KR100877913B1

KR100877913B1 - 돼지혈청으로부터 일본뇌염바이러스 항체 검출을 위한면역크로마토그래피 진단 키트

Info

Publication number: KR100877913B1
Application number: KR1020070014237A
Authority: KR
Inventors: 주영란; 한명국; 정영의; 전미진; 조정은
Original assignee: 대한민국
Priority date: 2007-02-12
Filing date: 2007-02-12
Publication date: 2009-01-12
Also published as: KR20080075285A

Abstract

본 발명은 돼지혈청으로부터 일본뇌염바이러스에 특이적으로 반응하는 항체를 15분 이내에 검출할 수 있도록 고안된 측방유동형 면역크로마토그래피 진단 키트에 관한 것이다.

본 발명에 따라 고안된 측방유동형 면역크로마토그래피 진단 키트를 이용하여 특정 장비나 검사요원이 없는 일반 동물병원이나 축사현장에서도 신속하게 일본뇌염바이러스의 감염 여부를 진단함으로써, 일본뇌염의 확산을 조기에 방지할 수 있다.

면역크로마토그래피, 진단 키트, 일본뇌염바이러스, 돼지 일본뇌염.

Description

돼지혈청으로부터 일본뇌염바이러스 항체 검출을 위한 면역크로마토그래피 진단 키트 {An immunochromatographic diagnosis kit for the detection of antibodies against Japanese encephalitis virus from swine sera}

도 1은 본 발명에 따른 측방유동형 면역크로마토그래피 진단 키트의 사시도이다.

도 2는 본 발명에 이용된 일본뇌염바이러스 재조합 단백질의 전기영동 결과 및 항-일본뇌염바이러스 항체와의 면역블롯(Immunoblot) 결과를 나타낸 사진이다.

도 3은 본 발명에 따른 진단 키트에 돼지 혈청을 적용하여 반응시킨 것으로, 위는 음성, 아래는 양성의 결과를 나타낸 사진이다.

<도면의 주요부분에 대한 부호의 설명>

1: 검체(샘플) 패드

2: 항체-금 입자 결합체 방출 패드

3: 검사선

4: 대조선

5: 흡수 패드

6: 나이트로셀룰로스 막

7: 스트립 지지대

본 발명은 돼지 혈청에서 일본뇌염바이러스 항체를 15분 이내에 검출할 수 있도록 고안된 측방유동형 면역크로마토그래피 진단 키트에 관한 것이다.

일본뇌염바이러스는 플라비바이러스과(Flaviviridae)의 플라비바이러스속(Flavivirus)에 속하는 단일 가닥의 RNA 형태로 구성된 40~50nm 크기의 바이러스이다. 일본뇌염은 일본뇌염바이러스를 매개하는 모기에 의한 흡혈을 통해 돼지나 사람에게 감염되는데, 주로 동남아시아 지역에서 유행하는 인수공통전염병이다. 우리나라에서는 1946년에 최초로 보고된 이래 1970년대 후반까지 매년 수십에서 천 여명에 이르는 환자가 발생했으나, 1980년대 초부터 도입된 백신접종 등의 영향으로 1,197명이 발병한 1982년의 대유행을 마지막으로 발생률이 급감하는 추세이다. 감염시 심각한 손상을 입는 사람과는 달리 일본뇌염바이러스에 감염된 돼지는 특별한 증상을 나타내지 않으나, 임신돈의 유산이나 사산을 유발하고 웅돈에서는 고환염을 일으켜 번식률을 떨어뜨리는 특징이 있다. 일본뇌염의 발생은 해마다 감소하고 있으나 여전히 매개모기나 증폭숙주인 돼지로부터 일본뇌염바이러스가 분리되고 있어 보건당국에서는 매년 일본뇌염 유행 감시사업을 수행하고 있다.

일본뇌염의 실험실 진단은 크게 (1) 역전사중합효소 연쇄반응법(Reverse transcriptase Polymerase Chain Reaction, RT-PCR)에 의한 바이러스 유전자 검출, (2) 세포배양이나 쥐 접종을 통한 바이러스 분리, (3) 중화시험(Neutralization test, Nt)이나 혈구응집억제시험법(Hemagglutination Inhibition test, HI), 면역형광항체법(Immunofluorescence Antibody assay, IFA) 또는 효소면역측정법(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay, ELISA)에 의한 혈청학적 진단으로 나눌 수 있다.

현재 돼지에서의 일본뇌염 진단은 주로 HI법과 ELISA법이 이용되고 있다. 1950년대에 개발되어 현재까지 사용되고 있는 HI법은 사용 시약이 10여 종에 이르며 실험조건이 까다롭고 신선한 거위 혈액을 지속적으로 필요로 하는 문제점이 있다. 더욱이, 감염 초기에 생성되는 IgM 항체 검출시 여타의 검사법에 비해 민감도가 떨어진다는 점에서 상기 방법은 조기진단 목적으로 활용하기에는 적절치 않다. 또한, 검체의 전처리를 포함하여 1회 시험에 4시간 이상이 소요되는 단점이 있다. IFA법에 의한 진단은 2시간 이내에 시험결과를 확인할 수 있고 감염 초기에 생성되는 IgM 항체 검출시 HI법에 비해 민감도가 높아 조기진단에 활용할 수 있으나, 고가의 형광 현미경을 필요로 하며 결과 판독에 있어서 주관성이 개입될 수 있는 문제점이 있다. ELISA법에 의한 혈청학적 진단은 다량의 검체를 적용하기 용이하며 2~3시간 사이에 시험결과를 얻을 수 있어 현재 가장 선호되는 방법이다. 그러나, 표준화된 규격이나 기준 없이 각 진단센터별로 자체 제작하여 활용하고 있으며 상용화된 제품은 아직 없는 실정이다.

우리나라에서는 주로 HI법을 이용하여 돼지혈청에서의 일본뇌염 항체양전율을 조사하고 있다. 이에 따라 특정지역에서의 돼지항체가 양전율이 50% 이상인 경우, 일본뇌염 경보발령을 통하여 질병의 확산을 방지하고자 노력하고 있다. 그러나 상술한 바와 같이 현재의 진단법은 특정 장비와 시설, 숙련된 진단요원을 필요로 하여 일반 동물병원이나 축산 현장에서 시행하기에는 어려움이 따른다. 또한 진단을 위해 돼지혈청을 진단센터로 이송하게 됨에 따라, 시험결과를 확인하는데 하루 이상의 시간이 추가로 소요되는 문제가 있다.

따라서, 본 발명의 목적은 유전자재조합기술로 대장균(E. coli)에서 생산한 일본뇌염바이러스 피막단백질과 항-돼지 IgG 항체-금 입자 결합체를 이용하여 면역크로마토그래피 원리에 의해 돼지 혈액 내의 일본뇌염바이러스 특이 항체를 검출할 수 있는 진단 키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 특정 장비나 시설, 검사요원 없이 일반 동물병원 또는 축사 현장에서 돼지 일본뇌염을 15분 이내에 확인할 수 있는 진단 키트를 제공함으로써, 질병의 확산을 조기에 막을 수 있도록 하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위해 제공되는 본 발명의 돼지 일본뇌염바이러스 항체 검출용 진단 키트는 염소 항-돼지 IgG 항체-금 입자 결합체가 함유된 결합체 방출 패드와; 돼지 혈청과 항체-금 입자 결합체가 반응한 후 나이트로셀룰로스 막 위로 원활히 전개될 수 있도록 전처리된 검체 패드; 유전자재조합기술로 생산한 일본뇌염바이러스 피막단백질을 고정시킨 검사선과 토끼 항-염소 IgG 항체를 고정시킨 대조선을 흡착하고 있는 나이트로셀룰로스 막; 상기 방출 패드, 검체 패드, 나이트로셀룰로스 막을 담지하는 플라스틱 재질의 케이스;를 포함하고 있다.

본 발명의 진단 키트 제조를 위하여, 일본뇌염바이러스(Nakayama-NIH 주)의 피막단백질 일부를 유전자재조합 기술을 통해 대장균으로부터 발현시킨 후 정제하였고, 돼지 혈청 중의 IgG 항체를 탐지하기 위해 항-돼지 IgG 항체와 붉은색을 띠는 금 입자를 이용하여 항체-금 입자 결합체를 제조하였다.

검체를 적하하는 검체 패드는 혈액과 항체-금 입자 결합체가 반응한 후 나이트로셀룰로스 막 위로 원활히 전개될 수 있도록 완충용액으로 전처리하여 제조하였고, 나이트로셀룰로스 막의 특정위치(검사선)에는 돼지 혈청 중에 존재하는 일본뇌염바이러스 특이 항체가 포획될 수 있도록 일본뇌염바이러스 피막단백질을 분주하여 고정시켰다.

항체-금 입자 결합체가 함유된 결합체 방출 패드와 검체 패드를 나이트로셀룰로스 막에 중첩되도록 부착하고 검체 패드 반대편의 나이트로셀룰로스 막에는 모세관 현상을 통해 상기 복합체가 원활히 전개될 수 있도록 흡수 패드를 중첩하여 부착하며, 이렇게 제조한 진단용 스트립을 원형의 검체투입구와 검사선(T) 및 대조선(C)이 표기된 플라스틱 재질의 케이스에 넣고 조립하였다.

본 발명에 따른 진단 키트의 제조방법 및 진단원리는 이하의 실시예를 통해 보다 구체적으로 설명될 것이다. 그러나, 이하의 실시예들은 본 발명에 대한 이해를 돕기 위해 제공된 것이며, 본 발명의 범위가 이들 실시예로 한정되는 것으로 해석해서는 안 된다.

<실시예>

본 실시예에서 %는 특별한 설명이 없는 한, 100㎖ 당 g수, 즉 (w/v)%를 의미한다.

<실시단계 1> 대장균에서의 일본뇌염바이러스 피막단백질의 생산

<실시단계 1-1> 일본뇌염바이러스 RNA 추출 및 발현벡터 제조

일본뇌염바이러스(Nakayama-NIH 주)의 피막단백질에 대한 유전자 재조합 발현벡터를 제조하고자 바이러스 배양액으로부터 QIAamp 바이러스 RNA 키트(QIAamp Viral RNA kit; QIAGEN, 독일)를 사용하여 일본뇌염바이러스의 RNA를 추출하였다. Superscript RT Ⅲ system (Invitrogen, 미국)과 프라미어 JEV-cD(서열 1)을 이용하여 상기 RNA로부터 cDNA를 합성하였다. 이어 상기 cDNA와 프라이머 JEV-F1(서열 2) 및 프라이머 JEV-R1(서열 3)를 사용하여 PCR을 수행하였다. 그 결과로 일본뇌염바이러스 피막단백질의 아미노산 서열 296번부터 400번까지를 코딩하는 유전자를 수획하였고, 이를 pBAD102/D-TOPO 벡터(Invitrogen, 미국)에 접합시켜 발현벡터를 제조하였다. 발현벡터로부터 DNA를 추출하여 일본뇌염바이러스 피막단백질 유전자 에 대한 염기서열을 확인한 결과, 의도하는 DNA가 삽입되어 있었다.

[서열 1] 프라이머 JEV-cD

cacattggtc gctaagaaca cgagc

[서열 2] 프라이머 JEV-F1

caccctgaaa ggcacaacct a

[서열 3] 프라이머 JEV-R1

tccagccttg tgccaatggt g

<실시단계 1-2> 유전자재조합 단백질의 발현 및 정제

일본뇌염바이러스 피막단백질의 발현벡터로 형질전환된 대장균을 앰피실린(ampicillin)이 포함된 배지에서 1시간 동안 진탕 배양한 다음, 최종 0.2％ 아라비노스(arabinose)를 첨가하고 다시 4시간 동안 배양하였다. 이를 원심분리하여 균체를 회수하고 초음파 파쇄기로 분쇄한 후, 상층액만을 모아 정제에 사용하였다. 단백질의 정제는 상기 상층액을 사용하여 니켈(Nikel) 컬럼을 이용한 통상적인 정제과정을 통해 수행하였고, 이를 통해 약 27 kDa의 일본뇌염바이러스 피막단백질을 얻었다. 이렇게 정제된 일본뇌염바이러스 피막단백질이 마우스 항-일본뇌염바이러스 단클론항체와 반응하는 것을 면역블롯팅법으로 확인하였다(도 2).

<실시단계 2> 염소 항-돼지 IgG 항체와 금 입자와의 결합체 제조

항체-금 입자 결합체의 제조를 위해 염소 항-돼지 IgG 항체를 2㎎/㎖의 농도로 0.5×PBS용액(phosphate buffered saline, PBS)에 희석하였다. 이 항체용액을 540nm에서의 흡광도가 15인 40nm 직경의 금 입자 용액(pH 7.3)에 최종 40㎍/㎖이 되도록 첨가한 후 상온에서 5분 동안 흔들면서 반응시켰다. 여기에 10％ BSA(bovine serum albumin, BSA)를 최종 1％가 되도록 첨가한 후 다시 5분 동안 반응시켰다. 제조된 항체-금 입자 결합체는 사용 전까지 약 4℃에서 냉장보관하였다.

<실시단계 3> 나이트로셀룰로스 막 위에 단백질 고정화

미세 분주기(AJQ 3000, Biodot)를 이용하여 나이트로셀룰로스 막 표면에 2.5㎎/㎖의 일본뇌염바이러스 피막단백질(검사선)과 1.5㎎/㎖의 토끼 항-염소 IgG 항체(대조선)를 1㎜ 폭의 선 형태로 분주하였다. 분주한 후, 나이트로셀룰로스 막을 37℃, RH 30~40％로 유지되는 제습 장치 안에서 1~2시간 동안 고정화시켰다.

<실시단계 4> 항체-금 입자 결합체 방출 패드 제조

염소 항-돼지 IgG 항체와 금 입자의 결합체를 6％ 슈크로스(sucrose)가 포함된 PBS용액과 2:1의 비율로 섞어 폴리에스테르 재질의 섬유에 고르게 적신 후 건조시켜 방출 패드를 제조하였다.

<실시단계 5> 샘플(검체) 패드 전처리

샘플 패드에 적하된 돼지 혈청이 항체-금 입자 결합체와 반응한 후 나이트로 셀룰로스 막을 통해 원활하게 전개될 수 있도록 샘플 패드를 전처리 용액(0.1％ 트윈20(tween20), 1％ BSA가 포함된 PBS용액)에 충분히 적신 후, 50℃에서 1시간 동안 건조시켰다.

<실시단계 6> 진단키트의 조립

도 1과 같이, 항체-금 입자 결합체가 함유된 결합체 방출 패드와 검체 패드를 나이트로셀룰로스 막에 중첩되도록 부착하고 검체 패드 반대편의 나이트로셀룰로스 막에는 모세관 현상을 통해 상기 복합체가 원활히 전개될 수 있도록 흡수 패드를 중첩하여 부착하였다. 이렇게 제조한 진단용 스트립을 원형의 검체투입구와 검사선(T) 및 대조선(C)이 표기된 플라스틱 재질의 케이스에 넣고 조립하여 본 발명의 진단키트를 제조하였다.

본 발명에 따르는 진단 키트의 반응 원리는 다음과 같다.

돼지 혈청을 완충액과 섞은 후 검체 투입구에 적하하면 혈청 중의 돼지 IgG항체는 염소 항-돼지 IgG 항체-금 입자 결합체와 복합체를 형성한다. 상기 복합체는 모세관현상에 의해 나이트로셀룰로스 막을 지나 흡수 패드 쪽으로 이동하며 일본뇌염바이러스의 피막단백질이 고정되어 있는 검사선과 토끼 항-염소 IgG 항체가 흡착된 대조선을 차례대로 지나게 된다. 이때 상기 복합체 중 일본뇌염바이러스 특이 항체가 존재하는 경우 이 항체는 검사선에 고정된 피막단백질과 항원-항체반응을 일으키게 되고 결과적으로 상기 복합체는 검사선에서 붉은색의 선명한 선을 띄 게 된다. 검사선에서 반응하지 않은 여분의 복합체는 토끼 항-염소 IgG 항체가 흡착된 대조선에서 반응하여 붉은색의 선을 띄게 된다.

즉, 완충액에 희석된 검체용액을 적하하고 15분 이내에 검사선의 붉은색 띠 유무를 관찰하여 양성과 음성으로 판정한다. 검사선은 돼지 혈청 내에 일본뇌염바이러스 특이 항체가 존재하면 붉은색의 띠를 나타내며, 이 경우에 한해 양성으로 판정한다. 대조선은 검체 내의 일본뇌염 항체 유무에 상관없이, 즉 검사선의 발색 여부와 무관하게 항상 붉은색의 띠를 나타내는데, 대조선이 발색되지 않는 경우는 실험상의 오류이거나 시약의 문제가 있는 것이므로 재실험이 요구된다.

본 발명 진단 키트의 효능을 확인하기 위하여, 다음과 같이 동일목적 진단법과의 비교시험을 통한 민감도 및 특이도를 평가하였다.

<시험예> 진단 키트의 효능평가 시험

본 발명에 따르는 돼지 일본뇌염바이러스 항체 진단 키트의 효능평가를 위해 동일한 목적의 진단법인 HI법과의 비교시험을 수행하였다.

돼지혈청은 2006년에 수행한 일본뇌염유행예측사업을 통하여 확보하였으며, HI법에 의한 진단은 국립보건연구원의 일본뇌염 표준진단법에 따라 수행하였고, HI항체 역가가 1:10 이상인 경우 양성으로 판정하였다. 본 발명품에 의한 진단은 상기 방법에 의해 음성 또는 양성으로 선별된 검체 각 10㎕와 90㎕의 완충액액(0.2％ PEG가 함유된 PBS용액)을 섞은 후, 이를 원형의 검체 투입구에 첨가하고 15분 이내 에 검사선의 발색 유무에 따라 양성과 음성으로 판정하였다.

동일목적 진단법과의 비교시험을 통한 민감도 및 특이도 평가

		HI 진단법		합계
		양성	음성	합계
본 발명품	양성	21	4	25
본 발명품	음성	2	54	56
합계		23	58	81

상기 시험예에 따른 평가 결과, 표 1과 같이 본 발명품은 돼지 일본뇌염바이러스 항체 검출시 HI법과 92.6％(75/81)의 일치율을 보이며, 민감도가 91.3％(21/23)이고 특이도가 93.1％(54/58)임을 확인하였다. 또한 두 시험법 사이의 차이는 통계적으로 무의미함을 확인하였다(X ² =0.167, p>0.05).

본 발명에 따른 돼지 일본뇌염바이러스 항체 진단 키트는 돼지 혈청에서 일본뇌염바이러스 감염 여부를 15분 이내에 정확하게 확인할 수 있다. 따라서, 본 발명에 따라 고안된 측방유동형 면역크로마토그래피 진단 키트를 이용하여 복잡한 장비나 숙련된 검사요원이 없는 일반 동물병원이나 축사현장에서도 신속하게 일본뇌염바이러스의 감염 여부를 진단해 냄으로써, 질병의 확산을 조기에 방지할 수 있다.

<110> Republic of Korea <120> An immunochromatographic diagnosis kit for the detection of antibodies against Japanese encephalitis virus from swine sera <130> 07100037 <140> 10-2007-0014237 <141> 2007-02-12 <160> 3 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 25 <212> DNA <213> Japanese encephalitis virus <400> 1 cacattggtc gctaagaaca cgagc 25 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Japanese encephalitis virus <400> 2 caccctgaaa ggcacaacct a 21 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Japanese encephalitis virus <400> 3 tccagccttg tgccaatggt g 21

Claims

삭제
염소 항-돼지 IgG 항체-금 입자 결합체가 함유된 결합체 방출 패드와,

돼지 혈청과 항체-금 입자 결합체가 반응한 후 나이트로셀룰로스 막 위로 원활히 전개될 수 있도록 전처리된 검체 패드,

하기 서열 1, 서열 2 및 서열 3의 프라이머를 사용하여 일본뇌염바이러스(Nakayama-NIH 주)로부터 RT-PCR법에 의해 증폭시킨 DNA를 이용하여 발현시킨 일본뇌염바이러스 피막단백질을 고정시킨 검사선과 토끼 항-염소 IgG 항체를 고정시킨 대조선을 흡착하고 있는 나이트로셀룰로스 막,

상기 방출 패드, 검체 패드, 나이트로셀룰로스 막을 담지하는 플라스틱 재질의 케이스;를 포함하는 것을 특징으로 하는 돼지 일본뇌염바이러스 항체 검출용 진단 키트.

[서열 1] 프라이머 JEV-cD

cacattggtc gctaagaaca cgagc

[서열 2] 프라이머 JEV-F1

caccctgaaa ggcacaacct a

[서열 3] 프라이머 JEV-R1

tccagccttg tgccaatggt g
제2항에 있어서,

상기 결합체는 염소 항-돼지 IgG 항체를 2㎎/㎖의 농도로 0.5×PBS용액(phosphate buffered saline, PBS)에 희석하고, 이 항체용액을 540nm에서의 흡광도가 15인 40nm 직경의 금 입자 용액(pH 7.3)에 최종 40㎍/㎖이 되도록 첨가한 후 상온에서 5분 동안 흔들면서 반응시킨 후, 10％ BSA(bovine serum albumin, BSA)를 최종 1％가 되도록 첨가한 후 다시 5분 동안 반응시켜 제조되는 것을 특징으로 하고,

상기 방출 패드는 염소 항-돼지 IgG 항체와 금 입자의 결합체를 6％ 슈크로스(sucrose)가 포함된 PBS용액과 2:1의 비율로 섞어 폴리에스테르 재질의 섬유에 고르게 적신 후 건조시켜 제조되는 것을 특징으로 하고,

상기 나이트로셀룰로스 막은 미세 분주기(AJQ 3000, Biodot)를 이용하여 나이트로셀룰로스 막 표면에 2.5㎎/㎖의 일본뇌염바이러스 피막단백질(검사선)과 1.5㎎/㎖의 토끼 항-염소 IgG 항체(대조선)를 1㎜ 폭의 선 형태로 분주한 후, 나이트로셀룰로스 막을 37℃, 상대습도(relative humidity, RH) 30~40％로 유지되는 제습 장치 안에서 1~2시간 동안 고정화시킨 것을 특징으로 하는 돼지 일본뇌염바이러스 항체 검출용 진단 키트.
일본뇌염바이러스에 감염된 것으로 의심되는 돼지 혈청을 제2항 또는 제3항 중 어느 하나의 진단 키트에 접촉시킴으로써 15분 이내에 결과를 확인할 수 있는 것을 특징으로 하는 돼지의 일본뇌염 조기 진단법.