ES2441291A1

ES2441291A1 - Método y dispositivo para el diagnóstico rápido de enfermedades causadas por Yersinia, en muestras fecales

Info

Publication number: ES2441291A1
Application number: ES201231025A
Authority: ES
Inventors: Carlos GUSTAVO ASÍN; Óscar Landeta Elorz; Beatriz Velasco Michelena; Yolanda GARCÍA MIGUEL
Original assignee: Certest Biotec SL
Current assignee: Certest Biotec SL
Priority date: 2012-07-02
Filing date: 2012-07-02
Publication date: 2014-02-03
Anticipated expiration: 2032-07-02
Also published as: WO2014006244A1; ES2441291B1

Abstract

Dispositivo inmunocromatográfico, y método para su uso que, mediante la aplicación de una muestra de heces o cultivo de enriquecimiento permite la detección simultanea y diferenciada de los antígenos O:3 y O:9 de la bacteria Yersinia enterocolítica mediante la formación de conjugados con partículas coloreadas y su captura en una membrana porosa.

Description

Método y dispositivo para el diagnóstico rápido de enfermedades causadas por Yersinia, en
muestras fecales

Campo de la invención

La presente invención se encuadra dentro del área de microbiología y biotecnología y en concreto en el diagnóstico de enfermedades causadas por Yersinia. El objeto de la invención es un procedimiento rápido y sencillo de detección de los serotipos 0:3 y 0:9 de la bacteria

Yersinia enteroco/ítica (Y. enterocolítica).

Estado de la técnica

Yersinia enterocoJítica es una especie anaeróbica facultativa, gram-negativa y oxidasa negativa. Y. enterocolítica es altamente heterogénea y puede clasificarse dentro de varios serotipos, de los cuales sólo unos pocos han sido asociados con enfermedad en humanos. Se han descrito seis diferentes biotipos (biotipo lA, lB, 2-5) Y numerosos serotipos de Y. enterocolítica. Once de esos serotipos se han asociado con mayor frecuencia con infecciones en humanos. La mayoría de las cepas de Y. enterocolítica que se asocian con la yersiniosis humana pertenecen a los serotipos 0:9 y 0:3.

Yersinia enterolocolítica es un patógeno relativamente común tanto en humanos como en animales. La infección provocada por Y. enterocolítica puede provocar, dependiendo de la edad de la persona infectada, gran variedad de síntomas. El síntoma clínico predominante es dolor abdominal y diarrea con o sin presencia de fiebre. Existen otras complicaciones como artritis y eritema nodoso. A menudo esta infección por Y. enterocolítica ocurre en niños pequeños. Los síntomas más comunes son fiebre, dolor abdominal y diarrea, a menudo sanguinolenta. Estos síntomas se desarrollan entre 4 y 7 días tras exposición y pueden durar hasta 1 o 3 semanas o incluso más. Hay cierta evidencia indirecta de que los alimentos, particularmente productos derivados del cerdo, son una fuente importante de la infección en humanos.

Problema a resolver

Tradicionalmente el diagnóstico de las enfermedades causadas por Yersinia, especialmente enterocolítica y pseudotuberculosis ha sido el cultivo y aislamiento a partir del mismo de la bacteria. Se puede cultivar con relativa facilidad a partir de fluidos corporales (fluidos cerebroespinal y peritoneal) y de tejidos. El aislamiento a partir de heces es mucho más complicado por la interferencia de la flora fecal, requiriéndose medios selectivos y cultivo a bajas temperaturas durante largos tiempos. En todo caso el procedimiento es largo y laborioso y requiere personal experimentado.

La forma más común de diagnosticar las enfermedades causadas por Yersínía es un inmunoensayo para detectar la presencia de anticuerpos (lgG oigA) anti Yersínia en el suero. El inmunoensayo puede ser una aglutinación, un inmunoblot (como el recomLine Yersinia de Mikrogen GmbH, Neuried, Alemania) o un ELlSA (como el Serian Elisa Yersinia de Serian Immundiagnostica GmbH, Würzburg, Alemania). Dependiendo del antígeno utilizado para realizar el inmunoensayo pueden aparecer reacciones cruzadas con Salmonella, Brucella, Escherichia coli y Vibrio. Para superar estos inconvenientes se propone la utilización de otros antígenos más específicos de Yersinia como los descritos en el documento US 2011/0306515 Al.

El diagnóstico de Yersinia por técnicas de cultivo es largo y tedioso y presenta una sensibilidad muy baja. La detección de anticuerpos en el suero, además de tener falsos positivos, solo dice que el sistema inmunitario del individuo ha visto el antígeno, no que haya una enfermedad activa.

Solución del problema

El objeto de la presente invención es un dispositivo de diagnóstiCO del tipo imunocromatográfico y su método de uso, para la determinación rápida y simultánea de los antígenos 0:3 y 0:9 de Yersinia enterocolítica en muestras fecales. Los cepas de Yersinia enterocolítíca con antígenos 0:3 y 0:9 son con diferencia las más frecuentes de todas las que causan enfermedad y entre las dos suman la gran mayoría de los casos encontrados.

El método presenta las siguientes ventajas:

Es rápido (basta resuspender la muestra en el diluyente, añadir unas gotas en el dispositivo y esperar 10 minutos), sencillo (no se requiere ningún complicado instrumental de laboratorio), el resultado es fácil de interpretar (aparece una línea indicando si el test es positivo o no), y barato (especialmente porque no requiere inversión inicial y porque lo puede llevar a cabo personal no especializado).

El dispositivo presenta las siguientes ventajas:

a.: Se utiliza un vial específico que permite la toma de la muestra de manera fácil e higiénica.

b.: Fiable. Lleva incorporada una línea de control cuya aparición verifica el correcto funcionamiento del test.

c.: Detecta la presencia de la bacteria y no los anticuerpos que el organismo infectado produce. Se identifican simultánea y separadamente los antígenos 0:3 y 0:9 de Yersinia enterocolítíca.

Descripción breve

El método de diagnóstico de la presente invención consiste en: la toma de una porción representativa de la muestra, su dispersión en un diluyente específico, la aplicación de esta dispersión de la muestra en un dispositivo inmunocromatográfico específico, la formación de complejos entre los anticuerpos del dispositivo y los antígenos de la muestra y la visualización de estos complejos en la membrana del dispositivo.

El dispositivo inmunocromatográfico utilizado es de un solo uso. No se requiere ningún tipo de instrumentación para llevar a cabo el método o interpretar el resultado. Como muestra se utilizan heces o cultivos de enriquecimiento.

El tiempo de preparación de la muestra son unos dos minutos y el tiempo de desarrollo de la prueba es de 5 a 10 minutos, lo que significa entre 10 y 20 veces menos que los ensayos EIA (fLlSA), mucho más complejos de llevar a cabo y necesitan de instrumentación de laboratorio.

Por su sencillez la prueba se puede llevar a cabo en la consulta del médico, e incluso, con las instrucciones adecuadas, por el propio paciente cuando la muestra es fecal.

Además de con muestras de heces, el dispositivo de la invención también se puede utilizar para la identificación de Yersinia enterocolítica a partir de cultivos o coprocultivos en medios de enriquecimiento ya sean selectivos o no y se realicen en medio líquido o semisólido (agar). En particular resulta adecuada la utilización del medio CIN (Cefsulodina-Irgasan-Novobiocina) cultivado entre 25 oC y 37 oC durante 24-48h. Cuando el cultivo se realiza en placas de agar, como en este caso, se procede a dispersar una o varias colonias en el diluyente antes de adicionarlo al dispositivo inmunocromatográfico de la invención. En este caso el procedimiento debería realizarse en un laboratorio con las medidas de seguridad y la experiencia adecuadas.

Descripción de la figuras

Figura 1: Esquema de las etapas del método de diagnóstico. El dispositivo o vial específico para la toma de muestras fecales (Figura lA) es un vial de plástico de unos 3 mL de capacidad, en el que previamente se ha dispensado 1 mi de diluyente, con un tapón a rosca que dispone de un vástago cuyo extremo, diseñado al efecto, permite la recolección de una muestra de heces (Figura lB) sólidas o semisólidas y su introducción en el vial. Tras esto, se cierra y se agita vigorosamente (Figura le) hasta la completa dispersión de la muestra. Por último, se rompe la parte opuesta del dispositivo (Figura 10) y se añaden unas gotas sobre el lugar de aplicación de la muestra del dispositivo (Figura lE).

Figura 2: Vistas del dispositivo inmunocromatográfico.

Figura 2A: Vista del dispositivo inmunocromatográfico en formato tira. Dicha tira incluye los siguientes elementos: un material absorbente (1), una membrana porosa (2) con una línea de control (3), una línea para la detección de Yersinia enterocolítica 0:3 (4) y otra línea para la detección de Yersinia enterocolítica 0:9 (5), un lugar de aplicación de la muestra (6) y un lugar para el conjugado anticuerpo-marcador (7).

Figura 2B: Vista superior del dispositivo de diagnóstico abierto en la que se observan las dos tiras inmunocromatográficas, una para 0:3 y otra para 0:9, en colocación paralela sobre la parte inferior del dispositivo.

Figura 2C: Vista superior del dispositivo de diagnóstico, en la que se observan las ventanas de resultados (A, B) Y los puntos de aplicación de la muestra (5) en la cara superior del dispositivo.

Descripción detallada

Los dispositivos inmunocromatográficos (le) para la detección tanto de antígenos como de anticuerpos están descritos en el estado de la técnica (por ejemplo, en la patente EP 1248112).

El dispositivo de la presente invención se puede realizar en una sola tira inmunocromatográfica (le) o bien en dos tiras inmunocromatográficas.

Cuando se usa una sola tira IC se trata de una prueba de tres líneas: una de control, otra para la detección de Yersinia enteraea/Hiea 0:3 y otra para la detección de Yersinia enteroeolftica 0:9 .

En la versión de dos tiras IC, una tira se usa para la detección de Yersínia enteraeolítica 0:3 y otra tira para la detección de Yersinia enteraealítiea 0:9 según se representa en la figura 2B. Existe también la posibilidad de utilizar una sola de estas tiras para detectar 0:3 u 0:9 según se desee.

Para la detección de los antígenos 0:3 y 0:9 se utilizan anticuerpos monadanales específicos para cada uno de ellos y que están disponibles comercialmente. Con estos anticuerpos monodonales, se preparan, por separado, conjugados con micropartículas coloreadas. Estas micropartículas inmunorreactivas son depositadas en uno de los materiales del dispositivo inmunocromatográfico y actúan como fase móvil. Los mismos anticuerpos son inmovilizados por separado sobre la membrana porosa que actúa como fase fija y en la que se produce la captura inmunológica por separado de los antígenos 0:3 y 0:9 de Yersinia enteracolitica. La membrana y el material con el conjugado son montados con la ayuda de otros materiales sobre un soporte plástico y éste se corta en forma tira.

Para determinar la presencia de Yersinia enterocolítica en muestras de heces se resuspende la muestra de heces en el diluyente de dispersión de la muestra en una proporción aproximada 1/10. Si la muestra es líquida 100 f..lL de muestra se mezclan con 1 mL del diluyente. Si la muestra es sólida se separan 100 mg de muestra con la ayuda de una espátula y se dispersan en 1 mL de diluyente. Resulta muy adecuado la utilización del vial de toma de muestra en el que se introduce la muestra con la ayuda de un vástago tras lo que se cierra con el tapón a rosca y se agita vigorosoramente para, posteriormente, romper la parte superior del tapón y añadir 4-5 gotas sobre el punto o puntos de aplicación de la muestra del dispositivo inmunocromatográfico. De esta manera la manipulación de la muestra resulta un procedimiento sencillo rápido e higiénico.

Tras la aplicación de la muestra se esperan 10 minutos para visualizar las líneas y se interpreta el resultado. En la versión de una tira, el test se considera negativo si solo aparece una sola línea, la de control (por ejemplo, verde) en la ventana de resultados; positivo para Yersinia enterocolitiea 0:3 si además de la línea de control aparece una línea en la posición de Yersinia enterocolitiea 0:3 (por ejemplo, azul); positivo para Yersinía enterocolitíca 0:9 si además de la línea de control aparece una línea en la posición de la Yersinia enteroeolitica 0:9 (por ejemplo, roja); y positivo para ambas (0:3 y 0:9) si aparecen tres líneas (por ejemplo, una verde, una roja y una azul). Con el dispositivo de 2 tiras se interpreta cada tira por separado de forma similar.

Para determinar la presencia de Yersínía enterocolítica en cultivo de enriquecimiento

5 El cultivo en medio CIN (para coprocultivo) es un método adecuado para el aislamiento de Yersinia spp. (condiciones aerobias, 24 h, 37 oC). Tras 24 horas de incubación en agar CIN (agar Cefsulodin-Irgasan-Novobiocin) las potenciales colonias de Yersinía enterocolítíca aparecen con el centro hundido de color rojo rodeadas de un borde claro-transparente dando la apariencia de un l/ojo de buey". Para llevar a cabo el método de la invención se examinan las

10 placas de CIN tras la incubación y se seleccionan 3-4 colonias pequeñas (1-2mm de diámetro) con el centro rojo hundido y con el borde más claro, sin color, muy definido e intacto. Se abre el vial para dilución de muestras y con el vástago se pican las 3 ó 4 colonias sospechosas de Yersínía. Se cierra el vial, se agita y después de romper la parte superior del tapón, se añaden 4-5 gotas sobre el punto o puntos de aplicación de la muestra del dispositivo

15 inmunocromatográfico.

Tras la aplicación de la muestra se esperan 10 minutos para visualizar las líneas y se interpreta el resultado como se ha descrito anteriormente.

Para una mayor facilidad y conveniencia, el dispositivo de diagnóstico y el vial con el diluyente pueden agruparse, junto las instrucciones de uso, en forma de kit para la realización 20 de una o más pruebas diagnósticas.

Ejemplos de realización:

Ejemplo 1:

Preparación de los conjugados

Se prepara un conjugado del anticuerpo monoclonal anti-Yersínia enterocolitica 0:3 con

25 micropartículas de poliestireno. Se utilizan partículas coloreadas con grupos carboxilo en su superficie de 300 nm de diámetro nominal (Kl 030 de la marca Estapor, Merck, Darmstadt, Alemania). 1 mL de partículas al 10 % (p/v) se lavan por centrifugación y resuspensión en tampón MES (ácido 2-(N-morfolino)etanosulfónico) 10 mM de pH 6 Y se le añade EDC (1-etil-3(3-dimetilaminopropil)-carbodiimida) hasta una concentración de 5 mM. Se incuba lh a 37 grados centígrados y se retira el exceso de reactivo por centrifugación. Las partículas así activadas se resuspenden en tampón MES 10 mM de pH 6 Y se les añade el anticuerpo monoclonal anti-Yersinia enterocolítica 0:3 hasta una concentración superficial de 2 mg/m2 tras lo que se incuban 18 h a 4 oC y posteriormente se lavan en Tween-20 al 0,1% (p/v). De la misma manera, se prepara un conjugado del anticuerpo monoclonal anti-Yersinia enterocolítica 0:9 con micropartículas de poliestireno del mismo o distinto color.

Los conjugados con partículas para línea de control se obtienen de la misma manera pero utilizando streptavidina (S4762, Sigma-Aldrich) a una concentración superficial final de 1 mg/m2•

Ejemplo 2:

Preparación del test de una tira le.

Una mezcla de los tres conjugados con partículas descritos en concentraciones de 0,02%, 0,04% Y 0,05% respectivamente, se diluyen en una solución que contiene sacarosa 10%, caseína bovina 2%, seroalbúmina bovina 0,5 % y Tween-20 2% en tampón TRIS (tris(hidroximetil)aminometano) de pH 8,4. Esta solución se deposita a razón de 14 I1L/cm en un material bobinado de fibras de poliéster no entretejidas de entre 20-30 mm de ancho que se seca en corriente de aire a 45 oC tras la deposición (5 min) y durante 24 h en una cámara a 30 grados y 20 % de humedad relativa.

Los anticuerpos anti-Yersinia enterocolítica 0:3 , anti-Yersinia enterocolítica 0:9 y antistreptavidina (para la línea de control) se dializan en PBS, se llevan a una concentración entre 0,5 y 1 mg/mL y se depositan linealmente de forma paralela sobre una membrana de nitrocelulosa laminada (Millipore Hi-Flow Plus) de 25 mm de ancho y de tamaño de poro entre 10 y 30 11m a razón de 1 I1L/cm tras lo cual se seca en corriente de aire a 45 oC tras la deposición (2 min) e inmediatamente después durante 24 h en una cámara a 30 oC y 20 % de humedad relativa.

El material con el conjugado, la membrana y el material absorbente se montan conforme indica la figura 2A sobre un soporte plástico con una lámina adhesiva y las tiras son cortadas transversalmente a su montaje a una anchura de 4 mm.

Ejemplo 3:

Preparación del dispositivo con dos tiras le.

La tira para la detección de Yersinia enterocolítica 0:3, se prepara de la misma forma que se ha descrito anteriormente pero sin utilizar el anticuerpo anti-Yersinia enterocolítica 0:9 en la

5 membrana y sin depositar el coloide anti-Yersínia enterocolitica 0:9 en el absorbente. La tira para la de detección de Yersinia enterocolftica 0:9 se prepara de la misma manera pero sin el anticuerpo anti-Yersinia enterocolítica 0:3 en la membrana y sin el coloide anti-Yersínia enterocalítica 0:3 en el absorbente.

Montaje del dispositivo.

10 Las dos tiras le (0:3 y 0:9) se disponen en el interior de una carcasa de material plástico que se ha diseñado de tal forma que presenta un alojamiento para cada una de las tiras, dos ventanas diferentes para la adición de las muestras y otras dos ventanas para la visualización de los resultados. La carcasa plástica puede ir marcada o impresa para la correcta indicación al usuario de la posición de cada tira.

15 Ejemplo 4.

Diluyente de la muestra.

Se prepara una solución para la dispersión de las muestras de heces consistente en una disolución acuosa de cloruro de sodio 150 mM, Triton X-lOO al 1%, anticuerpos IgG inespecíficos de ratón 250 ¡..tgfmL y anticuerpos IgG inespecíficos de conejo a 100 ¡..tgfmL en un

20 tampón TRIS 200 mM a un pH de 9,1. Esta preparación se dispensa en viales para la toma de muestra a razón de 1 mL/vial. Estos viales se utilizan para recogida y preparación de la muestra.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Dispositivo inmunocromatográfico para la detección de Yersinia enterocolítica en muestras biológicas caracterizado por que comprende una ventana de aplicación de la muestra, otra ventana de resultados y:

i) una tira inmunocromatográfica la cual comprende una zona (7) con conjugados de los anticuerpos monoclonales anti-Yersinia enterocolitica 0:3 y 0:9 con micropartículas inmunorreactivas y una zona de membrana porosa (2) que comprende anticuerpos anti-Yersinia enterocolitica 0:3 y 0:9 inmovilizados dispuestos por separado (3, 4),

o

ii) dos tiras inmunocromatográficas, donde una tira comprende una zona (7) con conjugados del anticuerpo monoclonal anti-Yersinia enterocolitica 0:3 con micropartículas inmunorreactivas, y una zona de membrana porosa (2) que comprende anticuerpos anti-Yersinia enterocolitica 0:3 inmovilizados, y otra tira comprende una zona (7) con conjugados del anticuerpo monoclonal anti-Yersinia enterocolitica 0:9 con micropartículas inmunorreactivas, y una zona de membrana porosa (2) que comprende anticuerpos anti-Yersinia enterocolitica 0:9 inmovilizados.
2.

Dispositivo de acuerdo con la reivindicación anterior donde las micropartículas in munorreactivas son coloreadas.
3.

Dispositivo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores donde las micropartículas inmunorreactivas son de poliestireno.
4.

Uso de un dispositivo según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores para la detección de Yersinia enterocolítica en una muestra biológica.
5.

Uso según la reivindicación anterior donde la muestra biológica es una muestra de heces.
6.

Uso según la reivindicación 4 donde la muestra biológica es un cultivo de enriquecimiento.
7.

Método de diagnóstico de las enfermedades causadas por Yersinia enterocolítica caracterizado por que comprende las siguientes etapas:

a.

dispersión de una muestra biológica de heces o de un cultivo de enriquecimiento en un diluyente,

b.

aplicación de la dispersión de a) en la ventana de muestra de un dispositivo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3,

c.

interpretación del resultado según la aparición de bandas en la ventana de resultados.
8.

Kit para llevar a cabo el método de diagnóstico de acuerdo con la reivindicación 7 caracterizado por que comprende:

a.

un dispositivo inmunocromatográfico según una cualquiera de las reivindicaciones 1-3,

b.

un diluyente para la dispersión de la muestra biológica,

c.

un vial para la toma de muestra y su manipulación.

FIGURA lA

FIGURA 1 B

FIGURA le FIGURA 1 D

o

o

FIGURA 1 E

FIGURA 1

6 7

FIGURA 2A

FIGURA 2B FIGURA 2e

~ e ~ ~ T ~

A B

s

1) 1)

FIGURA 2