KR102099370B1

KR102099370B1 - 인플루엔자 a형 바이러스의 검출 키트

Info

Publication number: KR102099370B1
Application number: KR1020147027698A
Authority: KR
Inventors: 히사히코 이와모토; 히로코 가와모토; 신이치 가토오
Original assignee: 다나카 기킨조쿠 고교 가부시키가이샤
Priority date: 2012-03-30
Filing date: 2013-03-29
Publication date: 2020-04-09
Also published as: EP2833147B1; JPWO2013145767A1; EP2833147A1; CN104246504A; JP5939656B2; US20150079581A1; EP2833147A4; CN104246504B; WO2013145767A1; TW201346040A; KR20140145142A

Abstract

본 발명은, 면역 크로마토그래피법의 원리를 응용한 인플루엔자의 신속 진단을 위한 검사 키트이며, 종래의 검사 키트보다 인플루엔자 A형 바이러스의 검출 감도가 높고, 인플루엔자 발병의 보다 빠른 시기로부터, 안정적이고 또한 높은 정밀도로 「양성」의 판정이 얻어지는 인플루엔자 A형 바이러스의 검사 키트를 제공하는 것을 목적으로 한다. 본 발명은, 크로마토그래프 매체에 고상화된 항체가, 미변성의 인플루엔자 A형 바이러스 핵단백질과 항원 항체 반응하지만, SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기 영동에 의해 분리된 전장의 인플루엔자 A형 바이러스 핵단백질과는 웨스턴 블로트법에 의해 항원 항체 반응하지 않는 항체인, 인플루엔자 A형 바이러스를 검출하기 위한 키트에 관한 것이다.

Description

인플루엔자 A형 바이러스의 검출 키트 {DETECTION KIT FOR INFLUENZA A VIRUS}

본 발명은, 인플루엔자 A형 바이러스 핵단백질과 특이적으로 항원 항체 반응을 하지만, SDS(도데실황산나트륨)-폴리아크릴아미드 겔 전기 영동에 의해 분리된 전장(全長)의 인플루엔자 A형 바이러스 핵단백질과는 웨스턴 블로트법에 의해 항원 항체 반응하지 않는 항체를 이용한, 인플루엔자 A형 바이러스를 검출하기 위한 면역 크로마토그래피법에 의한 검사 키트에 관한 것이다.

인플루엔자라 함은 인플루엔자 바이러스에 의한 감염증으로, 그 전형적인 증상으로서는, 발열·두통·전신의 권태감·근관절통 등이 갑자기 나타나며, 기침·콧물 등이 서로 전후하여 계속되는 것이 알려져 있고, 이들 증상은 약 1주일이면 조금 나아진다고 일컬어지고 있다. 그 밖의 이른바 감기 증후군에 비해, 인플루엔자의 특징은 전신 증상이 강한 것에 있지만, 정확한 진단을 행하기 위해서는 바이러스학적인 증명이 필요하다. 인플루엔자가 유행하고 있는 시기에 있어서, 감기 증상을 갖는 환자에 대해 인플루엔자인지 여부의 정확한 진단을 행하는 것은, 치료를 위한 항 인플루엔자 바이러스제의 적절한 선택에 결부될 뿐만 아니라, 유행 상황을 정확하게 파악하는 것이나 인플루엔자 백신의 효과를 판정하는 것과 같은 역학적인 관점에서도 중요하다.

인플루엔자의 병원 진단을 정확하게 행하기 위해서는, 인두 세척액이나 양치액을 재료로 하여 바이러스 분리를 행하는 것이 표준적인 방법이지만, 진단까지 장시간을 필요로 한다. PCR(Polymerase chain reaction)법을 이용하여 바이러스 게놈을 검출하면, 단시간에 정밀도가 높은 결과를 얻는 것도 가능하지만, PCR법에는 특별한 장치가 필요하여 위생 연구소나 제한된 검사실이 아니면 실시할 수 없다.

최근에는, 베드사이드 또는 외래 진료 등에서 인플루엔자 항원을 검출하는 것이 가능한 신속 진단 키트가 시판되게 되어, 바이러스학적 진단을 일상의 임상 중에서 용이하게 행할 수 있게 되어 왔다. 면역 크로마토그래피법의 원리를 응용한 인플루엔자의 신속 진단 키트(특허문헌 1∼11 참조)는, 용이하게 채취할 수 있는 비강 점막 또는 인두 점막 등의 생체 시료를 이용하여, 간편한 조작으로 단시간에 검사 결과를 얻을 수 있으므로, 검사를 받는 환자 및 검사를 실시하는 의료 종사자 양쪽의 부담이 가볍다고 하는 이점이 있다. 또한, 「양성」의 결과가 얻어진 경우는, 의사가 정확한 진단을 내리기 위한 유익한 정보를 제공하는 것이 가능하다. 그러나, 현재 시판되고 있는 신속 진단 키트는, 인플루엔자 바이러스의 검출 감도가 충분하지 않아, 「음성」의 결과가 얻어졌다고 해서 반드시 바이러스의 감염을 부정할 수 있는 것은 아니다.

인플루엔자 환자의 비강 점막 또는 인두 점막으로부터 검출되는 인플루엔자 바이러스의 양은, 발병 후 2∼3일에 최고에 달한 후, 급속하게 감소하여, 5∼7일에 소실되는 것이 알려져 있다. 신속 진단 키트에서 「양성」으로 판정되기 위해서는, 감염 후에 생체 내에서 인플루엔자 바이러스가 증식하여, 생체 시료 중에서의 바이러스량이 검출 감도 이상에 도달해 있을 필요가 있다. 바이러스의 증식이 시작된지 얼마 되지 않은 감염 초기의 환자나, 백신의 접종에 의해 바이러스의 증식 속도가 억제되는 환자 등에서는, 양성이라 판정하기에 충분한 양의 바이러스가 생체 시료 중에 존재하지 않는 경우가 있어, 실제로는 인플루엔자 바이러스에 감염되어 있음에도 불구하고 신속 진단 키트의 결과는 「음성」으로 되는 것과 같은, 위음성(僞陰性)의 판정의 문제가 있었다. 임상 현장에서는, 신속 진단 키트에 의한 검사는, 발병 후 24시간을 경과하면 안정적으로 바이러스를 검출할 수 있어 정밀도가 높은 결과가 얻어지지만, 발병 후 12시간 이내에서는 바이러스를 검출할 수 없어 정확한 판정을 할 수 없는 경우가 있는 것과 같은 실정으로부터, 「음성」의 결과가 된 환자에 대해서는, 다른 소견에 따라서 다음날 이후에 재검사가 실시되고, 환자는 다시 의료 기관에서 수진해야 해, 시간 및 비용의 면에서 과도한 부담을 강요받고 있었다.

또한, 치료를 위한 항 인플루엔자 바이러스제의 선택의 관점에서도, 감염의 가능한 한 빠른 시기에 정확한 인플루엔자의 진단이 이루어지는 것이 요구되고 있다. 현재, 인플루엔자의 치료약의 대표적인 것으로서, 인산오셀타미빌(상품명 타미플루)이나 자나미빌(상품명 리렌자) 등의 뉴라미니다아제 저해제가 널리 사용되고 있다. 뉴라미니다아제는 인플루엔자 바이러스가 생체 내에서 세포로부터 세포로 감염·전파해 갈 때 중요한 역할을 담당하고 있고, 뉴라미니다아제 저해제는 뉴라미니다아제의 활성을 저해함으로써, 세포 내에서 증식한 인플루엔자 바이러스가 세포 밖으로 나가는 것을 저해하여, 바이러스의 세포간에서의 전파를 억제함으로써, 치료 효과를 발휘한다. 이러한 뉴라미니다아제 저해제로 이루어지는 항 인플루엔자 바이러스제는, 발병 후 가능한 한 빠른 시기의 복용이 효과적이라고 하고 있다. 인플루엔자의 발병 후 12시간 이내의 복용이 이상적이고, 24시간 이내의 복용으로 충분한 유효성이 얻어지지만, 발병 후 48시간을 초과하면 치료 효과가 부족해진다고 일컬어지고 있다. 그러나, 항 인플루엔자 바이러스제에 의한 치료가 조기에 개시되는 것이 요구되는 한편, 뉴라미니다아제 저해제에는 부작용도 알려져 있고, 또한 인플루엔자의 폭발적인 유행에 대비하여 항 인플루엔자 바이러스제의 사용은 적절하게 이루어져야 한다는 사회적 요청도 존재하는 것 등으로부터, 항 인플루엔자 바이러스제의 처방은 인플루엔자 바이러스 감염의 정확한 진단하에 이루어지는 것이 요구되고 있다. 따라서, 임상 현장에서 널리 사용되고 있는 인플루엔자의 신속 진단 키트에는, 인플루엔자 바이러스의 검출 감도를 보다 향상시켜, 발병의 가능한 한 빠른 시기로부터, 특히 발병 후 24시간 이내라도, 안정적이고 또한 높은 정밀도로 「양성」의 판정이 얻어지는 성능이 강하게 요구되고 있다.

일본 특허 공개 제2011-069800호 공보 일본 특허 공개 제2010-261912호 공보 일본 특허 공개 제2007-093292호 공보 일본 특허 공개 제2007-033293호 공보 일본 특허 공개 제2006-194688호 공보 일본 특허 공개 제2006-194687호 공보 일본 특허 공개 제2006-189317호 공보 일본 특허 공개 제2006-067979호 공보 WO2009/148150호 팸플릿 WO2005/007697호 팸플릿 WO2005/007698호 팸플릿

본 발명은, 면역 크로마토그래피법의 원리를 응용한 인플루엔자의 신속 진단을 위한 검사 키트이며, 종래의 검사 키트보다 인플루엔자 A형 바이러스의 검출 감도가 높고, 인플루엔자 발병의 보다 빠른 시기로부터, 안정되고 또한 높은 정밀도로 「양성」의 판정이 얻어지는 인플루엔자 A형 바이러스의 검사 키트를 제공한다.

본 발명자들은, 면역 크로마토그래피법의 원리를 응용한 인플루엔자의 신속 진단 키트의 검출 감도를 높이기 위해, 크로마토그래프 매체에 고상화되는 항체 및 표지 물질과 결합되는 항체에, 인플루엔자 A형 바이러스 핵단백질에 대해 우수한 친화성을 갖는 항체를 사용하기 위해, 예의 연구를 행해 왔다. 본 발명자들은, 검사 키트가 임상에서 사용되는 것을 고려하여, 검사용 생체 시료 채취 후에 인플루엔자 A형 바이러스 핵단백질의 변성이 일어날 가능성이 전혀 없다고는 할 수 없는 것, 및 검사 키트에 사용되는 항체의 특징을 가능한 한 명확하게 하고자 한다는 요구가 있는 것 등으로부터, 검사 키트에 사용되는 항체로서, 미변성의 인플루엔자 A형 바이러스 핵단백질에 대해 우수한 친화성을 가질 뿐만 아니라 변성한, 예를 들어 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기 영동(이하, SDS-PAGE라고도 함)에 의해 분리된 인플루엔자 A형 바이러스 핵단백질에 대해서도 마찬가지의 높은 친화성을 갖는 항체를 탐색하여, 검사 키트에의 사용을 시도해 왔다. SDS-PAGE에 의해 분리된 인플루엔자 A형 바이러스 핵단백질에도 높은 친화성을 나타내는 항체는, 그 결합능이 핵단백질의 입체 구조의 변화에 영향을 받는 일이 적고, 또한 항체가 인식하는 에피토프 영역도 명확하게 하기 쉽다고 하는 이점을 갖기 때문이다. 그러나, 이러한 반응성을 갖는 항체를 사용한 경우라도, 종래의 제품 검출 감도를 초과하는 것은 매우 곤란하였다.

따라서, 본 발명자들은, 종래의 제품 검출 감도를 초과하는 우수한 검사 키트를 개발하기 위해, 더욱 예의 연구한 바, 놀랍게도, 크로마토그래프 매체에 고상화되는 항체로서, 미변성의 인플루엔자 A형 바이러스 핵단백질에 대해서는 우수한 친화성을 갖지만, SDS-PAGE에 의해 분리된 전장의 인플루엔자 A형 바이러스 핵단백질과는 웨스턴 블로트법에 의해 항원 항체 반응하지 않는 항체를 이용하면, 인플루엔자 A형 바이러스 검사 키트의 검출 감도를 비약적으로 높일 수 있는 것을 발견하였다.

즉, 본 발명은, 면역 크로마토그래피법의 원리를 응용한 검출 키트이며, 크로마토그래프 매체에 고상화된 항체가, 미변성의 인플루엔자 A형 바이러스 핵단백질과 항원 항체 반응하지만, SDS-PAGE에 의해 분리된 전장의 인플루엔자 A형 바이러스 핵단백질과는 웨스턴 블로트법에 의해 항원 항체 반응하지 않는 항체인, 인플루엔자 A형 바이러스를 검출하기 위한 키트에 관한 것이다.

본 발명을 보다 상세하게 설명하면, 이하와 같이 된다.

(1) 인플루엔자 A형 바이러스 핵단백질과 항원 항체 반응하고 인플루엔자 B형 바이러스 핵단백질과는 실질적으로 항원 항체 반응하지 않는 제1 항체가 고상화된 크로마토그래프 매체, 및 인플루엔자 A형 바이러스 핵단백질과 항원 항체 반응하고 인플루엔자 B형 바이러스 핵단백질과는 실질적으로 항원 항체 반응하지 않는 제2 항체와 표지 물질이 결합된 표지 시약을 함유하는 면역 크로마토그래피법에 의한 검출 키트이며,

제1 항체가, SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기 영동에 의해 분리된 전장의 인플루엔자 A형 바이러스 핵단백질과는 웨스턴 블로트법에 의해 항원 항체 반응하지 않는 항체이고, 제2 항체가, SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기 영동에 의해 분리된 전장의 인플루엔자 A형 바이러스 핵단백질과 웨스턴 블로트법에 의해 항원 항체 반응하는 항체인, 인플루엔자 A형 바이러스를 검출하기 위한 키트.

(2) 제1 항체가, 1 또는 그 이상의 모노클로널 항체인, 상기 (1)에 기재된 검출 키트.

(3) 제1 항체가, 인플루엔자 A형 바이러스 H1N1 아형의 전장의 핵단백질을 면역함으로써 얻어지는 항체인, 상기 (1) 또는 (2)에 기재된 검출 키트.

(4) 인플루엔자 A형 바이러스 핵단백질과 항원 항체 반응하고 인플루엔자 B형 바이러스 핵단백질과는 실질적으로 항원 항체 반응하지 않는 제1 항체가 고상화된 크로마토그래프 매체, 및 인플루엔자 A형 바이러스 핵단백질과 항원 항체 반응하고 인플루엔자 B형 바이러스 핵단백질과는 실질적으로 항원 항체 반응하지 않는 제2 항체와 표지 물질이 결합된 표지 시약을 이용한 면역 크로마토그래피법에 의한 검출 방법이며,

제1 항체가, SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기 영동에 의해 분리된 전장의 인플루엔자 A형 바이러스 핵단백질과는 웨스턴 블로트법에 의해 항원 항체 반응하지 않는 항체이고, 제2 항체가, SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기 영동에 의해 분리된 전장의 인플루엔자 A형 바이러스 핵단백질과 웨스턴 블로트법에 의해 항원 항체 반응하는 항체인, 인플루엔자 A형 바이러스의 검출 방법.

(5) 제1 항체가, 1 또는 그 이상의 모노클로널 항체인, 상기 (4)에 기재된 검출 방법.

(6) 제1 항체가, 인플루엔자 A형 바이러스 H1N1 아형의 전장의 핵단백질을 면역함으로써 얻어지는 항체인, 상기 (4) 또는 (5)에 기재된 검출 방법.

(7) 미변성의 인플루엔자 A형 바이러스 핵단백질과 항원 항체 반응하지만, SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기 영동에 의해 분리된 전장의 인플루엔자 A형 바이러스 핵단백질과는 웨스턴 블로트법에 의해 항원 항체 반응하지 않는 항체를 함유하여 이루어지는, 인플루엔자 A형 바이러스의 검출제.

(8) 인플루엔자 A형 바이러스 검출제가, 면역 크로마토그래피법에 의한 검출 키트에 사용되는 것인, 상기 (7)에 기재된 검출제.

(9) 인플루엔자 A형 바이러스 검출제가, 면역 크로마토그래피법에 의한 검출 키트의 크로마토그래프 매체에 고상화되어 사용되는 것인, 상기 (8)에 기재된 검출제.

(10) 인플루엔자 A형 바이러스 검출제가, 1 또는 그 이상의 모노클로널 항체인, 상기 (7)∼(9) 중 어느 하나에 기재된 검출제.

(11) 인플루엔자 A형 바이러스 검출제가, 인플루엔자 A형 바이러스 H1N1 아형의 전장의 핵단백질을 면역함으로써 얻어지는 항체인, 상기 (7)∼(10) 중 어느 하나에 기재된 검출제.

본 발명의 인플루엔자 A형 바이러스의 검사 키트는, 검출 감도가 높기 때문에, 종래의 검사 키트보다도 적은 바이러스량으로, 「양성」의 판정을 얻을 수 있으므로, 위음성의 판정이 감소하여, 「음성」의 판정에 대한 신뢰성이 극히 높아진다. 따라서, 인플루엔자의 발병 초기로 생체 내에서 바이러스의 증식이 시작된지 얼마 안 된 환자에 대해, 의사가 인플루엔자 바이러스 감염의 정확한 진단을 내리기 위한 유익한 정보를 제공할 수 있어, 항 인플루엔자 바이러스제에 의한 치료를 조기에 개시할 수 있다. 또한, 백신의 접종에 의해 바이러스의 증식 속도가 억제되는 환자에 있어서도, 인플루엔자 바이러스의 감염의 유무를 정확하게 진단할 수 있게 되므로, 감염의 확대의 주의를 환기시킬 수 있고, 또한 인플루엔자 백신의 효과를 판정하기 위한 역학적으로 중요한 정보도 제공할 수도 있다.

또한, 본 발명은 인플루엔자 A형 바이러스의 검출제를 제공하는 것이며, 본 발명의 인플루엔자 A형 바이러스 검출제를 사용, 특히 면역 크로마토그래피법에 의한 검출 키트에 있어서의 크로마토그래프 매체에 고상화된 항체로서 사용함으로써, 간편하고 보다 정확한 진단이 가능해진다.

도 1은 항체 1C6, 6F7 또는 10G5와, 인플루엔자 A형 바이러스의 리콤비넌트 핵단백질(56kDa)의 웨스턴 블로트법에 의한 반응 결과를 나타낸다. 도면 중의 상부의 M은 분자량 마커를 흘린 레인을 나타내고, rNP는 리콤비넌트 핵단백질을 흘린 레인을 나타낸다. (a) SDS-PAGE에 의해 분리된 전장의 리콤비넌트 핵단백질이 전사된 PVDF막과 항체 7307을 반응시킨 결과를 나타낸다. 분자량 50∼75kDa의 범위에 밴드가 검출되었다. 항체 7307과 리콤비넌트 핵단백질의 항원 항체 반응을 확인할 수 있는 조건하에서, 항체 1C6, 6F7 또는 10G5와 리콤비넌트 핵단백질의 반응성을 시험하였다. (b) 항체 1C6의 결과를 나타낸다. (c) 항체 6F7의 결과를 나타낸다. (d) 항체 10G5의 결과를 나타낸다. 항체 7307의 반응성을 확인할 수 있는 조건하에서, 항체 1C6, 6F7 또는 10G5와 리콤비넌트 핵단백질의 반응은 검출할 수 없었다.

본 발명은, 인플루엔자 A형 바이러스 핵단백질과 항원 항체 반응하고 인플루엔자 B형 바이러스 핵단백질과는 실질적으로 항원 항체 반응하지 않는 제1 항체 및 제2 항체를 이용한 면역 크로마토그래피법에 의한 인플루엔자 A형 바이러스의 검출 키트이며, 크로마토그래프 매체에 고상화되는 제1 항체에, 미변성의 인플루엔자 A형 바이러스 핵단백질과는 항원 항체 반응하지만, SDS-PAGE에 의해 분리된 전장의 인플루엔자 A형 바이러스 핵단백질과는 웨스턴 블로트법에 의해 항원 항체 반응하지 않는 항체를 이용하는 것을 특징으로 하는, 검출 키트이다.

본 발명에서 이용되는 제1 항체 및 제2 항체는, 인플루엔자 A형 바이러스 핵단백질과 항원 항체 반응하고 인플루엔자 B형 바이러스 핵단백질과는 실질적으로 항원 항체 반응하지 않는 항체이다. 인플루엔자 바이러스는, 핵단백질의 항원성의 차이에 의해 A형, B형 등으로 분류된다. 또한, 인플루엔자 A형 바이러스는, 바이러스 입자의 표면에, 헤마글루티닌(HA) 및 뉴라미니다아제(NA)라고 하는 당단백질을 갖고, 이 HA 및 NA의 구조의 차이에 의해 다양한 아형으로 분류된다. 본 발명에서 이용되는 제1 항체 및 제2 항체는, 인플루엔자 바이러스의 핵단백질을 인식하는 것이므로, 인플루엔자 A형 바이러스의 각종 아형의 핵단백질과 넓게 항원 항체 반응할 수 있고, 적어도 인플루엔자 A형 바이러스의 H1N1 아형, H3N2 아형, H5N1 아형 및 H7N7 아형 등의 핵단백질과 항원 항체 반응할 수 있지만, 인플루엔자 B형 바이러스의 핵단백질과는 항원 항체 반응하지 않는 항체이다. 본 발명의 제1 항체 및 제2 항체가 항원 항체 반응하는 인플루엔자 A형 바이러스의 핵단백질은, 바이러스로부터 분리된 천연의 단백질이어도 되고, 공지로 되어 있는 핵단백질 유전자의 염기 배열에 기초하여 제작된 재조합 단백질이어도 된다. 또한, 본 발명의 제1 항체 및 제2 항체가 항원 항체 반응하는 핵단백질은, 바이러스의 구성 성분으로부터 분리·정제된 것이어도 되고, 정제되지 않은 것이어도 되지만, 분리되어 있지 않은 경우에는 핵단백질과 항체의 접촉이 용이해지도록 계면 활성제로 처리된 바이러스에서 유래되는 핵단백질이어도 된다.

본 발명에 있어서의 「미변성의 인플루엔자 A형 바이러스 핵단백질」이라 함은, 천연에 존재하는 인플루엔자 A형 바이러스 핵단백질의 입체 구조 중, 적어도 특정 항체와의 항원 항체 반응을 유지하는 데 충분한 입체 구조가 남아 있는 것이면 되고, SDS-PAGE 등에 의해 천연에 존재하는 당해 단백질의 입체 구조가 파괴되어, 당해 항체에 대한 인플루엔자 A형 바이러스 핵단백질과의 실질적인 항원 항체 반응을 유지할 수 없게 된 것은 제외된다.

본 발명에서 이용되는 제1 항체 및 제2 항체와 인플루엔자 바이러스 핵단백질이 항원 항체 반응하는지 여부의 확인은, 주지의 면역 측정 방법에 의해 행할 수 있다. 즉, 측정 형식으로 분류하면, 샌드위치법, 경합법, 응집법 등의 면역 측정 방법이 있고, 이용하는 표지로 분류하면, 형광법, 효소법, 방사법 등의 면역 측정 방법이 있지만, 이들 중 어느 면역 측정 방법에 의해서나 항원 항체 반응의 확인을 행할 수 있다. 본 발명에 있어서 「실질적으로 항원 항체 반응하지 않는」이라 함은, 상기한 면역 측정 방법으로는 검출 가능한 레벨로 항원 항체 반응을 하지 않거나, 또는 반응을 하고 있어도 그 반응의 정도가 인플루엔자 A형 바이러스 핵단백질과의 항원 항체 반응의 정도에 비해 명백하게 약해, 인플루엔자 바이러스를 구성하는 다른 단백질과 동일 정도의 반응이며, 특이적인 반응은 아닌 것을 의미한다.

본 발명의 제1 항체로서는, 인플루엔자 A형 바이러스 핵단백질과 항원 항체 반응하고, 또한 인플루엔자 B형 바이러스 핵단백질과는 실질적으로 항원 항체 반응하지 않는 항체이며, 또한 천연에 존재하는 인플루엔자 A형 바이러스 핵단백질의 항원 항체 반응을 행하는 부위의 입체 구조가 파괴된 당해 단백질과는 실질적으로 항원 항체 반응하지 않는 항체이면 되고, 이러한 항체로서는, 예를 들어 인플루엔자 A형 바이러스 핵단백질과 항원 항체 반응하고 인플루엔자 B형 바이러스 핵단백질과는 실질적으로 항원 항체 반응하지 않는 항체이며, SDS-PAGE에 의해 분리된 전장의 인플루엔자 A형 바이러스 핵단백질과는 웨스턴 블로트법에 의해 항원 항체 반응하지 않는 항체가 바람직하다.

본 발명에 있어서의 「SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기 영동」이라 함은, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 관용되고 있는 단백질의 분리·분석법이며, 대표적으로는 Laemmli, U.K.의 방법[Nature, 227 : 680-685(1970)]에 따라서 행할 수 있지만, 이 방법에 한정되는 것은 아니다. 구체적으로는, 예를 들어 이하의 순서에 의해 실시할 수 있다. 우선, 겔판에 10∼15％ 농도의 폴리아크릴아미드로 이루어지는 분리 겔, 그 위에 3∼5％ 폴리아크릴아미드로 이루어지는 농축 겔을 중층하고, 제작한 겔을 슬래브형 전기 영동 장치에 설치한다. 인플루엔자 A형 바이러스 핵단백질을 함유하는 용액에 등량의 2배 농축 샘플 버퍼(125mM Tris-HCl, 20％ 글리세롤, 2％ SDS, 2％ 2-머캅토에탄올, 0.001％ 브로모페놀블루, pH6.8)를 첨가하고, 100℃에서 5∼10분간 가열 처리하고, 영동용 시료로 한다. 영동용 시료 및 시판되는 분자량 마커를 농축 겔로 제작된 레인에 각각 첨가하고, 영동용 버퍼(192mM 글리신, 0.1％ SDS, 24mM Tris, pH8.3)를 이용하여, 20mA의 정전류로 30∼90분간 영동을 행한다. SDS-PAGE에 의해 분리되는 전장의 인플루엔자 A형 바이러스 핵단백질은, 분리 겔 중의 분자량 약 56kDa에 상당하는 밴드로서 얻을 수 있다.

SDS-PAGE에 이용되는 인플루엔자 A형 바이러스 핵단백질을 함유하는 용액은, 최종적으로 행하는 웨스턴 블로트법에 있어서, 항체와 항원 항체 반응을 하는 데 충분한 양, 예를 들어 1∼2㎎의 인플루엔자 A형 바이러스 핵단백질을 함유하고 있으면 어떠한 것에도 한정되지 않고, 핵단백질에 관하여 정제되어 있어도 되고, 정제되어 있지 않아도 된다. 인플루엔자 A형 바이러스 핵단백질을 함유하는 용액으로서는, 예를 들어 인플루엔자 A형 바이러스 현탁액, 시판되고 있는 인플루엔자 HA 백신 및 재조합 인플루엔자 A형 바이러스 핵단백질 용액 등을 들 수 있다.

SDS-PAGE에 사용되는 2배 농축 샘플 버퍼 중의 SDS는, SDS의 결합량이 단백질 1에 대해 1.2∼1.5 정도인 것을 고려하여, 인플루엔자 A형 바이러스 핵단백질의 양에 따라서 0.5∼5중량％의 농도 범위에서 적절하게 변경하여 이용할 수 있다. 또한, 2배 농축 샘플 버퍼 중의 2-머캅토에탄올은, 인플루엔자 A형 바이러스 핵단백질에 존재하는 디술피드 결합을 절단하는 환원제로서 작용하고, 1∼10중량％의 농도 범위에서 적절하게 변경하여 사용해도 되고, 디티오트레이톨(DTT) 등의 다른 물질로 이루어지는 환원제를 사용할 수도 있다.

본 발명에 있어서의 「웨스턴 블로트법」은, SDS-PAGE에 의해 분리된 전장의 인플루엔자 A형 바이러스 핵단백질을, 예를 들어 Towbin H.들의 방법[Proc.Natl.Acad.Sci. U.S.A., 76 : 4350-4354(1979)]에 따라서 폴리비닐리덴디플루오라이드(PVDF)막에 전사함으로써 행할 수 있지만, 이 방법에 한정되는 것은 아니다. 구체적으로는, PVDF막을 100％ 메탄올에 10초간, 또한 전사용 전극 버퍼(192mM 글리신, 5％ 메탄올, 25mM Tris-HCl, pH8.3)에 30분간 침윤하고, 전사에 이용한다. 전사 장치의 조립은, 양극 전극판 상에 아래로부터 차례로 여과지, PVDF막, SDS-PAGE가 종료된 겔, 여과지를 중층하고, 그 위에 음극 전극판을 고정함으로써 행한다. 또한, 여과지는 미리 전사용 전극 버퍼에 2∼3분간 침지해 둔다. 전사는 1.9mA/㎠의 정전류로 60∼90분간 행한다. 전사 종료 후의 PVDF막은, 블로킹 용액(0.5％ BSA, 10mM Tris-HCl, 140mM NaCl, 0.01％ Tween20, pH7.5) 중, 실온에서 60분간 인큐베이트하고, 블로킹 조작을 행한다. 블로킹 종료 후, 세정 버퍼(10mM Tris-HCl, 140mM NaCl, 0.01％ Tween20, pH7.5)로 5분간, 2회 인큐베이트하여 세정하고, 1차 항체로서 상기한 항 인플루엔자 A형 바이러스 핵단백질 항체를 이용하여, 실온에서 90분간 인큐베이트하여 반응시킨다. 1차 항체와의 반응 종료 후, 세정 버퍼로 5분간, 2회 인큐베이트하여 세정하고, 2차 항체로서, 예를 들어 효소, 형광 물질 또는 방사성 동위 원소 등의 표지 물질로 표지된, 1차 항체에 특이적으로 반응하는 항체를 이용하여, 실온에서 60분간 인큐베이트하여 반응시킨다. 2차 항체와의 반응 종료 후, 세정 버퍼로 5분간, 2회 인큐베이트하여 세정한 후, 표지 물질의 성질을 이용하여 PVDF막에 전사된 인플루엔자 A형 바이러스 핵단백질에 결합된 1차 항체를 가시화함으로써, 웨스턴 블로트법에 있어서의 검출을 행한다.

본 발명의 제1 항체는, SDS-PAGE에 의해 분리된 전장의 인플루엔자 A형 바이러스 핵단백질과는, 웨스턴 블로트법에 의해 항원 항체 반응하지 않는 항체이다. 여기서, 웨스턴 블로트법에 의해 항원 항체 반응하지 않는다고 하는 것은, 표준적인 웨스턴 블로트법에 있어서의 항체 농도, 항원 농도, 기질 농도, 또는 반응시간 등의 조건하에서, 검출 가능한 레벨로 항원 항체 반응을 하지 않거나, 또는 인플루엔자 A형 바이러스 핵단백질 이외의 단백질에도 결합하여 인플루엔자 A형 바이러스 핵단백질에만 특이적으로 항원 항체 반응을 하지 않는 것을 말한다. 본 발명의 제1 항체가, SDS-PAGE에 의해 분리된 전장의 인플루엔자 A형 바이러스 핵단백질과는 웨스턴 블로트법에 의해 항원 항체 반응하지 않는 것의 확인은, 예를 들어 웨스턴 블로트법에 의해 인플루엔자 A형 바이러스 핵단백질과 항원 항체 반응하는 것이 확인되어 있는 시판되고 있는 항체, 예를 들어 항 인플루엔자 A형 바이러스 모노클로널 항체, 제품 번호 7307(메딕스바이오케미카사제)을 양성 컨트롤의 항체로서 이용하고, 양성 컨트롤의 항체가 PVDF막 상의 인플루엔자 A형 바이러스 핵단백질과 항원 항체 반응하여, 핵단백질을 검출할 수 있는 조건하에서, 인플루엔자 A형 바이러스 핵단백질을 검출 가능할 수 없는 것을 하나의 기준으로 하여 행할 수 있다. 본 발명의 제1 항체로서는, 웨스턴 블로트법에 있어서, 양성 컨트롤의 항체가 인플루엔자 A형 바이러스 핵단백질을 검출할 수 있는 항체 농도와 동일한 항체 농도에서 인플루엔자 A형 바이러스 핵단백질과 항원 항체 반응하지 않는 항체가 바람직하고, 보다 바람직하게는 2배의 항체 농도에서 인플루엔자 A형 바이러스 핵단백질과 반응하지 않는 항체, 더욱 바람직하게는 5배 또는 10배의 항체 농도에서 인플루엔자 A형 바이러스 핵단백질과 항원 항체 반응하지 않는 항체이다. 또한, 본 발명의 제1 항체로서 바람직한 항체는, 웨스턴 블로트법에 있어서, 양성 컨트롤의 항체를 검출할 수 있는 인플루엔자 A형 바이러스 핵단백질의 항원 농도와 동일한 농도의 인플루엔자 A형 바이러스 핵단백질과 항원 항체 반응하지 않는 항체이고, 보다 바람직하게는 2배의 항원 농도에서 반응하지 않는 항체, 더욱 바람직하게는 5배 또는 10배의 농도의 인플루엔자 A형 바이러스 핵단백질 항원과 항원 항체 반응하지 않는 항체이다.

본 발명에서 이용되는 제1 항체는, 인플루엔자 A형 바이러스 핵단백질을 면역원으로서 이용하여, 마우스, 래트, 모르모트, 개, 염소, 양, 돼지, 말 및 소 등의 동물에 투여함으로써 제작할 수 있다. 면역원으로서 이용되는 인플루엔자 A형 바이러스 핵단백질로서는, 핵단백질이 다량으로 존재하고 그 면역원으로서의 작용을 발휘할 수 있으면 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어 인플루엔자 A형 바이러스 현탁액, 시판되고 있는 인플루엔자 HA 백신 및 재조합 인플루엔자 A형 바이러스 핵단백질 용액 등을 이용할 수 있다. 항원에 포함되는 면역원성이 높은 HA나 NA의 작용을 억제하기 위해, 초원심에 의한 핵단백질 정제[예를 들어, J. Biochem., 102 : 1241-1249(1987)을 참조]나 프로테아제 처리(예를 들어, J. Immunol. Methods, 180 : 107-116(1995)을 참조]를 한 면역원을 사용할 수도 있다. 본 발명의 제1 항체는, 인플루엔자 A형 바이러스 핵단백질과는 특이적으로 항원 항체 반응하지만, SDS-PAGE에 의해 분리된 전장의 인플루엔자 A형 바이러스 핵단백질과는 실질적으로 항원 항체 반응하지 않는 항체이므로, 면역원으로서는, 환원제를 포함하는 SDS-PAGE용의 샘플 버퍼로 처리되어 있지 않은 인플루엔자 A형 바이러스 핵단백질이 바람직하고, 보다 바람직하게는 음이온성 계면 활성제인 SDS로 처리되어 있지 않은 인플루엔자 A형 바이러스 핵단백질이고, 더욱 바람직하게는 미변성의 인플루엔자 A형 바이러스 핵단백질이다. 본 발명의 제1 항체의 면역원으로서 적합한 것은, 인플루엔자 A형 바이러스를 음이온성 계면 활성제를 포함하지 않는 버퍼에 현탁한 것, 또는 전장의 재조합 인플루엔자 A형 바이러스 핵단백질 등이다.

본 발명에서 이용되는 제1 항체가, 폴리크로날 항체인 경우에는, 예를 들어 이하와 같이 하여 제조할 수 있다. 상기한 인플루엔자 A형 바이러스 핵단백질이 면역된 동물로부터, 인플루엔자 A형 바이러스 핵단백질과 항원 항체 반응하고 인플루엔자 B형 바이러스 핵단백질을 실질적으로 항원 항체 반응하지 않는 항혈청 또는 항혈청 중의 이뮤노글로블린 분획을, 예를 들어 인플루엔자 A형 바이러스 핵단백질을 결합한 담체를 이용한 어피니티 크로마토그래피에 의한 정제 등의 방법에 의해 취득한다. 이 항혈청 또는 이뮤노글로블린 분획을, PVDF막 상에 전사된 SDS-PAGE에 의해 분리된 전장의 인플루엔자 A형 바이러스 핵단백질과 함께 인큐베이트함으로써, PVDF막 상에 SDS-PAGE에 의해 분리된 전장의 인플루엔자 A형 바이러스 핵단백질과 항원 항체 반응하는 항체를 결합시켜, 항혈청 또는 이뮤노글로블린 분획 중으로부터 이들 항체를 분리·제거함으로써, 본 발명의 제1 항체로서 사용할 수 있는 폴리클로날 항체를 제조할 수 있다.

본 발명에서 이용되는 제1 항체가, 1 또는 그 이상의 모노클로날 항체인 경우에는, 예를 들어 상기한 인플루엔자 A형 바이러스 핵단백질이 면역된 동물로부터 비장 세포 등을 채취하고, 공지의 방법[예를 들어, Nature, 256 : 495-497(1975)을 참조]으로, 미엘로마 세포 등의 종양 세포와 세포 융합시킴으로써, 본 발명에서 이용되는 제1 항체를 산생하는 하이브리도마를 얻을 수 있다.

세포 융합에 의해 얻어진 하이브리도마 중으로부터, 본 발명에서 이용되는 제1 항체를 산생하는 하이브리도마를 스크리닝하는 방법으로서는, 예를 들어 이하의 순서에 의해 행할 수 있다.

1차 스크리닝으로서, 배양 상청 중에 인플루엔자 A형 바이러스 핵단백질과 항원 항체 반응하고 인플루엔자 B형 바이러스 핵단백질과는 실질적으로 항원 항체 반응하지 않는 항체를 산생하는 하이브리도마를 스크리닝한다.

1차 스크리닝은, 정제한 인플루엔자 A형 바이러스 핵단백질 또는 다시 재조합 인플루엔자 A형 바이러스 핵단백질을 항원으로 한 고상 ELISA법에 의해 행할 수 있다. 고상으로서의 담체에는, 마이크로타이터 플레이트, 자성 입자, 또는 니트로셀룰로오스막 등을 이용하여, 항원을 흡착시킨다. 고상에 흡착된 항원과 하이브리도마의 배양 상청을 접촉시켜, 간접적으로 고상에 결합되게 된 배양 상청 중의 항체를, 표지 물질로 표지된 항체 등을 이용하여 검출한다. 음성 컨트롤로서, 인플루엔자 B형 바이러스 핵단백질을 항원에 이용함으로써, 목적으로 하는 항체를 스크리닝할 수 있다.

1차 스크리닝의 다른 방법으로서는, 고상으로서의 담체에, 하이브리도마의 배양 상청 중에 존재하는 항체를 직접 또는 간접적으로 부동화하고, 인플루엔자 A형 바이러스 핵단백질을 항원으로서 접촉시킨다. 항원을 직접 표지해 두거나 또는 항원에 특이적인 항체 등을 이용하여 간접적으로 표지함으로써, 인플루엔자 A형 바이러스 핵단백질과 항원 항체 반응하는 항체를 검출할 수 있다.

본 발명의 항체를 얻기 위한 1차 스크리닝은, 고상에 항원 또는 항체를 부동화시킨 방법 중 어느 방법으로도 행할 수도 있고, 나아가서는 항원을 흡착시킨 고상을 이용하여 대략적인 선별을 행한 후에, 항체를 부동화시킨 고상을 이용하여 보다 엄밀한 선별을 행할 수도 있다.

본 발명의 제1 항체는 크로마토그래프 매체에 고상화하여 이용되는 항체이므로, 1차 스크리닝의 방법으로서는, 하이브리도마의 배양 상청 중에 존재하는 항체를 직접 또는 간접적으로 막 형상의 고상 담체에 부동화하고, 인플루엔자 A형 바이러스 핵단백질을 접촉시키는 방법이, 제1 항체의 사용시의 형태와 유사하여 바람직하다.

1차 스크리닝에 의해 얻어진 인플루엔자 A형 바이러스 핵단백질과 항원 항체 반응하고 인플루엔자 B형 바이러스 핵단백질과는 실질적으로 항원 항체 반응하지 않는 항체에 대해 2차 스크리닝을 행한다. 2차 스크리닝에서는, SDS-PAGE에 의해 분리된 전장의 인플루엔자 A형 바이러스 핵단백질과는 웨스턴 블로트법에 의해 항원 항체 반응하지 않는 항체를 산생하는 하이브리도마를 선택한다. 상기한 바와 같이, SDS-PAGE에 의해 분리된 전장의 인플루엔자 A형 바이러스 핵단백질을, PVDF막에 전사한다. 1차 스크리닝에서 선택된 하이브리도마의 배양 상청과 상기 PVDF막을 접촉시켜, 웨스턴 블로트법에 의한 검출을 상기한 바와 같이 행함으로써, 목적으로 하는 항체를 산생하는 하이브리도마를 스크리닝할 수 있다.

하기의 실시예에 있어서 상세하게 서술하는 바와 같이, 1차 스크리닝에서 선택된, 인플루엔자 A형 바이러스 핵단백질과 특히 강하게 항원 항체 반응하는 6개의 하이브리도마 중, 2차 스크리닝으로서, SDS-PAGE에 의해 분리된 전장의 인플루엔자 A형 바이러스 핵단백질과는 웨스턴 블로트법에 의해 항원 항체 반응하지 않는 항체를 선택한 바, 3개의 하이브리도마가 선택되었다. 이들 하이브리도마가 산생하는 모노클로널 항체를 크로마토그래프 매체에 고상화하여, 인플루엔자 A형 바이러스의 검출을 행한 바, 3개의 모든 모노클로널 항체에서 종래의 제품을 초과하는 검출 감도로 양성의 판정을 얻는 것이 가능하였다. 즉, 본 발명의 제1 항체로서 바람직한 모노클로널 항체를 산생하는 하이브리도마를 복수 선택할 수 있었다.

본 발명의 제1 항체는, 상기한 각 하이브리도마를, 통상 세포 배양에 사용되는 배지에 있어서 배양하고, 배양 상청으로부터 회수함으로써 제조할 수 있다. 또한, 하이브리도마가 유래되는 동물의 복강 내에 투여함으로써 복수를 저류시키고, 이 복수로부터 회수함으로써 제조할 수도 있다.

본 발명의 제2 항체는, 인플루엔자 A형 바이러스 핵단백질과 항원 항체 반응하고 인플루엔자 B형 바이러스 핵단백질과는 실질적으로 항원 항체 반응하지 않는 항체이며 인플루엔자 A형 바이러스 핵단백질에의 친화성이 높은 항체이면 되고, 바람직한 형태로서는, 제1 항체와의 조합에 따라서, SDS-PAGE에 의해 분리된 전장의 인플루엔자 A형 바이러스 핵단백질과 웨스턴 블로트법에 의해 항원 항체 반응하는 항체가 사용된다.

본 발명의 제2 항체는, 폴리클로날 항체여도, 모노클로널 항체여도 되고, 모노클로널 항체인 경우에는, 단일 종류의 항체여도, 복수 종류의 항체의 혼합물이어도 된다. 또한, 본 발명의 항체로서 모노클로널 항체를 이용하는 경우에는, Fab 또는 F(ab')2 등의 항원과의 결합성이 있는 단편으로서 사용할 수도 있다.

본 발명에서 사용되는 제2 항체는, 상기한 제1 항체를 제조하기 위한 면역원을 이용하여 제조할 수 있다. 본 발명의 제2 항체가, 폴리클로날 항체인 경우에는, 면역된 동물로부터 혈액을 채취하여, 인플루엔자 A형 바이러스 핵단백질과 항원 항체 반응하고 인플루엔자 B형 바이러스 핵단백질을 실질적으로 항원 항체 반응하지 않는 항혈청 또는 항혈청 중의 이뮤노글로블린 분획을 상기한 바와 같이 정제함으로써 제조할 수 있다. 본 발명의 제2 항체가, 모노클로널 항체인 경우에는, 공지의 방법으로 하이브리도마를 제작하여, 배양 상청 중에 인플루엔자 A형 바이러스 핵단백질과 항원 항체 반응하고 인플루엔자 B형 바이러스 핵단백질과는 실질적으로 항원 항체 반응하지 않는 항체를 산생하는 하이브리도마를 상기한 바와 같이 스크리닝 함으로써 제조할 수 있다. 본 발명의 제2 항체로서, SDS-PAGE에 의해 분리된 전장의 인플루엔자 A형 바이러스 핵단백질과 웨스턴 블로트법에 의해 항원 항체 반응하는 항체를 이용하는 경우에는, 웨스턴 블로트법에 의한 2차 스크리닝을 상기한 바와 같은 순서로 행하고, 항원 항체 반응이 검출된 항체를 선택함으로써, 원하는 항체를 선별할 수 있다.

본 발명의 검출 키트는, 상기 제1 항체가 고상화된 크로마토그래프 매체를 함유한다. 본 발명에서는, 크로마토그래프 매체에 고상화된 제1 항체는 판정 부위를 형성한다. 본 발명에서 사용되는 크로마토그래프 매체는, 모관 현상을 나타내는 미세 다공성 물질로 이루어지는 불활성의 것이며, 표지 시약 및 생체 시료 중의 성분 등과 반응하지 않는 것이면, 특별히 그 소재가 한정되지 않고 공지의 것을 이용할 수 있다. 구체적으로는, 니트로셀룰로오스 또는 아세트산셀룰로오스 등의 셀룰로오스 유도체나 나일론의 막, 여과지, 글래스 섬유 여과지 등을 들 수 있다.

크로마토그래프 매체의 형태 및 크기는 특별히 제한되는 것은 아니며, 실제 조작의 점 및 결과 관찰의 점에 있어서 적절하면 어떠한 것이어도 된다. 조작을 보다 간편하게 하기 위해, 크로마토그래프 매체의 이면에 플라스틱 등으로 이루어지는 지지체를 설치할 수도 있다. 이 지지체의 성상은 특별히 제한되는 것은 아니지만, 육안 판정에 의해 검출 결과의 관찰을 행하는 경우에는, 지지체는, 표지 물질에 의해 초래되는 색채와 유사하지 않은 색채를 갖는 것인 것이 바람직하고, 통상 무색 또는 백색인 것이 바람직하다.

크로마토그래프 매체에는, 임의로, 생체 시료를 첨가하기 위한 시료 첨가 부위(샘플 패드 등), 시료 중의 고형 성분을 제거하는 부위(고형 성분 분리 부위 등), 전개액을 첨가하기 위한 전개액 첨가 부위, 판정 부위에 포착되지 않은 표지 시약이나 전개액을 흡수하는 흡수 부위(흡수 패드 등), 검출이 정상적으로 행해진 것을 나타내는 대조 부위 등을 포함시켜도 된다. 이들 부위의 부재는, 모관 현상에 의해 시료 용액이나 전개액을 이동시킬 수 있으면 특별히 한정되지 않고, 일반적으로는 니트로셀룰로오스막, 여과지, 글래스 섬유 여과지 등의 복수의 다공성 물질로부터 그 목적에 따른 것을 선택하여 이용하고, 제1 항체가 고상화된 크로마토그래프 매체와 모관에 의해 연결되도록 배치한다.

제1 항체를 크로마토그래프 매체에 고상화하는 방법으로서는, 제1 항체를 크로마토그래프 매체에 물리적 또는 화학적 수단에 의해 직접 고정화하는 방법과, 제1 항체를 라텍스 입자 등의 미립자에 물리적 또는 화학적으로 결합하고, 이 미립자를 크로마토그래프 매체에 포착하여 고정화하는 간접 고정화 방법이 있지만, 감도 조정의 용이성의 점에서 직접 고정화의 쪽이 바람직하다. 직접적으로 고정화하는 방법으로서는, 물리 흡착을 이용해도 되고, 공유 결합에 의해도 된다. 일반적으로 크로마토그래프 매체가 니트로셀룰로오스막 또는 혼합 니트로셀룰로오스에스테르막인 경우, 물리 흡착을 행할 수 있다. 공유 결합시키는 경우에는 크로마토그래프 매체의 활성화를 브롬화시안, 글루타르알데히드, 카르보디이미드 등에 의해 행한다. 크로마토그래프 매체와 제1 항체는, 예를 들어 마이크로시린지, 조절 펌프가 달린 펜, 잉크 분사 인쇄 등의 방법으로 흡착 또는 결합시킬 수 있다. 판정 부위의 형태로서는 특별히 한정되지 않지만, 원형의 스폿, 크로마토그래프 매체의 전개 방향에 수직으로 연장되는 라인, 숫자, 문자나 ＋,－ 등의 기호 등의 형태로 판정 부위를 형성할 수 있다.

필요에 따라서, 제1 항체를 고상화한 크로마토그래프 매체는, 블로킹 처리가 행해진다. 블로킹 처리에 이용할 수 있는 블로킹제로서는, 소혈청 알부민, 탈지유, 카제인, 젤라틴 등의 단백질 외에, Blocking Peptide Fragment(TOYOBO사제)나 친수성 고분자 폴리머 등의 시판되는 블로킹제를 들 수 있다.

본 발명의 검출 키트는, 상기 제2 항체와 표지 물질이 결합된 표지 시약을 함유한다. 본 발명에서 이용되는 표지 물질로서는, 효소 또는 불용성 담체를 이용할 수 있다. 효소로서는, 알칼리포스파타아제, 서양 고추냉이 퍼옥시다아제, β-갈락토시다아제, 우레아제, 글루코스옥시다아제 등이 있고, 각각의 효소에 대응하는 공지의 발색 기질과 함께 이용할 수 있다. 불용성 담체로서는, 금, 은, 백금과 같은 콜로이드상 금속 입자, 산화철과 같은 콜로이드상 금속 산화물 입자, 황 등의 콜로이드상 비금속 입자 및 합성 고분자로 이루어지는 라텍스 입자, 그 외의 것을 이용할 수 있다. 콜로이드상 금속 입자 및 콜로이드상 금속 산화물 입자에는, 예를 들어 콜로이드상 금 입자, 콜로이드상 은 입자, 콜로이드상 백금 입자, 콜로이드상 산화철 입자, 콜로이드상 수산화 알루미늄 입자 등을 들 수 있다. 특히, 콜로이드상 금 입자와 콜로이드상 은 입자가 적당한 입경에 있어서, 콜로이드상 금 입자는 적색, 콜로이드상 은 입자는 황색을 나타내는 점에서 바람직하다. 이들 콜로이드상 금속 입자의 평균 입경은 1㎚∼500㎚, 특히 강한 색조가 얻어지는 10㎚∼150㎚인 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 40㎚∼100㎚의 범위 내이다. 본 발명의 표지 시약에 이용되는 표지 물질로서는, 불용성 담체가 바람직하고, 콜로이드상 금속 입자가 더욱 바람직하고, 특히 콜로이드상 금 입자가 바람직하다.

콜로이드상 금속 입자로서, 예를 들어 콜로이드상 금 입자를 이용하는 경우에는, 시판되는 것을 이용해도 된다. 또는, 통상법, 예를 들어 염화금산을 시트르산나트륨으로 환원하는 방법에 의해 콜로이드상 금 입자를 제조할 수 있다.

본 발명에서 이용하는 제2 항체와 표지 물질을 결합시키는 방법으로서는, 물리 흡착이나 화학 결합 등의 공지의 방법에 의해 행할 수 있다. 예를 들어, 제2 항체를 콜로이드상 금 입자로 표지화하는 경우는, 금 입자가 콜로이드상으로 분산된 용액에 제2 항체를 첨가하여 물리 흡착시킨 후, 소혈청 알부민 용액이나 전술한 시판 블로킹제 등을 첨가하여 항체가 미결합인 입자 표면을 블로킹함으로써 제조한다.

본 발명의 표지 시약은, 크로마토그래프 매체와는 별도의 시약으로서 본 발명의 키트에 포함할 수도 있지만, 크로마토그래프 매체 상에 표지 시약 유지부를 설치하고, 거기에 건조 유지시킬 수도 있다. 표지 시약 유지부에 표지 시약을 유지시키는 경우, 표지 시약이 전개액에 빠르게 용해되어 모관 작용에 의해 자유롭게 이동할 수 있도록 표지 시약을 유지시키는 것이 바람직하다. 표지 시약 유지부에는, 표지 시약의 재용해성을 양호하게 하기 위해, 사카로오스, 수크로오스, 트레할로오스, 말토오스, 락토오스 등의 당류, 만니톨 등의 당알코올을 표지 시약에 첨가하여 도포하거나, 이들 물질을 미리 코팅해 둘 수도 있다. 표지 시약 유지부의 형성은, 표지 시약을 크로마토그래프 매체에 직접 도포하여 건조시킴으로써 행할 수도 있고, 크로마토그래프 매체와는 별도의 다공성 물질, 예를 들어 셀룰로오스 여과지, 글래스 섬유 여과지, 나일론 부직포에 도포, 건조하여 표지 시약 유지 부재를 형성한 후, 크로마토그래프 매체와 상기 유지 부재가 모관에 의해 연결되도록 배치할 수도 있다.

본 발명의 검출 키트에 적용할 수 있는 생체 시료로서는, 인플루엔자 A형 바이러스를 함유하는 것이 의심되는 것이면 특별히 제한되지 않지만, 바람직한 시료로서는, 비강 세척액, 비강 흡인액, 인후 세척액 등을 들 수 있다. 본 발명의 키트에는, 이들 생체 시료를 그대로 적용할 수도 있지만, 통상은 시료를 전개액에 현탁 또는 희석하여 적용한다.

본 발명의 검출 키트와 함께 이용되는 전개액으로서는, 통상, 물을 용매로 하고, 인산염, 트리스히드록시메틸아미노메탄염산염, HEPES, 굿 등의 완충제, 염화나트륨 등의 무기염을 함유하는 것이 바람직하다. 또한, 필요에 따라서, 소혈청 알부민(BSA) 등의 단백질 성분, 방부제 등을 포함하고 있어도 된다. 또한 본 발명에서 이용되는 전개액은, 인플루엔자 바이러스의 바이러스 입자를 파괴하여, 본 발명의 제1 항체 및 제2 항체와 핵단백질의 접촉이 용이해지도록, 비이온성 계면 활성제를 함유하고 있어도 된다. 전개액에 첨가하는 비이온성 계면 활성제로서는, 예를 들어 폴리옥시에틸렌알킬에테르, 폴리옥시에틸렌소르비탄 지방산 에스테르(상품명 「Tween」 시리즈), 폴리옥시에틸렌p-t-옥틸페닐에테르(상품명 「Triton」 시리즈), 폴리옥시에틸렌p-t-노닐페닐에테르(상품명 「TritonN」 시리즈) 등을 들 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다. 이들 비이온성 계면 활성제의 함유량은 특별히 한정되지 않지만, 전개액 전체의 중량에 대해 0.01∼10.0중량％의 범위에서 이용되고, 바람직하게는 0.1∼5.0중량％, 보다 바람직하게는 0.1∼1.0중량％, 더욱 바람직하게는 0.3∼1.0중량％의 범위에서 이용된다.

본 발명의 검출 키트를 이용하여, 예를 들어 이하와 같은 조작으로, 인플루엔자 A형 바이러스를 검출할 수 있다.

본 발명의 일 형태로서는, 피검자로부터 채취한 생체 시료를, 전개액 중에서 미리 표지 시약과 혼합하여, 핵단백질과 표지 시약의 복합체를 형성한 후, 크로마토그래프 매체와 접촉시킨다. 핵단백질-표지 시약 복합체를 포함하는 전개액은, 이동상으로서 크로마토그래프 매체를 이동한다. 핵단백질-표지 시약 복합체가, 크로마토그래프 매체의 판정 부위를 이동할 때, 고상화된 제1 항체가 이것을 포착하여, 표지 시약이 간접적으로 판정 부위에 결합되게 된다. 판정 부위에 존재하는 표지 시약을, 표지 물질이 불용성 담체인 경우에는 직접, 표지 물질이 효소인 경우에는 기질을 작용시켜 반응 산물에 대해, 육안 또는 덴시토미터 등에 의해, 발색 강도의 확인을 행함으로써 인플루엔자 A형 바이러스의 검출 또는 정량을 할 수 있다.

본 발명의 또 다른 형태에서는, 표지 시약 유지부를 갖는 크로마토그래프 매체를 이용하여 인플루엔자 A형 바이러스의 검출을 행한다. 생체 시료 및 전개액을 크로마토그래프 매체와 접촉시키면, 그들이 이동상으로서 크로마토그래프 매체를 이동하여, 표지 시약 유지부에 유지되는 표지 시약을 용해한다. 이동상 중에 용해된 표지 시약은, 시료 중의 인플루엔자 A형 바이러스 핵단백질과 복합체를 형성하여, 크로마토그래프 매체를 이동한다. 크로마토그래프 매체의 판정 부위에 도달한 핵단백질-표지 시약 복합체는, 판정 부위에 고상화되어 있는 제1 항체에 포착되어, 표지 시약이 간접적으로 판정 부위에 결합되게 된다. 판정 부위에 존재하는 표지 시약을, 육안 또는 덴시토미터 등에 의해 측정함으로써 인플루엔자 A형 바이러스의 검출 또는 정량을 할 수 있다.

이하, 실시예에 의해 본 발명을 보다 구체적으로 설명하지만, 본 발명은 이들 실시예에 의해 전혀 한정되는 것은 아니다.

실시예

(실시예 1) 항 인플루엔자 A형 바이러스 핵단백질 항체의 제작

면역원에는, 인플루엔자 A형 바이러스 A/Puerto Rico/8/34(H1N1)주 유래의 핵단백질의 아미노산 배열(DDBJ/GeneBank 데이터베이스 Accession No.V01084)에 기초하여 제작한 리콤비넌트 핵단백질을 사용하였다. 면역원에 등량의 프로인트 완전 아쥬반트를 첨가하여 완전히 혼합한 후, BALB/c 마우스에 2주일 간격으로 총 4회 면역하였다. 마지막 면역으로부터 3일 후에 면역한 마우스로부터 비장 세포를 채취하고, 공지의 표준적인 방법을 이용하여, 미엘로마 세포(P3U1)와 융합하여 하이브리도마를 제작하였다. 10∼15일 후, 하이브리도마의 배양 상청을 이용하여 인플루엔자 A형 바이러스 핵단백질에 특이적인 항체의 스크리닝을 행하였다.

1차 스크리닝으로서, 이하의 스크리닝 조작을 순차 행함으로써, 인플루엔자 A형 바이러스 핵단백질과 항원 항체 반응하고 인플루엔자 B형 바이러스 핵단백질과는 실질적으로 항원 항체 반응하지 않는 항체를 선택하였다.

우선, 고상에 마이크로타이터 플레이트를 이용하고, 항원에 면역원으로 이용한 것과 동일한 리콤비넌트 핵단백질을 이용하여, 고상 ELISA법에 의한 스크리닝을 행하였다. 즉, 탄산 완충액 중에 10.0μg/ml의 리콤비넌트 핵단백질을 포함하는 용액을, 96 구멍 플레이트(SUMILON)의 각 웰에 100μl씩 첨가하고, 4℃에서 하룻밤 인큐베이트하여 항원을 고상화하였다. 다음으로, 0.1％의 Tween20(상품명)을 포함하는 PBS(이하, PBS-Tween이라 함)로 각 웰을 세정 후, PBS로 희석한 1％ BSA를 첨가하고 4℃에서 하룻밤 블로킹을 행하였다. PBS-Tween으로 세정 후, 배양 상청을 100μl씩 첨가하고 37℃에서 1시간 반응시켰다. PBS-Tween으로 충분히 세정한 후, 1000배 희석한 알칼리 포스파타아제 표지 항마우스 Igs 항체(후나코시 가부시끼가이샤제)를 각 웰에 첨가하고 37℃에서 1시간 반응시켰다. PBS-Tween으로 충분히 세정한 후, 기질로서 파라니트로페닐포스페이트를 각 웰에 100μl씩 첨가하고, 실온에서 30분간 반응시켰다. 반응 정지액을 각 웰에 100μl씩 첨가하고 파장 405㎚에서 발색 레벨을 측정하였다. 높은 발색을 나타낸 웰에 대응하는 배양 상청을 이용하여, 가일층의 스크리닝 조작을 행하였다.

다음으로, 고상에 니트로셀룰로오스막을 이용하고, 항원에 인플루엔자 A형 바이러스를 이용하여, 면역 크로마토그래피의 측정계로 스크리닝을 행하였다. 즉, 35㎜×5㎜의 니트로셀룰로오스막에 배양 상청을 도포하여 37℃에서 1시간 건조시킴으로써, 항체를 고정화하여 판정 라인을 형성하였다. 또한, 50mM HEPES 완충액 중에서 배양 상청과 금 콜로이드 용액을 혼화함으로써, 항체 감작 금 콜로이드 용액을 제작하였다. 인플루엔자 A형 바이러스 A/New Caledonia/20/99(H1N1)주 또는 음성 컨트롤로서의 인플루엔자 B형 바이러스 B/Tokio/53/99주를, 시료 희석액[20mM 인산 완충액(pH7.4), 0.3％ 탈지유, 0.3％ Tween20, 0.15M 염화나트륨]에 현탁하여, 96 구멍 플레이트(SUMILON)의 각 웰에 첨가하였다. 또한, 상기 항체 감작 금 콜로이드 용액을 각 웰 첨가하고, 바이러스 현탁액과 잘 혼합하였다. 각 웰의 혼합액 중에, 니트로셀룰로오스막의 단부를 삽입하고, 바이러스를 포함하는 혼합액을 전개시켰다. 전개를 개시하고 10분 후에 니트로셀룰로오스막을 혼합액으로부터 취출하여, 판정 라인 상에 포착된 금 콜로이드의 발색 강도를 면역 크로마토그래피 리더(하마마쯔 포토닉스 가부시끼가이샤제)로 측정하였다. 발색 강도가 8.0mABS를 초과한 경우에, 양성이라 판정하였다. 인플루엔자 A형 바이러스를 전개한 경우에 양성으로 되고, 인플루엔자 B형 바이러스를 전개한 경우에 음성으로 된 측정계에서 이용된 항체를, 인플루엔자 A형 바이러스 핵단백질과 항원 항체 반응하고 인플루엔자 B형 바이러스 핵단백질과는 실질적으로 항원 항체 반응하지 않는 항체로서 선택하였다.

1차 스크리닝에서 선택된 항체에 대해, 2차 스크리닝으로서, 상기한 리콤비넌트 핵단백질을 이용하여 웨스턴 블로트법을 행함으로써, 인플루엔자 A형 바이러스 핵단백질과 항원 항체 반응하지만, SDS-PAGE에 의해 분리된 인플루엔자 A형 바이러스 핵단백질과는 항원 항체 반응하지 않는 항체를 선택하였다. 즉, 0.01mg/ml의 상기 리콤비넌트 핵단백질 용액을, 10％의 2-머캅토에탄올을 첨가한 2×Tris-Glycine SDS Sample Buffer(TEFCO사제)와 등량으로 혼합하고, 100℃에서 10분간 가열하고, SDS-PAGE에 제공하였다. SDS-PAGE는, 레이디 겔 J5-20％ 12well(BIO-RAD사제)을 이용하여, 공지의 표준적인 방법에 따랐다. 영동 후의 겔로부터 단백질을 Sequi-Blot PVDF Membrane(BIO-RAD사제)에 블로팅 장치(BIO-RAD사제)에 의해 전사하였다. 전사 후의 PVDF막을 이뮤노블록(DS 파마 라보라토리즈)으로 실온에서 1시간 블로킹하였다. 블로킹액을 제거하고, PVDF막을 0.05％의 Tween20(상품명)을 포함하는 PBS(이하, T-PBS라 함)로 10분간 3회 세정 후, 1차 스크리닝에서 선택된 항체를 포함하는 배양 상청과 함께 실온에서 1시간 인큐베이트하였다. PVDF막을 T-PBS로 10분간 3회 세정 후, T-PBS로 5000배로 희석한 알칼리 포스파타아제 표지 항마우스 IgG(SIGMA사제)와 함께 실온에서 30분간 인큐베이트하였다. T-PBS로 10분간 3회 세정 후, 발색 기질인 1-Step^TM NBT/BCIP(PIERCE사제)와 함께 PVDF막을 인큐베이트하여, PVDF막에 결합된 항체를 가시화하였다. 양성 컨트롤로서, 배양 상청 대신에 시판되는 항 인플루엔자 A형 바이러스 모노클로널 항체(제품 번호 7307, 메딕스바이오케미카사제)를 이용하여, 양성 컨트롤 항체의 PVDF막에의 결합을 육안으로 검출할 수 있는 조건하에서, 배양 상청에 포함되는 항체의 결합을 검출할 수 없는 경우에, 그 항체를 SDS-PAGE에 의해 분리된 인플루엔자 A형 바이러스 핵단백질과는 항원 항체 반응하지 않는 항체로서 선택하였다. 당해 항체를 산생하는 하이브리도마를 클로닝하여, 3개의 독립된 클론을 선택하여, 각각을 하이브리도마 1C6, 6F7 및 10G5라고 명명하였다. 또한, 하이브리도마 1C6, 6F7 및 10G5가 각각 산생하는 항체를, 항체 1C6, 6F7 및 10G5라고 명명하였다. 상기 하이브리도마 3주로부터 얻어진 모노클로널 항체의 서브클래스는 모두 IgG1이었다.

웨스턴 블로트법에 있어서의 항체 1C6, 6F7 및 10G5와, 인플루엔자 A형 바이러스의 리콤비넌트 핵단백질의 반응을 도 1에 나타낸다. 항체의 농도를 각각 10μg/ml로 제조하여, 1레인당 1.0μg의 리콤비넌트 핵단백질과 반응시켰다. 도 1에 나타내어지는 바와 같이, 항체 7307에 의해, 전장의 인플루엔자 A형 바이러스 핵단백질에 상당하는 56kDa의 밴드가 검출되었지만, 동일한 조건에서 항체 1C6, 6F7 또는 10G5를 이용하면 밴드를 검출할 수는 없었다. 또한, 1레인당 리콤비넌트 핵단백질의 양을 5.0μg까지 증가시켜 다시 마찬가지의 실험을 행하였지만, 항체 1C6, 6F7 또는 10G5를 이용한 경우에는 웨스턴 블로트법으로는 검출 가능한 밴드는 확인되지 않았다(데이터 나타나지 않음).

(실시예 2) 면역 크로마토그래피법에 의한 검사 키트의 제작

(1) 포착 항체용 희석액의 제작

이소프로필알코올을 50mM 인산 완충액(pH7.4)으로 5％로 되도록 혼화 희석하여 제1 항체용 희석액을 제작하였다.

(2) 크로마토그래프 매체 상의 판정부의 제작

항체 1C6, 6F7 및 10G5 중으로부터 1종 또는 2종의 항체를 조합하여 선택하고, 총 항체 농도가 1.0mg/ml로 되도록 포착 항체용 희석액으로 희석하였다. 이 항체 용액을, 도포기(BioDot사제)를 이용하여, 25×2.5cm의 니트로셀룰로오스막(밀리포어사제)에 도포하고, 50℃에서 5분간 건조시킨 후, 다시 실온에서 1시간 건조시켜 크로마토그래프 매체 상에 판정부를 제작하였다.

(3) 표지 항체 용액의 제작

표지 물질로서 금 콜로이드 현탁액(다나까 기긴조꾸 고교 가부시끼가이샤제:평균 입자 직경 40㎚, 금 농도 0.36mM)을 이용하였다. 항체 7307만 또는 항체 7307과 항체 1C6, 6F7 혹은 10G5 중 어느 하나를 조합하여, 인산 완충액(pH7.4)으로 총 항체 농도가 0.05mg/ml로 되도록 희석하였다. 항체 용액 0.1ml을, 금 콜로이드 현탁액 0.5ml에 첨가하고, 실온에서 10분간 정치하였다. 이어서, 1％ BSA를 포함하는 인산 완충액(pH7.4)을 0.1ml 첨가하고, 다시 실온에서 10분간 정치하였다. 그 후, 충분히 교반하여, 8000×g로 15분간 원심 분리를 행하였다. 상청을 제거한 후, 0.5％ BSA를 포함하는 인산 완충액(pH7.4)을 2ml 첨가하였다.

(4) 면역 크로마토그래피법에 의한 검사 키트의 제작

상기 (3)에서 제작한 표지 항체 용액을 15㎜×300㎜의 글래스 섬유 패드(밀리포어사제)에 균일해지도록 첨가한 후, 진공 건조기에 의해 건조시켜, 콘주게이션 패드를 제작하였다. 다음으로, 배킹 시트로 이루어지는 기재에, 상기 (2)에서 제작한 크로마토그래프 매체를 접합하고, 또한 전개 방향 상류에 콘주게이션 패드와 시료 첨가부인 샘플 패드(밀리포어사제 : 300㎜×30㎜)를 차례로 접합하고, 전개 방향 하류에 흡수 패드를 접합한 후, 5㎜ 폭으로 재단하여 면역 크로마토그래피법에 의한 검사 키트를 제작하였다. 1키트당 흡수 패드의 크기는 26㎜×5㎜이고, 사용한 표지 항체 용액 중의 금 함유량은 1μg이었다.

(5) 전개액의 제조

초순수에 각각의 시약의 농도가, 10％ Tween20이 1％, 0.1M 황산마그네슘이 5mM, 디메틸술폭시드가 0.95％, 20％ 덱스트란황산나트륨(중량 평균 분자량 : 50만)이 2％, 및 CE510(JSR Corporation제)이 2％로 되도록 첨가하여, 혼화하였다. 또한, 방부제로서 아지드화나트륨을 0.05％로 되도록 첨가하여 혼화하고, 전개액을 제작하였다.

(실시예 3) 인플루엔자 A형 바이러스의 측정

상기에서 제작한 검사 키트를 이용하여, 이하의 방법으로 인플루엔자 A형 바이러스와의 반응성 시험을 행하여, 본 발명의 검사 키트의 성능을 시험하였다.

PCR법을 이용한 감염 검사에 의해 인플루엔자 A형 바이러스(H3N2)의 감염이 음성이라 판정된 피험자로부터 콧물을 채취하였다. 콧물의 채취는, 피험자의 비강의 안쪽부까지 흡인 트랩의 한쪽 관을 삽입하고, 다른 한쪽의 관을 흡인 펌프에 접속하여, 흡인 펌프를 음압으로 함으로써 행하였다. 콧물을 전개액으로 20배로 희석함으로써 인플루엔자 A형 바이러스 음성 검체를 제조하였다. 상기 음성 검체에 불활성화한 인플루엔자 A형 바이러스 A/Panama/2007/99(H3N2)를 첨가하여, 인플루엔자 A형 바이러스 양성 검체로 하였다.

양성 검체 또는 음성 검체를 각각 150μl씩 검사 키트의 샘플 패드 상에 얹어 전개시켜, 10분 후에 육안으로 판정하였다. 판정부에 빨간 라인을 확인할 수 있는 경우를「＋」, 빨간 라인을 보다 강하게 확인할 수 있을 경우를「＋＋」, 빨간 라인은 확인할 수 있지만 색이 매우 옅은 경우를「±」, 빨간 선을 확인할 수 없는 경우를 「－」로 하였다. 표 1에 결과를 나타낸다.

(비교예 1)

상기 실시예 2의 검사 키트의 제작에 있어서, 크로마토그래프 매체 상의 판정부에 도포하는 항체 및 금 콜로이드와 결합시키는 항체를 변경한 것을 제외하고, 실시예 3과 마찬가지의 조작에 의해 양성 검체 및 음성 검체의 측정을 행하였다.

크로마토그래프 매체 상의 판정부에 도포하는 항체로서는, 항체 1C6, 6F7 및 10G5 중 어느 하나 또는 그들의 조합 대신에, 항체 7307, 항체 1C6 또는 그들의 조합을 이용하였다.

금 콜로이드와 결합시키는 표지 항체로서는, 항체 7307 대신에, 항체 6F7 및 10G5를 사용하였다.

표 1에 결과를 나타낸다.

(비교예 2)

면역 크로마토그래피법에 의한 시판되는 인플루엔자 A형 바이러스의 검사 키트, 이뮤노에스 Flu(상품명)(가부시끼가이샤 타운즈사제)를 이용하여, 실시예 3과 마찬가지의 조작에 의해 양성 검체 및 음성 검체의 측정을 행하였다.

표 1에 결과를 나타낸다.

면역 크로마토그래피법에 의한 검사 키트의 고상화 항체로서, 인플루엔자 A형 바이러스 핵단백질과 항원 항체 반응하지만, SDS-PAGE에 의해 분리된 핵단백질과는 항원 항체 반응을 하지 않는 항체(항체 1C6, 6F7 또는 10G5)를 이용한 경우, 종래 시판되고 있는 검사 키트(비교예 2)와 비교하여, 인플루엔자 A형 바이러스에 대해 수배 높은 검출 감도를 나타냈다.

특히, 표지 항체로서, SDS-PAGE에 의해 분리된 핵단백질과도 항원 항체 반응을 하는 항체(항체 7307)를 선택하고, 상기한 고상화 항체와 조합하여 이용함으로써, 종래의 검사 키트보다 높은 검출 감도가 얻어졌다.

한편, 고상화 항체로서, SDS-PAGE에 의해 분리된 핵단백질과도 항원 항체 반응을 하는 항체(항체 7307)를 이용한 경우(비교예 1)는, 그 검출 감도는 종래의 시판품과 동등하였다.

(실시예 4)

검체로서, 인플루엔자 A형 바이러스 A/Panama/2007/99(H3N2)주 대신에, 불활성화한 인플루엔자 A형 바이러스 A/New Caledonia/20/99(H1N1)주, A/Brisbane/10/2007(H3N2)주, 또는 A/Solomon/03/2006(H1N1)주를 이용한 것을 제외하고는, 실시예 3과 마찬가지의 조작에 의해 검체의 측정을 행하였다. 고상화 항체로서는 항체 6F7 및 10G5를 이용하고, 표지 항체로는 항체 7307을 이용하였다.

표 2에 결과를 나타낸다.

본 발명의 검사 키트는, 아형의 차이에 관계없이, 인플루엔자 A형 바이러스를 높은 감도로 검출하는 것이 가능하였다.

본 발명의 인플루엔자 A형 바이러스의 검사 키트는, 종래의 검사 키트보다 인플루엔자 A형 바이러스의 검출 감도가 높아, 적은 바이러스량으로 「양성」의 판정이 얻어지므로, 「음성」의 판정에 대한 신뢰성이 극히 높은 검사 키트를 제공할 수 있다고 하는, 산업상 이용 가능성을 갖는다.

Claims

인플루엔자 A형 바이러스 핵단백질과 항원 항체 반응하고 인플루엔자 B형 바이러스 핵단백질과는 실질적으로 항원 항체 반응하지 않는 제1 항체가 고상화된 크로마토그래프 매체, 및 인플루엔자 A형 바이러스 핵단백질과 항원 항체 반응하고 인플루엔자 B형 바이러스 핵단백질과는 실질적으로 항원 항체 반응하지 않는 제2 항체와 표지 물질이 결합된 표지 시약을 함유하는 면역 크로마토그래피법에 의한 검출 키트이며,
제1 항체가, SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기 영동에 의해 분리된 전장의 인플루엔자 A형 바이러스 핵단백질과는 웨스턴 블로트법에 의해 항원 항체 반응하지 않는 항체이고, 제2 항체가, SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기 영동에 의해 분리된 전장의 인플루엔자 A형 바이러스 핵단백질과 웨스턴 블로트법에 의해 항원 항체 반응하는 항체인, 인플루엔자 A형 바이러스의 검출 키트.
제1항에 있어서, 제1 항체가, 1 또는 그 이상의 모노클로널 항체인, 인플루엔자 A형 바이러스의 검출 키트.
제1항 또는 제2항에 있어서, 제1 항체가, 인플루엔자 A형 바이러스 H1N1 아형의 전장의 핵단백질을 면역함으로써 얻어지는 항체인, 인플루엔자 A형 바이러스의 검출 키트.
인플루엔자 A형 바이러스 핵단백질과 항원 항체 반응하고 인플루엔자 B형 바이러스 핵단백질과는 실질적으로 항원 항체 반응하지 않는 제1 항체가 고상화된 크로마토그래프 매체, 및 인플루엔자 A형 바이러스 핵단백질과 항원 항체 반응하고 인플루엔자 B형 바이러스 핵단백질과는 실질적으로 항원 항체 반응하지 않는 제2 항체와 표지 물질이 결합된 표지 시약을 사용한 면역 크로마토그래피법에 의한 검출 방법이며,
제1 항체가, SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기 영동에 의해 분리된 전장의 인플루엔자 A형 바이러스 핵단백질과는 웨스턴 블로트법에 의해 항원 항체 반응하지 않는 항체이고, 제2 항체가, SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기 영동에 의해 분리된 전장의 인플루엔자 A형 바이러스 핵단백질과 웨스턴 블로트법에 의해 항원 항체 반응하는 항체인, 인플루엔자 A형 바이러스의 검출 방법.
제4항에 있어서, 제1 항체가, 1 또는 그 이상의 모노클로널 항체인, 인플루엔자 A형 바이러스의 검출 방법.
제4항 또는 제5항에 있어서, 제1 항체가, 인플루엔자 A형 바이러스 H1N1 아형의 전장의 핵단백질을 면역함으로써 얻어지는 항체인, 인플루엔자 A형 바이러스의 검출 방법.
미변성의 인플루엔자 A형 바이러스 핵단백질과 항원 항체 반응하지만, SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기 영동에 의해 분리된 전장의 인플루엔자 A형 바이러스 핵단백질과는 웨스턴 블로트법에 의해 항원 항체 반응하지 않는 항체를 함유하여 이루어지는, 인플루엔자 A형 바이러스의 검출제.
제7항에 있어서, 인플루엔자 A형 바이러스 검출제가, 면역 크로마토그래피법에 의한 검출 키트에 사용되는 것인, 인플루엔자 A형 바이러스의 검출제.
제8항에 있어서, 인플루엔자 A형 바이러스 검출제가, 면역 크로마토그래피법에 의한 검출 키트의 크로마토그래프 매체에 고상화하여 사용되는 것인, 인플루엔자 A형 바이러스의 검출제.
제7항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 인플루엔자 A형 바이러스 검출제가, 1 또는 그 이상의 모노클로널 항체인, 인플루엔자 A형 바이러스의 검출제.
제7항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 인플루엔자 A형 바이러스 검출제가, 인플루엔자 A형 바이러스 H1N1 아형의 전장의 핵단백질을 면역함으로써 얻어지는 항체인, 인플루엔자 A형 바이러스의 검출제.