JP2023536737A - Ｓａｒｓ－ｃｏｖ－２を検出するためのアッセイ - Google Patents

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ブリン，ローレンス，ビー
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コヴァックス，ステファン
シン，タオ
ロバーツ，ドナベル
キム，スン，ヒー
パーク，サン，ヨン
ジ，ミジュン
ジーマン，ロバート，エヌ．
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Abstract

本開示は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス由来のタンパク質またはそのフラグメントに結合する、一次抗体またはその抗原結合フラグメントと、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス由来のタンパク質またはそのフラグメントに結合する、二次抗体またはその抗原結合フラグメントを使用して、対象から得られた試料中で、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス由来のタンパク質またはそのフラグメントを検出する方法に関する。【選択図】図１

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０２０年８月４日に出願された米国仮特許出願第６３／０６０，９７５号、２０２０年８月１４日に出願された同第６３／０６５，８９８号、２０２０年８月１８日に出願された同第６３／０６７，０５１号、及び２０２０年１２月１６日に出願された同第６３／１２６，３３６号の利益を主張し、これらの内容は、それぞれ、全体が本明細書に参照により組み込まれる。
配列表の記載
２０２１年８月４日に作成された「３８６９１－６０１＿ＳＥＱＵＥＮＣＥ＿ＬＩＳＴＩＮＧ＿ＳＴ２５」という名称の、１３，１０７バイトのファイルサイズを有する、本明細書と共に出願されたコンピュータ可読配列表のテキストは、全体が本明細書で参照により組み込まれる。
本開示は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原を検出するための構成要素及び方法に関する。
発熱、重度の呼吸器疾患、及び肺炎を引き起こす、新しいコロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（２０１９－ｎＣｏＶ））は、２０１９年後半に中国の湖北省でヒト病原体として出現した。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（２０１９－ｎＣｏＶ）と関連する疾患は、ＣＯＶＩＤ－１９と名付けられた。新しいコロナウイルスは、ベータコロナウイルス属のメンバーであり、いくつかのコウモリコロナウイルス及び重症急性呼吸器症候群コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ）と密接に関連する。しかし、ＳＡＲＳ－ＣｏＶとは異なり、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（２０１９－ｎＣｏＶ）は、ヒト間で急速に伝染する。
２０２１年７月末現在で、２００を超える国において、１億９，０００万件を超えるＣＯＶＩＤ－１９の症例が確認されており、ＣＯＶＩＤ－１９の合併症は、４００万人を超える死因として特記された。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２伝染による健康上のリスクがあるので、ヒトのコロナウイルス感染を評価するための方法及びキットが必要であり、これは、対象から得られた１つ以上の試料において、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２タンパク質の存在を判定し、及び／または、その量を検出する方法を含む。
本開示は、対象由来の試料中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の存在を検出するか、または、その量を決定するための方法、デバイス、及びキットを提供する。
いくつかの実施形態では、方法は、試料中に存在する場合、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス由来のタンパク質またはそのフラグメントの、一次抗体またはその抗原結合フラグメントとの結合を可能にする条件下で、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス由来のタンパク質またはそのフラグメントに特異的に結合する一次抗体またはその抗原結合フラグメントと、対象から得られた試料を接触させること；ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス由来のタンパク質またはそのフラグメントに特異的に結合する二次抗体、及び検出可能な標識を含むコンジュゲートと、試料を接触させること；ならびに、検出可能な標識のシグナルの存在を評価すること、を含み、検出可能な標識のシグナルの存在は、試料中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス由来のタンパク質またはそのフラグメントの存在を示す。
いくつかの実施形態では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス由来のタンパク質またはそのフラグメントは、ヌクレオキャプシド（Ｎ）タンパク質である。一次抗体またはその抗原結合フラグメント、及び二次抗体またはその抗原結合フラグメントは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス由来のタンパク質の異なるエピトープ（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスヌクレオキャプシド（Ｎ）タンパク質）を認識し得る。
一次抗体またはその抗原結合フラグメントは、（ｉ）配列番号１と少なくとも７０％の同一性を有する相補性決定領域１（ＣＤＲ）アミノ酸配列、配列番号２と少なくとも７０％の同一性を有するＣＤＲ２アミノ酸配列、及び配列番号３と少なくとも７０％の同一性を有するＣＤＲ３アミノ酸配列を含む重鎖可変領域、ならびに、（ｉｉ）配列番号４と少なくとも７０％の同一性を有するＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号５と少なくとも７０％の同一性を有するＣＤＲ２アミノ酸配列、及び配列番号６と少なくとも７０％の同一性を有するＣＤＲ３アミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、を含んでもよい。いくつかの実施形態では、一次抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号７と少なくとも７０％の同一性を有する重鎖可変領域アミノ酸配列、及び配列番号８と少なくとも７０％の同一性を有する軽鎖可変領域アミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、一次抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号１７と少なくとも７０％の同一性を有する重鎖可変領域アミノ酸配列、及び配列番号１８と少なくとも７０％の同一性を有する軽鎖可変領域アミノ酸配列を含む。
二次抗体またはその抗原結合フラグメントは、（ｉ）配列番号９と少なくとも７０％の同一性を有する相補性決定領域１（ＣＤＲ）アミノ酸配列、配列番号１０と少なくとも７０％の同一性を有するＣＤＲ２アミノ酸配列、及び配列番号１１と少なくとも７０％の同一性を有するＣＤＲ３アミノ酸配列を含む重鎖可変領域、ならびに、（ｉｉ）配列番号１２と少なくとも７０％の同一性を有するＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号１３と少なくとも７０％の同一性を有するＣＤＲ２アミノ酸配列、及び配列番号１４と少なくとも７０％の同一性を有するＣＤＲ３アミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、を含んでもよい。いくつかの実施形態では、二次抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号１５と少なくとも７０％の同一性を有する重鎖可変領域アミノ酸配列、及び配列番号１６と少なくとも７０％の同一性を有する軽鎖可変領域アミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、方法は、イムノアッセイを使用して実施される。イムノアッセイは、酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）またはラテラルフローイムノアッセイ（ＬＦＡ）であってよい。
試料は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ０２を含む、または含むと疑われる対象由来の任意の試料であってよい。いくつかの実施形態では、試料は、鼻または鼻咽頭のスワブもしくはブラシ、唾液、粘液、血液、血清、または血漿を含む。
本明細書では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス由来のタンパク質またはそのフラグメントに特異的に結合する、一次抗体またはその抗原結合フラグメント、及び、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス由来のタンパク質またはそのフラグメントに特異的に結合する、二次抗体またはその抗原結合フラグメント、を含むラテラルフローデバイスも開示される。いくつかの実施形態では、一次抗体またはその抗原結合フラグメントが固定される。いくつかの実施形態では、検査ラインは、一次抗体またはその抗原結合フラグメントを含む。いくつかの実施形態では、二次抗体またはその抗原結合フラグメントは、検出可能な標識を含む。いくつかの実施形態では、試料パッドは、二次抗体またはその抗原結合フラグメントを含む。
いくつかの実施形態では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス由来のタンパク質またはそのフラグメントは、ヌクレオキャプシド（Ｎ）タンパク質である。一次抗体またはその抗原結合フラグメント、及び二次抗体またはその抗原結合フラグメントは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス由来のタンパク質の異なるエピトープ（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスヌクレオキャプシド（Ｎ）タンパク質）を認識し得る。
一次抗体またはその抗原結合フラグメントは、（ｉ）配列番号１と少なくとも７０％の同一性を有する相補性決定領域１（ＣＤＲ）アミノ酸配列、配列番号２と少なくとも７０％の同一性を有するＣＤＲ２アミノ酸配列、及び配列番号３と少なくとも７０％の同一性を有するＣＤＲ３アミノ酸配列を含む重鎖可変領域、ならびに、（ｉｉ）配列番号４と少なくとも７０％の同一性を有するＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号５と少なくとも７０％の同一性を有するＣＤＲ２アミノ酸配列、及び配列番号６と少なくとも７０％の同一性を有するＣＤＲ３アミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、を含んでもよい。いくつかの実施形態では、一次抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号７と少なくとも７０％の同一性を有する重鎖可変領域アミノ酸配列、及び配列番号８と少なくとも７０％の同一性を有する軽鎖可変領域アミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、一次抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号１７と少なくとも７０％の同一性を有する重鎖可変領域アミノ酸配列、及び配列番号１８と少なくとも７０％の同一性を有する軽鎖可変領域アミノ酸配列を含む。
二次抗体またはその抗原結合フラグメントは、（ｉ）配列番号９と少なくとも７０％の同一性を有する相補性決定領域１（ＣＤＲ）アミノ酸配列、配列番号１０と少なくとも７０％の同一性を有するＣＤＲ２アミノ酸配列、及び配列番号１１と少なくとも７０％の同一性を有するＣＤＲ３アミノ酸配列を含む重鎖可変領域、ならびに、（ｉｉ）配列番号１２と少なくとも７０％の同一性を有するＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号１３と少なくとも７０％の同一性を有するＣＤＲ２アミノ酸配列、及び配列番号１４と少なくとも７０％の同一性を有するＣＤＲ３アミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、を含んでもよい。いくつかの実施形態では、二次抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号１５と少なくとも７０％の同一性を有する重鎖可変領域アミノ酸配列、及び配列番号１６と少なくとも７０％の同一性を有する軽鎖可変領域アミノ酸配列を含む。
さらに、本明細書に記載のラテラルフローデバイスを含むキットが開示される。キットは、さらに、抽出緩衝液及びサンプリングデバイス（例えば、鼻スワブ）の少なくとも一方または両方を含んでもよい。
本開示の他の態様及び実施形態は、以下の詳細な説明及び添付の図面に照らして明らかになるであろう。
フック効果を検査するための例示的なラテラルフローアッセイの用量応答のグラフである。
本開示は、少なくとも部分的に、特異度を高め、検出限界を下げたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の検出を可能にする抗体のペアを用いる方法の開発に基づいている。
本明細書で使用される語「含む」、「含む」、「有すること」、「有する」、「できる」、「含有する」、及びそれらの変形は、追加の行為または構造の可能性を排除しない、制限のない移行句、用語、または単語であることが意図される。単数形「ａ」、「及び」、及び「ｔｈｅ」には、文脈に別途明示のない限り、複数の参照を含む。本開示は、明示的に記載されているかどうかにかかわらず、本明細書で提示される実施形態または要素を「含む」、「からなる」、及び「から本質的になる」他の実施形態も企図する。
本明細書における数値範囲を詳述する場合、同程度の精度で、その間に介在する各数値が、明確に企図される。例えば、６～９の範囲では、７及び８の数字が、６及び９に加えて考えられ、６．０～７．０の範囲では、６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、及び７．０の数字が、明示的に企図される。
本明細書で使用される「免疫グロブリン」または「抗体」という用語は、脊椎動物の血液または他の体液に見出されるタンパク質を指し、これは、異物、例えば、細菌及びウイルスを同定及び中和するために免疫系により使用される。通常は、免疫グロブリンまたは抗体は、少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含むタンパク質である。ＣＤＲは、抗体の「超可変領域」を形成し、これは、抗原結合に関与する（さらに以下で検討）。免疫グロブリン全体は、通常、４つのポリペプチド：２つの同一コピーの重（Ｈ）鎖ポリペプチド及び２つの同一コピーの軽（Ｌ）鎖ポリペプチド、からなる。各重鎖のそれぞれは、１つのＮ末端可変（ＶＨ）領域及び３つのＣ末端定常（ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３）領域を含み、各軽鎖は、１つのＮ末端可変（ＶＬ）領域及び１つのＣ末端定常（ＣＬ）領域を含む。抗体の軽鎖は、定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）またはラムダ（λ）の２つの異なるタイプの１つに割り当てることができる。代表的な免疫グロブリンでは、各軽鎖は、ジスルフィド結合で重鎖に連結されており、２つの重鎖は、ジスルフィド結合で互いに連結されている。軽鎖可変領域は、重鎖の可変領域とアラインされ、軽鎖定常領域は、重鎖の最初の定常領域とアラインされる。重鎖の残りの定常領域は、互いにアラインされる。
軽鎖及び重鎖の各ペアの可変領域は、抗体の抗原結合部位を形成する。ＶＨ及びＶＬ領域は、同じ一般構造を有し、各領域は、４つのフレームワーク（ＦＷまたはＦＲ）領域を含む。本明細書で使用される「フレームワーク領域」という用語は、ＣＤＲ間に位置する可変領域内の比較的保存されたアミノ酸配列を指す。各可変ドメインには、４つのフレームワーク領域があり、これは、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４と呼ばれる。フレームワーク領域は、可変領域の構造フレームワークを提供するβシートを形成する（例えば、以下を参照、Ｃ．Ａ．Ｊａｎｅｗａｙ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．），Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ，５ｔｈ Ｅｄ．，Ｇａｒｌａｎｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．（２００１））。
フレームワーク領域は、３つのＣＤＲで連結される。上で検討されるように、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３として既知の３つのＣＤＲは、抗体の「超可変領域」を形成し、これは、抗原結合に関与する。ＣＤＲは、フレームワーク領域で形成されたベータシート構造を連結する、いくつかの場合では、それの一部を含むループを形成する。軽鎖及び重鎖の定常領域は、抗体の抗原への結合に直接関与していないが、定常領域は、可変領域の配向に影響を与え得る。定常領域は、様々なエフェクター機能、例えば、エフェクター分子及び細胞との相互作用を介した抗体依存性補体媒介溶解または抗体依存性細胞毒性への関与、も示す。
本明細書で使用される場合、抗体または他のエンティティ（例えば、抗原結合ドメイン）が抗原またはエピトープを「特異的に認識する」または「特異的に結合する」時、タンパク質及び／または巨大分子の複雑な混合物中の抗原を優先的に認識し、抗原またはエピトープを提示しない他のエンティティよりも実質的に高い親和性を有する抗原またはエピトープに結合する。この点に関しては、「実質的により高い親和性」は、所望のアッセイまたは測定装置を使用してエンティティと区別される抗原またはエピトープの検出を可能にするのに十分に高い親和性を意味する。通常は、少なくとも１０７Ｍ－１（例えば、＞１０７Ｍ－１、＞１０８Ｍ－１、＞１０９Ｍ－１、＞１０１０Ｍ－１、＞１０１１Ｍ－１、＞１０１２Ｍ－１、＞１０１３Ｍ－１など）の結合定数（Ｋａ）を有する結合親和性を意味する。そのような特定の実施形態では、抗体は、異なる抗原がその特定のエピトープを含む限り、異なる抗原に結合することが可能である。特定の場合では、例えば、異なる種由来の相同タンパク質は、同じエピトープを含んでもよい。
本明細書で使用される「抗体」及び「抗体（複数）」は、モノクローナル抗体、単一特異性抗体（例えば、モノクローナルであり得るか、または共通の生殖細胞からそれらを産生する他の手段でも産生され得る）、多重特異性抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体（完全または部分的ヒト化）、動物抗体、例えば、限定されないが、鳥類（例えば、アヒルまたはガチョウ）、サメ、クジラ、及び非霊長類（例えば、ウシ、ブタ、ラクダ、ラマ、ウマ、ヤギ、ウサギ、ヒツジ、ハムスター、モルモット、ネコ、イヌ、ラット、マウスなど）を含む哺乳動物、または非ヒト霊長類（例えば、サル、チンパンジーなど）、組み換え抗体、キメラ抗体、一本鎖可変フラグメント（「ｓｃＦｖ」）、一本鎖抗体、単一ドメイン抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）フラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、ジスルフィド結合Ｆｖ（「ｓｄＦｖ」）、及び抗イディオタイプ（「抗Ｉｄ」）抗体、二重ドメイン抗体、二重可変ドメイン（ＤＶＤ）、または三重可変ドメイン（ＴＶＤ）抗体（二重可変ドメイン免疫グロブリン及びそれらを作製する方法は、Ｗｕ，Ｃ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２５（１１）：１２９０－１２９７（２００７）及びＰＣＴ国際出願ＷＯ２００１／０５８９５６に記載されており、これらのそれぞれの内容は、参照により本明細書に組み込まれる）、またはドメイン抗体（ｄＡｂ）（例えば、Ｈｏｌｔ ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２１：４８４－４９０に記載されるもの、ならびに、例えば、軟骨魚類及びラクダ科動物のような天然に存在する単一ドメイン抗体ｓｄＡｂ、または合成的なもの、例えば、ナノボディ、ＶＨＨ、もしくは他のドメイン構造である単一ドメイン抗体ｓｄＡｂを含むもの）、ならびに、上記のいずれかの機能的に活性なエピトープ結合フラグメントのいずれかを指す。特に、抗体には、免疫グロブリン分子及び免疫グロブリン分子の免疫学的に活性なフラグメント、すなわち、分析物結合部位を含有する分子を含む。免疫グロブリン分子は、任意のタイプ（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、及びＩｇＹ）、クラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、及びＩｇＡ２）、またはサブクラスのものであり得る。簡単にするために、分析物に対する抗体は、多くの場合、本明細書では、「抗分析物抗体」または単に「分析物抗体」と呼ばれる。
抗体の「抗体のフラグメント」、「抗体フラグメント」、及び「抗原結合フラグメント」という用語は、抗原に特異的に結合する能力を保持する抗体の１つ以上のフラグメントを指すために、本明細書では互換的に使用される（一般には、以下を参照：Ｈｏｌｌｉｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，２３（９）：１１２６－１１２９（２００５））。本明細書に記載の抗体の任意の抗原結合フラグメントは、本発明の範囲内である。抗体フラグメントは、望ましくは、例えば、１つ以上のＣＤＲ、可変領域（もしくはその部分）、定常領域（もしくはその部分）、またはそれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、部分には、インタクト抗体のＦｃ領域の定常重鎖ドメイン（すなわち、抗体アイソタイプに応じて、ＣＨ２、ＣＨ３、またはＣＨ４）を含まれない。抗体フラグメントの例としては、（ｉ）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ、及びＣＨ１ドメインからなる一価フラグメントであるＦａｂフラグメント、（ｉｉ）ヒンジ領域でジスルフィド架橋により連結された２つのＦａｂフラグメントを含む二価フラグメントであるＦ（ａｂ’）２フラグメント、（ｉｉｉ）抗体の単一アームのＶＬ及びＶＨドメインからなるＦｖフラグメント、（ｉｖ）穏やかな還元条件を使用して、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントのジスルフィド架橋を切断することにより得られるＦａｂ’フラグメント、（ｖ）ジスルフィド安定化Ｆｖフラグメント（ｄｓＦｖ）、（ｖｉ）抗原に特異的に結合する抗体単一可変領域ドメイン（ＶＨまたはＶＬ）ポリペプチドであるドメイン抗体（ｄＡｂ）、（ｖｉｉ）Ｆａｂ’－ＳＨフラグメント、（ｖｉｉｉ）Ｆｄフラグメント、（ｉｘ）ダイアボディ、（ｘ）一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）分子、（ｘｉ）軽鎖可変ドメインを１つのみ含有する一本鎖ポリペプチド、（ｘｉｉ）軽鎖可変ドメインの３つのＣＤＲを含有する一本鎖ポリペプチド、（ｘｉｉ）重鎖可変領域を１つのみ含有する一本鎖ポリペプチド、及び、（ｘｉｉｉ）重鎖可変領域の３つのＣＤＲを含有する一本鎖ポリペプチド、が挙げられるが、これらに限定されない。
特定のエピトープを認識する抗体フラグメントは、既知の手法で生成され得る。例えば、Ｆａｂ及びＦ（ａｂ’）２フラグメントは、パパイン（２つの同一のＦａｂフラグメントを生成する）またはペプシン（Ｆ（ａｂ’）２フラグメントを生成する）などの酵素を使用して、免疫グロブリン分子のタンパク質分解切断で生成され得る。ＩｇＧ分子のＦ（ａｂ’）２フラグメントは、より大きな（「親」）ＩｇＧ分子の２つの抗原結合部位を保持し、これには、両方の軽鎖（可変軽鎖領域及び定常軽鎖領域を含有）、重鎖のＣＨ１ドメイン、ならびに親ＩｇＧ分子のジスルフィド形成ヒンジ領域が含まれる。従って、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントは、依然として、親ＩｇＧ分子のような抗原分子を架橋することが可能ある。
本明細書で使用される「フラグメント抗原結合フラグメント」または「Ｆａｂフラグメント」は、抗原に結合し、１つの抗原結合部位、１つの完全な軽鎖、及び１つの重鎖の一部を含む抗体のフラグメントを指す。Ｆａｂは、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ、及びＣＨ１ドメインからなる一価フラグメントである。Ｆａｂは、重鎖及び軽鎖のそれぞれの１つの定常ドメイン及び１つの可変ドメインからなる。可変ドメインは、パラトープ（抗原結合部位）を含み、これは、単量体のアミノ末端に一連の相補性決定領域を含む。従って、Ｙの各アームは、抗原上のエピトープに結合する。例えば、酵素パパインを使用して、当該技術分野で記載されているように、Ｆａｂフラグメントを生成することができ、免疫グロブリン単量体を２つのＦａｂフラグメントとＦｃフラグメントに切断するために、これを使用することができるか、または、組み換え手段で、これを生成することができる。
本明細書で使用される「Ｆ（ａｂ’）２フラグメント」は、ヒンジ領域の一部をインタクトのままにしながら、Ｆｃ領域の大部分を除去するＩｇＧ抗体全体のペプシン消化で生成された抗体を指す。Ｆ（ａｂ’）２フラグメントは、ジスルフィド結合で互いに連結された２つの抗原結合Ｆ（ａｂ）部分を有し、従って、約１１０ｋＤａの分子量を有する二価のものである。二価抗体フラグメント（Ｆ（ａｂ’）２フラグメント）は、ＩｇＧ分子全体よりも小さく、組織への浸透を良好にし、それにより、免疫組織化学における抗原認識が容易になる。また、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントを使用すると、生細胞上のＦｃ受容体またはプロテインＡ／Ｇへの非特異的結合が回避される。Ｆ（ａｂ’）２フラグメントは、抗原に結合して沈殿し得る。
本明細書で使用される「フレームワーク」（ＦＲ）または「フレームワーク配列」は、可変領域の残りの配列からＣＤＲを差し引いたものを意味し得る。ＣＤＲ配列の正確な定義が、種々のシステムで決定することができるので、フレームワーク配列の意味は、それに対応して、種々の解釈の対象となる。６つのＣＤＲ（軽鎖のＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、及びＣＤＲ－Ｌ３、ならびに重鎖のＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、及びＣＤＲ－Ｈ３）はまた、軽鎖及び重鎖のフレームワーク領域を４つのサブ領域（ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４）に分割し、ＣＤＲ１は、ＦＲ１及びＦＲ２間に位置し、ＣＤＲ２は、ＦＲ２及びＦＲ３間に位置し、ＣＤＲ３は、ＦＲ３及びＦＲ４間に位置する。特定のサブ領域をＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、またはＦＲ４と特定することなく、他者が言及するフレームワーク領域は、単一の天然に存在する免疫グロブリン鎖の可変領域内で組み合わされたＦＲを表す。本明細書で使用される場合、ＦＲは、４つのサブ領域のうちの１つを表し、ＦＲは、フレームワーク領域を構成する４つのサブ領域のうちの２つ以上を表す。
ヒト重鎖及び軽鎖ＦＲ配列は、当該技術分野で既知であり、当該技術分野で既知の手法を使用して非ヒト抗体をヒト化するため重鎖及び軽鎖「アクセプター」フレームワーク配列（または、単に「アクセプター」配列）として使用することができる。一実施形態では、ヒト重鎖及び軽鎖アクセプター配列は、一般公開されているデータベース、例えば、Ｖ－ｂａｓｅ（ハイパーテキスト転送プロトコール：ｖｂａｓｅ（ｄｏｔ）ｍｒｃ－ｃｐｅ（ｄｏｔ）ｃａｍ（ｄｏｔ）ａｃ（ｄｏｔ））ｕｋ）または国際ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ（登録商標）（ＩＭＧＴ（登録商標））情報システム（ハイパーテキスト転送プロトコール：ｉｍｇｔ（ｄｏｔ）ｃｉｎｅｓ（ｄｏｔ）ｆｒ／ｔｅｘｔｓ／ＩＭＧＴｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ／ＬｏｃｕｓＧｅｎｅｓ／）に記載されているフレームワーク配列から選択される。
「組み換え抗体」及び「組み換え抗体」は、１つ以上のステップで調製された抗体を指し、これには、組み換え手法で、適切な発現ベクターに１つ以上のモノクローナル抗体の全部または一部をコードする核酸配列をクローニングすること、続いて、適切な宿主細胞に抗体を発現させること、が含まれる。用語には、組み換え産生されたモノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体（完全または部分的にヒト化）、抗体フラグメントから形成された多重特異性または多価構造、二機能性抗体、ヘテロコンジュゲート抗体、ＤＶＤ－Ｉｇ（登録商標）、及び本明細書（i）に記載される他の抗体が含まれるが、これらに限定されない。（二重可変ドメイン免疫グロブリン及びそれらを作製する方法は、Ｗｕ，Ｃ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２５：１２９０－１２９７（２００７）に記載されている）。
「核酸」、「ポリヌクレオチド」、「ヌクレオチド配列」、及び「オリゴヌクレオチド」という用語は、本明細書では互換的に使用され、それぞれ、ピリミジン及び／またはプリン塩基、好ましくは、シトシン、チミン、及びウラシル、ならびにアデニン及びグアニンのポリマーまたはオリゴマーを指す（以下を参照：Ａｌｂｅｒｔ Ｌ．Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ａｔ ７９３－８００（Ｗｏｒｔｈ Ｐｕｂ．１９８２））。用語は、任意のデオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、またはペプチド核酸構成成分、及びそれらの任意の化学バリアント、例えば、それらの塩基のメチル化形態、ヒドロキシメチル化形態、またはグリコシル化形態を包含する。ポリマーまたはオリゴマーは、組成物中で不均一または均一であり得るか、天然源から単離され得るか、または人工的もしくは合成的に生成され得る。加えて、核酸は、ＤＮＡもしくはＲＮＡ、またはそれらの混合物であってよく、ホモ二本鎖、ヘテロ二本鎖、及びハイブリッド状態を含む、一本鎖形態または二本鎖形態で永続的または一時的に存在し得る。いくつかの実施形態では、核酸または核酸配列は、他の種類の核酸構造、例えば、ＤＮＡ／ＲＮＡヘリックス、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、モルホリノ核酸（例えば、以下を参照：Ｂｒａａｓｃｈ ａｎｄ Ｃｏｒｅｙ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４１（１４）：４５０３－４５１０（２００２）及び米国特許第５，０３４，５０６号）、ロックされた核酸（ＬＮＡ；以下を参照：Ｗａｈｌｅｓｔｅｄｔ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，９７：５６３３－５６３８（２０００））、シクロヘキセニル核酸（以下を参照：Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２２：８５９５－８６０２（２０００））、及び／またはリボザイムを含む。「核酸」及び「核酸配列」という用語は、天然ヌクレオチドと同じ機能を示し得る、非天然ヌクレオチド、改変ヌクレオチド、及び／または非ヌクレオチド構成単位を含む鎖（例えば、「ヌクレオチドアナログ」）も包含し得る。
「ペプチド」、「ポリペプチド」、及び「タンパク質」という用語は、本明細書では互換的に使用され、任意の長さのアミノ酸のポリマー形態を指し、これには、コード化及び非コード化アミノ酸、化学的または生化学的に改変または誘導体化されたアミノ酸、ならびに改変ペプチド骨格を有するポリペプチドが含まれ得る。
「免疫原」及び「抗原」という用語は、本明細書では互換的に使用され、動物（例えば、哺乳動物）において免疫応答を誘導する任意の分子、化合物、または物質を指す。「免疫応答」は、例えば、抗体産生及び／または免疫エフェクター細胞の活性化を伴い得る。本開示の文脈における抗原は、哺乳動物において免疫応答を誘発する任意のタンパク質性または非タンパク質性（例えば、炭水化物または脂質）分子の任意のサブユニット、フラグメント、またはエピトープを含み得る。「エピトープ」とは、抗体または抗原受容体に認識される抗原の配列を意味する。エピトープは、当該技術分野では「抗原決定基」とも呼ばれる。特定の実施形態では、エピトープは、抗体に特異的に結合される抗原の領域である。特定の実施形態では、エピトープは、アミノ酸、糖側鎖、ホスホリル、またはスルホニル基などの分子の化学的に活性な表面基を含んでもよい。特定の実施形態では、エピトープは、特定の３次元構造特性（例えば、「立体配座」エピトープ）及び／または特定の電荷特性を有し得る。抗原は、ウイルス、細菌、寄生虫、真菌、原生動物、プリオン、細胞、または細胞外起源のタンパク質またはペプチドであり得、これは、哺乳動物において免疫応答を誘発し、好ましくは、防御免疫がもたらされる。
本明細書で使用される「検出可能な標識」及び「標識」という用語は、視覚的または機器的手段で検出可能なシグナルを生成し得る部分を指す。いくつかの実施形態では、標識は、直接標識、例えば、その自然状態で、肉眼で、または光学フィルター及び／または適用された刺激、例えば、蛍光を促進するＵＶ光、を用いて容易に見えるエンティティである。例えば、着色微粒子、例えば、染料ゾル、金属ゾル（例えば、金）、及び着色ラテックス粒子が非常に適している。いくつかの実施形態では、標識は、間接標識、例えば、酵素、例えば、アルカリホスファターゼ及び西洋ワサビペルオキシダーゼ、である。間接標識は、通常、可視シグナルが検出され得る前に、１つ以上の展開試薬、例えば、基質を添加することを要する。
本明細書で使用される場合、「存在」または「非存在」（あるいは、「存在する」または「存在しない」）は、特定のエンティティ（例えば、分析物）の量またはレベルについて記載するための相対的な意味で使用される。例えば、分析物が検査試料中に「存在する」と言われる場合、それは、この分析物のレベルまたは量が、所定の閾値を超えていることを意味し、逆に、分析物が検査試料中に「存在しない」と言われる場合、それは、この分析物のレベルまたは量が所定の閾値を下回っていることを意味する。所定の閾値は、分析物を検出するために使用される特定の検査に関連する検出可能性の閾値、または任意の他の閾値であり得る。分析物が試料中で「検出」される場合、それは、試料中に「存在し」；分析物が「検出されない」場合、それは、試料中に「存在しない」。さらに、分析物が「検出される」または分析物が「存在する」試料は、分析物に対して「陽性」である試料である。分析物が「検出されない」または分析物が「存在しない」試料は、分析物に対して「陰性」である試料である。
本明細書で使用される場合、「分析物」という用語は、リガンド、受容体、または酵素（例えば、抗体または抗原）への特異的結合で検出及び／または測定されるべき化合物または組成物を指す。いくつかの実施形態では、分析物は、タンパク質または核酸である。いくつかの実施形態では、分析物は、抗原である。いくつかの実施形態では、分析物は、抗原のフラグメントである。いくつかの実施形態では、分析物は、分析物アナログまたは分析物誘導体（例えば、化学的または生物学的方法で改変された分析物）である。いくつかの実施形態では、分析物は、エピトープである。いくつかの実施形態では、「分析物」という用語は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス由来のタンパク質及び／または核酸を指す。いくつかの実施形態では、分析物は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス由来のタンパク質及び／または核酸のフラグメント及び／またはエピトープである。いくつかの実施形態では、分析物は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ０ＤＴＣ２で提供される「Ｓ」タンパク質）またはスパイクタンパク質受容体結合ドメインである（例えば、以下を参照：Ｗｒａｐｐ（２０２０）Ｃｒｙｏ－ＥＭ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ ２０１９－ｎＣｏＶ ｓｐｉｋｅ ｉｎ ｔｈｅ ｐｒｅｆｕｓｉｏｎ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ”Ｓｃｉｅｎｃｅ ３６７：１２６０－６３；Ｗａｌｌｓ（２０２０）“Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｆｕｎｃｔｉｏｎ，ａｎｄ Ａｎｔｉｇｅｎｉｃｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ＳＡＲＳ ＣｏＶ－２ Ｓｐｉｋｅ Ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ”Ｃｅｌｌ １８０：１－１２（これらは、参照により本明細書に組み込まれる）。いくつかの実施形態では、分析物は、ウイルス転写及び／または複製タンパク質（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ０ＤＴＣ１で提供されるレプリカーゼポリタンパク質１ａ（Ｒ１ａ）またはＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ０ＤＴＤ１で提供されるレプリカーゼポリタンパク質１ａｂ（Ｒ１ａｂ））である。いくつかの実施形態では、分析物は、ウイルス出芽タンパク質（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ０ＤＴＣ３で提供されるタンパク質３ａまたはＰ０ＤＴＣ４で提供されるエンベロープ小膜タンパク質（Ｅ））である。いくつかの実施形態では、分析物は、ウイルス形態形成タンパク質（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ０ＤＴＣ５で提供される膜タンパク質（Ｍ））である。いくつかの実施形態では、分析物は、非構造タンパク質６（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ０ＤＴＣ６で提供される）、タンパク質７ａ（ＮＳ７Ａ）（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ０ＤＴＣ７で提供される）、タンパク質７ｂ（ＮＳ７Ｂ）（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ０ＤＴＤ８で提供される）、非構造タンパク質８（ＮＳ８）（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ０ＤＴＣ８で提供される）、またはタンパク質９ｂ（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ０ＤＴＤ２で提供される）である。いくつかの実施形態では、分析物は、ウイルスゲノムパッケージングタンパク質（例えば、核タンパク質（例えば、Ｎ）、例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ０ＤＴＣ９で提供される）である。いくつかの実施形態では、分析物は、未同定タンパク質である（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ０ＤＴＤ３またはＡ０Ａ６６３ＤＪＡ２で提供される）。
本明細書で使用される場合、「システム」は、共通の目的のために一緒に動作する複数の実コンポーネント及び／または抽象コンポーネントを指す。いくつかの実施形態では、「システム」は、ハードウェア及び／またはソフトウェアコンポーネントの統合集合体である。いくつかの実施形態では、システムの各コンポーネントは、１つ以上の他のコンポーネントと相互作用し、及び／または１つ以上の他のコンポーネントに関連する。いくつかの実施形態では、システムは、方法を制御及び指示するためのコンポーネント及びソフトウェアの組み合わせを指す。
本明細書で使用される場合、「試料」という用語は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２またはその一部もしくは構成成分を含むか、あるいは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２またはその一部もしくは構成成分を潜在的に含む、任意の試料を指す。従って、「試料」という用語は、分析物、例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２またはその一部もしくは構成成分の存在または量について検査されるべき材料を指す。好ましくは、試料は、流体試料、好ましくは、液体試料である。例えば、試料は、体液、例えば、血液（例えば、毛細血管血、静脈血、乾燥血斑などを含む）、血清、血漿、眼液、尿、粘液、精液、鼻もしくは鼻咽頭スワブ液、咽頭スワブ、涙、汗、または唾液、であってよい。試料となり得る溶液、溶出液、懸濁液、または抽出物を作成するために、粘性液体、半固体、または固体の標本が使用されてもよい。例えば、喉または生殖器スワブが、試料を作成するために溶液に懸濁され得る。
「ポイント・オブ・ケアデバイス」は、患者のケアの時間及び場所（例えば、病院、内科医の診療所、緊急もしくは他の医療施設、患者の家庭、介護施設、及び／または長期ケア及び／またはホスピス施設）で、ポイント・オブ・ケアまたはその近く（つまり、研究室外）において検査する医療診断法を提供するために使用されるデバイスを指す。ポイント・オブ・ケアデバイスの例としては、Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ａｂｂｏｔｔ Ｐａｒｋ，ＩＬ）（例えば、ｉ－ＳＴＡＴ及びｉ－ＳＴＡＴ Ａｌｉｎｉｔｙ、Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ（Ｒｏｗｖｉｌｌｅ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）（以下を参照：ＵＳ２００６／０１３４７１３）、Ａｘｉｓ－Ｓｈｉｅｌｄ ＰｏＣ ＡＳ（Ｏｓｌｏ，Ｎｏｒｗａｙ）、及びＣｌｉｎｉｃａｌ Ｌａｂ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ（Ｌｏｓ Ａｎｇｅｌｅｓ，ＵＳＡ）で製造されたものが挙げられる。
本明細書で使用されるアッセイの「感度」は、結果が陽性である対象に対する、陽性と正確に同定（例えば、対象が検査されている疾患または病状に罹患する対象を正確に同定）された対象の比を指す。例えば、これには、β－コロナウイルスなどのコロナウイルスに感染していると対象を、β－コロナウイルスなどのコロナウイルスに感染していないか、または感染したことがない対象から正確に識別することが含まれ得る。いくつかの態様では、アッセイのシグナル対ノイズ（Ｓ／Ｎ）比の変化を評価することにより、アッセイの感度を決定することができる。例えば、いくつかの態様では、Ｓ／Ｎ比の増加は、特定の分析物（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ヌクレオキャプシドタンパク質）に対するアッセイの感度の改善を示し得る。
本明細書で使用されるアッセイの「特異度」は、結果が陰性である対象に対する、陰性と正確に同定（例えば、対象が検査されている疾患または病状に罹患していない対象を正確に同定）された対象の比を指す。例えば、これには、β－コロナウイルスなどのコロナウイルスに感染している対象を、β－コロナウイルスなどのコロナウイルスに感染したことがない対象から正確に識別することが含まれ得る。
本明細書で特に定義しない限り、本開示に関連して使用される科学用語及び技術用語は、当業者らが一般に理解する意味を有するものとする。用語の意味及び範囲は明確でなければならない。但し、潜在的なあいまいさがある場合は、本明細書で提供される定義が、任意の辞書または外部の定義よりも優先される。さらに、別途文脈上必要のない限り、単数形の用語は、複数形を含み、複数形の用語は、単数形を含むものとする。
好ましい方法及び材料を以下に記載するが、本明細書に記載のものと同様または同等の方法及び材料を本開示の実施または検査に使用することができる。本明細書で言及された全ての刊行物、特許出願、特許、及び他の参考文献は、全体が参照により組み込まれる。本明細書に開示の材料、方法、及び実施例は、例示のみを目的としており、限定を意図しない。
１．抗体
開示された方法に従って、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス由来のタンパク質またはそのフラグメントに特異的に結合する一次抗体またはその抗原結合フラグメント（例えば、Ｆａｂ）、及び、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス由来のタンパク質に特異的に結合する二次抗体またはその抗原結合フラグメント（例えば、Ｆａｂ）と、試料を接触させる。一次抗体またはその抗原結合フラグメント、及び、二次抗体またはその抗原結合フラグメントは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスまたはそのフラグメント由来のタンパク質の異なるエピトープを認識する。いくつかの実施形態では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス由来のタンパク質は、ウイルスゲノムパッケージングタンパク質（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ０ＤＴＣ９で提供される、例えば、ヌクレオキャプシド（Ｎ）タンパク質）である。
一次抗体またはその抗原結合フラグメント抗体は、（ｉ）配列番号１と少なくとも７０％（例えば、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％）同一であるＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号２と少なくとも７０％同一であるＣＤＲ２アミノ酸配列、及び配列番号３と少なくとも７０％同一であるＣＤＲ３アミノ酸配列を含む重鎖可変領域、ならびに、（ｉｉ）、配列番号４と少なくとも７０％同一であるＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号５と少なくとも７０％同一であるＣＤＲ２アミノ酸配列、及び配列番号６と少なくとも７０％同一であるＣＤＲ３アミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、を含む。
あるいは、一次抗体またはその抗原結合フラグメントは、それぞれ、配列番号１、配列番号２、及び／または配列番号３と少なくとも９０％同一である重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３アミノ酸配列、及び／または、それぞれ、配列番号４、配列番号５、及び／または配列番号６と少なくとも９０％同一である軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３アミノ酸配列、を含んでもよい。
一実施形態では、（ｉ）重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及び／またはＣＤＲ３アミノ酸配列のそれぞれは、それぞれ、配列番号１、配列番号２、及び／または配列番号３を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなり、（ｉｉ）軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及び／またはＣＤＲ３アミノ酸配列のそれぞれは、それぞれ、配列番号４、配列番号５、及び／または配列番号６を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる。開示された抗体の重鎖及び／または軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３が、上記のアミノ酸配列から本質的になる場合、追加の構成要素は、抗体またはその抗原結合フラグメント（例えば、精製または単離を容易にするビオチンなどのタンパク質部分）に実質的に影響を及ぼさないＣＤＲに含まれ得る。開示された抗体の重鎖及び／または軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３が上記のアミノ酸配列からなる場合、各ＣＤＲは、任意の追加の構成要素（例えば、ＣＤＲに対して内因性でない構成要素）を含まない。
配列番号１－ＣＫＡＳＧＹＳＦＴＳＹＷＭＨＷ
配列番号２－ＭＩＤＰＳＤＳＥＴＲＬＮＱＲＦＫＤＫ
配列番号３－ＣＡＲＳＬＬＲＧＶＹＡＭＤＹＷ
配列番号４－ＣＫＡＳＱＳＶＳＮＤＶＡＷ
配列番号５－ＹＹＡＳＮＲＹＴＧＶＰＤＲ
配列番号６－ＣＱＱＤＹＳＳＰＹＴＦ
いくつかの実施形態では、一次抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号７を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる重鎖可変領域（ＶＨ）アミノ酸配列、及び、配列番号８を含むか、それらから本質的になるか、またはそれらからなる軽鎖可変領域（ＶＬ）アミノ酸配列を含む。ＶＨアミノ酸配列が配列番号７から本質的になり、ＶＬアミノ酸配列が配列番号８から本質的になる場合、追加の構成要素が、抗体またはその抗原結合フラグメント（例えば、精製または単離を容易にするビオチンまたはＨｉｓタグなどのタンパク質部分）に実質的に影響を及ぼさない重鎖または軽鎖可変領域に含まれ得る。ＶＨアミノ酸配列が配列番号７からなり、ＶＬアミノ酸配列が配列番号８からなる場合、重鎖及び軽鎖可変領域は、任意の追加の構成要素（例えば、重鎖または軽鎖の可変領域に内因性でない構成要素）を含まない。
他の実施形態では、一次抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号７と少なくとも７０％同一である重鎖可変領域アミノ酸配列及び配列番号８と少なくとも７０％である軽鎖可変領域アミノ酸配列、を含んでもよい。
配列番号７－ＱＶＱＬＱＱＳＧＰＱＬＶＲＰＧＡＳＶＫＩＳＣＫＡＳＧＹＳＦＴＳＹＷＭＨＷＶＫＱＲＰＧＱＧＬＥＷＩＧＭＩＤＰＳＤＳＥＴＲＬＮＱＲＦＫＤＫＡＴＬＴＶＤＲＳＳＳＴＡＹＭＱＬＳＳＰＴＳＥＤＳＡＶＹＹＣＡＲＳＬＬＲＧＶＹＡＭＤＹＷＧＱＧＴＳＶＴＶＳＳ
配列番号８－
ＳＩＶＭＴＱＴＰＫＦＬＬＶＳＡＧＤＲＶＴＩＴＣＫＡＳＱＳＶＳＮＤＶＡＷＹＱＱＫＰＧＱＳＰＫＬＬＩＹＹＡＳＮＲＹＴＧＶＰＤＲＦＴＧＳＧＹＧＴＤＦＴＦＴＩＳＴＶＱＡＥＤＬＡＶＹＦＣＱＱＤＹＳＳＰＹＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫ
いくつかの実施形態では、一次抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号１７を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる重鎖可変領域（ＶＨ）アミノ酸配列、及び、配列番号１８を含むか、それらから本質的になるか、またはそれらからなる軽鎖可変領域（ＶＬ）アミノ酸配列を含む。ＶＨアミノ酸配列が配列番号１７から本質的になり、ＶＬアミノ酸配列が配列番号１８から本質的になる場合、追加の構成要素が、抗体またはその抗原結合フラグメント（例えば、精製または単離を容易にするビオチンまたはＨｉｓタグなどのタンパク質部分）に実質的に影響を及ぼさない重鎖または軽鎖可変領域に含まれ得る。ＶＨアミノ酸配列が配列番号１７からなり、ＶＬアミノ酸配列が配列番号１８からなる場合、重鎖及び軽鎖可変領域は、任意の追加の構成要素（例えば、重鎖または軽鎖の可変領域に内因性でない構成要素）を含まない。
他の実施形態では、一次抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号１７と少なくとも７０％同一である重鎖可変領域アミノ酸配列及び配列番号１８と少なくとも７０％である軽鎖可変領域アミノ酸配列、を含んでもよい。
配列番号１７－ＱＶＱＬＱＱＳＧＰＱＬＶＲＰＧＡＳＶＫＩＳＣＫＡＳＧＹＳＦＴＳＹＷＭＨＷＶＫＱＲＰＧＱＧＬＥＷＩＧＭＩＤＰＳＤＳＥＴＲＬＮＱＲＦＫＤＫＡＴＬＴＶＤＲＳＳＳＴＡＹＭＱＬＳＳＰＴＳＥＤＳＡＶＹＹＣＡＲＳＬＬＲＧＶＹＡＭＤＹＷＧＱＧＴＳＶＴＶＳＳＡＫＴＴＰＰＳＶＹＰＬＡＰＧＳＡＡＱＴＮＳＭＶＴＬＧＣＬＶＫＧＹＦＰＥＰＶＴＶＴＷＮＳＧＳＬＳＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＤＬＹＴＬＳＳＳＶＴＶＰＳＳＴＷＰＳＥＴＶＴＣＮＶＡＨＰＡＳＳＴＫＶＤＫＫＩＶＰＲＤＣ
配列番号１８－
ＳＩＶＭＴＱＴＰＫＦＬＬＶＳＡＧＤＲＶＴＩＴＣＫＡＳＱＳＶＳＮＤＶＡＷＹＱＱＫＰＧＱＳＰＫＬＬＩＹＹＡＳＮＲＹＴＧＶＰＤＲＦＴＧＳＧＹＧＴＤＦＴＦＴＩＳＴＶＱＡＥＤＬＡＶＹＦＣＱＱＤＹＳＳＰＹＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫＲＡＤＡＡＰＴＶＳＩＦＰＰＳＳＥＱＬＴＳＧＧＡＳＶＶＣＦＬＮＮＦＹＰＫＤＩＮＶＫＷＫＩＤＧＳＥＲＱＮＧＶＬＮＳＷＴＤＱＤＳＫＤＳＴＹＳＭＳＳＴＬＴＬＴＫＤＥＹＥＲＨＮＳＹＴＣＥＡＴＨＫＴＳＴＳＰＩＶＫＳＦＮＲＮＥＳ
二次抗体またはその抗原結合フラグメント抗体は、（ｉ）配列番号９と少なくとも７０％（例えば、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％）同一であるＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号１０と少なくとも７０％同一であるＣＤＲ２アミノ酸配列、及び配列番号１１と少なくとも７０％同一であるＣＤＲ３アミノ酸配列を含む重鎖可変領域、ならびに、（ｉｉ）、配列番号１２と少なくとも７０％同一であるＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号１３と少なくとも７０％同一であるＣＤＲ２アミノ酸配列、及び配列番号１４と少なくとも７０％同一であるＣＤＲ３アミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、を含む。
あるいは、二次抗体またはその抗原結合フラグメントは、それぞれ、配列番号９、配列番号１０、及び／または配列番号１１と少なくとも９０％同一である重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３アミノ酸配列、及び／または、それぞれ、配列番号１２、配列番号１３、及び／または配列番号１４と少なくとも９０％同一である軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３アミノ酸配列、を含んでもよい。
一実施形態では、（ｉ）重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及び／またはＣＤＲ３アミノ酸配列のそれぞれは、それぞれ、配列番号９、配列番号１０、及び／または配列番号１１を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなり、（ｉｉ）軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及び／またはＣＤＲ３アミノ酸配列のそれぞれは、それぞれ、配列番号１２、配列番号１３、及び／または配列番号１４を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる。開示された抗体の重鎖及び／または軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３が、上記のアミノ酸配列から本質的になる場合、追加の構成要素は、抗体またはその抗原結合フラグメント（例えば、精製または単離を容易にするビオチンなどのタンパク質部分）に実質的に影響を及ぼさないＣＤＲに含まれ得る。開示された抗体の重鎖及び／または軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３が上記のアミノ酸配列からなる場合、各ＣＤＲは、任意の追加の構成要素（例えば、ＣＤＲに対して内因性でない構成要素）を含まない。
配列番号９－ＳＹＡＩＳ
配列番号１０－ＧＩＩＰＩＦＧＴＡＮＹＡＱＫＦＱＧ
配列番号１１－ＧＹＷＧＳＧＹＨＹＹＧＭＤＶ
配列番号１２－ＧＧＮＮＩＧＳＫＳＶＨ
配列番号１３－ＹＤＳＤＲＰＳ
配列番号１４－ＱＶＷＤＲＳＳＤＬＶＶ
いくつかの実施形態では、二次抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号１５を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる重鎖可変領域（ＶＨ）アミノ酸配列、及び、配列番号１６を含むか、それらから本質的になるか、またはそれらからなる軽鎖可変領域（ＶＬ）アミノ酸配列を含む。ＶＨアミノ酸配列が配列番号１５から本質的になり、ＶＬアミノ酸配列が配列番号１６から本質的になる場合、追加の構成要素が、抗体またはその抗原結合フラグメント（例えば、精製または単離を容易にするビオチンまたはＨｉｓタグなどのタンパク質部分）に実質的に影響を及ぼさない鎖または軽鎖可変領域に含まれ得る。ＶＨアミノ酸配列が配列番号１５からなり、ＶＬアミノ酸配列が配列番号１６からなる場合、重鎖及び軽鎖可変領域は、任意の追加の構成要素（例えば、重鎖または軽鎖の可変領域に内因性でない構成要素）を含まない。
他の実施形態では、二次抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号１５と少なくとも７０％同一である重鎖可変領域アミノ酸配列、及び配列番号１６と少なくとも７０％である軽鎖可変領域アミノ酸配列を含んでもよい。
配列番号１５－ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＧＴＦＳＳＹＡＩＳＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＧＩＩＰＩＦＧＴＡＮＹＡＱＫＦＱＧＲＶＴＩＴＡＤＥＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＧＹＷＧＳＧＹＨＹＹＧＭＤＶＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＣ
配列番号１６－ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＳＶＡＰＧＫＴＡＲＩＰＣＧＧＮＮＩＧＳＫＳＶＨＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＶＬＶＩＹＹＤＳＤＲＰＳＧＩＰＥＲＦＳＧＳＮＳＧＮＴＡＴＬＴＩＳＲＶＥＡＧＤＥＡＤＹＹＣＱＶＷＤＲＳＳＤＬＶＶＦＧＧＧＴＫＬＴＶＬＧＱＰＫＡＡＰＳＶＴＬＦＰＰＳＳＥＥＬＱＡＮＫＡＴＬＶＣＬＩＳＤＦＹＰＧＡＶＴＶＡＷＫＡＤＳＳＰＶＫＡＧＶＥＴＴＴＰＳＫＱＳＮＮＫＹＡＡＳＳＹＬＳＬＴＰＥＱＷＫＳＨＲＳＹＳＣＱＶＴＨＥＧＳＴＶＥＫＴＶＡＰＴＥＳＳ
本明細書に記載の核酸またはアミノ酸配列「同一性」は、目的の核酸またはアミノ酸配列を、参照核酸またはアミノ酸配列と比較することにより決定することができる。パーセント同一性は、最長配列の長さ（例えば、目的の配列または参照配列のいずれかの長さの、いずれか長い方）で除した、目的の配列及び参照配列間で同じである（例えば、同一である）ヌクレオチドまたはアミノ酸残基の数である。最適なアラインメントを取得し、２つ以上の配列間の同一性を計算するための多数の数学的アルゴリズムが既知であり、多数の利用可能なソフトウェアプログラムに組み込まれる。そのようなプログラムの例としては、ＣＬＵＳＴＡＬ－Ｗ、Ｔ－Ｃｏｆｆｅｅ、及びＡＬＩＧＮ（核酸及びアミノ酸配列のアラインメント用）、ＢＬＡＳＴプログラム（例えば、ＢＬＡＳＴ２．１、ＢＬ２ＳＥＱ、及びそれらの後のバージョン）、ならびにＦＡＳＴＡプログラム（例えば、ＦＡＳＴＡ３ｘ、ＦＡＳ（商標）、及びＳＳＥＡＲＣＨ）（配列アラインメント及び配列類似検索用）が挙げられる。配列アラインメントアルゴリズムはまた、例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌ．，２１５（３）：４０３－４１０（１９９０）、Ｂｅｉｇｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１０６（１０）：３７７０－３７７５（２００９）、Ｄｕｒｂｉｎ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ｐｒｏｂａｂｉｌｉｓｔｉｃ Ｍｏｄｅｌｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｎｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ（２００９），Ｓｏｄｉｎｇ，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，２１（７）：９５１－９６０（２００５）、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２５（１７）：３３８９－３４０２（１９９７）、及びＧｕｓｆｉｅｌｄ，Ａｌｇｏｒｉｔｈｍｓ ｏｎ Ｓｔｒｉｎｇｓ，Ｔｒｅｅｓ ａｎｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ ＵＫ（１９９７）に開示される。
上述の抗体またはその抗原フラグメントの１つ以上のアミノ酸を、異なるアミノ酸で置換（ｒｅｐｌａｃｅｄ）または置換（ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｄ）することができる。アミノ酸の「置換（ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ）」または「置換（ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）」は、ポリペプチド配列内の同じ位置または残基の別のアミノ酸で、所与の位置または残基の１個のアミノ酸を置換することを指す。
加えて、１個以上のアミノ酸を、抗体またはその抗原結合フラグメントに挿入することができる（例えば、重鎖及び／または軽鎖可変領域アミノ酸配列への挿入）。任意数の任意の好適なアミノ酸を、抗体またはその抗原結合フラグメントのアミノ酸配列に挿入することができる。この点において、少なくとも１個のアミノ酸（例えば、２個以上、５個以上、または１０個以上のアミノ酸）であるが、多くとも２０個のアミノ酸（例えば、１８個以下、１５個以下、または１２個以下のアミノ酸）を、抗体またはその抗原結合フラグメントのアミノ酸配列に挿入することができる。例えば、１～１０個のアミノ酸（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個のアミノ酸）は、抗体または抗原結合フラグメントのアミノ酸配列に挿入され得る。この点において、アミノ酸（複数可）を、抗体またはその抗原結合フラグメントの任意の好適な位置に挿入することができる。好ましくは、アミノ酸（複数可）は、抗体またはその抗原結合フラグメントのＣＤＲ（例えば、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、またはＣＤＲ３）に挿入される。
本発明の方法で使用される抗体またはその抗原結合フラグメントは、本明細書に記載の特定のアミノ酸配列を含むポリペプチドに限定されない。実に、抗体またはその抗原結合フラグメントは、テノホビルまたはテノホビル誘導体への結合について本発明の抗体またはその抗原結合フラグメントと競合する任意の重鎖ポリペプチドまたは軽鎖ポリペプチドを含み得る。抗体競合は、例えば、ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロット、または免疫組織化学法などの通常のペプチド競合アッセイを使用してアッセイすることができる（例えば、以下を参照：Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔｓ ４，８２８，９８１ ａｎｄ ８，５６８，９９２；及びＢｒａｉｔｂａｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｓｃｉ．，４：１２（２００６））。
抗体は、当該技術分野で既知の多数の手法のいずれかで産生され得る。例えば、重鎖及び軽鎖をコードする発現ベクター（複数可）が標準的な手法で宿主細胞にトランスフェクトされる、宿主細胞からの発現。「トランスフェクション」という用語の様々な形態は、内因性ＤＮＡを原核または真核宿主細胞に導入するために一般に使用される多種多様な手法、例えば、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿、ＤＥＡＥ－デキストラントランスフェクションなど、を包含することが意図される。原核宿主細胞または真核宿主細胞のいずれにおいても抗体を発現させることが可能であるが、真核細胞における抗体の発現が、好ましく、哺乳動物宿主細胞における抗体の発現が、最も好ましい。その理由は、そのような真核細胞（特に、哺乳動物細胞）が、原核細胞よりも、適切に折りたたまれ、免疫学的に活性な抗体を組み立てて分泌する可能性が高いからである。
組み換え抗体を発現するための例示的な哺乳動物宿主細胞としては、チャイニーズハムスター（ＣＨＯ細胞）（例えば、Ｋａｕｆｍａｎ ａｎｄ Ｓｈａｒｐ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１５９：６０１－６２１（１９８２）に記載のＤＨＦＲ選択マーカーと共に使用されるｄｈｆｒ－ＣＨＯ細胞（Ｕｒｌａｕｂ ａｎｄ Ｃｈａｓｉｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７：４２１６－４２２０（１９８０）に記載）、ＮＳ０骨髄腫細胞、ＣＯＳ細胞、及びＳＰ２細胞を含む）が挙げられる。抗体遺伝子をコードする組み換え発現ベクターが哺乳動物宿主細胞に導入される場合、抗体は、宿主細胞における抗体の発現、または、より好ましくは、宿主細胞が成長する培地への抗体の分泌、を可能にするのに十分な時間、宿主細胞を培養することにより産生される。抗体は、標準的なタンパク質精製法を使用して培地から回収することができる。いくつかの態様では、抗体は、当該技術分野で既知の通常の手法を使用して、ＣＨＯ及び／またはＨＥＫ細胞で精製することができる。
ＦａｂフラグメントまたはｓｃＦｖ分子などの機能的な抗体フラグメントを生成するために、宿主細胞を使用することもできる。上記の手順の変形形態が実行され得ることが理解されるであろう。例えば、抗体の軽鎖及び／または重鎖のいずれかの機能的フラグメントをコードするＤＮＡで宿主細胞をトランスフェクトすることが望ましいことがある。組み換えＤＮＡ技術はまた、目的の抗原への結合に必要でない軽鎖及び重鎖のいずれかまたは両方をコードするＤＮＡの一部または全部を除去するために使用され得る。そのような切断されたＤＮＡ分子から発現される分子も抗体に包含される。
抗体またはその抗原結合部分の組み換え発現のための好ましいシステムでは、抗体重鎖及び抗体軽鎖の両方をコードする組み換え発現ベクターが、リン酸カルシウム媒介性トランスフェクションでｄｈｆｒ－ＣＨＯ細胞に導入される。組み換え発現ベクター内で、抗体の重鎖及び軽鎖遺伝子は、それぞれ、高レベルの遺伝子の転写を駆動するように、ＣＭＶエンハンサー／ＡｄＭＬＰプロモーター調節エレメントに作動可能に結合している。組み換え発現ベクターは、メトトレキサート選択／増幅を使用して、ベクターでトランスフェクトされているＣＨＯ細胞の選択を可能にするＤＨＦＲ遺伝子も担持する。抗体の重鎖及び軽鎖の発現を可能にするために、選択された形質転換体宿主細胞が培養され、インタクト抗体が培地から回収される。組み換え発現ベクターを調製し、宿主細胞にトランスフェクトし、形質転換体を選択し、宿主細胞を培養し、及び培地から抗体を回収するために、標準的な分子生物学的手法が使用される。さらに、本開示は、組み換え抗体が合成されるまで、好適な培地中で宿主細胞を培養することにより、組み換え抗体を合成する方法を提供する。この方法は、さらに、培地から組み換え抗体を単離することを含み得る。
ヒト化抗体は、目的の抗原に特異的に結合し、ヒト抗体のアミノ酸配列を実質的に有するフレームワーク（ＦＲ）領域と、非ヒト抗体のアミノ酸配列を実質的に有する相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む、抗体もしくはバリアント、誘導体、アナログ、またはそのフラグメントもしくは部分であってよい。ヒト化抗体は、非ヒト種由来の１つ以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）と、ヒト免疫グロブリン分子由来のフレームワーク領域を有する所望の抗原に結合する非ヒト種抗体由来であり得る。
本明細書で使用される場合、ＣＤＲの文脈における「実質的に」という用語は、非ヒト抗体ＣＤＲのアミノ酸配列と、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一のアミノ酸配列を有するＣＤＲを指す。ヒト化抗体は、少なくとも１つ、通常は、２つの可変ドメイン（Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ＦａｂＣ、Ｆｖ）を実質的に全て含み、ＣＤＲ領域の全てまたは実質的に全てが、非ヒト免疫グロブリン（例えば、ドナー抗体）のものに対応し、フレームワーク領域の全てまたは実質的に全てが、ヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のものである。一態様によると、ヒト化抗体は、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部、通常は、ヒト免疫グロブリンのものも含む。いくつかの実施形態では、ヒト化抗体は、軽鎖と、少なくとも重鎖の可変ドメインの両方を含有する。抗体は、重鎖のＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３、及びＣＨ４領域も含んでもよい。いくつかの実施形態では、ヒト化抗体は、ヒト化軽鎖のみを含有する。いくつかの実施形態では、ヒト化抗体は、ヒト化重鎖のみを含有する。特定の実施形態では、ヒト化抗体は、軽鎖及び／または重鎖のヒト化可変ドメインのみを含有する。
ヒト化抗体は、ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、及びＩｇＥを含む免疫グロブリンの任意のクラス、ならびに、限定されないが、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４を含む任意のアイソタイプから選択することができる。ヒト化抗体は、複数のクラスまたはアイソタイプ由来の配列を含んでもよく、特定の定常ドメインは、当該技術分野で周知の手法を使用して所望のエフェクター機能を最適化するように選択され得る。
ヒト化抗体のフレームワーク（ＦＲ）及びＣＤＲ領域は、親配列に正確に対応する必要はない。例えば、ドナー抗体ＣＤＲまたはコンセンサスフレームワークは、その部位のＣＤＲまたはフレームワーク残基がドナー抗体またはコンセンサスフレームワークのいずれにも対応しないように、少なくとも１個のアミノ酸残基の置換、挿入、及び／または欠失で変異導入され得る。しかし、一実施形態では、そのような変異は、広範にわたるものではないであろう。通常、ヒト化抗体残基の少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％が、親ＦＲ及びＣＤＲ配列のものに対応するであろう。本明細書で使用される場合、「コンセンサスフレームワーク」という用語は、コンセンサス免疫グロブリン配列中のフレームワーク領域を指す。本明細書で使用される場合、「コンセンサス免疫グロブリン配列」という用語は、関連する免疫グロブリン配列のファミリー内で最も頻繁に出現するアミノ酸（またはヌクレオチド）から形成される配列を指す（例えば、以下を参照：Ｗｉｎｎａｋｅｒ，Ｆｒｏｍ Ｇｅｎｅｓ ｔｏ Ｃｌｏｎｅｓ（Ｖｅｒｌａｇｓｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ，Ｗｅｉｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ １９８７））。免疫グロブリンのファミリーでは、コンセンサス配列の各位置は、ファミリー内のその位置で最も頻繁に出現するアミノ酸で占められている。２個のアミノ酸が同じ頻度で出現する場合、いずれもコンセンサス配列に含まれ得る。
ヒト化抗体は、齧歯動物の抗ヒト抗体に対する望ましくない免疫応答を最小限にするように設計され得、これにより、ヒトレシピエントにおける、それらの部分の治療用途の期間及び有効性が制限される。ヒト化抗体は、非ヒトである供給源から、それに導入された１個以上のアミノ酸残基を有してもよい。これらの非ヒト残基は、多くの場合、「移入」残基と呼ばれ、通常は、可変ドメインから取得される。ヒト化は、ヒト抗体の対応する配列を超可変領域配列で置換することにより実施され得る。従って、そのような「ヒト化」抗体は、インタクトヒト可変ドメインよりも実質的に少なく、非ヒト種由来の対応する配列で置換されているキメラ抗体である。例えば、以下を参照：米国特許第４，８１６，５６７号（この内容が参照により本明細書に組み込まれる）。ヒト化抗体は、いくつかの超可変領域残基、及び、場合により、いくつかのＦＲ残基が、齧歯動物抗体の類似部位由来の残基で置換されているヒト抗体であってよい。本開示の抗体のヒト化または改変は、限定されないが、米国特許第５，７２３，３２３号；同第５，９７６，８６２号；同第５，８２４，５１４号；同第５，８１７，４８３号；同第５，８１４，４７６号；同第５，７６３，１９２号；同第５，７２３，３２３号；同第５，７６６，８８６号；同第５，７１４，３５２号；同第６，２０４，０２３号；同第６，１８０，３７０号；同第５，６９３，７６２号；同第５，５３０，１０１号；同第５，５８５，０８９号；同第５，２２５，５３９号；及び同第４，８１６，５６７号に記載されるものなどの任意の既知の方法を使用して実施することができる。
ヒト化抗体は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原に対する高い親和性及び他の好ましい生物学的特性を保持し得る。ヒト化抗体は、親及びヒト化配列の３次元モデルを使用して、親配列及び様々な概念上のヒト化産物の分析プロセスで調製され得る。免疫グロブリンの３次元モデルは、一般に、入手可能である。選択された候補免疫グロブリン配列のありそうな３次元コンフォメーション構造を図示し表示するコンピュータプログラムが利用可能である。これらのディスプレイの調査により、候補免疫グロブリン配列の機能における残基の可能な役割の分析、例えば、候補免疫グロブリンがその抗原に結合する能力に影響する残基の分析、が可能になる。このように、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する親和性の増加など、所望の抗体特性が達成されるように、フレームワーク残基を、レシピエント及び移入配列から選択して組み合わせることができる。一般に、超可変領域残基は、抗原結合への影響に直接且つ最も実質的に関与し得る。
ヒト化の代替として、ヒト抗体（本明細書では「完全ヒト抗体」とも呼ばれる）を生成することができる。例えば、ＰＲＯｆｕｓｉｏｎ及び／または酵母関連技術を介して、ライブラリーからヒト抗体を単離することが可能である。トランスジェニック動物（例えば、免疫化の際、内因性免疫グロブリン産生の非存在下でヒト抗体の完全なレパートリーを産生することが可能なマウス）を生成することも可能である。例えば、キメラマウス及び生殖系列変異マウスにおける抗体重鎖結合領域（ＪＨ）遺伝子のホモ接合型欠失は、内因性抗体産生の完全な阻害をもたらす。そのような生殖系列変異マウスへのヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子アレイの移入は、抗原チャレンジ時にヒト抗体の産生をもたらすであろう。ヒト化抗体または完全ヒト抗体は、米国特許第５，７７０，４２９号；同第５，８３３，９８５号；同第５，８３７，２４３号；同第５，９２２，８４５号；同第６，０１７，５１７号；同第６，０９６，３１１号；同第６，１１１，１６６号；同第６，２７０，７６５号；同第６，３０３，７５５号；同第６，３６５，１１６号；同第６，４１０，６９０号；同第６，６８２，９２８号；及び同第６，９８４，７２０号（これらの内容は、それぞれ、参照により本明細書に組み込まれる）に記載の方法に従って調製され得る。
２．方法
開示された方法は、本明細書に記載されるように、試料中に存在する場合、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス由来のタンパク質またはそのフラグメントもしくはエピトープを、一次抗体またはその抗原結合フラグメントに結合させて、第１の複合体を形成させることが可能な条件下で、対象から得られた試料を、検出可能な標識を含み、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス由来のタンパク質またはそのフラグメントもしくはエピトープに特異的に結合する一次抗体またはその抗原結合フラグメントと接触させることを含む。いくつかの実施形態では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス由来のタンパク質は、ウイルスゲノムパッケージングタンパク質（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ０ＤＴＣ９で提供される、例えば、ヌクレオキャプシド（Ｎ）タンパク質）である。
試料は、一次抗体またはその抗体結合フラグメントと接触する前に、１つ以上の処理ステップを受け得る。いくつかの実施形態では、そのような処理ステップには、採取場所から検査場所への試料の保管または輸送を容易にする１つ以上の防腐剤または安定剤の添加が含まれる。いくつかの実施形態では、そのような処理ステップには、目的の分析物について試料を濃縮するために、試料から１つ以上の構成成分を除去する精製ステップ（例えば、フィルター、遠心分離などを使用）が含まれる。
一次抗体またはその抗原結合フラグメントは、当該技術分野で既知の任意の好適な方法を使用して試料と接触させ得る。本明細書で使用される「接触させること」という用語は、抗体に、特異的な目的の分析物が試料に存在する場合に結合相互作用が生じるように、抗体、特に、固体支持体上に固定された抗体を、試料中の目的の分析物（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス由来のタンパク質）と十分に極めて近づける、組み合わせ処理のいずれかのタイプを指す。接触は、抗体またはその抗原結合フラグメントと、試料を直接組み合わせること、または、試料に極めて接近した固体支持体を導入することにより、抗体またはその抗原結合フラグメントを含む固体支持体に試料を曝露することを含む、様々な異なる方法で達成され得る。接触は、結合相互作用が生じるように、必要な回数または必要な時間繰り返され得る。
本明細書に記載の方法は、望ましくは、イムノアッセイを使用して実施される。本明細書で使用される「イムノアッセイ」という用語は、抗体または抗原を使用して溶液中の巨大分子または小分子の存在または濃度を測定する生化学的検査を指す。任意の好適なイムノアッセイが使用され得、多種多様なイムノアッセイのタイプ、構成、及び形式が当該技術分野で既知であり、本開示の範囲内である。イムノアッセイの好適なタイプには、酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ラテラルフローアッセイ、競合阻害イムノアッセイ（例えば、フォワード及びリバース）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、フルオロイムノアッセイ（ＦＩＡ）、化学発光イムノアッセイ（ＣＬＩＡ）、カウンティングイムノアッセイ（ＣＩＡ）、酵素増幅イムノアッセイ手法（ＥＭＩＴ）、ワンステップ抗体検出アッセイ、ホモジニアスアッセイ、ヘテロジニアスアッセイ、キャプチャーオンザフライアッセイ、単一分子検出アッセイなどが挙げられるが、これらに限定されない。そのような方法は、例えば、米国特許第６，１４３，５７６号；同第６，１１３，８５５号；同第６，０１９，９４４号；同第５，９８５，５７９号；同第５，９４７，１２４号；同第５，９３９，２７２号；同第５，９２２，６１５号；同第５，８８５，５２７号；同第５，８５１，７７６号；同第５，８２４，７９９号；同第５，６７９，５２６号；同第５，５２５，５２４号；同第５，４８０，７９２号；同第１１，０２２，５９８号、国際特許出願公開ＷＯ２０１６／１６１４００；及びＡｄａｍｃｚｙｋ ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ，５７９（１）：６１－６７（２００６）に記載されている。
イムノアッセイの形式は、「直接」または「間接」「サンドイッチ」であってよい。サンドイッチ形式は、試料中の抗原を固定化及び検出するための、捕捉抗原及び検出抗原の使用を含む。具体的には、固体支持体（例えば、ＥＬＩＳＡプレート、ビーズなど）の表面は、捕捉抗体またはその抗原結合フラグメントでコーティングされ、捕捉抗体は、それに適用された試料中に存在する標的抗原に結合して固定化する。次に、検出抗体が、複合体に添加されるか、または接触する。検出抗体は、抗原の検出及び定量化を可能にするために、抗体で直接標識することができる（「直接サンドイッチイムノアッセイ」）。あるいは、検出抗体が標識されていない場合、二次酵素コンジュゲート検出抗体が使用されてもよい（「間接サンドイッチアッセイ」）。
従って、開示された方法は、さらに、二次抗体を含むコンジュゲートと、試料を接触させることを含んでもよく、二次抗体またはその抗原結合フラグメント、コンジュゲートの一部は、標的抗原（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来のタンパク質またはそのフラグメントもしくはエピトープ）に特異的に結合し、これにより、コンジュゲートの補足された分析物への結合及び免疫サンドイッチ（本明細書では「免疫サンドイッチ複合体」とも呼ばれる）の形成がもたらされる。サンドイッチイムノアッセイ形式では、一次抗体及び二次抗体が、標的分析物／抗原上の２つの異なる重複しないエピトープを認識することが理解されるであろう。
特定の実施形態では、一次抗体またはその抗原結合フラグメントは、固体支持体に結合または固定され得る。「固相」及び「固体支持体」という用語は、本明細書では互換的に使用され、１つ以上の抗体を結合及び／または誘引及び固定するために使用することができる任意の材料を指す。当該技術分野で既知の任意の固体支持体を、本明細書に記載の方法で使用することができる。好適な固体支持体の例としては、電極、試験管、ビーズ、微粒子、ナノ粒子、マイクロウェルまたはマルチウェルプレートのウェル、ゲル、コロイド、生物細胞、シート、ストリップ、及びチップが挙げられる。
一実施形態では、固体支持体は、望ましくは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス由来のタンパク質またはそのフラグメントもしくはエピトープに結合する、その表面に固定された複数（例えば、２以上、５０以上、１００以上、１，０００以上、または５，０００以上）の抗体またはその抗原結合フラグメントを含む。本明細書で使用される「固定された」という用語は、固体支持体の表面との結合メンバーの安定した会合を指す。本明細書で検討されるように、固体支持体及び試料間の十分なインキュベーション時間の後、試料中に存在する場合、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス由来のタンパク質またはそのフラグメントもしくはエピトープが、望ましくは、固定された抗体により固体支持体の表面上で捕捉される。
抗体または抗体フラグメントは、結合を介して固体支持体に結合され得、これは、支持体及び／または支持体への抗体の結合を容易にする抗体の任意の部分、機能化、または改変を含んでもよい。抗体及び支持体間の結合には、１つ以上の化学的または物理的結合（例えば、ファンデルワールス力、水素結合、静電相互作用、疎水性／親水性相互作用などによる非特異的結合）及び／またはそのような結合（複数可）を提供する化学的スペーサーが含まれ得る。抗体を多種多様な固体支持体に結合させるために、多くの手法が使用され得る（例えば、以下を参照：米国特許第５，６２０，８５０号；及びＨｅｌｌｅｒ，Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．，２３：１２８（１９９０））。
いくつかの実施形態では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス由来のタンパク質またはそのフラグメントもしくはエピトープと、一次抗体もしくは二次抗体または抗体フラグメントとの間の結合親和性は、非特異的に結合した分子または粒子を除去する洗浄ステップを含むアッセイの条件下で結合を維持するのに十分でなければならない。接触は、望ましくは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス由来のタンパク質またはそのフラグメントもしくはエピトープと、一次抗体もしくは二次抗体または抗体フラグメントとの間に結合相互作用を生じさせるのに十分な時間維持される（例えば、インキュベートされる）。加えて、インキュベーションは、例えば、アルブミン（例えば、ＢＳＡ）、非イオン性界面活性剤（Ｔｗｅｅｎ－２０、ＴｒｉｔｏｎＸ－１００）、及び／またはプロテアーゼ阻害剤（例えば、ＰＭＳＦ）などの特異的結合相互作用を促進する結合緩衝液中であってよい。一次抗体もしくは二次抗体または抗体フラグメントの結合親和性及び／または特異度は、結合緩衝液を変化させることによりアッセイで操作または変更されてもよい。
任意の未結合抗体、抗体フラグメント、またはコンジュゲートの構成要素は、例えば、液滴作動、電気泳動、エレクトロウェッティング、誘電泳動、静電作動、電場媒介、電極媒介、毛管力、クロマトグラフィー、遠心分離、吸引、または表面音響波（ＳＡＷ）ベースの洗浄方法などの任意の好適な手段で免疫サンドイッチから分離され得る。
方法は、さらに、二次抗体にコンジュゲートされた検出可能な標識からのシグナルの存在を評価することを含み、検出可能な標識からのシグナルの存在は、試料中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス由来のタンパク質またはそのフラグメントもしくはエピトープの存在を示す。
好適な検出可能な標識には、様々な酵素、補欠分子族、蛍光物質、発光物質、及び放射性物質が含まれる（例えば、以下を参照：Ｚｏｌａ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．（１９８７））。例えば、検出可能な標識は、放射性同位体（例えば、３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓ、もしくは１２５Ｉ）、蛍光もしくは化学発光化合物（例えば、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、もしくはルシフェリン）、または酵素（例えば、アルカリホスファターゼ、β－ガラクトシダーゼ、もしくは西洋ワサビペルオキシダーゼ）であり得る。抗体を検出可能な標識に別々にコンジュゲートするための当該技術分野で既知の任意の方法が、本開示の文脈で用いられ得る（例えば、以下を参照：Ｈｕｎｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，１４４：９４５（１９６２）；Ｄａｖｉｄ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１３：１０１４（１９７４）；Ｐａｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．，４０：２１９（１９８１）；及びＮｙｇｒｅｎ，Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．ａｎｄ Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．，３０：４０７（１９８２））。抗体に結合している検出可能な標識から生じるシグナルは、その分光特性に基づいて測定することができる。
上記の抗原捕捉及び免疫サンドイッチ形成方法の異なる立体配座は、本開示の範囲内であることが理解されるであろう。実に、上記の固体支持体、コンジュゲート、及び検出可能な標識の様々な構成要素は、任意の好適な組み合わせ、立体配座、または形式で配置または利用され得る。例えば、開示された方法は、試料を一次抗体、続いて、二次抗体とインキュベートするか、またはその逆でインキュベートする、一段階、遅延一段階、または二段階形式で実施され得る。アッセイ試薬（例えば、微粒子、コンジュゲート、フルオロフォアなど）は、必要に応じて、事前に混合するか、または順次添加され得る。
一実施形態では、ラテラルフローアッセイが使用される。ラテラルフローアッセイは、抗原抗体相互作用を使用して（例えば、イムノクロマトグラフィーを使用して）短時間で分析物を定性的に検出及び／または定量的に測定するための技術を提供する。これらの検査は、通常、アッセイ検査ストリップの形態のアッセイデバイス、またはアッセイストリップがプラスチックケース内に取り付けられたデバイスを使用する。例えば、以下を参照：国際特許出願公開第ＷＯ２０１１１０２５６３Ａ１号；米国特許第８，８２８，７３９号（これらのそれぞれは、参照により本明細書に組み込まれる）。
ラテラルフローアッセイは、一般に、ラテラルフロー検査ストリップ（例えば、ニトロセルロースまたは濾紙）、試料適用領域（例えば、試料パッド）、検査結果領域（例えば、検査ライン）、任意の対照結果領域（例えば、対照ライン）、及び検出可能な標識（例えば、着色粒子または酵素検出システム）に結合している分析物特異的結合試薬を含むデバイスで提供される。例えば、以下を参照：米国特許第６，４８５，９８２号；同第６，１８７，５９８号；同第５，６２２，８７１号；同第６，５６５，８０８号；同第６，８０９，６８７号；及び同第１０，７１７，０８２号（これらのそれぞれは、参照により本明細書に組み込まれる）。いくつかの実施形態では、技術は、特異的結合アッセイ、例えば、イムノアッセイ、を提供するための試薬含浸検査ストリップを含む検査デバイスに関する。
いくつかの実施形態では、本開示は、家庭、診療所、または病院での使用に適しており、最小限の技術及びユーザーの関与で迅速な分析結果を与えることが意図される、ラテラルフローデバイスに関する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のデバイスの使用は、観察可能な検査結果を提供するためにユーザーが一連の操作を実行する方法を含む。
いくつかの実施形態では、ラテラルフローデバイスは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス由来のタンパク質またはそのフラグメントに特異的に結合する一次抗体と、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス由来のタンパク質またはそのフラグメントに特異的に結合する二次抗体を含む。上で提供される抗体の説明は、本明細書に記載のラテラルフローデバイスに関連する。いくつかの実施形態では、デバイスの検査ラインは、一次抗体を含む。いくつかの実施形態では、試料パッドは、二次抗体を含む。
いくつかの実施形態では、試料は、検査ストリップの一部に適用され、水などの溶離溶媒及び／または好適な抽出緩衝液（例えば、任意に界面活性剤を含む）を通常用いて、ストリップ材料に透過させる。そうすることで、試料は、検査ストリップの検出ゾーン内に、またはそれを通過して進み、分析物（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス由来のタンパク質またはそのフラグメントもしくはエピトープ）（試料中に存在すると疑われる）に対する特異的結合試薬（例えば、抗体）が固定される。従って、試料中に存在する分析物は、検出ゾーン内で結合するようになる可能性がある。検査ストリップに組み込むか、またはその後、それに適用することもできる標識試薬を用いて、分析物がそのゾーン内で結合するようになる程度を決定することができる。
いくつかの実施形態では、分析検査デバイスは、液体検査試料を多孔質担体に適用することができるように、ケーシングの外側と直接的または間接的に連通する乾燥多孔質担体を含有する水分不透過性固体材料で構築された中空ケーシングを含む。いくつかの実施形態では、デバイスは、分析物に対する標識特異的結合試薬も含み、標識特異的結合試薬は、湿った状態の場合、多孔性担体内で自由に移動する。いくつかの実施形態では、デバイスは、同じ分析物に対する非標識特異的結合試薬を含み、非標識試薬は、担体材料上の検出ゾーンに永久に固定され、従って、湿った状態では移動しない。標識試薬及び検出ゾーンの相対的な配置は、デバイスに適用された液体試料が標識試薬を受け取り、その後、検出ゾーンに浸透し得、デバイスは、標識試薬が検出ゾーン内で観察されるようになる程度（存在する場合）を提供する。
いくつかの実施形態では、デバイスは、標識試薬を有する多孔性固相材料を第１のゾーンに含む。標識試薬は、多孔性材料が乾燥状態にある間第１のゾーンに保持されるが、例えば、分析物を含有すると疑われる水性液体試料を適用することにより多孔性材料を湿らせた場合、多孔性材料を通って自由に移動する。いくつかの実施形態では、多孔質材料は、第１のゾーンとは空間的に異なる第２のゾーンに、分析物に対する特異度を有する非標識特異的結合試薬を含み、これは、「サンドイッチ」または「競合」反応のいずれかで標識試薬と関与する可能性がある。非標識特異的結合試薬は、多孔性材料が湿った状態にある場合に自由に移動しないように、多孔性材料上にしっかりと固定される。
いくつかの実施形態では、分析物を含有すると疑われる水性液体試料と、本明細書に記載のデバイスを接触させ、その結果、試料が、毛細管現象により多孔性固相材料を通って第１のゾーンを介して第２のゾーンに浸透し、標識試薬は、第１のゾーンから第２のゾーンに、それと共に移動し、試料中の分析物の存在は、標識試薬が第２のゾーンで結合するようになる程度（存在する場合）を観察することにより決定される。
いくつかの実施形態では、標識試薬は、分析物に対する特異的結合パートナーである。標識試薬、分析物（存在する場合）、及び固定された非標識特異的結合試薬は、「サンドイッチ」反応で協働する。これにより、分析物が試料中に存在する場合、標識試薬が第２のゾーンに結合するようになる。サンドイッチ形式では、２つの結合試薬が、分析物の異なるエピトープに対して特異性を有する。いくつかの実施形態では、一次抗体は、固定される。いくつかの実施形態では、二次抗体は、検出可能な標識を含む。
いくつかの実施形態では、検査ストリップ（例えば、担体材料）は、ニトロセルロースを含む。これは、事前の感作を必要とせずに、タンパク質を結合する自然な能力を有するので、紙などの他のストリップ材料よりもかなりの利点を有する。免疫グロブリンなどの特異的結合試薬は、ニトロセルロースに直接適用して固定することができる。試薬の本質的な特異的結合活性を妨げ得る化学処理は必要ない。その後、ニトロセルロース上の未使用の結合部位を、ポリビニルアルコールなどの単純な材料を使用してブロックすることができる。さらに、ニトロセルロースは、幅広い細孔サイズで容易に入手でき、これにより、試料流量などの特定の要件に適合する担体材料の選択が容易になる。
いくつかの実施形態では、多孔性固相材料は、多孔性受容部材に結合しており、そこへ、液体試料を適用することができ、そこから、試料が、多孔性固相材料に浸透し得る。いくつかの実施形態では、多孔性固相材料は、水分不透過性ケーシングまたはハウジング内に収容され、多孔性固相材料が結合している多孔性受容部材は、ハウジングの外に延び、液体試料がハウジングに入り、多孔性固相材料に浸透することを許容する手段として機能し得る。手段、例えば、適切に配置された窓、を有するハウジングが提供されるべきであり、この窓により、多孔性固相材料（固定された非標識特異的結合試薬を担持する）の第２のゾーンが、アッセイの結果を観察することができるように、ハウジングの外側から観察可能になる。必要に応じて、さらなる手段を有するハウジングも提供され得る。これは、多孔性固相材料の別のゾーンを、ハウジングの外側から観察可能にし、別のゾーン１が対照試薬を取り込み、これにより、アッセイ手順が完了したかどうかを表示が通知することを可能にする。いくつかの実施形態では、ハウジングは、使用前の保管中に、突出した多孔性受容部材を保護し得る取り外し可能なキャップまたはシュラウドと共に提供される。必要に応じて、試料適用後に突出している多孔性受容部材の上のキャップまたはシュラウドを交換することができるが、アッセイ手順を実施しており、任意に、標識試薬を、デバイス内のいずれかに、例えば、吸水性試料収集部材に取り込むことができるが、これは、好ましくない。
いくつかの実施形態では、デバイスは、病院、診療所、または家庭での使用に適したキットとして提供される。いくつかの実施形態では、キットは、湿気不透過性包装で個別に包装され、ユーザーへの適切な説明書と共にパッケージ化された複数（例えば、２つ）のデバイスを含む。
いくつかの実施形態では、デバイスは、任意の「対照ゾーン」を含む。存在する場合、「対照」ゾーンは、デバイスが機能しているという無関係なシグナルをユーザーに通知するように設計することができる。試料が検査ストリップに浸透していることを確認するために、例えば、第１のゾーンからの標識抗体、例えば、標識ウサギＩｇＧに結合することになる対照ゾーンに、抗体（例えば、ヤギ抗ウサギＩｇＧ）を搭載することができる。いくつかの実施形態では、第１のゾーンは、分析物とは無関係であり、対照ゾーンで特異的に捕捉される抗原及び／または抗体を含む。いくつかの実施形態では、対照ゾーンは、湿らせた場合、変色または発色を生じる無水試薬、例えば、無水硫酸銅を含有し得る。これは、水性試料で湿らせた場合、青色に変化するであろう。さらなる代替として、対照ゾーンは、第１のゾーンからの過剰の標識試薬と反応する固定された分析物を含有し得る。対照ゾーンの目的は、検査が完了していることをユーザーに示すことであるので、対照ゾーンは、目的の検査結果が記録される第２のゾーンの下流に位置しなければならない。従って、陽性対照指標は、試料が検査デバイスを介して必要な距離に浸透していることをユーザーに示す。
理想的には、アッセイの結果は、目で識別できる必要があり、これを容易にするために、直接標識が検出ゾーンに集中するようになる必要がある。いくつかの実施形態では、検出可能な標識は、直接標識、例えば、その自然状態で、肉眼で、または光学フィルター及び／または適用された刺激、例えば、蛍光を促進するＵＶ光、を用いて容易に見えるエンティティである。例えば、着色微粒子、例えば、染料ゾル、金属ゾル（例えば、金）、及び着色ラテックス粒子が非常に適している。小さなゾーンまたは体積（例えば、検査ライン）内の標識の濃縮は、容易に検出可能なシグナル、例えば、強く着色された領域、を生じさせる。目測で、または、必要に応じて、機器で、これを評価することができる。
いくつかの実施形態では、技術は、間接標識の使用を含む。間接標識、例えば、酵素、例えば、アルカリホスファターゼ及び西洋ワサビペルオキシダーゼを使用することができるが、これらは、通常、可視シグナルが検出され得る前に、基質などの１つ以上の展開試薬を追加する必要がある。それらが水性液体試料に溶解または分散するように、多孔性固相材料または、存在する場合は、試料受容部材に、組み込むことができる。あるいは、多孔性材料と接触する前に、展開試薬を試料に添加することができるか、または、結合反応が起こった後に、多孔性材料を展開試薬に曝露することができる。
いくつかの実施形態では、試料の流れは、検出ゾーンを超えて続き、十分な試料が多孔性材料に適用され、その結果、これが生じ得、第２のゾーンで、いかなる結合反応にも関与しない第１のゾーンからの任意の過剰な標識試薬が、この継続的な流れにより検出ゾーンから洗い流される。必要に応じて、担体材料の遠位端に吸収性「シンク」を備えることができる。吸収性シンクは、例えば、Ｗｈａｔｍａｎ ３ＭＭクロマトグラフィー紙から構成されてもよく、いかなる未結合コンジュゲートも検出ゾーンから洗い流すことを可能にする十分な吸収能力を提供するべきである。そのようなシンクの代替として、検出ゾーンを越えて延びる、ある長さの多孔性固相材料を有することで十分であり得る。
いくつかの実施形態では、担体材料は、試薬が空間的に別個のゾーンに適用されるストリップまたはシートの形態であり、液体試料を、シートまたはストリップを片側または端から別の側または端に浸透させる。
いくつかの実施形態では、多孔性固相を含む材料は、ニトロセルロースである。これは、事前の化学処理なしに、第２のゾーンの抗体をしっかりと固定することができるという利点を有する。例えば、多孔性固相材料が紙を含む場合、第２のゾーンにおける抗体の固定化は、例えば、ＣＮＢｒ、カルボニルジイミダゾール、または塩化トレシルを使用する化学カップリングで行う必要がある。
抗体を検出ゾーンに適用した後、多孔性固相材料の残部を処理して、他の箇所の任意の残りの結合部位をブロックする。ブロッキングは、タンパク質（例えば、ウシ血清アルブミンもしくは乳タンパク質）またはポリビニルアルコールもしくはエタノールアミン、またはこれらの薬剤の任意の組み合わせで処理することにより達成することができる。次に、第１のゾーン用の標識試薬を、乾燥担体上に分配することができ、湿った状態の場合、キャリア内で移動可能になるであろう。これらの様々なプロセスステップ（増感、非標識試薬の適用、ブロッキング、及び標識試薬の適用）のそれぞれの間に、多孔性固相材料が乾燥される。
開示された方法は、品質管理構成要素を含み得る。本明細書に記載のイムノアッセイ及びキットの文脈における「品質管理構成要素」には、キャリブレーター、対照、及び感度パネルが含まれるが、これらに限定されない。抗原などの分析物の濃度を内挿するための較正（標準）曲線を確立するために、「キャリブレーター」または「標準」（例えば、１つ以上、例えば、複数）を使用することができる。あるいは、参照レベルまたは対照レベル（例えば、「低」レベル、「中」レベル、または「高」レベル）に近い単一のキャリブレーターを使用することができる。「感度パネル」を構成するために、複数のキャリブレーター（例えば、複数のキャリブレーターまたは様々な量のキャリブレーター（複数可））を組み合わせて使用することができる。任意に、キャリブレーターは、一連のキャリブレーターの一部であり、キャリブレーターのそれぞれは、例えば、濃度または検出方法（例えば、比色または蛍光検出）で、一連の他のキャリブレーターとは異なる。
開示された方法は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に加えて、さらに、１つ以上の病原体またはその抗原を検出することを含んでもよい。病原体は、目的の感染症を引き起こすか、または、適切な治療のための鑑別診断が必要とされる疾患の症状を引き起こし得る、任意の感染性生物であり得る。目的の感染性生物には、細菌（限定されないが、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ種、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ種、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ種、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ種、及びＮｅｉｓｓｅｒｉａ種を含む）、ウイルス（限定されないが、アデノウイルス、Ｅｎｔｅｒｏｖｉｒｕｓ、Ｅｃｈｏｖｉｒｕｓ、ヒトヘルペスウイルス、おたふくかぜウイルスＡｇ、インフルエンザ、パラインフルエンザ、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）、他のヒトコロナウイルス、ライノウイルス、ヒトメタニューモウイルスを含む）、または真核病原体（真菌及び原生動物を含む）が含まれる。いくつかの実施形態では、方法は、さらに、インフルエンザ、ライノウイルス、ＲＳＶ、及び／またはアデノウイルスを検出することを含む。
他の病原体の検出は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原の検出に使用されるのと同じタイプの方法、例えば、上記のイムノアッセイ、を使用し得る。あるいは、他の病原体の検出は、限定されないが、核酸検出（例えば、マイクロアレイ）、核酸増幅（例えば、ＲＴ－ＰＣＲ）、及び／またはシーケンシング（例えば、次世代シーケンシング）、免疫蛍光アッセイ、血清学的アッセイ、及び細胞培養ベースの検出を含む、検出の非イムノアッセイを使用し得る。
他の病原体の検出は、ＳＡＲＳ－Ｃｏｖ－２抗原の検出と同時に、その前に、またはその後に行われ得る。例えば、他の病原体を検出する方法が同じタイプのイムノアッセイである場合、試料は、ＳＡＲＳ－Ｃｏｖ－２抗原の検出のためのもの（例えば、ラテラルフローアッセイにおける複数の検査ストリップ用の単一の試料パッド）と同時に、他の病原体の検出試薬と共にインキュベートされ得る。
３．キット及び測定器
本明細書では、上記の方法を実施するためのキットも提供される。キットに含まれる使用説明書は、パッケージ材料に添付されても、添付文書として含まれ得る。使用説明書は、書面または印刷物であり得るが、そのようなものに限定されない。そのような使用説明書を格納し、それらをエンドユーザーに通知することが可能な任意の媒体が、本開示により企図される。そのような媒体には、電子記憶媒体（例えば、磁気ディスク、テープ、カートリッジ、チップ）、光学媒体（例えば、ＣＤ ＲＯＭ）などが含まれるが、これらに限定されない。本明細書で使用される場合、「使用説明書」という用語には、使用説明書を提供するインターネットサイトのアドレスが含まれ得る。
キットには、本明細書に記載のラテラルフローデバイスが含まれ得る。いくつかの実施形態では、ラテラルフローデバイスは、密封パッケージ内にある（例えば、湿気を通さないラッピングで包まれている）。ラテラルフローデバイスは、使い捨てであってもよい。いくつかの実施形態では、デバイスは、病院、診療所、または家庭での使用に適したキットとして提供される。いくつかの実施形態では、キットは、湿気不透過性包装で個別に包装され、ユーザーへの適切な説明書と共にパッケージ化された複数（例えば、２つ）のデバイスを含む。
キットは、試料容器を含んでもよい。試料容器は、キュベットであってよい。試料ホルダーは、マイクロフルイディクスモジュールを含むカートリッジであってよい。試料ホルダーは、ＥＬＩＳＡプレートであってよい。試料容器には、本明細書に開示の方法を実施するのに有用な１つ以上の試薬（例えば、結合緩衝液及び抗体）を含まれ得る。試料ホルダーには、ユーザーの観点から望ましい可能性のある他の材料（複数可）、例えば、緩衝液（複数可）、希釈剤（複数可）、標準（複数可）（例えば、キャリブレーター及び対照）、及び／または試料処理、洗浄、もしくはアッセイのその他のステップの実施に有用な他の任意材料も含まれ得る。
キットは、さらに、試料中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス由来のタンパク質またはそのフラグメントを検出するための参照標準を含んでもよい。参照標準は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスまたはそのフラグメントの濃度からのタンパク質の内挿及び／または外挿のための標準曲線を確立するために用いられ得る。キットには、濃度レベルが異なる参照標準が含まれ得る。例えば、キットには、高濃度レベル、中濃度レベル、または低濃度レベルのいずれかを有する１つ以上の参照標準が含まれ得る。参照標準の濃度範囲に関して、これを、アッセイごとに最適化することができる。
キットには、品質管理構成要素（例えば、感度パネル、キャリブレーター、陽性対照）も含まれ得る。品質管理試薬の調製は、当該技術分野で周知であり、様々な免疫診断製品の挿入シートに記載されている。感度パネル部材は、任意に、アッセイ性能特性を確認するために使用され、キット試薬の完全性及びアッセイの標準化の有用な指標である。
キットには、任意に、試料中の追加の病原体を検出するために必要な他の試薬、及び任意の参照標準またはその品質管理構成要素も含まれ得る。
キットには、任意に、アッセイを実施するために、または品質管理評価を容易にするために必要な他の試薬、例えば、緩衝液、塩、酵素、酵素補因子、基質、検出試薬なども含まれ得る。検査試料の単離及び／または処理のための緩衝液及び溶液（例えば、前処理試薬または抽出緩衝液）などの他の構成要素も、キットに含まれ得る。キットには、さらに、１つ以上の他の対照が含まれ得る。キットの構成要素のうちの１つ以上を凍結乾燥することができ、その場合には、キットは、さらに、凍結乾燥構成要素の再構成に適した試薬を含み得る。構成要素のうちの１つ以上は、液体形態であってよい。
キットの様々な構成要素は、任意に、必要に応じて好適な容器で提供される。キットには、さらに、試料を保持または保管するための容器（例えば、試料用の容器またはカートリッジ）が含まれ得る。必要に応じて、キットは、任意に、反応容器、混合容器、及び試薬または検査試料の調製を容易にする他の構成要素を含有し得る。キットには、検査試料の取得を支援するための１つ以上の試料収集／取得器具（例えば、組織試料を取得、保存、または吸引するための、マイクロサンプリングデバイス、マイクロニードル、もしくは他の低侵襲無痛採血法；採血管（複数可）；ランセット；毛細血管採血管；他の単一の指先穿刺採血方法；口腔スワブ、鼻／咽頭スワブ；１６ゲージもしくは他のサイズの針、手術用ナイフもしくはレーザー（例えば、特に、手持ち式の）、注射器、滅菌容器、またはカニューレ）も含まれ得る。
本明細書に記載の概念、キット、及び方法は、イムノアッセイを実施するための任意の手動、自動、または半自動システムを含む、任意のシステムまたは機器で実施することができる。特定の実施形態では、本明細書に記載のアッセイ、キット、及びキット構成要素を、病院、家庭、または診療所で実施することができる。
特定の実施形態では、本明細書に記載のアッセイ、キット、及びキット構成要素を、例えば、Ａｂｂｏｔｔ（商標）ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（商標）（Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）イムノアッセイアナライザーなどのハイスループットイムノアッセイ実験室システムで実施することができる。そのようなデバイス及びその構成要素は、例えば、米国特許第５，４６８，６４６号；同第５，５４３，５２４号；同第５，５４５，７３９号；同第５，５６５，５７０号；同第５，６６９，８１９号；及び同第５，７８３，６９９号に記載されている。
特定の実施形態では、本明細書に記載のアッセイ、キット、及びキット構成要素を、電気化学的または他の手持ち式のまたはポイント・オブ・ケアアッセイシステム、例えば、サンドイッチアッセイ及びＡｘｉｓ－Ｓｈｉｅｌｄ ＰＯＣ ＡＳを実施するＡｂｂｏｔｔポイント・オブ・ケア（Ｉ－ＳＴＡＴ（登録商標）、Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）電気化学アッセイシステムで、実施することができる。免疫センサー及びそれらの製造方法ならびに使い捨て検査デバイスでの操作は、例えば、米国特許第５，０６３，０８１号；同第７，４１９，８２１号；同第７，６８２，８３３号；及び同第７，７２３，０９９号；ならびに、米国特許出願公開第２００４／００１８５７７号に記載されている。
実施例１
ラテラルフローアッセイ
サンドイッチ型アッセイを利用する、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を検出するための例示的なラテラルフローアッセイが提供される。特に、デバイスは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス由来のタンパク質またはそのフラグメントに特異的な標識抗体、例えば、検出可能な標識で標識されたモノクローナル抗体を含む第１のゾーン（例えば、試薬ゾーン）を含む。デバイスは、第２のゾーン（例えば、検出ゾーン）に固定された、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス由来のタンパク質またはそのフラグメントとは異なるエピトープに特異的な二次抗体を含む。陽性検査は、検出ゾーン（例えば、検査ラインの）に目に見える線が現れることにより示される。
デバイスの最初の検査を、試薬ゾーンに適用された発泡スワブ上で希釈された熱不活化ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスで実施した。ＬＯＤは、２２．５の５０％組織培養感染量（ＴＣＩＤ５０）（ＴＣＩＤ５０）／検査希釈または１１２５のＴＣＩＤ５０／ｍＬであることが判明した。
アデノウイルス（１型、５型、及び７型）、Ｅｎｔｅｒｏｖｉｒｕｓ（ＥＶ６８及びＤ６８）、Ｅｃｈｏｖｉｒｕｓ（１型及び２型）、ヒトヘルペスウイルス（１型及び２型）、おたふくかぜウイルスＡｇ、インフルエンザウイルスＡ（Ｈ１Ｎ１株（Ａ／Ｖｉｒｇｉｎｉａ／ＡＴＣＣ１／２００９）、Ｈ１Ｎ１株（Ａ／ＷＳ／３３）、及びＨ３Ｎ２株（Ａ／Ｈｏｎｇｋｏｎｇ／８／６８））、インフルエンザＢ（株（Ｂ／Ｌｅｅ／４０））、パラインフルエンザ（１型、２型、３型、及び４Ａ型）、呼吸器合胞体ウイルスまたはＲＳＶ（Ａ型及びＢ型）、ヒトコロナウイルス（ＨＫＵ１、ＮＬ６３、ＯＣ４３及び２２９Ｅ）、ライノウイルス（Ａ１６型）、ＭＥＲｓ－ＣｏＶ、及びヒトメタニューモウイルス（１６Ａ１型）を含む検査された他の多数のウイルスでは、交差反応性は観察されなかった。加えて、非ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス（インフルエンザＡ、ライノウイルス、ＲＳＶ、またはアデノウイルス）との同時感染は、検出限界近くのＳＡＲＳ ＣｏＶ－２の検出に影響しなかった。
しかし、２５ｎｇ／ｍＬ～２５μｇ／ｍＬのヒトＳＡＲＳコロナウイルス核タンパク質を使用した場合、ヒトＳＡＲＳコロナウイルスに対する交差反応性が観察された。これは、ゲノムまたはＳＡＲＳ－ＣｏＶ及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２間の７９．６％の類似性に起因すると思われる。２．５ｎｇ／ｍＬのヒトＳＡＲＳコロナウイルス核タンパク質を含む試料では、交差反応は生じなかった。
Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ（Ｇｒｏｕｐ Ａ １９６１５）、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｐｒｏｐｈｙｔｉｃｕｓ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｓｐ．（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｌａｃｔａｍｉｃａ）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ、Ｈｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｐｒｏｔｅｕｓ ｖｕｌｇａｒｉｓ、Ｍｏｒａｘｅｌｌａ ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｎｅｃｒｏｐｈｏｒｕｍ、及びＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓを含む他の生物では、交差反応性は観察されなかった。加えて、ポーリングされたヒト鼻洗浄試料では交差反応性は観察されなかった。
例えば、内因性物質、例えば、ムチン、ヘモグロビン、トリグリセリド、黄疸（ビリルビン）、リウマチ因子、抗核抗体、妊娠、及び全血、ならびに、去痰薬、例えば、グアイアコールグリセリルエーテル；気管支拡張薬、例えば、アルブテロール及びエフェドリン；抗ヒスタミン薬、例えば、クロルフェニラミン及びジフェンヒドラミン；鼻充血除去薬、例えば、フェニレフリンヒドロクロリド、及びオキシメタゾリンヒドロクロリド；抗ウイルス薬、例えば、リバビリン、オセルタミビル、及びザナミビル；抗生物質、例えば、アモキシシリン；一般的な薬、例えば、アセチルサリチル酸及びイブプロフェン；降圧薬、例えば、クロロチアジド及びインダパミド；抗糖尿病薬、例えば、グリメピリド（スルホニル尿素）及びインダパミド；ならびに、想定されるＣＯＶＩＤ－１９薬、例えば、イベルメクチン、ロピナビル、リトナビル、及びクロロキンホスファートを含む様々な既知の干渉物質も含めて、検査を実施した。干渉物質の溶液をフォームスワブまたは試料リポジトリにスパイクし、上記のように検査を完了した。検査された濃度では、干渉は観察されなかった。
実施例２
ラテラルフローアッセイキット
例示的なラテラルフローアッセイキットには、以下の少なくとも１つまたは全てが、別々またはラテラルフローデバイス内に含まれる：ラテラルフローデバイス；１ＸのＸＴＢＥ及び１％のＢＳＡ溶液中の組み換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｎタンパク質を含む陽性対照スワブ；検査ライン及び対照ラインを備えたニトロセルロース検査ストリップ；患者のスワブ（例えば、フォームが先端についたアプリケーター）；ならびに、一次抗体及び二次抗体またはそのフラグメントの少なくとも一方または両方。ラテラルフローデバイスは、ブリッジパッド（例えば、Ａｈｌｓｔｒｏｍ １２８１－Ａｈｌｓｔｒｏｍ Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ Ｉｎｃ．、Ｍｔ．Ｈｏｌｌｙ Ｓｐｒｉｎｇｓ，Ｐａ．）、コンジュゲートパッド（例えば、ＰＮＰＫ００２１２３）、試料パッド（例えば、Ａｈｌｓｔｒｏｍ １２８１－Ａｈｌｓｔｒｏｍ Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ Ｉｎｃ．、Ｍｔ．Ｈｏｌｌｙ Ｓｐｒｉｎｇｓ，Ｐａ．）、Ａｂパッド（例えば、Ａｈｌｓｔｒｏｍ ９０４－Ａｈｌｓｔｒｏｍ Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ Ｉｎｃ．、Ｍｔ．Ｈｏｌｌｙ Ｓｐｒｉｎｇｓ，Ｐａ．）、及びハウジングを含む検査ストリップ構成要素を含む。抽出バッファーは、２００ｍＭのＴｒｉｃｉｎｅ、１．２％のＮａＣｌ、０．７５％のＺｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ、０．５％のＴｗｅｅｎ２０、及び０．０１２５％のアジド（ｐＨ８．８）を含む。検査ラインを、２ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ－Ｆａｂ、１．５％のトレハロース、５０ｍＭのトリス、０．１％のアジド、及び０．０２％のＩｎｔｒａｗｈｉｔｅ（ＵＶ）を含む溶液で包埋または処理した。対照ラインを、１ｍｇ／ｍＬのニワトリＩｇＹ、１％のトレハロース、５０ｍＭのトリス、０．１％のアジド、及び０．０５％のＦＤ＆Ｃ青色色素を含む溶液で包埋または処理した。
二次抗体もしくはコンジュゲート抗体またはそのフラグメントは、再懸濁緩衝液（例えば、５ｍＭのホウ酸、０．１％のカゼイン、０．０１％のＰＥＧ化合物、及び０．０１％のアジド（ｐＨ７．４））ならびに乾燥緩衝液（例えば、５ｍＭのホウ酸、２％の酵素カゼイン（Ｎ－Ｚケース）、０．１％のＴｒｉｔｏｎＸ－１００、２％のＴｗｅｅｎ２０、６％のスクロース、及び０．０２％のアジド（ｐＨ８））で提供される。二次抗体もしくはコンジュゲート抗体またはそのフラグメントは、配列番号１５及び１６またはその誘導体、ならびにＢＳＡフリーロバ抗ニワトリを含んでもよい。
実施例３
ラテラルフローアッセイキット
過去７日間にＣＯＶＩＤ－１９への曝露が疑われるか、またはＣＯＶＩＤ－１９の症状を示した個人から収集された２４３人の鼻咽頭検体を使用して、本明細書に開示の一次抗体及び二次抗体を含む例示的なラテラルフローデバイスを検査した（６０人のＰＣＲ陽性及び１８３人のＰＣＲ陰性）。
結果は、９７．９％の全体一致率を示す（表１）。


実施例４
ラテラルフローアッセイの比較
ＣＯＶＩＤ－１９感染が疑われる患者の鼻腔スワブ由来の試料における、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のリアルタイムＰＣＲ（ＲＴ－ＰＣＲ）を含む参照方法に対する臨床感度及び特異度について、例示的なラテラルフローデバイスを検査した。１つの例示的なラテラルフローデバイスは、本明細書に記載の一次抗体及び二次抗体の全長バージョンを含み、第２のラテラルフローデバイスは、一次抗体及び二次抗体のＦａｂ抗体フラグメントを含んでいた。各患者から２つの鼻スワブを採取した。一方は、ラテラルフローアッセイを使用した直接検査用であり、他方は、ウイルス移入培地に入れ、その後のＲＴ－ＰＣＲ分析のために２～８℃に冷却した。鼻腔スワブの採取順序を無作為化した。
全長抗体を含む例示的なラテラルフローデバイスは、ＲＴ－ＰＣＲ分析と比較した場合、症状のある患者のみの全ての試料で約６８％の陽性一致率を有することが判明した（表２）。陽性一致率は、培養可能なウイルス測定値（ＣＴカットオフ＝２３）と比較して、約９０％であったが、陰性一致率は、わずかに減少した（表３）。患者の大部分（１００人）は、７日未満で症状を呈し、結果は、表２に示されるように全ての患者の要約結果と同様であった。しかし、８～１０日、１１～１４日、または１５日以上の症状を呈する患者の試料サイズが小さいので、９５％信頼区間が大きくなった。


Ｆａｂ抗体フラグメントを含む例示的なラテラルフローデバイスは、全長抗体を使用するデバイスよりも顕著に高い陽性一致率をもたらした。全ての患者試料（症状のある患者及び無症状の患者）の陽性一致率は、約９０％であり；症状のある患者で、陽性一致率は、９１．５％であった（表４）。同様の結果が、Ｆａｂラテラルフローデバイスを培養可能なウイルスと比較して判明した（ＣＴカットオフ＝２３）。試料サイズが小さいので、９５％信頼区間で示されているように、無症候性患者の陽性一致率は、大きな誤差があった。（表４）。


症状のある患者の大部分（１０２／１２６）は、症状を７日未満呈した。それらの試料では、陽性一致率及び全体一致は、全て、それぞれ、９７．１％及び９８．０％に増加し；陰性一致率は、実質的に同じままであった。しかし、無症候性患者の総数と同様に、８～１０日（５人の患者）、１１～１４日（１３人の患者）、及び１５日以上（６人の患者）の症状を有する症状のある患者の試料サイズが小さいので、１００．０％（２９．２、１００．０）、６２．５％（２４．５、９１．５）、及び１００．０％（２．５、１００．０）の陽性一致率の測定値の誤差が大量にもたらされた。表５に示されるように、１０日以下の症状のある患者由来の試料により、約９８％の全体一致率がもたらされた。
ラテラルフローデバイスで全長抗体の代わりにＦａｂ抗体フラグメントを使用すると、検査された患者試料について、約６８％～約９０％の陽性一致率、及び約８８％～約９５％の全体一致率が増加し、１０日以下の症状を有する患者由来の試料について、陽性一致率、陰性一致率、及び全体一致率が増加した。
実施例５
ラテラルフローアッセイ
本明細書に記載されている、一次抗体及び二次抗体の全長バージョンを含むラテラルフローデバイスを使用した追加の検査を、確認された陽性患者から単離された熱不活化ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対して実施した。ＬＯＤは、７９の５０％組織培養感染量（ＴＣＩＤ５０）／ｍＬ（（ＴＣＩＤ５０）／ｍＬ）であることが判明した。
また、試料を使用して、フック効果（高用量フック効果としても既知の）の有無を判定した。フック効果は、固定化抗体及び標識抗体の両方と同時及び瞬時に、反応する過剰な標的タンパク質に起因する。従って、フック効果は、非常に高レベルの標的が、検査試料に存在する場合に見ることができる偽陰性結果を指す。フック効果を克服するために、標本の希釈が必要とされ得る。（図１）に示されるように、フック効果は、１．０×１０５．８（６３０，９５７）（ＴＣＩＤ５０）／ｍＬ以下の濃度で明らかではなかった。
実施例６
ラテラルフローデバイスを用いた鼻咽頭及び鼻腔標本の臨床評価
ＣＯＶＩＤ－１９感染が疑われる患者の鼻咽頭標本由来の試料におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のリアルタイムＰＣＲ（ＲＴ－ＰＣＲ）を含む参照方法に対する感度及び特異度の臨床評価に、例示的なラテラルフローデバイスを使用した。例示的なラテラルフローデバイスは、本明細書に記載の一次抗体及び二次抗体の全長バージョンを含んでいた。
全長抗体を含む例示的なラテラルフローデバイスは、ＲＴ－ＰＣＲ分析と比較した場合、全試料で約９１％の感度（上記の陽性一致率とも呼ばれる）を有することが判明した（表６）。特異度（上記の陰性一致率とも呼ばれる）は、９９％を超えていた。
また、症状発現後の日数に基づいて、試料を分類した。表７に示されるように、感度は、症状発現の０～７日後の全ての陽性対象で９０％を超えていた。加えて、特異度は、症状発現の０～３日後の陰性対象で１００％であり、症状発現の４～７日後の陰性対象で９９％を超えていた。


ＣＯＶＩＤ－１９感染が疑われる患者の鼻腔スワブ由来の試料における、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のリアルタイムＰＣＲ（ＲＴ－ＰＣＲ）を含む参照方法に対する臨床感度及び特異度を検査するために、例示的なラテラルフローデバイスを使用した。例示的なラテラルフローデバイスは、本明細書に記載の一次抗体及び二次抗体の全長バージョンを含んでいた。
全長抗体を含む例示的なラテラルフローデバイスは、ＲＴ－ＰＣＲ分析と比較した場合、全ての試料で約９１％の感度を有することが判明した（表８）。特異度は、９９％を超えていた。
また、症状発現後の日数に基づいて、試料を分類した。表９に示されるように、感度は、症状発現の０～７日後の全ての陽性対象で９０％を超えていた。加えて、特異度は、症状発現の４～７日後の陰性対象で１００％であり、症状発現の４～７日後の陰性対象で９９％を超えていた。
加えて、実施例４に記載され、上で使用されたように、第２の試料ではなく、試料の一部または大部分がラテラルフローアッセイで使用された後の残りの試料を使用して、ＲＴ－ＰＣＲを完了した。
全長抗体を含む例示的なラテラルフローデバイスは、残りの試料のＲＴ－ＰＣＲ分析と比較して、全ての試料で約９８％の感度を有することが判明した（表１０）。特異度は、９９％を超えていた。全体一致率は、９９％を超えていた。
また、症状発現後の日数で、試料を分類した。表１１に示されるように、感度は、症状発現の０～３日後の全ての陽性対象で１００％であり、症状発現の４～７日後の全ての陽性対象で９６％を超えていた。加えて、特異度は、症状発現の４～７日後の陰性対象で１００％であり、症状発現の４～７日後の陰性対象で９９％を超えていた。
実施例７
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアント
デルタ株及びラムダ株を含む循環ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２株に見られるヌクレオキャプシド変異の影響を評価するために、検査用の臨床検体で特定された変異を有する組み換えタンパク質を調製した。個別にまたは組み合わせて検査された変異には、Ｄ６３Ｇ、Ｒ２０３Ｋ、Ｒ２０３Ｍ、Ｇ２０４Ｒ、Ｒ２０９Ｉ、Ａ２２０Ｖ、Ｑ２２９Ｈ、Ｍ２３４Ｉ、Ｓ２３５Ｆ、Ｄ３４８Ｙ、Ｐ３６５Ｓ、Ｅ３６７Ｑ、Ａ３７６Ｔ、Ｄ３７７Ｙ、及び野生型（ＷＴ）武漢参照対照が含まれる。これらの変異は、いくつかの循環系統のユニークなヌクレオキャプシドシーケンスプロファイルを提示する：Ｂ．１．１．７、Ｂ．１．６１７．１、Ｂ．１．６１７．２、Ｂ．１．６１７．３、Ｂ．１．６１８、ＡＹ．１、ＡＹ．２、Ｐ．２、Ｂ．１．５２６、Ｂ．１．５２６．１、Ｂ．１．５２６．２、及びイタリアの株のパネル。本明細書に開示の抗体を用いて実施されたウェスタンブロット及びハイスループットイムノアッセイにより、ＷＴ対照と同等の感度で全ての変異体及びＷＴ組み換え抗原（ｒＡｇ）の検出が確認された。
上述の詳細な説明及び付随する実施例は、単なる例示であり、本開示の範囲において限定として解釈されるものではなく、これは、添付の特許請求の範囲及びそれらの均等物によってのみ定義されることが理解される。
開示された実施形態に対する様々な変更及び修正は、当業者らには明らかであり、その精神及び範囲から逸脱することなく行われ得る。

Claims (19)

  1. 対象から得られた試料中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスを検出する方法であって、この方法が、
    前記試料中に存在する場合、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス由来のタンパク質またはそのフラグメントの、一次抗体またはその抗原結合フラグメントとの結合を可能にする条件下で、前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス由来のタンパク質またはそのフラグメントに特異的に結合する前記一次抗体またはその抗原結合フラグメントと、対象から得られた試料を接触させることを含み、前記一次抗体またはその抗原結合フラグメントが、
    （ｉ）配列番号１と少なくとも７０％の同一性を有する相補性決定領域１（ＣＤＲ）アミノ酸配列、配列番号２と少なくとも７０％の同一性を有するＣＤＲ２アミノ酸配列、及び配列番号３と少なくとも７０％の同一性を有するＣＤＲ３アミノ酸配列を含む重鎖可変領域、
    （ｉｉ）配列番号４と少なくとも７０％の同一性を有するＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号５と少なくとも７０％の同一性を有するＣＤＲ２アミノ酸配列、及び配列番号６と少なくとも７０％の同一性を有するＣＤＲ３アミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、を含み、
    さらに、前記方法が、前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス由来のタンパク質またはそのフラグメントに特異的に結合する二次抗体、及び検出可能な標識を含むコンジュゲートと、前記試料を接触させること、を含み、前記二次抗体またはその抗原結合フラグメントが、
    （ｉ）配列番号９と少なくとも７０％の同一性を有する相補性決定領域１（ＣＤＲ）アミノ酸配列、配列番号１０と少なくとも７０％の同一性を有するＣＤＲ２アミノ酸配列、及び配列番号１１と少なくとも７０％の同一性を有するＣＤＲ３アミノ酸配列を含む重鎖可変領域、
    （ｉｉ）配列番号１２と少なくとも７０％の同一性を有するＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号１３と少なくとも７０％の同一性を有するＣＤＲ２アミノ酸配列、及び配列番号１４と少なくとも７０％の同一性を有するＣＤＲ３アミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、を含み、
    さらに、前記方法が、前記検出可能な標識のシグナルの存在を評価すること、を含み、前記検出可能な標識のシグナルの存在が、前記試料中の前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス由来のタンパク質またはそのフラグメントの存在を示す、前記方法。
  2. イムノアッセイを使用して実施される、請求項１に記載の方法。
  3. 前記イムノアッセイが、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）またはラテラルフローイムノアッセイ（ＬＦＡ）である、請求項１または請求項２に記載の方法。
  4. 前記試料が、鼻スワブもしくは鼻ブラシ、唾液、粘液、血液、血清、または血漿を含む、請求項１～３のいずれかに記載の方法。
  5. 前記一次抗体またはその抗原結合フラグメント、及び前記二次抗体またはその抗原結合フラグメントが、前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス由来のタンパク質の異なるエピトープを認識する、請求項１～４のいずれかに記載の方法。
  6. 前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス由来のタンパク質またはそのフラグメントが、ヌクレオキャプシド（Ｎ）タンパク質である、請求項１～５のいずれかに記載の方法。
  7. 前記一次抗体またはその抗原結合フラグメントが、配列番号７と少なくとも７０％の同一性を有する重鎖可変領域アミノ酸配列、及び配列番号８と少なくとも７０％の同一性を有する軽鎖可変領域アミノ酸配列を含む、請求項１～６のいずれかに記載の方法。
  8. 前記二次抗体またはその抗原結合フラグメントが、配列番号１５と少なくとも７０％の同一性を有する重鎖可変領域アミノ酸配列、及び配列番号１６と少なくとも７０％の同一性を有する軽鎖可変領域アミノ酸配列を含む、請求項１～７のいずれかに記載の方法。
  9. さらに、少なくとも１つ以上の追加の病原体またはその抗原の検出を含む、請求項１～８のいずれかに記載の方法。
  10. ラテラルフローデバイスであって、
    ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス由来のタンパク質またはそのフラグメントに特異的に結合する、一次抗体またはその抗原結合フラグメント、を含み、前記一次抗体またはその抗原結合フラグメントが、
    （ｉ）配列番号１と少なくとも７０％の同一性を有する相補性決定領域１（ＣＤＲ）アミノ酸配列、配列番号２と少なくとも７０％の同一性を有するＣＤＲ２アミノ酸配列、及び配列番号３と少なくとも７０％の同一性を有するＣＤＲ３アミノ酸配列を含む重鎖可変領域、
    （ｉｉ）配列番号４と少なくとも７０％の同一性を有するＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号５と少なくとも７０％の同一性を有するＣＤＲ２アミノ酸配列、及び配列番号６と少なくとも７０％の同一性を有するＣＤＲ３アミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、を含み、
    さらに、前記ラテラルフローデバイスが、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス由来のタンパク質またはそのフラグメントに特異的に結合する、二次抗体またはその抗原結合フラグメント、を含み、前記二次抗体またはその抗原結合フラグメントが、
    （ｉ）配列番号９と少なくとも７０％の同一性を有する相補性決定領域１（ＣＤＲ）アミノ酸配列、配列番号１０と少なくとも７０％の同一性を有するＣＤＲ２アミノ酸配列、及び配列番号１１と少なくとも７０％の同一性を有するＣＤＲ３アミノ酸配列を含む重鎖可変領域、
    （ｉｉ）配列番号１２と少なくとも７０％の同一性を有するＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号１３と少なくとも７０％の同一性を有するＣＤＲ２アミノ酸配列、及び配列番号１４と少なくとも７０％の同一性を有するＣＤＲ３アミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、を含む、前記ラテラルフローデバイス。
  11. 前記一次抗体またはその抗原結合フラグメントが、固定されている、請求項１０に記載のラテラルフローデバイス。
  12. 前記二次抗体またはその抗原結合フラグメントが、検出可能な標識を含む、請求項１０または１１に記載のラテラルフローデバイス。
  13. 前記一次抗体またはその抗原結合フラグメント、及び前記二次抗体またはそのフラグメントが、前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス由来のタンパク質の異なるエピトープを認識する、請求項１０～１２のいずれかに記載のラテラルフローデバイス。
  14. 試料パッドが、前記二次抗体またはその抗原結合フラグメントを含む、請求項１０～１３のいずれかに記載のラテラルフローデバイス。
  15. 検査ラインが、前記一次抗体またはその抗原結合フラグメントを含む、請求項１０～１４のいずれかに記載のラテラルフローデバイス。
  16. 密閉パッケージに、請求項１０～１５のいずれかに記載のラテラルフローデバイスを含む、キット。
  17. さらに、抽出緩衝液を含む、請求項１６に記載のキット。
  18. さらに、サンプリングデバイスを含む、請求項１６または１７のいずれかに記載のキット。
  19. 前記サンプリングデバイスが、鼻スワブを含む、請求項１８に記載のキット。

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