ES2637200T3 - Procedimiento para el diagnóstico in vitro y/o monitorización de terapia in vitro de infecciones - Google Patents

Abstract

Procedimiento para el diagnóstico in vitro y/o monitorización de terapia in vitro de tuberculosis y/o borreliosis, especialmente para la distinción entre infecciones agudas (activas) por un lado e infecciones latentes (crónicas) o superadas por otro, caracterizado por el hecho de que se incuban células eucariotas con al menos un antígeno específico de tuberculosis y/o al menos un antígeno específico de borreliosis y se prueban en cuanto a las células secretoras de anticuerpos específicos de un antígeno (ASC), donde los anticuerpos secretados se dirigen específicamente contra el antígeno, donde la incubación de las células eucariotas se realiza durante un período de entre 2 y 18 horas.

Description

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DESCRIPCION

Procedimiento para el diagnostico in vitro y/o monitorizacion de terapia in vitro de infecciones

[0001] La presente invention se refiere a un procedimiento para el diagnostico in vitro y/o monitorizacion de terapia in vitro de infecciones y/o enfermedades infecciosas, especialmente para distinguir entre infecciones agudas por un lado e infecciones latentes o superadas por otro, asi como un kit correspondiente.

[0002] Para identificar estructuras propias del cuerpo y para la defensa ante organismos o sustancias ajenos al cuerpo, los organismos superiores, como los animales o las personas, disponen de un sistema inmunologico altamente complejo. El sistema inmunologico humano se puede subdividir en dos grupos de mecanismos de defensa. Se distingue entre inmunidad humoral y celular. La defensa inmune innata se denomina inmunidad natural. En caso de que la inmunidad se cree unicamente despues de entrar en contacto con estructuras reconocidas como ajenas al cuerpo, llamadas antigenos, se denomina inmunidad adquirida. Para dichos mecanismos muy especificos, los leucocitos, tanto monocitos como granulocitos y linfocitos B y T, desempenan un papel fundamental tanto en la defensa celular como humoral.

[0003] En caso de infection o enfermedad infecciosa, el organismo es capaz de reaccionar ante multiples antigenos. Con una proliferation de los linfocitos B, particularmente con una expansion clonal, en combination con una selection de otras celulas de defensa incluyendo procedimientos de diferenciacion, por lo general, el organismo puede combatir los antigenos intrusos con anticuerpos neutralizantes.

[0004] En la practica, el medico plantea un diagnostico; sin embargo, frecuentemente el problema es distinguir entre infecciones o enfermedades infecciosas agudas, latentes o superadas o enfermedades. La distincion entre infecciones que se acaban de producir (agudas o activas) e infecciones latentes o cronicas o ya superadas es decisiva, por ejemplo, para estimar si los pacientes infectados o enfermos todavia son contagiosos.

[0005] Para distinguir las distintas fases de las infecciones o enfermedades infecciosas se ofrece una prueba directa de agentes infecciosos o parte de ellos. No obstante, por un lado es muy complicado aislar los agentes infecciosos. Por otro, deben cultivarse agentes infecciosos aislados con la ayuda de practicas de cultivo apropiadas para que se pueda realizar una prueba correcta. Esto normalmente conlleva un alto coste y un largo periodo de tiempo y ademas, no es factible para todos los agentes patogenos.

[0006] En una forma indirecta de la prueba de infeccion tambien entran en consideration los anticuerpos, que se forman contra el agente infeccioso. No obstante, una desventaja en este caso es que los anticuerpos, habitualmente, se pueden identificar en la sangre de los pacientes anos despues de superar la infeccion. Por lo tanto, en este caso en particular tampoco se puede diferenciar entre infeccion aguda, latente o infeccion superada. Sin embargo, por esta misma razon, seria deseable la adoption de medidas terapeuticas sucesivas cuando se hace una declaration a modo de diagnostico sobre el estado de la infeccion (agudo, latente o superado).

[0007] Se conocen los procedimientos de detection de la infeccion respiratoria provocada por el coronavirus en pollos (Pei J. et al.: Specific antibody secreting cells from chickens can be detected by three days and memory B cells by three weeks post-infection with the avian respiratory coronavirus", Developmental & Comparative Immunology 29,2005: 153-160).

[0008] Del documento US 2005/0089942 A1 se conocen procedimientos de deteccion de enfermedades infecciosas, en particular, tambien para la tuberculosis.

[0009] Ademas, se conoce la prueba de celulas B, que produce anticuerpos dirigidos contra el virus de hepatitis B (Bocher et al.: "Regulation of the neutralizing anti-hepatitis B surface (HBs) antibody response in vitro in HBs vaccine recipients and patients with acute or chronic hepatitis B virus (HBV) infection, Clin Exp Immunol. 1996, 105: 52-58).

[0010] Asimismo, se divulgo la activation de celulas B en la mucosa del duodeno tras un vacuna oral contra el colera (Nilssen et al.: "B-cell Activation in Duodenal Mucosa after Oral Cholera Vaccination in IgA Deficient Subjects with or without IgG Subclass Deficiency", Scand J. Immunol. 38, 1993: 201-208).

[0011] Ademas, se divulgo la prueba de de celulas secretoras de anticuerpos especificos con el metodo ELISPOT (Czerkinsky et al.: "A Solid-Phase Enzyme-Linked Immunospot (ELISPOT) Assay for Enumeration of Specific Antibody-Secreting Cells, Journal of Immunological Methods, 65, 1983: 109-121).

[0012] La presente invencion tiene como objetivo crear un procedimiento fiable para el diagnostico in vitro y/o monitorizacion de terapia in vitro, que permita sobre todo realizar una distincion con respecto al estado de la infeccion.

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[0013] Este objetivo se consigue, segun la invention, a traves de un procedimiento con las caractensticas de la reivindicacion independiente 1. Las formas de realization preferidas del procedimiento son objeto de las reivindicaciones dependientes de la 2 hasta la 9. Ademas, la presente invencion tambien hace referencia a las aplicaciones del procedimiento segun las reivindicaciones 10 y 11. Otro aspecto de la invencion se refiere al uso de un kit con las caracteristicas de la reivindicacion 12.

[0014] El procedimiento, segun la invencion, es un procedimiento para el diagnostico in vitro y/o motorization de terapia in vitro de infecciones y/o enfermedades infecciosas para la distincion entre infecciones o enfermedades infecciosas agudas por un lado e infecciones o enfermedades infecciosas latentes o superadas por otro, donde las celulas eucariotas se incuban con un antigeno, preferiblemente sobre una superficie de analisis o un soporte, y se prueban en cuanto a celulas secretoras de anticuerpos especificos de un antigeno (ASC), cuyos anticuerpos secretados estan dirigidos especificamente contra el antigeno.

[0015] En otras palabras, se trata de un procedimiento, segun la invencion, de diagnostico in vitro y/o monitorizacion de terapia in vitro de infecciones y/o enfermedades infecciosas para la distincion entre infecciones o enfermedades infecciosas agudas por un lado e infecciones o enfermedades infecciosas latentes o superadas por otro, donde las celulas eucariotas , se incuban con un antigeno, preferiblemente sobre una superficie de analisis o un soporte y se prueban en cuanto a celulas secretoras de anticuerpos especificos de un antigeno (ASC), cuyos anticuerpos secretados estan dirigidos especificamente contra el antigeno.

[0016] A traves de la invencion se crea un procedimiento in vitro que permite la distincion entre infecciones agudas (activas) por un lado e infecciones latentes o superadas (cronicas) por otro. En el marco del procedimiento segun la invencion se investiga en celulas eucariotas la presencia de ASC, cuyos anticuerpos segregados se dirigen contra el antigeno, que se usa para la incubation de las celulas eucariotas. Las ASC que se pueden probar gracias al procedimiento segun la invencion, son por regla general celulas efectoras, particularmente de celulas B efectoras. Este tipo de celulas particular permite realizar una diferenciacion entre infecciones agudas (activas) por un lado e infecciones latentes o superadas (cronicas) por otro. Si el resultado de la prueba de celulas eucariotas sobre ASC es positivo, las celulas eucariotas provendran de un organismo humano o animal que padece una infection aguda del antigeno afectado o en su caso tambien una enfermedad infecciosa. Si por el contrario no se identifica ningun ASC, las celulas eucariotas evaluadas provendran por regla general de organismos humanos o animales que padezcan o bien una infeccion latente del antigeno afectado, particularmente una infeccion persistente durante meses, o que esten sanos desde el punto de vista medico. Bajo organismo humano o animal sano se entiende un organismo que o bien ha superado una infeccion o bien no ha padecido una infeccion en ningun momento.

[0017] Las celulas eucariotas provienen usualmente de una prueba humana y/o animal. Las celulas eucariotas provienen preferiblemente de muestras de liquidos corporales, en particular de pruebas de sangre, frotis del cuello uterino y/o lavados bronquiales.

[0018] En una forma de realizacion preferida, las celulas eucariotas, particularmente las que se presentan entre las celulas eucariotas como celulas inmunocompetentes, denominadas celulas del sistema inmunitario, se enriquecen antes de la incubacion. En el caso de las celulas eucariotas se trata preferiblemente de celulas sanguineas, particularmente de linfocitos B, linfocitos T, granulocitos, celulas dendriticas, macrofagos y/o eritrocitos. Para el enriquecimiento de las celulas eucariotas se tienen en consideration las tecnicas de enriquecimiento celular habitualmente utilizadas. De esta forma, se pueden enriquecer las celulas eucariotas, por ejemplo, a traves de la centrifugation, particularmente de la centrifugation por gradiente. En la centrifugation por gradiente pueden, por ejemplo, utilizarse los gradientes de azucar. Preferiblemente, las celulas eucariotas se liberan antes de la incubacion de eritrocitos. En una forma de realizacion posible, se enriquecen las ASC que se presentan entre las celulas eucariotas.

[0019] En una forma de realizacion particularmente preferida se liberan las celulas eucariotas antes de la incubacion de suero sanguineo, particularmente suero sanguineo autologo. Esto ocurre usualmente partiendo de un analisis de sangre coagulado mediante la separation del porcentaje sanguineo liquido de componentes sanguineos celulares. En lo que respecta a los componentes celulares y a las tecnicas adecuadas de separacion se hace referencia al parrafo anterior. Con la separacion del suero sanguineo se eliminan con una ventaja especial componentes de suero molestos, especialmente proteinas de suero, como, por ejemplo, albumina y/o inmunoglobulina, especialmente anticuerpos. En caso contrario, estos podrian conducir a resultados de prueba erroneos.

[0020] En una forma de realizacion adicional se utilizan como antigeno los fragmentos de los tipos de agente patogeno, particularmente epitopes patogenos. En el caso de los epitopes se trata particularmente de peptidos, preferiblemente oligopeptidos. Los epitopos adecuados pueden estar formados por entre 5 hasta 25, especialmente entre 9 y 11 unidades de aminoacidos.

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[0021] Esta previsto segun la invencion, en particular, que para la incubacion de celulas eucariotas se utilice al menos un antigeno del grupo PPD, RD 1, RD 2, ESAT 6, CfP 10, MPT 41, MTB 64, PPE 44, OSP A, OSP B, OSP C, OSP D, OSP E, VIsE, p 58, p 100 y Dbp A.

[0022] Para la incubacion de las celulas eucariotas se utiliza al menos un antigeno especifico de tuberculosis, particularmente del grupo PPD, RD 1, RD 2, MPT 64, MTB 41 y PPE 44.

[0023] Para la incubacion de las celulas eucariotas se utiliza alternativamente o en combination al menos un antigeno especifico de borreliosis, particularmente del grupo VlsE, OSP A, OSP B, OSP C, OSP D y OSP E.

[0024] El procedimiento segun la invencion se realiza usualmente en una superficie de analisis idonea, particularmente en un recipiente de analisis o en un soporte idoneo. La superficie de analisis o el soporte pueden ser, por ejemplo, fondos de cavidades o los agujeros de placas perforadas, planchas onduladas o placas de microtitulo. Tales placas perforadas o de microtitulo, que preferiblemente se utilizan como recipientes de analisis, son comercializadas, en particular con distinto numero de cavidades o agujeros (Wells). Por ejemplo, el procedimiento segun la invencion se puede realizar con ayuda de una placa de microtitulo 96. Las placas de microtitulo pueden presentar, por ejemplo, un diametro de cavidad de aprox. 5 mm, lo que se corresponde con una superficie de aproximadamente 20 mm2. La superficie de analisis utilizada es, convenientemente, plana. De esta forma se pueden evitar las diferencias de concentration local en el procedimiento segun la invencion. Ademas, las superficies de analisis planas son sustancialmente mejores para la production de estratos celulares simples (monocapa). Los materiales tipicos de los que estan compuestos los recipientes de analisis adecuados son, por ejemplo, el poliestireno, el polifluoruro de vinilideno (PVDF), la nitrocelulosa o el nylon.

[0025] En una forma de realization especialmente adecuada, se calcula el numero de celulas especificas secretoras de anticuerpos especificos de un antigeno. El metodo de medicion se explica en la siguiente descripcion.

[0026] Conforme a lo anteriormente mencionado, segun la invencion, preferiblemente, se calcula el numero de celulas secretoras de anticuerpos especificos de un antigeno.

[0027] En una forma de realizacion particularmente preferida, el procedimiento se realizara mediante el metodo ELISPOT (Enzyme Linked Immuno Spot Technique). En otras palabras, segun la invencion, es preferible que el proceso se realice mediante el metodo ELISPOT. El metodo ELISPOT, en contraposition a la tecnica Elisa, se realiza en una fase fija, generalmente sobre un soporte idoneo. El soporte puede ser la placa perforada o placa de microtitulo mencionadas anteriormente o sus fondos de cavidad o agujeros. Con la ayuda del metodo ELISPOT puede medirse en general la segregation (secretion o expulsion) de citocinas y/o anticuerpos de celulas bajo la aplicacion de antigenos o anticuerpos, que unen especificamente estas citocinas o anticuerpos. Las citocinas o anticuerpos secretados son usualmente visibles sobre fondos de cavidad de placas de microtitulo en forma de puntos coloridos, llamados spots. Se pueden hacer declaraciones sobre la actividad de las celulas a traves del recuento de spots y/o por determination de su intensidad de color mediante programas de software apropiados.

[0028] El metodo ELISPOT aplicable dentro del marco de la invencion comprende en una forma de realizacion adicional los siguientes pasos:

a) aplicacion de moleculas de captura sobre una superficie de analisis o sobre un soporte,

b) incubacion de las celulas eucariotas con el antigeno sobre la superficie de analisis o sobre el soporte,

c) adicion de moleculas de detection sobre la superficie de analisis o sobre el soporte,

d) deteccion de ASC sobre la superficie de analisis o sobre el soporte, cuyos anticuerpos segregados estan dirigidos especificamente contra el antigeno.

[0029] Las moleculas de captura aplicadas pueden estar ligadas generalmente a la superficie de analisis y se fijan a esta de manera particularmente ventajosa. Las moleculas de captura pueden aplicarse particularmente de manera estratiforme sobre la superficie de analisis. Como moleculas de captura, es preferible utilizar anticuerpos (anticuerpos de captura), que estan dirigidos contra anticuerpos o subtipos de anticuerpos de las ASC por identificar. Por ejemplo, en los subtipos de anticuerpos, en el caso del PPD como antigeno, se puede tratar de al menos uno de los siguientes subtipos del grupo IgG1, IgG2, IgG3 y IgG4. En este contexto, tambien se habla de los denominados antianticuerpos. En el caso de las moleculas de captura se puede tratar de anticuerpos policlonales o monoclonales, donde son preferibles los anticuerpos monoclonales. Preferiblemente, para la aplicacion de las moleculas de captura sobre la superficie de analisis, se utiliza una dispersion acuosa de moleculas de captura. Para la fabrication de la dispersion acuosa se pueden dispersar las moleculas de captura en un tampon idoneo, por ejemplo, en un tampon de acetato. Si fuese necesario, la dispersion podria filtrarse para obtener una solution. La dispersion acuosa se fabrica generalmente justo antes de la aplicacion de las moleculas de captura sobre la superficie de analisis. Preferiblemente, las moleculas de captura presentan una concentracion de entre 1 y 3 pg/ml3, particularmente aprox. de 2,5 pg/ml3 en la dispersion acuosa.

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[0030] Las celulas eucariotas se aplican normalmente en forma de suspension celular sobre la superficie de analisis. El antigeno se aplica normalmente como solucion acuosa sobre la superficie de analisis. Segun la invention, esta previsto particularmente que el antigeno se aplique sobre la superficie de analisis antes que las celulas eucariotas. El antigeno se fija habitualmente sobre la superficie de analisis, en particular acoplado directamente en el fondo de la superficie de analisis. En este caso no se debe anadir ningun antigeno adicional para incubar las celulas eucariotas. La incubation de las celulas eucariotas se llevara a cabo durante un periodo de entre 2 y 18 horas, particularmente de entre 2 y 4 horas. De esta forma se consigue de manera especialmente ventajosa que ninguna celula de memoria se desarrolle contra el antigeno, ya que en caso contrario, esto conducina a una falsification de los resultados de la prueba. Por consiguiente, se garantiza que solo se detectan las celulas que son responsables de una infection aguda o activa. A traves de la incubacion con el antigeno, se provoca que las ASC presentes entre las celulas eucariotas, cuyos anticuerpos estan dirigidos especificamente contra el antigeno, provoquen la segregation de los anticuerpos correspondientes. Estos son interceptados a traves de las moleculas de captura y de esta forma son ligados a la superficie de analisis.

[0031] Ademas, se pueden prever segun la invencion pasos de lavado. La superficie de analisis se puede lavar, por ejemplo, antes de la adicion de las moleculas de detection. Para lavar la superficie de analisis se utilizan habitualmente soluciones tampon, por ejemplo, el tampon fosfato. Asi se eliminan componentes independientes de la superficie de analisis, en particular, celulas eucariotas. En caso necesario se puede repetir el lavado de la superficie de analisis, eventualmente incluso varias veces.

[0032] Ademas de las moleculas de deteccion, normalmente se utiliza otro tipo de anticuerpos, los denominados anticuerpos de deteccion. Las moleculas de deteccion estan especificamente dirigidas contra los anticuerpos de las ASC por identificar. No obstante, normalmente, se ligan las moleculas de deteccion a otras zonas del anticuerpo de ASC que las moleculas de captura descritas previamente. Asi surgen sobre la superficie de analisis, complejos ternarios de moleculas de captura, moleculas de deteccion y anticuerpos ASC. Se utilizan preferiblemente las moleculas de deteccion como compuestos conjugados. Son posibles asociados de conjugation enzimas, colorantes fluorescentes, oro y/o plata. Las enzimas particularmente preferibles son fosfatasa alcalina o peroxidasa de rabano, especialmente de origen equino, y/o glucosa oxidasa. Ejemplos adecuados de colorantes fluorescentes son la isotiocianato de fluoresceina y/o la cianina 3. Ademas, tambien deben tenerse en consideration otra serie de colorantes. Los expertos conocen sobradamente colorantes de este tipo. Otro asociado de conjugacion preferido es la biotina. La molecula de deteccion biotilinada se utiliza habitualmente junto con un compuesto conjugado de avidina o de estreptavidina y un asociado de conjugacion idoneo, por ejemplo, la fosfatasa alcalina o la peroxidasa de rabano.

[0033] Ademas, la superficie de analisis se puede lavar antes de la deteccion de ASC. De esta forma se pueden eliminar las moleculas de deteccion no unidas de la superficie de analisis. Para lavar la superficie de analisis pueden usarse soluciones de lavado, en particular tampones quimicos. Si fuese necesario podrian repetirse los pasos del lavado, en particular podrian repetirse varias veces.

[0034] Normalmente, la deteccion de ASC se realiza con una prueba colorimetrica. Por medio de la reaction de la prueba se originan spots coloreados (coloraciones) sobre la superficie de analisis, que dado el caso pueden solaparse entre si. En casos excepcionales tambien se puede tenir la superficie de analisis completa. Los spots se pueden detectar y particularmente contar con un microscopio o con un sistema automatico de analisis de imagenes. Comparar el numero de spots con el numero de celulas empleadas permite calcular la frecuencia o el numero de celulas de reaccion. Preferiblemente, la reaccion de deteccion se cataliza por medio de una enzima. La reaccion de deteccion se puede realizar, por ejemplo, con la ayuda de substratos apropiados, particularmente de cromogenicos. Substratos adecuados son, por ejemplo, paranitrofenilfosfato, carbazol o bromo-cloro-indolil fosfato. Por ejemplo, la fosfatasa alcalina escinde el resto de fosfato del p-nitrofenilfosfato incoloro, con lo que surge el p-nitrofenol tenido de amarillo. La reaccion se puede observar, por ejemplo, con un fotometro. La intensidad del color es proporcional a la concentration de p-nitrofenol y tambien a la concentration de anticuerpos de las ASC por probar.

[0035] En una forma de realization preferida del procedimiento segun la invencion se mide el numero de celulas secretoras de anticuerpos especificos de un antigeno (ASC). A tal efecto, se puede determinar sustancialmente el numero de spots que aparecen sobre la superficie de analisis. Alternativamente o en combination a esto, se mide cuantitativamente preferiblemente la intensidad de color de cada spot o de los spots que se solapan, en se caso tambien de las coloraciones que cubren la superficie de analisis total. Es especialmente preferible descomponer la superficie de analisis en una variedad de puntos individuales, medir la intensidad de color de cada punto individual por separado y anadir los valores de intensidad medidos. Esta particularmente previsto segun la invencion, que se registren de 1 a 2 millones, particularmente aprox. 1,5 millones de puntos de imagen (pixeles) por superficie de analisis. Para captar los pixeles se puede utilizar, por ejemplo, una camara. Para medir la intensidad de color de un punto individual se dispone sobre la superficie de analisis con ventaja particular de entre 200 y 300, particularmente entre 220 y 260, preferiblemente aprox. 256 diferenciaciones (valores de gris). Los pixeles se pueden procesar y analizar, por ejemplo, con un aparato de lectura. Preferiblemente, se mide el numero total de pixeles asi como en particular su intensidad con ayuda de un analizador de imagen. De esta forma resulta posible medir la coloration total en lo que se refiere a la superficie

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de analisis o a una parte determinada de esta. Un punto de color natural sobre la superficie de analisis puede servir como valor de referencia, en caso necesario tambien en otra superficie de analisis. La medida de la actividad total, es decir, la intensidad total de la reaccion de todas las celulas eucariotas ante un antigeno definido sobre la superficie de analisis resulta del numero del pixeles estimulados (tenidos), multiplicado por el valor de color (por ejemplo, tonos de gris entre 0 y 256) de cada pixel estimulado. Esto producto se divide de forma conveniente entre 1000 para obtener valores numericos (unidades) facilmente manejables. Los pixeles se registran y analizan preferiblemente desde arriba, es decir, por encima de la superficie de analisis. El tratamiento hacia una imagen bidimensional se realiza usualmente con ayuda de tecnicas de ordenador.

[0036] Usualmente, en la produccion de imagenes se utilizan sistemas de filtros adecuados. Preferiblemente se utilizan sistemas de filtros, particularmente, juegos de filtros, con filtro de banda estrecha. Esta previsto particularmente, segun la invencion, que para probar las celulas eucariotas en cuanto a ASC se trabaje con un filtro de estimulacion de banda estrecha y un filtro de bloqueo de banda estrecha por juego de filtros utilizado. Los juegos de filtros se pueden fusionar con un conductor de rayos para integrar en un bloque de filtro.

[0037] En otra forma de realization se pueden tomar medidas mediante las que disminuya la coloration producida sobre la superficie de analisis en la intensidad por punto individual en comparacion con el estado de la tecnica y/o aumente en la extension de la superficie, es decir, en el numero de puntos individuales por celula. Mediante el aumento de la extension de la superficie se debilitara particularmente la coloracion por unidad de superficie y por lo tanto, las diferencias de coloracion entre las superficies individuales y/o dentro de una superficie mayor seran mas evidentes. De este modo se puede medir la intensidad de color de los puntos individuales en el sector medible tecnicamente. Asi, tambien se pueden registrar superficies tenidas de forma intensiva, cuya intensidad sobrepasa el valor maximo constatable tecnicamente, a causa del aumento de la extension superficial. Con el metodo de medicion descrito en los apartados anteriores se puede mejorar la evaluation del estado de infection un paciente.

[0038] El procedimiento segun la invencion sirve sobre todo para comprobar el estado de infeccion y diferenciar infecciones o enfermedades infecciosas agudas por un lado e infecciones o enfermedades infecciosas latentes o infecciones o enfermedades infecciosas superadas por otro. La denomination para caracterizar el estado inmune puede variar dependiendo de la infeccion o enfermedad infecciosa. De esta forma, en relation con la tuberculosis se habla de infecciones agudas y latentes. Por el contrario, en el caso de la borreliosis usualmente se utiliza la denominacion activas y cronicas. Ademas, el procedimiento segun la invencion tambien sirve para comprobar la inmunidad vacunal, es decir, con ayuda del procedimiento se puede valorar si la inmunidad vacunal es todavia suficiente o si es necesaria una revacunacion.

[0039] Las infecciones y/o enfermedades infecciosas son la tuberculosis y/o la borreliosis.

[0040] La presente invencion se refiere ademas a la utilization de un kit (descrito en la revindication 12) al diagnostico in vitro y/o monitorizacion de terapia in vitro de infecciones y/o enfermedades infecciosas para la distincion entre infecciones agudas por un lado e infecciones latentes o superadas por otro, incluyendo al menos un componente para comprobar celulas secretoras de anticuerpos especificos de un antigeno (ASC). Se consideran componentes del kit, en particular, las moleculas de captura, las moleculas de detection, los colorantes de quimioluminiscencia, los colorantes fluorescentes y/o los antigenos. Los componentes pueden estar presentes en forma de dispersiones acuosas y/o en forma seca, por ejemplo, de forma liofilizada. El kit comprende dos o mas componentes que estan preferiblemente separados el uno del otro. En lo que respecta a otras caracteristicas y propiedades del kit se toma como referencia la description anterior.

[0041] Otros detalles y caracteristicas de la invencion se deducen de las formas de realizacion preferibles de la siguiente descripcion en forma de ejemplos en relacion con las reivindicaciones secundarias. Las respectivas caracteristicas pueden realizarse por si mismas o en combination con varias caracteristicas.

Ejemplo 1:

Prueba de agente patogeno de tuberculosis

[0042] Para llevar a cabo el procedimiento se usa una placa perforada 96. En primer lugar, se inmovilizan los antianticuerpos como moleculas de captura en el fondos de las cavidades de la placa perforada. Los antianticuerpos utilizados estan dirigidos especificamente contra los anticuerpos de las celulas secretoras de anticuerpos especificos de los agentes patogenos de tuberculosis. Despues, se inmoviliza el PPD como agente patogeno de tuberculosis en el suelo de las cavidades. Adicional o alternativamente, tambien se pueden utilizar los peptidos del denominado complejo RD1 y RD2. Ademas, se pueden utilizar tambien otras proteinas de Miyobacterium Tuberculosum (38 kD, 41 kD, 44 kD, 64 kD). Posteriormente, se anaden por cavidad de 100.000 a 250.000 PBMC (celulas mononucleares de sangre perifericas). La incubation de las celulas sanguineas (junto a los agentes patogenos de tuberculosis) se efectua durante un periodo de aprox.18 horas a aprox. 37 °C. Despues, se decantan las celulas y se lava la placa perforada varias veces. A continuation, se anade otro antianticuerpo que esta conjugado con fosfatasa alcalina (detection capture molecule). Se efectua otra

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incubacion a aprox. 37 °C en un periodo de 4 a 12 horas. A continuacion, se limpian los antianticuerpos conjugados no ligados del fondo de la placa de perforation 96. Tras la adicion del paranitrofenilfosfato se examinan las superficies de analisis (fondos de las cavidades) en busca de las coloraciones surgidas. Si ningun spot presenta color (coloraciones), la reaction es negativa. Esto significa que no hay ninguna placa de plasma especifica de tuberculosis (ASC) entre las celulas sanguineas. De tal modo, el paciente, cuyas celulas sanguineas fueron examinadas, no padece ni tuberculosis aguda ni activa. En este sentido, el resultado en este paciente es o bien negativo o bien el paciente padece tuberculosis latente o ya superada, no activa.

Ejemplo 2:

Prueba de borreliosis

[0043] Para llevar a cabo el procedimiento se usa una placa perforada 96. Se inmovilizan los antianticuerpos en los fondos de las cavidades de la placa perforada. Dichos antianticuerpos estan dirigidos especificamente contra los anticuerpos de las celulas secretoras de anticuerpos especificos de la borreliosis. A continuacion, se utilizan antigenos especificos de la borreliosis, por ejemplo, los peptidos OSP A, OSP B, OSP C y/o VIsE fragmento flagelina interna. Los antigenos especificos de la borreliosis se acoplan al fondo de las cavidades con una concentration de 1 a 10 pg/ml. Despues, se anaden por cavidad de 100.000 a 250.000 PBMC (celulas mononucleares de sangre periferica). Las celulas sanguineas se incuban (junto a antigenos especificos de la borreliosis) durante un periodo de aprox. 18 horas a aprox. 37 °C. Despues se decantan las celulas sanguineas y se lava la placa perforada varias veces. A continuacion, se anade otro antianticuerpo que esta conjugado con fosfatasa alcalina. Se efectua otra incubacion a aprox. 37 °C en un periodo de 4 a 12 horas. A continuacion, se limpian los antianticuerpos conjugados no ligados de la placa. Tras la adicion del paranitrofenilfosfato se examina el fondo de las cavidades en busca de las coloraciones surgidas. Si aparecen colores en los spot de los fondos de las cavidades, quedara probado que entre las celulas sanguineas hay ASC especificas de borreliosis. En este caso, el diagnostico sera borreliosis aguda o borreliosis activa. Si por el contrario no hay coloraciones, esto significa que se trata de borreliosis latente o superada.

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   REIVINDICACIONES

   1. Procedimiento para el diagnostico in vitro y/o monitorizacion de terapia in vitro de tuberculosis y/o borreliosis, especialmente para la distincion entre infecciones agudas (activas) por un lado e infecciones latentes (cronicas) o superadas por otro, caracterizado por el hecho de que se incuban celulas eucariotas con al menos un antigeno especifico de tuberculosis y/o al menos un antigeno especifico de borreliosis y se prueban en cuanto a las celulas secretoras de anticuerpos especificos de un antigeno (ASC), donde los anticuerpos secretados se dirigen especificamente contra el antigeno, donde la incubacion de las celulas eucariotas se realiza durante un periodo de entre 2 y 18 horas.
2. 2. Procedimiento segun la reivindicacion 1, caracterizado por el hecho de que se enriquecen las celulas eucariotas antes de incubacion.
3. 3. Procedimiento segun la reivindicacion 1 o 2, caracterizado por el hecho de que se liberan las celulas eucariotas de los eritrocitos antes de la incubacion.
4. 4. Procedimiento segun cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por el hecho de que se liberan las celulas eucariotas del suero sanguineo, particularmente suero sanguineo autologo, antes de la incubacion.
5. 5. Procedimiento segun cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por el hecho de que para la incubacion de las celulas eucariotas se usan como antigeno epitopes patogenos.
6. 6. Procedimiento segun cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por el hecho de que para la incubacion de las celulas eucariotas se utiliza al menos un antigeno del grupo PPD, RD 1, RD 2, ESAT 6, CFP 10, MPT 41, MTB 64, PPE 44, OSP A, OSP B, OSP C, OSP D, OSP E y VIsE.
7. 7. Procedimiento segun cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por el hecho de que para la incubacion de las celulas eucariotas se utiliza al menos un antigeno especifico de tuberculosis del grupo PPD, RD 1, RD 2, MPT 64, MTB 41 y PPE 44.
8. 8. Procedimiento segun cualquiera de las reivindicaciones anteriores caracterizado por el hecho de que para la incubacion de las celulas eucariotas se utiliza al menos antigeno especifico de borreliosis del grupo VIsE, OSP A, OSP B, OSP C, OSP D y OSP E.
9. 9. Procedimiento segun cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por el hecho de que se lleva a cabo el metodo ELISPOT, particularmente incluyendo los siguientes pasos:

   a) aplicacion de moleculas de captura sobre una superficie de analisis,

   b) incubacion de las celulas eucariotas con el antigeno sobre la superficie de analisis,

   c) adicion de moleculas de deteccion sobre la superficie de analisis,

   d) deteccion de ASC sobre la superficie de analisis, cuyo anticuerpos secretados especificos estan dirigidos especificamente contra el antigeno.
10. 10. Aplicacion del procedimiento segun cualquiera de las reivindicaciones anteriores para la comprobacion de la inmunidad vacunal.
11. 11. Uso del procedimiento segun una de las reivindicaciones de la 1 hasta la 9 para valorar el estado inmune, especialmente para distinguir entre infecciones agudas por un lado e infecciones latentes o superadas por otro.
12. 12. Uso de un kit, que comprende al menos un componente para la prueba de celulas secretoras de anticuerpos especificos de un antigeno (ASC), particularmente moleculas de captura, moleculas de deteccion, colorantes de quimioluminiscencia, colorantes fluorescentes y/o antigenos, en un procedimiento segun una de las reivindicaciones de la 1 hasta la 9.