JP7144039B2 - 重症熱性血小板減少症候群ウイルス抗体検出キット及び重症熱性血小板減少症候群ウイルス抗体検出方法 - Google Patents
重症熱性血小板減少症候群ウイルス抗体検出キット及び重症熱性血小板減少症候群ウイルス抗体検出方法 Download PDFInfo
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Description
重症熱性血小板減少症候群ウイルスの第1の組換え核タンパク質が固定化された担体と、
重症熱性血小板減少症候群ウイルスの標識された第2の組換え核タンパク質と、
を備え、
前記第1の組換え核タンパク質及び前記第2の組換え核タンパク質のアミノ酸配列は、
配列番号1に示されるアミノ酸配列である。
ELISA用プレートに設けられたウェルである、
こととしてもよい。
西洋ワサビペルオキシダーゼで標識されている、
こととしてもよい。
血液検体に暴露される検体反応部及び前記血液検体に含まれる重症熱性血小板減少症候群ウイルスの核タンパク質に対する抗体を捕捉する捕捉部を有するクロマトグラフ媒体であって、
前記検体反応部は、前記第2の組換え核タンパク質を有し、
前記捕捉部には、前記第1の組換え核タンパク質が固定化されている、
こととしてもよい。
金コロイドで標識されている、
こととしてもよい。
担体に固定化された重症熱性血小板減少症候群ウイルスの第1の組換え核タンパク質に捕捉された血液検体に含まれる重症熱性血小板減少症候群ウイルスの核タンパク質に対する抗体を、前記抗体に結合した、重症熱性血小板減少症候群ウイルスの標識された第2の組換え核タンパク質を介して検出し、
前記第1の組換え核タンパク質及び前記第2の組換え核タンパク質のアミノ酸配列は、
配列番号1に示されるアミノ酸配列である。
本実施の形態に係るSFTSV抗体検出キットは、血液検体に含まれるSFTSVの核タンパク質(以下「NP」とする)に対する抗体(以下「抗NP抗体」という)を検出するためのキットである。血液検体に抗NP抗体が検出された場合、被検者はSFTSVに感染している又は感染していた、すなわち、SFTSである又はSFTSであったと診断される。血液検体は、被検者の全血であってもよく、被検者の血液に含まれる血清及び血漿等の成分であってもよい。また、血液検体は、被検者の全血、血清及び血漿等の成分を緩衝液等で希釈したものであってもよい。
本実施の形態に係るSFTSV抗体検出キットは、ELISAではなく、イムノクロマトグラフィーで血液検体中の抗NP抗体を検出する。このため、SFTSV抗体検出キットは、担体としてクロマトグラフ媒体10を備える。
(SFTSVのNPをコードする遺伝子の増幅及び発現ベクターへの組み込み)
SFTSV株SPL030Aの全cDNA(国立感染症研究所より取得、Accession No.AB818000)を鋳型に用い、NP遺伝子を増幅した。NP遺伝子増幅用のプライマー対には、NcoIサイトを付加したNP-F1(配列番号2)及びEcoRIサイトを付加したNP-R1(配列番号3)を用いた。増幅酵素としてPrimeSTAR(商標) GXL DNA Polymerase(タカラバイオ社製)を用いて、98℃で20秒間変性させた後、98℃で10秒間、60℃で10秒間及び72℃で1分間を1サイクルとして30サイクルの増幅を行った。0.8%アガロースゲルを用いた電気泳動で、増幅産物がNP遺伝子であることを確認した。
上記のプラスミドDNAを、タンパク質発現用の大腸菌BL21(DE3)Competent Cell(Novagen社製)に導入した。形質転換した大腸菌にSOC溶液350μLを添加し、37℃で30分間振とう培養した後、アンピシリン(最終濃度100μg/mL)を添加したLBプレートに播種し、37℃で一昼夜培養した。得られたコロニーの一部を25mM NaOH 20μLで溶菌し、98℃で5分間加温後、100mM Tris HCl(pH7.0)20μLを添加した。ボルテックスで混和後、遠心して得た上清を鋳型として、インサートDNAを増幅するプライマーpET-F1(配列番号4)及びpET-R1(配列番号5)を用いてTaKaRa Ex Taq HS(タカラバイオ社製)でインサートDNAを増幅した。インサートDNAの塩基配列はABI PRISMTM 310 Genetic Analyzer(Thermo Fisher Scientific社製)を用いてダイレクトシーケンス法で確認した。
NP発現ベクターを導入した大腸菌BL21(DE3)を、アンピシリン(最終濃度100μg/mL)を添加したLB培地において、37℃で16時間、振とう培養した。その培養液3.2mLを新しいアンピシリン添加LB培地160mLに添加し、37℃で振とう培養した。600nmの吸光度が0.4~0.5に達した時点で、IPTGを最終濃度1mMになるように添加し、さらに4時間培養して組換えタンパク質の発現を誘導した。培養液を3500rpmで20分間、遠心し、その菌体にHiTALONTM Buffer Set(タカラバイオ社製)のTractor Buffer 16mLを添加し超音波処理で可溶化を行った。
rNPのHRPによる標識は、Peroxidase Labeling Kit-NH2(同仁化学研究所製)を用いて以下のように行った。300μgのrNPにWashing Bufferを100μL加え、分画分子量1万の限界濾過膜スピンカラム NANOSEP 10K OMEGA(Pall corporation社製)にアプライし8000×gで10分間遠心し、再度Washing Bufferを100μL加え、バッファーを交換した。Reaction buffer 10μLで溶解したNH2-Reaction Perxidaseをメンブレン上のrNPに添加し、37℃で2時間反応させ、rNPにペルオキシダーゼを結合させた。メンブレンにWashing Bufferを100μL添加し、8000×gで10分間遠心し、最終的に200μLのStorage Bufferでペルオキシダーゼ標識rNPを溶出して回収し、4℃で保存した。
PBSでrNPを希釈し、ELISA用96ウェルプレートであるF96 MAXISORP NUNC-IMMUNOPLATE(Thermo Fisher Scientific社製)の1ウェルに100μLずつ添加し、4℃で16時間静置し、rNPを固相化した。固相化後、TBST(20mM Tris-HCl(pH7.4)、0.1M NaCl、0.05%Tween20)で洗浄し、ブロッキングとして5%スキムミルクを含むTBSTを200μL添加し、室温(24~26℃)で2時間静置した。
図2及び図3は、それぞれ症例M2及び症例M4について、rNP溶液の濃度に対する吸光度を示す。血清の希釈倍率に関わらず、rNPの濃度が2.5μg/mLまで、rNPの濃度依存的な吸光度の増大が確認された。
(カットオフ指標の設定)
健常人血清60検体を0.5%SM/TBSTで25倍希釈し、上記ELISAで抗NP抗体を測定した。得られた吸光度の平均+6×標準偏差をカットオフ値とした。なお、固相化したrNP溶液におけるrNPの濃度は3ng/mLとした。
凍結保存したSFTS患者3症例の血清(症例M1の発症後4、6、8、10、375日、症例M2の発症後6、9、11、18、32、63、622日、症例M6の発症後7、11、13、23、57、126日)を0.5%SM/TBSTで25倍希釈し、上記ELISAで抗NP抗体を測定した。なお、固相化したrNP溶液のrNPの濃度は3ng/mLとした。
健常人60名の血清の吸光度の分布を図4に示す。カットオフ値は0.041と算出された(0.005+6×0.005=0.041)。
0.5%SM/TBSTで25倍希釈した症例M1(発症後4日)、症例M2(発症後6日)、症例M6(発症後7日)の血清にrNPを0、1、3、10μg/mLの濃度で添加し室温(25℃)で1時間反応させた後、ELISAの検体として測定した。また、25倍希釈した患者血清にMock細胞ライセート又はSFTSV感染細胞ライセートをそれぞれ1/30量加えて室温(25℃)で1時間反応させた検体もELISAで測定した。
図6(A)~(C)は、それぞれ症例M1、症例M2及び症例M6の血清に関する結果を示す。いずれもrNPの濃度依存的に吸光度が減少し、終濃度10μg/mL rNPで吸光度がほぼ0となった。また、SFTSV感染細胞ライセート(感染細胞)でも吸光度が低下し、非感染細胞のMock細胞ライセートではrNPを添加しなかった検体と比較して吸光度が低下しなかったことから、上記ELISAは特異的に抗NP抗体を測定していることが示された。図6(D)に示すように、コントロールとしてrNPを免疫源として感作して得られたウサギ抗NP血清でも同様の結果が得られた。
(NP抗原感作金コロイドの作製)
上記のrNP溶液(1mg/mL)を5mMリン酸緩衝液(pH7.0)で、100μg/mLに調製した。10mL梨型沈殿管に、50mMリン酸緩衝液(pH7.0)を100μL添加した。当該沈殿管に金コロイド(40nm、BBI Solutions社製、EMGC40)液を900μL添加し、軽く撹拌した。当該沈殿管に100μg/mLに調製したrNP溶液を撹拌しながら添加し、室温で10分静置した。当該沈殿管に1%ポリエチレングリコール(PEG、和光工業社製、169-21105)を55μL添加し、軽く撹拌した。さらに、当該沈殿管に10%BSA(SIGMA社製、AA3050-50G)を110μL添加し、軽く撹拌した。
上記のウサギ抗NP血清10mLにPBS10mLを加え、硫酸ナトリウム3.6gを添加し4℃で1時間静置した後、12000rpmで20分間遠心した。沈殿を17.5mMリン酸緩衝液(pH6.3)で溶解し、同じリン酸緩衝液で平衡化したPD10(GEヘルスケア社製)カラムに添加し、同じリン酸緩衝液3.5mLで溶出しバッファーを交換した。この溶液を17.5mMリン酸緩衝液(pH6.3)で平衡化したDE-52(ワットマン社製)カラムに添加し、同じ緩衝液で溶出した。280nmに吸収が認められた溶出分画をIgG分画として得た。さらに、このIgG分画をSepharose4B(GEヘルスケア社製)にrNP1.4mgを結合させて作成した抗原カラムにアプライし、20mM Tris-HCl(pH8.0)、0.5M NaClで洗浄した後、0.1M Glycin-HCl(pH2.5)で溶出した。280nmで吸収の認められた溶出分画をプールし、PBSで平衡化したPD-10カラムでバッファーを交換し、アフィニティ精製ウサギ抗NP IgGとして用いた。
上記の抗体及び抗原を固相化したメンブレン(固相化メンブレン)を、コントロールライン側が上、テストラインが下になるようにバッキングシート(ニップエンジニアリング社製、34042/9107)の下端から20mmの位置に貼り付けた。サンプル吸収パッド(20mm×150mm、Cellulose Fiber Sample Pad、MILLIPORE社製、CFSP223000)を、固相化メンブレンとサンプル吸収パッドが5mm重なるようにして、バッキングシートの上端に合わせて貼り付けた。サンプルパッド(21.5mm×150mm、ABSORBENT TYPE 111、ポール社製、BSP111PK)を、固相化メンブレンとサンプルパッドが2mm重なるようにして、バッキングシートの下端に合わせて貼り付けた。乾燥剤を入れた袋で、冷蔵保存した。使用時に5mm幅にカットし、イムノクロマトストリップとした。
Tris-HCl、Triton X100及びBSAを混合し、反応用緩衝液を調製した。ウサギ抗NP抗体溶液を、健常人血清を用いて2000、1000、500、250、100、50及び10ng/mLに調整し、試料とした。試料と反応用緩衝液とを9:1(試料:反応用緩衝液)で混合し、検体とした。また、NCとして健常人血清と反応用緩衝液とを混合した検体も調製した。
図7に示すように、イムノクロマトグラフィーによって、ウサギ抗NP抗体の濃度として50ng/mLまで検出できた。また、ウサギ抗NP抗体を含まない健常人血清で非特異反応が出ないことを確認した。
上記実施例4で作製したイムノクロマトストリップを用いて、SFTS患者の血清検体に関する抗NP抗体の検出を以下のように検討した。凍結保存したSFTS患者5症例の血清(症例M1の発症後4日及び375日、症例M2の発症後63日、症例M3の発症後430日、症例M4の発症後7日及び350日、症例M6の発症後7日及び57日)4μLに反応用緩衝液89μL及びNP抗原感作金コロイド溶液7μLを加えた。
図8に回復期血清(症例M1の発症後375日、症例M2の発症後63日、症例M3の発症後430日、症例M4の発症後350日、症例M6の発症後57日)に関する結果を示す。いずれの検体についてもテストラインに金コロイドのラインが確認され、陽性と判定された。
2 コンジュゲートパッド
3 メンブレン
4 吸収パッド
5 バッキングシート
10 クロマトグラフ媒体
31 捕捉部
32 コントロールライン
Claims (6)
- 重症熱性血小板減少症候群ウイルスの第1の組換え核タンパク質が固定化された担体と、
重症熱性血小板減少症候群ウイルスの標識された第2の組換え核タンパク質と、
を備え、
前記第1の組換え核タンパク質及び前記第2の組換え核タンパク質のアミノ酸配列は、
配列番号1に示されるアミノ酸配列である、
重症熱性血小板減少症候群ウイルス抗体検出キット。 - 前記担体は、
ELISA用プレートに設けられたウェルである、
請求項1に記載の重症熱性血小板減少症候群ウイルス抗体検出キット。 - 前記第2の組換え核タンパク質は、
西洋ワサビペルオキシダーゼで標識されている、
請求項2に記載の重症熱性血小板減少症候群ウイルス抗体検出キット。 - 前記担体は、
血液検体に暴露される検体反応部及び前記血液検体に含まれる重症熱性血小板減少症候群ウイルスの核タンパク質に対する抗体を捕捉する捕捉部を有するクロマトグラフ媒体であって、
前記検体反応部は、前記第2の組換え核タンパク質を有し、
前記捕捉部には、前記第1の組換え核タンパク質が固定化されている、
請求項1に記載の重症熱性血小板減少症候群ウイルス抗体検出キット。 - 前記第2の組換え核タンパク質は、
金コロイドで標識されている、
請求項4に記載の重症熱性血小板減少症候群ウイルス抗体検出キット。 - 担体に固定化された重症熱性血小板減少症候群ウイルスの第1の組換え核タンパク質に捕捉された血液検体に含まれる重症熱性血小板減少症候群ウイルスの核タンパク質に対する抗体を、前記抗体に結合した、重症熱性血小板減少症候群ウイルスの標識された第2の組換え核タンパク質を介して検出し、
前記第1の組換え核タンパク質及び前記第2の組換え核タンパク質のアミノ酸配列は、
配列番号1に示されるアミノ酸配列である、
重症熱性血小板減少症候群ウイルス抗体検出方法。
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Non-Patent Citations (3)
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Fuxun Yu,Application of recombinant severe fever with thrombocytopenia syndrome virus nucleocapsid protein for the detection of SFTSV-specific human IgG and IgM antibodies by indirect ELISA,Virol J,2015年08月04日,12:117,pp.1-7,doi: 10.1186/s12985-015-0350-0 |
Xianguo Wang,Development of a Colloidal Gold Kit for the Diagnosis of Severe Fever with Thrombocytopenia Syndrome Virus Infection,Biomed Res Int.,2014年,Volume 2014, Article ID 530621,pp.1-6,doi: 10.1155/2014/53062 |
Yongjun Jiao,Preparation and Evaluation of Recombinant Severe Fever with Thrombocytopenia Syndrome Virus Nucleocapsid Protein for Detection of Total Antibodies in Human and Animal Sera by Double-Antigen Sandwich Enzyme-Linked Immunosorbent Assay,J Clin Microbiol,2012年02月,50(2),pp.372-7,doi: 10.1128/JCM.01319-11 |
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