diagnóstico in vitro para la
detección y la determinación simultánea de por lo menos dos clases
de analitos.
Un primer objeto de la presente invención,
enunciado en las reivindicaciones respectivas 1, 3, 4 y 10, se
refiere a un kit de diagnóstico para la detección o la
cuantificación simultánea y específica de por lo menos dos analitos
que pertenecen a unas clases de antibióticos diferentes, es decir,
por lo menos dos clases de entre las
\beta-lactamas, las tetraciclinas y las
sulfamidas, caracterizado porque comprende, de manera genérica, por
ejemplo:
- -
- por un lado, una única mezcla de reacción, preferentemente en forma de una disolución o de un liofilizado, que comprende por lo menos dos moléculas biológicamente diferentes, capaces cada una de reconocer, respectiva, simultánea y específicamente, un analito determinado presente en una muestra que puede contener unos analitos que pertenecen a dichas clases distintas de analitos; y
- -
- por otro lado, un sistema de recuperación en forma de un soporte sólido único al que se encuentran fijados, en sitios distintos y conocidos en el espacio, unos ligandos respectivos capaces de recuperar específica, selectiva y exclusivamente cada una de dichas moléculas biológicas contenidas en dicha mezcla de reacción, de manera que se identifica mediante el sitio de la recuperación sobre dicho soporte, el tipo de clase a la que pertenece cada uno de los analitos presentes en la muestra.
Según el caso, o bien el elemento de
recuperación inmovilizado es un análogo competidor de la sustancia
buscada y se marca el receptor en disolución, o bien el análogo
competidor en disolución se marca y el elemento de recuperación
inmovilizado es el receptor. También pueden coexistir según la
invención unos sistemas mixtos.
En las reivindicaciones subordinadas 2, 5 a 9 y
11 y 12 se describen unos modos preferidos de la invención.
Un segundo objeto de la invención, indicado en
la reivindicación 13, se refiere a un procedimiento de utilización
de un kit de diagnóstico según cualquiera de las reivindicaciones 1
a 12, caracterizado porque presenta las siguientes etapas:
- -
- poner en contacto la mezcla de reacción citada anteriormente con una muestra a caracterizar para obtener una disolución que se deja incubar a una temperatura comprendida entre 30ºC y 50ºC durante 3 a 15 minutos;
- -
- sumergir una varilla que contiene el sistema de recuperación citado anteriormente en la disolución obtenida y dejar incubar durante 3 a 15 minutos;
- -
- interpretar el resultado sobre la varilla o bien visualmente, o bien mediante un lector óptico de varilla.
En las formas de realización preferidas de la
presente invención, se preconiza evitar por una parte la
purificación y por otra parte la modificación química del receptor
recurriendo por ejemplo a unos anticuerpos
anti-receptor que estarían marcados o bien
directamente con oro coloidal o bien preferentemente con la ayuda de
proteína A acoplada al oro coloidal. Por otro lado, en una idea de
multiplicidad de detección, la proteína A marcada con el oro
coloidal serviría de marcador genérico para todos los anticuerpos
introducidos en la disolución.
Con el fin de preservar al máximo las
funcionalidades de los receptores y anticuerpos usados en la
presente invención, un principio adoptado es que no tenga lugar
ninguna marcación por modificación química. Por consiguiente, la
presente invención explota los receptores bacterianos en su estado
más natural posible. Estos receptores están marcados con la ayuda
de anticuerpos que serán a su vez reconocidos por una proteína A
conjugada con oro coloidal. Llegado el caso, es por lo tanto
exclusivamente la proteína de marcación la que estará acoplada con
el oro pero no las moléculas sensibles para el reconocimiento de los
analitos en cuestión.
En este enfoque, todos los grupos funcionales de
las moléculas sensibles para el reconocimiento están por lo tanto
preservados. Esta ventaja adquiere toda su importancia cuando se
trata de explotar la actividad de los receptores cuyo mecanismo de
reconocimiento depende de ciertas cadenas laterales tales como los
restos de lisinas por ejemplo. Es aún más importante por cuanto que
cuando tiene lugar una modificación química, en la mayoría de los
casos ilustrados, la modificación implica los restos NH_{3}+ de
las cadenas laterales de las lisinas. En conclusión, un
acoplamiento químico sobre las lisinas puede alterar unas lisinas
del sitio activo y hacer así la preparación parcialmente
inactiva.
La marcación mediante anticuerpos presenta la
flexibilidad de una marcación no paralizada. En efecto, una
marcación química implica una unión covalente e irreversible
mientras que una fijación de anticuerpos es reversible y está
sujeta a un equilibrio que se puede desplazar según las fuerzas en
acción. Otra ventaja es poder modular la etapa de marcación en un
segundo tiempo. En efecto, en una segunda formulación de la presente
invención, es después de la fase de reconocimiento del analito por
el receptor, ya sea el analito libre de la muestra o el analito
inmovilizado para la recuperación, cuando el anticuerpo reconoce el
receptor.
Por diversas razones económicas o de
estabilidad, pero también para una perfecta integración en un ensayo
multi-analitos, la presente invención preconiza
preferentemente el uso de un receptor de las
\beta-lactamas aislado a partir de
Staphylococcus aureus ^{(6)}.
En efecto, siendo originario de la cepa
bacteriana más competente frente a la lucha contra los antibióticos
y las \beta-lactamas en particular, este receptor
usado in vitro ha demostrado unas capacidades excepcionales
de reconocimiento del conjunto de compuestos de las
\beta-lactamas, tanto para las penicilinas como
para las cefalosporinas (véase ref. ^{(6)} y resultados recogidos
en los ejemplos).
Otra ventaja de este receptor es que tiene un
punto isoeléctrico (pl) básico. Esto ofrece la posibilidad de poder
purificarlo muy fácilmente a partir de un extracto bruto de células
para obtener unos anticuerpos.
Por otro lado, la elección de los inventores ha
estado determinada asimismo por la observación de una muy buena
respuesta inmunitaria en el conejo, muy específica y que no
ocasionaba ninguna respuesta no específica con el resto del
conjunto de los agentes reactivos implicados en la determinación
multi-analitos.
Según la presente invención, se ha podido
formular un procedimiento en el que es posible reunir en una única y
misma operación todos los elementos necesarios para la detección
común de varios compuestos de clases diferentes usando unos
mecanismos de reconocimiento totalmente diferentes.
La presente invención ofrece la ventaja
suplementaria de proponer una formulación de un ensayo
multi-analitos fiable y económico. En efecto, no es
necesario purificar los receptores, ni las preparaciones de
anticuerpos, y además los receptores no se modifican químicamente,
lo que debería preservar la integridad de su reactividad así como su
estabilidad.
La figura 1 representa esquemáticamente un
ejemplo de posicionamiento de los elementos de recuperación según la
invención sobre un soporte sólido de nitrocelulosa en el caso de la
determinación simultánea sólo de dos antibióticos, estando asimismo
prevista una zona de control fija.
La figura 2 representa esquemáticamente un
ejemplo de posicionamiento de los elementos de recuperación según la
invención sobre un soporte sólido de nitrocelulosa en el caso de la
determinación simultánea de tetraciclinas, de
\beta-lactamas y de sulfamidas, estando prevista
asimismo una zona de control fija.
Tal como se ha evocado en el estado de la
técnica, un ensayo de competición previsto según la presente
invención puede presentarse en particular en dos formatos
diferentes. En el primer caso (formato 1), son los receptores los
que se conjugan con unas partículas de oro coloidales y los
compuestos competidores, análogos de la sustancia buscada, los que
sirven de elementos de recuperación siendo inmovilizados en el punto
de captura específico. En el segundo caso (formato 2), son los
compuestos competidores, análogos de la sustancia buscada, los que
se conjugan con unas partículas de oro coloidales, y son los
receptores los que sirven de elementos de recuperación siendo
inmovilizados en el punto de captura específico. En ciertos casos de
detección multi-analitos, se puede disponer asimismo
de un sistema mixto (formato 1 y 2 presentes).
El procedimiento usa una mezcla de reacción que
contiene los dos receptores respectivos de las
\beta-lactamas y tetraciclinas, así como sus
agentes reactivos y un elemento de recuperación en el que se
encuentran inmovilizados, en unos sitios precisos y distintos, unos
ligandos específicos de estos receptores.
\vskip1.000000\baselineskip
Para la detección de las
\beta-lactamas, la mezcla de reacción contiene el
receptor específico de reconocimiento de las
\beta-lactamas, su anticuerpo específico y una
preparación de proteína A conjugada con oro coloidal. Para la
detección de las tetraciclinas, la mezcla de reacción contiene el
receptor de las tetraciclinas, su anticuerpo específico, un
fragmento de ADN específico conjugado con biotina y una preparación
de proteína A conjugada con oro coloidal.
\newpage
\global\parskip0.930000\baselineskip
El receptor \beta-lactama se
obtiene según el procedimiento descrito por
Golemi-Kotra et al. ^{(6)}. El receptor no
purificado se filtra sobre una membrana Millex HV (Millipore, Inc,
USA) antes de ser conservado a 4ºC en presencia de glicerol al 50%
v/v. El receptor de tetraciclina se obtiene según el procedimiento
descrito en la solicitud de patente
WO-A-03/048770.
Las dos preparaciones de anticuerpos se obtienen
según el procedimiento descrito en Kachab et al. ^{(7)}.
Estas preparaciones de anticuerpos se han obtenido mediante la
inyección de una preparación de receptor purificado hasta la
homogeneidad proteica según Golemi-Kotra et
al. ^{(6)} para el receptor de
\beta-lactamas y según la solicitud
WO-A-03/048770 para el receptor de
tetraciclinas. Las dos preparaciones de anticuerpos se usan
preferentemente no purificadas, lo que significa que es un suero no
purificado lo que se añade directamente a la mezcla de reacción.
Según un segundo modo preferido, los anticuerpos específicos, de
tipo policlonal o monoclonal, se purifican según los procedimientos
conocidos por el experto en la materia para ser después acoplados o
bien directamente o bien indirectamente a unas partículas de oro
coloidal según el procedimiento de Frens ^{(8)}.
El fragmento de ADN se obtiene de Eurogentec SA,
Bélgica, según la secuencia y la preparación tomada de la solicitud
de patente WO-A-03/048770. En este
caso preciso, el fragmento de ADN no se inmoviliza en un punto de
captura sobre una membrana de nitrocelulosa sino que se integra
directamente a la mezcla de reacción. Este fragmento se recuperará
in testo con la ayuda de su extremo biotinilado sobre avidina
inmovilizada en un punto de captura (véase a continuación).
El conjunto de los agentes reactivos necesarios
se introducen sin ninguna modificación química ni ninguna
sustitución de manera que se preserva la integridad de las
propiedades de actividad y de estabilidad. Estas moléculas se
pueden purificar o no, lo que presenta una ventaja económica
evidente.
En el ejemplo preciso, la mezcla de reacción
contiene:
- -
- 5 partes de receptor \beta-lactama (RSA) a una concentración de 360 nM;
- -
- 5 partes de receptor tetraciclina (TetR) a una concentración de 4,2 \muM;
- -
- 1 parte de suero anti-RSA diluido 4x en tampón NaPi 50 mM, NaCl 150 mM, pH 7,8;
- -
- 1 parte de suero anti-TetR diluido 4x en tampón NaPi 50 mM, NaCl 150 mM, pH 7,8;
- -
- 1 parte de ácido nucleico a una concentración de 25 \muM en NaCl 690 mM;
- -
- 15 partes de proteína A oro de 40 nm con una DO = 10 a 520 nm;
- -
- 22 partes de tampón Hepes 120 mM, pH 8, BSA 2%, dextrano 1%, sacarosa 5%.
Esta mezcla o bien se prepara extemporáneamente
o bien se liofiliza durante 20 horas.
\vskip1.000000\baselineskip
El sistema de recuperación está constituido por
una membrana de nitrocelulosa sobre la cual se encuentran fijados,
en sitios distintos, los elementos capaces de formar un complejo con
las moléculas de reconocimiento de la mezcla de reacción. Estos
elementos son:
- -
- para la señal denominada "beta" (por \beta-lactama), un antibiótico, preferentemente de tipo penicilina o cefalosporina, inmovilizado sobre una molécula que no presenta ninguna reactividad particular con la proteína A o la biotina o también la avidina. En un modo de realización preferido de la presente invención, se usa una ampicilina inmovilizada sobre una \beta-lactoglobulina;
- -
- para la señal denominada "tetra" (por tetraciclina), una avidina capaz de reconocer un fragmento de ADN que presenta en un extremo una molécula de biotina. Preferiblemente, se usará una avidina de huevo.
Las zonas de captura "beta" y "tetra"
se pueden localizar sucesivamente una antes de la otra, o
inversamente, sin preferencia particular mientras que estén
dispuestas en unos sitios espacialmente distintos pero conocidos.
En efecto, es esta posición distinta la que permitirá localizar el
tipo de antibiótico presente en la disolución de análisis. Si los
dos sistemas de captura estuvieran reunidos en un único sitio, no se
alteraría la determinación pero no sería posible determinar qué
tipo de compuesto está efectivamente presente.
\vskip1.000000\baselineskip
Se elige la
\beta-lactoglobulina porque es una proteína de la
leche que contiene muchos restos de lisina (10%) y la estructura
tridimensional indica que la mayoría de las lisinas presentan su
extremo NH_{2} hacia el exterior de la proteína (Pubmed,
structure, 1GXA).
\global\parskip1.000000\baselineskip
Se incuban 100 mg de
\beta-lactoglobulina y 15 mg de
2-iminotiolano en un tampón NaPi 100 mM, pH 8,5 en
un volumen de reacción de 4 ml durante 60 minutos a 25ºC. Después,
la mezcla se deposita sobre una columna PD10
(Amersham-Biosciences, UK) previamente equilibrada
con PBS pH 7, EDTA 5 mM y eluida en este mismo tampón. Se reúnen las
fracciones proteicas según los procedimientos bien conocidos.
Por otro lado, se incuban 2 ml de DMSO que
contiene 100 mg de SICC con 2 ml de una disolución de 50 mg/ml de
ampicilina sódica en tampón NaPi 25 mM, pH 8, durante 60 minutos a
25ºC, antes de ser incubado en presencia de 50 mg de disolución
proteica durante 4 horas a 4ºC. Por último, la disolución se dializa
dos veces durante 6 horas contra 100 volúmenes de tampón NaPi 25 mM,
pH 7,5.
\vskip1.000000\baselineskip
Se prepara una disolución de 5 mg/ml de avidina
de huevo, disponible en Pierce Inc, USA en un tampón NaPi 50 mM, pH
7,5.
\vskip1.000000\baselineskip
La presente invención preconiza el uso de una
línea de control que tiene una intensidad constante y visible antes
y después del desarrollo del ensayo. Esta línea es preferentemente
de color similar al color desarrollado en las líneas "ensayos"
y está sintetizada como sigue.
A una preparación de 27 ml de oro coloidal de 40
nm, obtenida según el procedimiento de Frens ^{(8)} y cuya
densidad óptica DO_{lambda \ max} es de 3, se añaden 3 ml de una
disolución de BSA (Sigma) al 10% en tampón borato 10 mM, pH 6,5. Se
incuba la mezcla durante 60 minutos a 20ºC antes de centrifugarla
durante 45 minutos a 10.000 rpm en un rotor SS34 (Sorvall).
Después, se recupera el residuo en un tampón NaPi 50 mM, NaCl 150
mM, Con el fin de obtener una DO_{lambda \ max} de 45. La
disolución que se depositará sobre la membrana de nitrocelulosa se
diluye nuevamente 15 veces en el mismo tampón para obtener una DO
final de 3.
\vskip1.000000\baselineskip
La técnica inmunocromatográfica se conoce y se
describe en la bibliografía (Developing immunochromatographic Test
Strips: A short Guide, Millipore, Lit. nº TB500 Printed un USA
11/96, 96-204). En la presente invención, las
preparaciones obtenidas anteriormente se depositan en unos sitios
precisos y distintos sobre una membrana de nitrocelulosa y
preferentemente sucesivamente uno detrás del otro haciendo
referencia al sentido de migración del líquido. La membrana de
nitrocelulosa se dispone a continuación en contacto por un extremo
con una membrana, por ejemplo de tipo 142 disponible en Ahlstrom,
Inc., USA o de tipo GFDVA disponible en Whatman, UK, pero no del
tipo Leukosorb® disponible en Pall, UK, y por el otro extremo con un
papel absorbente cualquiera, por ejemplo, de tipo 17CHR disponible
en Whatman, UK.
\vskip1.000000\baselineskip
Es el posicionamiento de los elementos de
recuperación lo que permitirá identificar el tipo de contaminación
encontrada en la muestra. Las disoluciones se depositan con la ayuda
de un "distribuidor" Biodot (UK) de tipo
Quanti-3000, a un caudal de 1 \mul/cm.
En el caso de una detección de dos parámetros,
es a ambos lados de la línea de control donde se depositarán las
preparaciones de \beta-lactoglobulina y de
avidina. Por ejemplo, el conjugado
\beta-lactoglobulina preparado anteriormente se
depositará por debajo de la línea de control, y la disolución de
avidina neutralizada se depositará por encima de la línea de
control (figura 1). Por consiguiente, la presencia de compuesto
\beta-lactamas se caracterizará por una ausencia
de marcación sobre la \beta-lactoglobulina, es
decir, en la línea de ensayo situada por debajo de la línea de
control, y la presencia de compuestos tetraciclinas se caracterizará
por una ausencia de marcación en la línea de ensayo situada por
encima de la línea de control. En el caso en el que los dos
compuestos estén presentes en cantidad suficiente no aparecerá
ninguna de las dos señales, a ambos lados de la línea de control
(véase la figura 1).
\vskip1.000000\baselineskip
Se incuban 200 \mul de leche fría a 50ºC en
presencia de 50 \mul de agentes reactivos preparados y/o
liofilizados como anteriormente. Después de 3 minutos de incubación
a 50ºC se sumerge el elemento de recuperación descrito
anteriormente en la disolución. La interpretación final se realiza
después de 3 minutos de incubación con la ayuda de un lector óptico
de varilla disponible en Matest (Alemania).
Se recogen los resultados en la tabla 1. El
procedimiento permite considerar como positiva una muestra de leche
que contiene 4 ppb de Ampicilina y/o 75 ppb de Tetraciclina.
La tabla 2 resume los límites de detección
obtenidos mediante el presente procedimiento para los diversos
compuestos de \beta-lactamas y de tetraciclinas en
cuestión. Como regla general, cuando la relación de las
intensidades de la señal de ensayo en cuestión con relación a la
señal de control es igual o inferior a 1, la muestra se considera
como positiva para el parámetro (compuesto) en cuestión.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
En esta forma de realización preferida, el
procedimiento integra además de los dos receptores de las
tetraciclinas y \beta-lactamas, un anticuerpo
específico para el reconocimiento de las sulfadimetoxinas.
\vskip1.000000\baselineskip
A la mezcla indicada anteriormente, se integra
además un anticuerpo anti-sulfadimetoxina según la
siguiente preparación:
- -
- 5 partes de receptor \beta-lactama (RSA) a una concentración de 360 nM;
- -
- 5 partes de receptor tetraciclina (TetR) a una concentración de 4,2 \muM;
- -
- 1 parte de suero anti-RSA diluida 4x en tampón NaPi 50 mM, NaCl 150 mM, pH 7,8;
- -
- 1 parte de suero anti-TetR diluida a 4x en este mismo tampón;
- -
- 1 parte de suero anti-sulfadimetoxina diluida 2 x en este mismo tampón;
- -
- 1 parte de ácido nucleico a una concentración de 50 \muM;
- -
- 20 partes de proteína A Oro de 40 nm con una DO = 10 a 520 nm;
- -
- 16 partes de tampón de Hepes 120 mM, pH 8, BSA al 2%, dextrano al 1%, sacarosa al 5%.
Esta mezcla o bien se prepara extemporáneamente
o bien se liofiliza durante 20 horas.
\vskip1.000000\baselineskip
El sistema de recuperación es parecido al del
ejemplo 1, en el que se integra una cuarta línea específica para la
recuperación de las moléculas de anticuerpos
anti-sulfadimetoxina (3ª línea de ensayo). Las demás
zonas de captura son idénticas pero posicionadas de forma diferente
según la figura 2.
\vskip1.000000\baselineskip
La preparación se realiza siguiendo el protocolo
descrito por Dixon-Holland y Katz ^{(9)}. Se
incuban 100 mg de sulfadimetoxina y 200 mg de BSA solubilizados en
25 ml de una mezcla, que contiene 2 partes de tampón de fosfato 50
mM pH 7,2 y 1 parte de dioxano, en presencia de 120 \mul de 25% de
glutaraldehído bajo agitación durante 3 horas a 25ºC. La disolución
se dializa a continuación durante 6 días a 4ºC contra 100 volúmenes
de tampón NaPi 50 mM, pH 7,2 con un cambio de tampón cada 12
horas.
\vskip1.000000\baselineskip
En el caso de una detección de tres parámetros,
las líneas de captura se depositan en unos sitios precisos y
distintos sobre una membrana de nitrocelulosa y preferentemente
sucesivamente una detrás de la otra haciendo referencia al sentido
de migración del líquido. Según un modo preferido, las zonas de
captura \beta-lactama, tetraciclina,
sulfadimetoxina y la zona de control se disponen respectivamente en
un primer, en un segundo, en un tercer y por último en un cuarto
nivel haciendo referencia al sentido de migración del líquido
(figura 2). Una única zona de control sirve de referencia para los
tres marcadores. Una formulación diferente, similar al ejemplo
anterior, sería integrar dos zonas de control, es decir, una zona de
control entre cada una de las zonas de ensayo.
Se observará de manera general que, según la
presente invención, las líneas de ensayo de control no deben estar
siempre de forma obligatoria dispuestas en el mismo orden con
relación al sentido de migración del líquido. Así, el kit funciona
tanto si se tiene respectivamente el orden "beta"-"tetra"
o bien "tetra"-"beta", "beta"-"sulfa", o bien
"sulfa"-"beta" (véase el ejemplo siguiente),
"beta"-"tetra"-"sulfa" o bien
"sulfa"-"tetra"-"beta", etc.
\vskip1.000000\baselineskip
Se incuban 200 \mul de leche fría a 50ºC en
presencia de 50 \mul de los agentes reactivos preparados y/o
liofilizados como anteriormente. Después de 3 minutos de incubación
a 50ºC, el elemento de recuperación descrito anteriormente se
sumerge en la disolución. La interpretación final se realiza después
de 3 minutos de incubación con la ayuda de un lector óptico de
varilla disponible en Matest (Alemania).
Los resultados se recogen el la tabla 3. El
procedimiento permite considerar positiva una muestra de leche que
contiene 4 ppb de ampicilina y/o 75 ppb de tetraciclina y 100 ppb de
sulfadimetoxina.
\newpage
La tabla 4 resume los límites de detección
obtenidos mediante el procedimiento de la invención para los
diversos compuestos de \beta-lactamas, de
tetraciclinas y de sulfadimetoxinas indicados. Como regla general,
cuando la relación de las intensidades de la señal de ensayo en
cuestión con relación a la señal de control es igual o inferior a
1, la muestra se considera como positiva para el parámetro
(compuesto) en cuestión.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
La mezcla de reacción comprende:
- -
- 5 partes de receptor \beta-lactama (RSA) a una concentración de 360 nM;
- -
- 10 partes de un anticuerpo monoclonal anti-RSA acoplado con oro coloidal (DO = 10 a 520 nm);
- -
- 1 parte de anti-sulfadimetoxina biotinilada en NaPi 50 mM, NaCl 150 mM, pH 7,8;
- -
- 10 partes de una dilución de BSA-sulfadimetoxina-Oro de 40 nm;
- -
- 24 partes de tampón Hepes 120 mM, pH 8, BSA al 2%, dextrano al 1%, sacarosa al 5%.
Esta mezcla o bien se prepara extemporáneamente
o bien se liofiliza durante 20 horas.
\vskip1.000000\baselineskip
Se incuban 825 \mul de una disolución que
contiene 5 mg/ml de anticuerpo anti-sulfadimetoxina
dializada en tampón de carbonato 100 mM, pH 9,2, en presencia de
165 \mul de una disolución de
biotina-LC-NHS de 1,5 mg/ml
(disponible en Perbio, Inc) durante 2 horas a 25ºC protegida de la
luz. La reacción se bloquea mediante la adición de 10 \mul de una
disolución de tampón tris 1M pH 8 durante 30 minutos antes de la
diálisis 2 veces durante 10 horas contra tampón NaPi 50 mM, NaCl 150
mM, pH 7,8.
\vskip1.000000\baselineskip
La preparación de
BSA-sulfadimetoxina descrita en el ejemplo 2 se usa
en acoplamiento sobre unas partículas de oro coloidal en un
protocolo similar al descrito en el ejemplo 1 para preparar la
disolución de control BSA-Oro.
\vskip1.000000\baselineskip
El sistema de recuperación es idéntico al del
ejemplo 1. Sin embargo, en el presente caso, es el anticuerpo
anti-sulfamida biotinilado el que se recuperará en
la avidina inmovilizada en el segundo punto de captura por encima de
la zona de control.
\vskip1.000000\baselineskip
Se incuban 200 \mul de leche fría durante 15
minutos a 30ºC en presencia de 50 \mul de los agentes reactivos
preparados anteriormente. Después de esta primera incubación, el
elemento de recuperación descrito anteriormente se sumerge en la
disolución. La interpretación final se realiza después de una
segunda incubación de 15 minutos. Los resultados se recogen en la
tabla 5.
\vskip1.000000\baselineskip
La mezcla de reacción comprende:
- -
- 5 partes de receptor tetraciclina (TetR) a una concentración de 4,2 \muM;
- -
- 1 parte de anticuerpo monoclonal de ratón anti-TetR diluido en tampón NaPi 50 mM, NaCl 150 mM, pH 7,8;
- -
- 1 parte de anticuerpo de conejo anti-sulfamida diluido en este mismo tampón;
- -
- 10 partes de una dilución de BSA-sulfadimetoxina-Oro de 40 nm;
- -
- 1 parte de ácido nucleico biotinilado a una concentración de 50 \muM;
- -
- 10 partes de un anticuerpo anti-biotina-Oro de 40 nm con una DO = 10 a 520 nm;
- -
- 22 partes de tampón Hepes 120 mM, pH 8, BSA al 2%, dextrano al 1%, sacarosa al 5%.
Esta mezcla o bien se prepara extemporáneamente
o bien se liofiliza durante 20 horas.
\vskip1.000000\baselineskip
El sistema de recuperación es similar al del
ejemplo 1. Sin embargo, en el presente caso, es un anticuerpo
anti-ratón el que constituye el primer punto de
captura en el que se recuperará el anticuerpo monoclonal
anti-TetR y es un anticuerpo de pollo
anti-conejo el que constituye el segundo punto de
captura en el que se recuperará el anticuerpo
anti-sulfamida.
\vskip1.000000\baselineskip
A 10 g de músculo de cerdo se añaden 30 ml de
tampón NaPi 50 mM, pH 8, y la mezcla se bate con la ayuda de un
batidor de tipo MiniMix (Interscience, F) durante 2 minutos. La
disolución, recogida en un tubo Eppendorf, se centrifuga a
continuación durante 1 minuto a 6.000 rpm para recuperar el
sobrenadante. Se incuban 200 \mul de sobrenadante durante 15
minutos a 25ºC en presencia de 50 \mul de los agentes reactivos
preparados anteriormente. Después de esta primera incubación, el
elemento de recuperación descrito anteriormente se sumerge en la
disolución. La interpretación se realiza después de una segunda
incubación de 15 minutos. Los resultados se recogen en la tabla
6.
\vskip1.000000\baselineskip
La mezcla de reacción comprende:
- -
- 5 partes de receptor \beta-lactama (RSA) a una concentración de 360 nm;
- -
- 1 parte de un anticuerpo monoclonal de ratón anti-RSA diluido en tampón NaPi 50 mM, NaCl 150 mM, pH 7,8;
- -
- 5 partes de receptor tetraciclina (TetR) a una concentración de 4,2 \muM;
- -
- 1 parte de un anticuerpo monoclonal de ratón anti-TetR diluido en tampón NaPi 50 mM, NaCl 150 mM, pH 7,8;
- -
- 1 parte de ácido nucleico biotinilado a una concentración de 50 \muM;
- -
- 1 parte de anticuerpo policlonal de conejo anti-sulfamida diluido en tampón NaPi 50 mM, NaCl 150 mM, pH 7,8;
- -
- 7 partes de una dilución de BSA-sulfadimetoxina-Oro de 40 nm;
- -
- 13 partes de un anticuerpo anti-ratón acoplado con oro coloidal de 40 nm con una DO = 10 a 520 nm;
- -
- 16 partes de tampón Hepes 120 mM, pH 8, BSA al 2%, dextrano al 1%, sacarosa al 5%.
Esta mezcla o bien se prepara extemporáneamente
o bien se liofiliza durante 20 horas.
En un segundo procedimiento preferido, los dos
anticuerpos monoclonales anti-RSA y
anti-TetR se conjugan directamente con unas
partículas de oro coloidal.
\vskip1.000000\baselineskip
El sistema de recuperación es similar al del
ejemplo 1. Sin embargo, en el presente caso, es la
lactoglobulina-ampicilina la que constituye el
primer punto de captura en el que se recuperará el receptor RSA, es
avidina en el segundo punto de captura en el que se recuperará el
receptor TetR y es un anticuerpo de pollo
anti-conejo el que constituye el tercer punto de
captura en el que se recuperará el anticuerpo de conejo
anti-sulfamida.
Se incuban 200 \mul de leche fría durante 15
minutos a 30ºC en presencia de 50 \mul de los agentes reactivos
preparados anteriormente. Después de esta primera incubación, el
elemento de recuperación descrito anteriormente se sumerge en la
disolución. La interpretación final se realiza después de una
segunda incubación de 15 minutos. Los resultados se recogen en la
tabla 7.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
^{(1)} DIRECTIVA 96/23/CE DEL CONSEJO, del 29
de abril de 1996, relativa a las medidas de control aplicables
respecto de determinadas sustancias y sus residuos en los animales
vivos y sus productos y por la que se derogan las directivas
85/358/CEE y 86/469/CEE y las Decisiones 89/187/CEE y
91/664/CEE.
^{(2)} REGLAMENTO (CEE) nº 2377/90 DEL
CONSEJO, del 26 de junio de 1990, por el que se establece un
procedimiento comunitario de fijación de los límites máximos de
residuos de medicamentos veterinarios en los alimentos de origen
animal.
^{(3)}Off. J. Eur. Comm. 2002,
L221/8 - 2002/657/CE.
^{(4)}Hisao Oka, Chemical Analysis for
antibiotics Used in Agriculture, by AOAC INTERNATIONAL, 1995,
ISBN
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Claims (13)
1. Kit de diagnóstico para la determinación
simultánea de antibióticos de clases diferentes, por lo menos de las
\beta-lactamas y de las tetraciclinas,
caracterizado porque comprende:
- -
- por un lado, una única mezcla de reacción que contiene por lo menos un primer receptor, específico del reconocimiento de las \beta-lactamas, un segundo receptor que reconoce de manera específica y competitiva una tetraciclina, y un fragmento de ácido nucleico biotinilado, siendo los dos receptores marcados preferentemente mediante unas partículas de oro coloidal, o bien directamente o bien indirectamente mediante un anticuerpo o un anticuerpo en asociación con proteína A; y
- -
- por otro lado, un sistema de recuperación en forma de un soporte sólido que comprende una membrana de nitrocelulosa sobre la cual se fijan en dos sitios conocidos y distintos denominados zonas de ensayo, respectivamente un antibiótico con núcleo \beta-lactama y una avidina o inversamente;
de tal manera que la intensidad de marcación
detectada sobre el sistema de recuperación en las dos zonas de
ensayo resulte de manera independiente de un reconocimiento
competitivo de cada antibiótico por su receptor marcado.
2. Kit de diagnóstico según la reivindicación 1,
caracterizado porque el antibiótico con núcleo
\beta-lactama y la avidina fijados sobre la
membrana de nitrocelulosa son respectivamente una penicilina o una
cefalosporina, preferentemente una ampicilina inmovilizada sobre una
\beta-lactoglobulina, y una avidina de huevo.
3. Kit de diagnóstico, para la determinación
simultánea de antibióticos de clases diferentes, por lo menos de las
\beta-lactamas y de las sulfamidas,
caracterizado porque comprende:
- -
- por un lado, una única mezcla de reacción que contiene por lo menos un primer receptor, específico del reconocimiento de las \beta-lactamas, marcado o bien directamente o bien indirectamente, preferentemente mediante unas partículas de oro coloidal, un anticuerpo anti-sulfamida biotinilado y un análogo de una sulfamida marcada o bien directamente o bien indirectamente con oro coloidal; y
- -
- por otro lado, un sistema de recuperación en forma de un soporte sólido que comprende una membrana de nitrocelulosa sobre la cual se fijan en dos sitios conocidos y distintos, denominados zonas de ensayo, respectivamente un antibiótico con núcleo \beta-lactama y una avidina o inversamente;
de manera que la intensidad de marcación
detectada sobre el sistema de recuperación en las dos zonas de
ensayo resulte de manera independiente de un reconocimiento
competitivo de cada antibiótico.
4. Kit de diagnóstico para la determinación
simultánea de analitos que corresponden a unos antibióticos de
clases diferentes, por lo menos unas tetraciclinas y unas
sulfamidas, caracterizado porque comprende:
- -
- por un lado, una única mezcla de reacción que contiene por lo menos un receptor, que reconoce de manera específica y competitiva una tetraciclina y un fragmento de ácido nucleico biotinilado, siendo dicho receptor marcado preferentemente mediante unas partículas de oro coloidal, o bien directamente o bien indirectamente mediante un anticuerpo, así como un anticuerpo anti-sulfamida y un análogo de una sulfamida marcado o bien directamente o bien indirectamente, preferentemente con oro coloidal; y
- -
- por otro lado, un sistema de recuperación en forma de un soporte sólido que comprende una membrana de nitrocelulosa sobre la cual se fijan en dos sitios conocidos y distintos, denominados zonas de ensayo, respectivamente un anticuerpo dirigido específicamente o bien contra el receptor de tetraciclina, o bien contra el anticuerpo específico del receptor de tetraciclina, y un anticuerpo dirigido específicamente contra el anticuerpo anti-sulfamida o inversamente.
5. Kit de diagnóstico según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque los anticuerpos
anti-receptores específicos añadidos a la mezcla de
reacción son unos anticuerpos o bien monoclonales, o bien
policlonales, modificados o no modificados químicamente o mediante
recombinación, purificados o no purificados, acoplados o no
acoplados, directamente o indirectamente, a unas partículas
marcadas, preferentemente unas partículas de oro coloidal.
6. Kit de diagnóstico según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque la membrana de
nitrocelulosa, depositada sobre un soporte de varilla, está en
contacto por un primer extremo con una membrana y por un segundo
extremo con un papel absorbente, y presenta las dos zonas de ensayo
distintas una detrás de la otra en el sentido de migración del
líquido, pudiendo eventualmente una zona de control separar las dos
zonas de ensayo.
7. Kit de diagnóstico según la reivindicación 6,
caracterizado porque la zona de control se obtiene a partir
de una preparación cualquiera de proteína marcada, preferentemente
mediante unas partículas de oro coloidal y preferentemente aún a
partir de una albúmina de suero bovino o BSA acoplada a unas
partículas de oro coloidal.
\newpage
8. Kit de diagnóstico para la determinación
simultánea de \beta-lactamas, de tetraciclinas y
de sulfamidas, según la reivindicación 1 ó 2, caracterizado
porque la mezcla de reacción comprende además un anticuerpo
específico del reconocimiento de las sulfamidas y marcado,
preferentemente directa o indirectamente mediante unas partículas de
oro coloidal, y porque el sistema de recuperación comprende además
una preparación de proteína conjugada con unas sulfamidas,
inmovilizada sobre la membrana de nitrocelulosa.
9. Kit de diagnóstico para la determinación
simultánea de \beta-lactamas, de tetraciclinas y
de sulfamidas según la reivindicación 8, caracterizado porque
la membrana de nitrocelulosa, depositada sobre un soporte de
varilla, está en contacto por un primer extremo con una membrana y
por un segundo extremo con un papel absorbente, y presenta tres
zonas de ensayo distintas y una zona de control, dispuestas
sucesivamente una detrás de la otra en el sentido de migración del
líquido, o dos zonas de control, dispuesta cada una alternativamente
entre dos zonas de ensayo.
10. Kit de diagnóstico para la determinación
simultánea de analitos que corresponden a unos antibióticos de
clases diferentes, por lo menos de las
\beta-lactamas, de las tetraciclinas y de las
sulfamidas, caracterizado porque comprende:
- -
- por un lado, una única mezcla de reacción que contiene por lo menos un primer receptor, específico del reconocimiento de las \beta-lactamas, un segundo receptor, que reconoce de manera específica y competitiva una tetraciclina y un fragmento de ácido nucleico biotinilado, siendo los dos receptores marcados preferentemente mediante unas partículas de oro coloidal, o bien directamente, o bien indirectamente mediante un anticuerpo o un anticuerpo en asociación con una proteína A, así como un anticuerpo anti-sulfamida, así como un análogo de una sulfamida libre marcada o bien directamente o bien indirectamente con oro coloidal; y
- -
- por otro lado, un sistema de recuperación en forma de un soporte sólido que comprende una membrana de nitrocelulosa sobre la cual se fijan en tres sitios conocidos y distintos, respectivamente un antibiótico con núcleo \beta-lactama, una avidina y un anticuerpo dirigido contra el anticuerpo anti-sulfamida,
de manera que la intensidad de marcación
detectada sobre el sistema de recuperación en las tres zonas de
ensayo resulte de manera independiente de un reconocimiento
competitivo de cada antibiótico.
11. Kit de diagnóstico según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la muestra
es esencialmente líquida y se obtiene a partir de leche, de miel, de
carne, de huevos o de líquidos biológicos.
12. Kit de diagnóstico según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, caracterizado porque los
receptores usados para la determinación de las
\beta-lactamas o de las tetraciclinas son
respectivamente los receptores BlaR y TetR aislados a partir de
clases conocidas de microorganismos, preferentemente a partir de
Staphylococcus aureus para BlaR y del plásmido pSC101 de
E. coli 600 para TetR respectivamente.
13. Procedimiento para la utilización de un kit
de diagnóstico según cualquiera de las reivindicaciones anteriores,
caracterizado porque comprende las siguientes etapas:
- -
- poner en contacto la mezcla de reacción citada anteriormente con una muestra a caracterizar para obtener una disolución que se deja incubar a una temperatura comprendida entre 30ºC y 50ºC durante 3 a 15 minutos;
- -
- sumergir una varilla que contiene el sistema de recuperación citado anteriormente en la disolución obtenida y dejar incubar durante 3 a 15 minutos;
- -
- interpretar el resultado sobre la varilla o bien visualmente, o bien mediante un lector óptico de varilla.
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